Universidade do Estado do Rio de Janeiro Centro de Tecnologia e Ciências Instituto de Física. Andrea Mantuano Coelho da Silva

Universidade do Estado do Rio de Janeiro Centro de Tecnologia e Ciências Instituto de Física Andrea Mantuano Coelho da Silva Avaliação da concentração de Cl, K e Ca na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus usando a técnica de fluorescência de raios X por reflexão total por radiação síncrotron (SR-TXRF) Rio de Janeiro 2012

Andrea Mantuano Coelho da Silva Avaliação da concentração de Cl, K e Ca na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus usando a técnica de fluorescência de raios X por reflexão total por radiação síncrotron (SR-TXRF) Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-graduação em Física, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Orientadora: Coorientadora: Prof.ª Dra. Regina Cély Barroso Prof.ª Dra. Patricia Azambuja Rio de Janeiro 2012

CATALOGAÇÃO NA FONTE UERJ / REDE SIRIUS / BIBLIOTECA CTC/D S586 Silva, Andréa Mantuano Coelho da. Avaliação da concentração de CI, K e Ca na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus usando a técnica de fluorescência de raios X por reflexão total por radiação síncroton (SR-TXRF) / Andréa Mantuano Coelho da Silva. 2012. 82 f.: il. color. Orientadora : Regina Cely Rodrigues Barroso. Coorientadora : Patrícia Azambuja. Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Física Armando Dias Tavares. 1.Fluorescência de raio X -Teses. 2. Espectroscopia de fluorescência -Teses. 3. Radiação sincroton -Tese. 4. Física médica - Teses I. Barroso, Regina Cely Rodrigues. II. Azambuja, Patrícia. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de de Física Armando Dias Tavares. IV. Título. CDU 535.37 Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, desde que citada a fonte. Assinatura Data

Andrea Mantuano Coelho da Silva Avaliação da concentração de Cl, K e Ca na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus usando a técnica de fluorescência de raios X por reflexão total por radiação síncrotron (SR-TXRF) Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre, ao Programa de Pós-graduação em Física, da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Aprovada em 5 de setembro de 2012. Orientadora: Coorientadora: Banca Examinadora: Prof.ª Dra. Regina Cély Barroso Instituto de Física - UERJ Prof.ª Dra. Patricia Azambuja Fundação Oswaldo Cruz Prof. Dr. Nilson Antunes de Oliveira Instituto de Física - UERJ Prof. Dr. Pedro Jorge von Ranke Perlingeiro Instituto de Física - UERJ Dr. Carlos Alberto Perez Laboratório Nacional de Luz Síncrotron Prof.ª Dra. Simone Coutinho Cardoso Universidade Federal do Rio de Janeiro Rio de Janeiro 2012

DEDICATÓRIA Dedico ao meu avô Salvatore Mantuano que sempre, enquanto esteve entre nós, foi o mais orgulhoso e amoroso avô do mundo!!! Te amo onde quer que você esteja!

AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar agradeço a Deus por me mostrar que os caminhos mais árduos são pelos quais mais aprendemos e crescemos. Agradeço a essa família perfeita que Deus me deu, minha irmã, minha segunda mãe, foi importantíssima assim como meus pais por toda a paciência e muita, mas muita ajuda em todas as madrugadas sem dormir e almoços sem comer (não é mãe?)! O meu amor Alexandre sempre fundamental na minha vida e principalmente nos meus finais de semana, para relaxar, para curtir, e para me divertir e me fazer bem! O amor cura qualquer cansaço! Aos meus amigos, que juntos nos divertimos, mas também precisamos algumas vezes perder um ou mais finais de semana para escrever um artigo, estudar para um concurso... Coisas da vida que só amigos de verdade entendem não é Felipe Leão e Camilla Lopes?! Agradeço a Professora Doutora, e mãe postiça, Regina Cely por toda a disposição de fazer dar certo, de acreditar em mim e correr atrás junto comigo dessa conquista. Obrigada por sua amizade e carinho de sempre desde a iniciação científica! Claro que... Quando crescer quero ser igual a você! Aos amigos do grupo de trabalho do Laboratório de Física Aplicada às Ciências Biomédicas e Ambientais, Lab_FisMed, porque todos, sem exceção, me ajudaram em alguma (ou muitas) etapas do meu trabalho. Em especial à Arissa Pickler, que colocou muitas horas e até dias, à minha disposição! Uma aluna (e principalmente ajudante, e como ela diz: escrava rsrs) exemplar que tem um futuro maravilhoso com certeza! Aos professores Patricia Azambuja da FIOCRUZ, Marcelo S. Gonzalez da UFF, e as alunas Marcela Figueiredo e Bianca Henriques, obrigada pelas amostras cedidas, pela mão de obra, pela amizade e confiança ao ceder livre acesso ao Laboratório de Bioquímica de insetos. À professora Simone Cardoso do Instituto de Física da UFRJ pela amizade e principalmente pelo trabalho feito conosco durante tanto tempo (inclusive às noites sem dormir no LNLS). À todos pela dedicação e empenho para a realização deste trabalho. Ao laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Projetos XRF-10959 e XRF-11776, pela oportunidade e disponibilidade de trabalharmos com seus equipamentos de alta tecnologia e assim obtermos os melhores resultados

