Vantagens das colunas SEC Agilent AdvanceBio para análises biofarmacêuticas Comparação de colunas de diferentes fornecedores para melhorar a qualidade dos dados Descrição técnica Introdução A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é uma técnica padrão para a deteração das médias de massa molar e é frequentemente usada para descrever a separação de biomoléculas baseadas em medida. Na SEC, a eficiência da separação vem somente da fase estacionária,,enquanto a fase móvel não deveria ter efeito algum. Portanto, a seleção de coluna para uma dada biomolécula é essencial para a aplicação com êxito da SEC. Há diferentes tipos de colunas SEC disponíveis comercialmente que vêm em várias dimensões, porosidades e tamanhos de partículas. As colunas SEC Agilent AdvanceBio contam com uma tecnologia inovadora para a análise de SEC. As colunas foram projetadas e fabricadas pela Agilent para dar eficiência máxima sem risco de degradação de cisalhamento da amostra ou entupimento entre as partículas. O método único de fabricação que controla o volume, a estrutura e o tamanho dos poros e, em seguida, a a aplicação de um revestimento polimérico hidrófilo asseguram que os picos de proteína são sejam fortes e bem resolvidos. Essa nota técnica compara as colunas SEC de diferentes fornecedores usando uma fase móvel comumente usada para uma separação com padrões de proteína, anticorpos monoclonais e um conjugado anticorpo-droga (ADC). Queríamos identificar as diferenças no desempenho da coluna que poderia impactar a qualidade dos dados que estavam sendo gerados. Demonstramos a vantagem exclusiva das colunas SEC AdvanceBio para separação de alta resolução de biomoléculas para aplicações biofarmacêuticas.
Materiais e métodos Colunas 7, mm SEC Agilent AdvanceBio Å,,7 µm Outro fornecedor A Å,, µm Outro fornecedor B Å,, µm Outro fornecedor C Å, µm Outro fornecedor D Å, µm Outro fornecedor E Å, µm, mm SEC Agilent AdvanceBio Å,,7 µm Outro fornecedor F Å,, µm Outro fornecedor G Å,,7 µm Resultados e discussão Comparação da robustez de colunas SEC de 7, mm para métodos de SEC-DAD Padrões de separação de proteínas A Figura compara a resolução de um padrão de referência de seis proteínas em colunas com diferentes tamanhos de poros e mostra claramente o efeito do tamanho do poro na resolução. As proteínas maiores, tiroglobulina e seu monômero, têm boa resolução com poros de Å e Å. No entanto, conforme o tamanho do poro diui, as maiores proteínas são excluídas e a resolução é ruim. Enquanto as maiores proteínas apresentavam melhor resolução na coluna B de Å e na coluna E de Å, ambas as colunas ofereceram larguras de pico mais amplas, o que torna a quantificação de baixos níveis de agregação mais difícil e menos precisa. A coluna SEC AdvanceBio melhorou a resolução de biomoléculas de peso alto, médio e baixo, o que é essencial para a separação de muitas de las (Figura ). A SEC AdvanceBio também forneceu aumento da sensibilidade, simetria de pico estreita e baixo volume de eluição. Tabela. Condições cromatográficas Parâmetro 7, mm, mm Taxa de fluxo, ml/, ml/ Fase móvel mm de tampão de fosfato, ph 7, mm de tampão de fosfato, ph 7, Instrumento LC quaternário Agilent Infinity Bio-inert LC binário Agilent 9 Infinity com DAD GD e cela de fluxo Bio-inert (. bar) Volume de injeção µl µl TCC Ambiente Ambiente Detecção UV, nm UV, nm Amostras Marcadores de peso molecular de proteína (agregado de tireoglobulina, tireoglobulina, IgG, albua de soro bovino, mioglobina) e marcador de permeação total de uracil Anticorpos monoclonais terapêuticos (rituximabe e trastuzumabe) Conjugado de medicamentos de anticorpos terapêuticos SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å, 7, mm Rs =, Rs =, Rs =, Outro fornecedor A,, µm, Å, 7, mm Rs =, Rs =,9 Rs =, Outro fornecedor B,, µm, Å, 7, mm Rs =, Rs =,7 Outro fornecedor C, µm, Å, 7, mm Rs =, Outro fornecedor D, Rs =, µm, Å, 7, mm Rs =,97 Rs =,77 Outro fornecedor E, Rs =,7 µm, Å, 7, mm Rs =,7 Rs =,9 Figura. Comparação dos perfis de SEC de padrões de proteínas em colunas SEC 7, mm. As resoluções entre os picos e, e e e foram calculadas. Rs =, Rs =,9 Rs =, DI de pico. Agregados de tireoglobulina. Tireoglobulina ( kda). IgG ( kda). BSA ( kda). Mioglobina (7 kda). Uracil ( Da)