possíveis para este trabalho. Estou realmente grata ao Dr. Carlos Alberto Perez pela atenção incessante e suporte nas medidas de fluorescência durante todo o experimento. Não poderia deixar de agradecer ao secretário do Programa de Pós graduação do Instituto de Física: Rogerio Teixeira! Esse homem sabe tudo, resolve tudo...é uma loucura! Obrigada Rogerio, você também faz parte disso! Agradeço as agências Brasileiras PAPES-FIOCRUZ, IOC-FIOCRUZ, PDTIS-FIOCRUZ, CNPq, FAPERJ e CAPES pelo apoio financeiro.

"Seja a mudança que você quer ver no mundo" Dalai Lama

RESUMO SILVA, Andrea Mantuano Coelho da. Avaliação da concentração de Cl, K e Ca na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus usando a técnica de fluorescência de raios X por reflexão total por radiação síncrotron (SR-TXRF). 2012. 82 f. Dissertação (Mestrado em Física) - Instituto de Física, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2012. Neste trabalho utilizou-se a técnica fluorescência de raios X usando radiação síncrotron (SR-TXRF) para estudar, quantitativamente, o transporte de cloro, potássio e cálcio na hemolinfa, urina e túbulos de Malpighi (TM) em ninfas de quinto estágio do Rhodnius prolixus (R. prolixus), considerando a excreção destes elementos em diferentes dias após o repasto sanguíneo. R. prolixus é um dos principais vetores do Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas. R. prolixus fornece um sistema modelo particularmente útil porque seus TMs tanto secretam quanto reabsorvem íons a taxas elevadas. Os TMs filtram a hemolinfa e secretam um líquido que é muitas vezes comparado com a urina primária em vertebrados. Os resultados obtidos mostram que a concentração de potássio na urina é substancialmente maior do que na hemolinfa. A concentração de cloro na hemolinfa é menor do que na urina, mas a diferença não é tão marcada como no caso do potássio. No caso do Rhodnius é razoável interpretar a elevada concentração de potássio na urina como adaptativo para o problema de excreção imediato do inseto. A concentração de cálcio nos TMs é substancialmente maior em comparação com os valores encontrados na hemolinfa e urina. Este resultado mostra que o cálcio é retido no corpo do R. prolixus e pouco eliminado. Os resultados obtidos estão coerentes com a literatura. Avaliou-se também o efeito no transporte de Cl, K e Ca após um repasto de sangue de coelho contaminado com HgCl2 de modo a avaliar o efeito da presença deste metal tóxico no balanço iônico nos fluidos de excreção urina e hemolinfa e também pelo principal órgão de transporte, os túbulos de Malpighi. As excreções de Cl e K pela urina são afetadas pela ingestão. Este resultado é esperado levando-se em consideração a ingestão de excesso de Cl através do HgCl2. O transporte de Cl, K e Ca na hemolinfa do Rhodnius prolixus não é afetada pela ingestão de HgCl2. Nos túbulos de Malpighi, as altas concentrações de Ca obtidas foram comparáveis àquelas encontradas nos insetos controle. Pode-se concluir que SR-TXRF é um método muito promissor para análises diretas, rápidas e confiáveis para a quantificação simultânea de elementos envolvidos na regulação do transporte e em todo o sistema excretor de insetos. Além disso, o estudo do transporte e a excreção de elementos no inseto Rhodnius prolixus abrem oportunidade para a maior compreensão de efeitos da poluição em espécies de invertebrados. Palavras-chave: Rhodnius prolixus. Túbulos de Malpighi. Excreção. Fluorescência de raios X por reflexão total. Luz Síncrotron.

ABSTRACT In this work, we investigated changes in the concentrations of Cl, K and Ca, in 5th instar Rhodnius prolixus using total reflection X-ray fluorescence with synchrotron radiation (SR-TXRF). The elements were quantified using urine, hemolymph and Malpighian tubules samples collected on different days after a blood meal. Rhodnius prolixus is one of the most important vectors of the Trypanosoma cruzi, causative agent of Chagas? disease. R. prolixus provides a particularly useful model system because its MTs both secrete and reabsorb ions at high rates. The TMs filter hemolymph and secrete a liquid that is often compared with the primary urine in vertebrates. The experimental results showed that the concentration of potassium in the urine is substantially greater than in the hemolymph. The concentration of chlorine in the hemolymph is generally less than in the urine, but the difference is not so marked as in the case of potassium. In the case of Rhodnius, it is reasonable to interpret the high concentration of potassium in the urine as adaptive to the animals? immediate excretory problem. The concentration of calcium in the TMs is substantially greater than in both the hemolymph and the urine. This result shows that that calcium is retained in the body and not eliminated. These results are in accordance with the literature. We also investigated whether dietary mercury contamination may influence the transport of Cl, K and Ca by the hemolymph, urine and Malpighian tubules of R. prolixus fed on blood containing HgCl2. The results suggested that dietary Hg contamination may influence the Cl and K contents during excretion of the urine. It was expected considering the large amounts of chlorine ingested by Rhodnius prolixus in its meals of blood containing HgCl2. Statistical analysis showed no significant variation in all elements contents for hemolymph samples. The main conclusion which can be drawn from the results is that in all the insects studied calcium is deposited in Malpighian tubules. These observations point out that the analytical approach of the SR-TXRF method can be efficiently used to measure elements involved in the transport regulation into insect Malpighian tubules and also provides useful data concerning the biological effects of pollution on invertebrate species. Keywords: Rhodnius prolixus. Malpighian tubules. Excretion. Total Reflection X-Ray Fluorescence. Synchrotron radiation.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Esquema para o efeito fotoelétrico 22 Figura 2 - Energia de ligação ou corte de absorção dos elétrons dos níveis K, L e M em função do número atômico (Z) 23 Figura 3 - Esquema para o efeito fotoelétrico para as transições entre as camadas K e L 23 Figura 4 - Exemplo de espectro de raios X característico para uma amostra de águas pluviais por SR-TXRF 24 Figura 5 - Rendimento da fluorescência das camadas K, L e M em função do número atômico (Z) 26 Figura 6 - Representação da refração e reflexão de um feixe de radiação incidindo em um material com um ângulo theta1 e refletido com um ângulo theta1r 29 Figura 7 - Representação esquemática do fenômeno de refração e reflexão 29 Figura 8 - Esquema de arranjo experimental para TXRF 30 Figura 9 - Rhodnius prolixus (5 estágio) 36 Figura 10Esquema do ciclo biológico do parasita Trypanosoma cruzi - com o inseto vetor. O inseto alimentado com sangue infectado com a forma tripomastigota os quais se transformam em epimastigotas e alguns spheromastigotes no estômago (A). No intestino, epimastigotas multiplicadas (B) população de parasitas crescendo. No reto, epimastigotas se transformam em tripomastigotas metacíclicas (C) os quais são eliminados com as fezes e a urina 36 Figura 11 Mecanismo global de excreção dos insetos - Figura 12 Túbulos de Malpighi de Drosophila - Figura 13 Mecanismo de absorção de túbulo de Malpighi e secreção - Figura 14 A formação de urina primária e secundária no sistema excretor - Figura 15Micrografias eletrônicas de cortes longitudinais através do túbulo de - Malpighi de Rhodnius prolixus com esferas de cálcio 44 Figura 16Diferentes funções em diferentes insetos que o túbulo de Malpighi - pode assumir 44 39 40 41 42