Para avaliar o efeito do tamanho do poro na separação de uma gama de marcadores de proteína, as curvas de calibração para cada coluna foram representadas graficamente (Figura ). As moléculas maiores do que o tamanho do poro são excluídas e partículas menores penetram nos poros para definir o limite da faixa de exclusão e permeação de uma coluna. Uma coluna SEC ideal é aquela que separa biomoléculas na parte mais linear da curva de calibração. Quando avaliamos as colunas para a separação da mesma variedade de proteínas, a SEC AdvanceBio forneceu uma inclinação linear e superficial para a maior parte da curva de resolução. Esse desempenho resultou na separação melhorada de marcadores de proteínas dentro da faixa de peso molecular kda a Da, a faixa da maioria das bioterapias com base em proteína. Comparação de volumes de poro A capacidade de pico e resolução na SEC são deteradas primariamente pelo volume dos poros. Um volume maior dos poros fornece melhor resolução em uma faixa mais ampla de peso molecular. A Tabela mostra os volumes de poro calculados a partir do ponto de permeação total (uracil) e do limite de exclusão (agregado de tireoglobulina) para as colunas. A SEC AdvanceBio forneceu um volume maior do poro (7, ml) em comparação com as outras colunas, e assim forneceu melhor resolução e maior capacidade de pico. Log Mw Log Mw.......... Curvas de calibração comparação da SEC Agilent AdvanceBio com as colunas A e B R =,7 R =,9 R =,9 Coluna SEC Agilent AdvanceBio, Å Outro fornecedor A, Å Outro fornecedor B, Å. 7 9 Volume de eluição (ml),,,,,,,,,, Curvas de calibração comparação da SEC Agilent AdvanceBio com as colunas C, D e E R =, R =,9 R =,9 R =,9 Coluna SEC Agilent AdvanceBio, Å Outro fornecedor D, Å Outro fornecedor C, Å Outro fornecedor E, Å, Volume de eluição (ml) Figura. Curvas de calibração para padrões de proteína em várias colunas SEC de 7, mm. Tabela. Comparação do volume total do poro da coluna Coluna 7, mm SEC Agilent AdvanceBio Å,,7 µm 7, Outro fornecedor A Å,, µm, Outro fornecedor B Å,, µm,7 Outro fornecedor C Å, µm, Outro fornecedor D Å, µm,7 Outro fornecedor E Å, µm,, mm SEC Agilent AdvanceBio Å,,7 µm, Outro fornecedor F Å,, µm, Outro fornecedor G Å,,7 µm, Volume do poro (ml)
Separação de anticorpos monoclonais terapêuticos A Figura mostra a melhoria na qualidade dos dados para a separação de trastuzumabe terapêutico na coluna SEC AdvanceBio de,7 µm. O cromatograma exibe os valores de resolução de várias colunas para a separação do monômero e dos agregados. A SEC AdvanceBio e a coluna D mostraram os maiores fatores de resolução de,7 e,, respectivamente, para o monômero de trastuzumabe e seu agregado. A coluna E, que afirma separar proteínas maiores ou dímeros de anticorpos e agregados maiores, não resolveu o agregado e não foi possível integrar o monômero e o agregado para deterar sua resolução.,,,,,, SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å, 7, mm Outro fornecedor A,, µm, Å, 7, mm Outro fornecedor B,, µm, Å, 7, mm Outro fornecedor C, µm, Å, 7, mm Outro fornecedor D, µm, Å, 7, mm Outro fornecedor E, µm, Å, 7, mm Rs =,7 Rs =,9 Rs =,7 Rs =, Rs =, Figura. Análise de monômero de trastuzumabe e agregados usando colunas SEC de 7, mm.
Também foram feitas comparações entre as colunas para a separação de rituximabe de anticorpos monoclonais terapêuticos comerciais, para mostrar o desempenho das colunas em situações reais. A área destacada na Figura revela a capacidade da SEC AdvanceBio de resolver agregados e fragmentos em comparação com as colunas de A a E. O tamanho e o volume ideais do poro da SEC AdvanceBio oferece a maior resolução necessária para a separação dos monoclonais terapêuticos, seus agregados e os produtos de degradação. Outro fornecedor A,, µm, Å, 7, mm SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å, 7, mm Outro fornecedor B,, µm, Å, 7, mm Outro fornecedor C, µm, Å, 7, mm Zoom - - - - Outro fornecedor D, µm, Å, 7, mm Outro fornecedor E, µm, Å, 7, mm - - Figura. Comparação de perfis de rituximabe em várias colunas SEC de 7, mm.
Separação de conjugado anticorpo-droga A análise por SEC de conjugado anticorpo-droga (ADCs) exige colunas com interação secundária reduzida de cargas hidrofóbicas com a fase estacionária da coluna. Os métodos mais publicados para análise da SEC de ADC realizados usando fases aquosas geraram um formato de pico inadequado e resolução incompleta do agregado do conjugado monomérico. Esse efeito foi causado devido à interação não específica da carga hidrofóbica com a fase estacionária. A adição de modificadores orgânicos demonstrou superar esse efeito, mas a viscosidade da fase móvel, e, consequentemente, a pressão, pode comprometer a taxa de fluxo ou a vida útil da coluna. A integridade da amostra pode ser comprometida pois os componentes orgânicos podem afetar a agregação da amostra. A análise de ADC usando as colunas de A a E com fase móvel aquosa levou a formatos de pico inadequados devido à interação não específica da carga hidrofóbica com a fase estacionária, como mostrado na Figura. No entanto, os picos foram simétricos quando o ADC foi analisado usando uma SEC AdvanceBio com uma fase móvel, tampão de fosfato de mm. Esse método também deu a maior resolução de monômero e agregados (Rs =,7), indicando nenhuma interação não específica do medicamento hidrofóbico com a fase estacionária (Figura ). Além disso, a SEC AdvanceBio conseguiu separar e resolver agregados de ADC melhor do que as outras colunas, indicando sua adequação para a análise de ADC e agregados. Os picos mais largos produzidos por colunas de outros fornecedores não apenas impactou a sensibilidade e limitou a detecção de baixos níveis de agregados, mas também tornou difícil a integração de pico. SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å, 7, mm Rs =,7 Outro fornecedor A,, µm, Å, 7, mm Rs =, Outro fornecedor B,, µm, Å, 7, mm Zoom Outro fornecedor C, µm, Å, 7, mm Rs =, Outro fornecedor D, µm, Å, 7, mm Rs =, Outro fornecedor E, µm, Å, 7, mm Figura. Comparação de perfis de ADC terapêutico em várias colunas SEC de 7, mm.