Figura 17Adaptador artificial de alimentação para o Rhodnius prolixus - Figura 18 Suportes para coleta de urina no 1º e no 2º dia após alimentação - Figura 19 Eppendorf acoplado para coleta de urina 1 e 2 dias após a - alimentação 48 Figura 20 Coleta de hemolinfa através de um capilar 2 e 5 dias após a - alimentação 48 Figura 21 Fixação do inseto no microscópio para dissecação e coleta das - amostras de túbulo de Malpighi 49 Figura 22Foto da linha D09B-XRF do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron - (LNLS) 52 Figura 23Espectro característico típico obtido para uma amostra de túbulo de - Malpighi 53 Figura 24 Curva de sensibilidade elementar para série K - Figura 25 Curva obtida para o limite de detecção para as amostras de túbulo de - Malpighi de Rhodnius prolixus 55 Figura 26Curva obtida para o limite de detecção para as amostras de hemolinfa - de Rhodnius prolixus 56 Figura 27 Curva obtida para o limite de detecção para as amostras de urinade - Rhodnius prolixus 56 Figura 28Gráfico das concentrações para as amostras de urina e túbulos de - Malpighi de Rhodnius prolixus 1 dia após o repasto sanguíneo 59 Figura 29Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa, urina e - túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 2 dias após o repasto sanguíneo 59 Figura 30Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa e túbulos - de Malpighi de Rhodnius prolixus 5 dias após o repasto sanguíneo 61 Figura 31Gráfico das concentrações para as amostras de urina e túbulos de - Malpighi de Rhodnius prolixus 1 dia após o repasto sanguíneo 64 Figura 32Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa, urina e - túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 2 dias após o repasto sanguíneo 64 Figura 33Gráfico das concentrações para as amostras de túbulos de Malpighi - de Rhodnius prolixus 1, 2 e 5 dias após o repasto sanguíneo para os insetos de controle e tratados 66 Figura 34 Gráfico das concentrações para as amostras de túbulos de Malpighi 46 47 54

- de Rhodnius prolixus 1, 2 e 5 dias após o repasto sanguíneo para os insetos de controle e tratados 67 Figura 35 Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa de - Rhodnius prolixus 2 e 5 dias após o repasto sanguíneo para os insetos de controle e tratados 68

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Concentrações para Solução Padrão 51 Tabela 2 - Comparação das concentrações elementares (mg/ml) para amostras de túbulos de Malpighi, urina e hemolinfa coletadas em diferentes dias após a alimentação 58 Tabela 3 - Comparação das concentrações elementares (mg/ml) para amostras de túbulos de Malpighi, urina e hemolinfa coletadas em diferentes dias após a alimentação com HgCl2 63

SUMÁRIO INTRODUÇÃO 14 1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 19 1.1 Espectroscopia por fluorescência de raios X 19 1.1.1 Fluorescência de raios X por reflexão total utilizando luz síncrotron (SR-TXRF) 27 1.1.2 Análise quantitativa por TXRF 33 1.1.3 Limite de detecção (LD) 35 1.2 Triatomíneos de importância médica 36 1.2.1 Rhodnius prolixus e o sistema excretor 37 2 METODOLOGIA 46 2.1 Preparação de amostras 46 2.1.1 Alimentação dos insetos 46 2.1.2 Coleta de urina, hemolinfa e túbulo de Malpighi 47 2.1.3 Procedimento de preparação de amostra para análise de SR-TXRF 49 2.2 Preparo de amostras padrão 51 2.3 Instrumentação e medidas 51 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 53 3.1 Análise por TXRF 53 3.1.1 Curva de Sensibilidade 54 3.1.2 Limite de detecção 55 3.2 Análise dos resultados 57 3.2.1 Avaliação de amostras controle 57 3.2.2 Avaliação de amostras tratadas com HgCl2 62 4 CONCLUSÃO 70 REFERÊNCIAS 73