Comparação de colunas SEC de, mm para métodos sensíveis Padrões de separação de proteínas A Figura compara a resolução de um padrão de referência de cinco proteínas na coluna SEC AdvanceBio, mm,,7 µm e as colunas F e G. A proteína maior, agregado de tireoglobulina) (pico ), estava bem resolvida, com sensibilidade aprimorada e picos simétricos em comparação com outras colunas. No geral, a SEC AdvanceBio oferece melhor resolução para marcadores de peso molecular alto, médio e baixo do que a coluna F e é comparável à coluna G de,7 µm. A curva de calibração da SEC AdvanceBio tem menos inclinação, com a curva mostrando um excelente valor de coeficiente para um peso molecular mais preciso (Figura 7). A SEC AdvanceBio também fornece um volume maior de poro (, ml) em comparação com as colunas F (, ml) e G (, ml), e assim fornece melhor resolução e maior capacidade de pico. Além disso, a coluna F exige um tempo de corrida cromatográfica maior para resolver o mesmo intervalo de marcadores. A faixa de permeação da coluna (, ml) também excede o volume da coluna (,9 ml), sugerindo alguma interação não específica durante a eluição.,,,,,,,,,,,, SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å,, mm 7 bar 7 bar bar Rs =, Rs =, Rs =, Outro fornecedor F,, µm, Å,, mm Outro fornecedor G,,7 µm, Å,, mm Rs =,9 Rs =, Rs =, Rs =,9 Rs =, DI de pico. Agregados de tireoglobulina. Tireoglobulina ( kda). IgG ( kda). BSA ( kda). Mioglobina (7 kda). Uracilo ( kda) Figura. Comparação de perfis de padrões de proteína em várias colunas SEC de, mm. As resoluções entre os picos e, e e e foram calculadas. Log Mw Curvas de calibração comparação da SEC Agilent AdvanceBio com as colunas F e G,, SEC Agilent AdvanceBio, Outro fornecedor F, Å, Outro fornecedor G, Å,,, R =,97, R =,, R =,9,,,,,,,,,,,, Volume de eluição (ml) Figura 7. Curvas de calibração para padrões de proteína em várias colunas SEC de. mm. 7
Separação de anticorpo monoclonal terapêutico A Figura mostra a separação de mab de trastuzumabe nas colunas de, mm. O cromatograma exibe os valores de resolução na separação do monômero e dos agregados. A SEC AdvanceBio mostra a resolução do pico de monômero como comparável à coluna F de, µm, Å, assim como à coluna G de,7 µm, Å. Além disso, a SEC AdvanceBio e a coluna F puderam identificar trastuzumabe degradado, destacado em azul, que a coluna G não pôde separar.,,,,,,,,, 7 bar 7 bar bar SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å,, mm Outro fornecedor F,, µm, Å,, mm Outro fornecedor G,,7 µm, Å,, mm Rs =,7 Rs =,7 Rs =,9 Figura. Análise de monômero de trastuzumabe e agregados usando colunas SEC de. mm de diferentes fornecedores.
Separação de conjugado de medicamentos de anticorpos A Figura 9 ilustra a separação da SEC de ADC em várias colunas, mm. É evidente que a SEC AdvanceBio mostrou o maior fator de resolução (Rs =,7) para monômero de ADC e seu agregado, comparado às colunas F e G. As colunas F e G deram formatos de pico incorretos devido à interação de cargas hidrofóbicas com a fase estacionária da coluna. A Coluna SEC AdvanceBio também forneceu melhor formato de pico para o monômero ADC e melhorou a resolução de seus agregados. Além disso, para melhor separação de marcadores de proteínas, mabs/adcs e seus agregados, a SEC AdvanceBio opera a aproximadamente 7 bar, em oposição aos bar da coluna G de coluna de sub- µm A última exige sistemas de LC que são capazes de tolerar altas pressões Conclusões O potencial da cromatografia de exclusão de tamanhos para caracterização de biomoléculas é muito alto. Essa Descrição técnica demonstra vários benefícios das colunas SEC Agilent AdvanceBio para análises biofarmacêuticas em comparação às colunas SEC de outros fornecedores. Primeiro, usamos as colunas de 7, mm para separar uma gama de proteínas, monômeros mab, agregados e fragmentos. O tamanho e o volume ideais de poro da SEC AdvanceBio oferece excelente separação e capacidade de pico para agregados de monômeros e fragmentos para separações robustas e confiáveis. Para atingir melhor sensibilidade, o método foi transferido para uma coluna de, mm e comparado a colunas de, µm, Å e,7 µm, Å, que também resultaram em resolução superior. Além disso, as capacidades de pico e resolução podem ser significativamente melhoradas acoplando duas colunas em série. Isso é possível somente com as colunas SEC AdvanceBio que podem ser executadas em pressões mais baixas. Por fim, as colunas SEC AdvanceBio fornecem melhores formatos de pico e a certeza de resolver monômeros ADC e seus agregados usando a fase móvel aquosa, sem comprometer a vida útil da coluna e a integridade da amostra. 7 bar 7 bar bar SEC Agilent AdvanceBio,,7 µm, Å,, mm Outro fornecedor F,, µm, Å,, mm Outro fornecedor G,,7 µm, Å,, mm - Rs =,7 Rs =, - Rs =,7 - Figura 9. Comparação de separação de ADC em várias colunas SEC de, mm. 9
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