14 INTRODUÇÃO O uso de métodos analíticos mais rápidos e precisos para análise de fluidos biológicos pode e vem proporcionando uma melhor compreensão da excreção do inseto Rhodnius prolixus e vem sendo estudado de várias formas por muitos autores ao longo dos anos (JONES, 1962,1965; BENNUN ; GOMEZ, 1997; HED 1977; VERHOEF, 1985; GIAIMIS et al., 1992; MANTUANO, 2012a, 2012b; GOMES et al., 2002). O uso potencial das técnicas de espectrometria de raios X usando radiação síncrotron vem fornecer novas soluções para problemas do tipo excreção e comportamento hormonal, elementar e imune de insetos. A Fluorescência de raios X (XRF) foi efetivamente introduzida como técnica de análise elementar na década de 50, quando os primeiros equipamentos de XRF tornaram-se disponíveis comercialmente. Estes equipamentos utilizavam um sistema de Fluorescência de raios X por dispersão de comprimento de onda (WDXRF). Nestes sistemas, os raios X característicos são selecionados, por um cristal difrator, de acordo com seus comprimentos de onda obedecendo a Lei de Bragg da difração (LACHANCE ; CLAISSE, 1995). Uma importante variante da XRF denomina-se Fluorescência de raios X por reflexão total (TXRF) a qual vem sendo utilizada principalmente para identificação de elementos traço (na faixa de µg ml -1 ) (BAUR et al, 2001; VARGA, 1999), através de suas concentrações, em amostras líquidas (da ordem de µl) e amostras sólidas (na ordem de µg) precedidas por digestão química (MISTRA et al.,2002; NASCIMENTO, 1999; STOSNACHA, 2009). Técnicas instrumentais modernas, assim como espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), espectrometria de massa com plasma acoplado (ICP-MS); e espectrometria de absorção atômica (AAS); têm sido utilizadas para a determinação de elementos traço de várias formas a partir da quantificação feita com amostras na faixa de mg. Entre as técnicas analíticas instrumentais, a TXRF é altamente atrativa porque ela permite a quantificação multielementar e não destrutiva de elementos traço e ultra-traço em pequenos volumes de amostra (5-10μL), seja em aplicações industriais, análise de contaminação em meio ambiente, caracterização elementar de amostras biológicas, entre outras (AIGINGER, 1991; PINTO et al, 2010; MEIRER et al, 2010; WOBRAUSCHEK, 2007; VON BOHLEN, 2009; KLOCKENKÄMPER, 2006; BENNUN

15 ; GOMEZ, 1996; BRADLEY et al, 2012; ESPINOZA-QUIÑONES et al, 2010; ANTOSZ et al, 2012; GREAVES, 1996). Além disso, a TXRF não é afetada pelo efeito matriz na amostra, é extremamente sensível, requer um tempo muito pequeno de preparação de amostras, tornando a análise ainda mais simples, barata e de maior facilidade de operação (TOLG ; KLOCKENKÄMPER, 1993). Rhodnius prolixus (R. prolixus), é estritamente hematófago e pertence à família Reduviidae, subfamília Triatominae ordem Hemíptera,e é um dos vetores de mais relevante importância do hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi), agente causador da doença de Chagas. A doença de Chagas, também chamada Tripanossomíase Americana, é uma doença humana tropical, que é endêmica em grandes áreas da América Central e América do sul. Entre as doenças parasitárias, a doença de Chagas é classificada como uma das mais importantes da América Latina em termos de impacto social e econômico, afetando cerca de 18 milhões de pessoas, com cerca de 100 milhões de pessoas vivendo em zonas que são consideradas de alto risco, e aproximadamente 300.000 novos casos que ocorrem todos os anos com cerca de 21.000 mortes por ano (SCHOFIELD ; GALVÃO, 2009; WHO, 2002; BARRETT, 2003; GARCIA et al, 2007). A maioria das espécies de triatomíneos encontrados nesta região são vetores potenciais para T. cruzi. As interações do T. cruzi com triatomíneos são complexas e mediadas por numerosos parasitas. O parasita circula entre os seres humanos, mamíferos domésticos e selvagens, e, insetos vetores. A infecção do inseto vetor pelo T. cruzi começa com a ingestão de uma refeição infecciosa de sangue (CASTRO et al., 2012; BARRETT, et al, 2003; MAYA, et al, 2007). Para a transmissão bem sucedida, o parasita passa por diferentes estágios de transformação no intestino do inseto vetor até que seja eliminado com as fezes e urina. O inseto vetor R. prolixus também pode ser infectado e transmitir o protozoário Trypanosoma rangeli (T. rangeli), que apesar de ser não-patogênica para humanos e animais, podem causar danos fisiológicos para o inseto vetor. Ao contrário de T. cruzi, que se desenvolve exclusivamente no intestino de seus hospedeiros invertebrados, T. rangeli inicialmente se desenvolve no intestino e depois invade a hemolinfa do inseto vetor (PAIM et al., 2012; GARCIA, 2006). O ciclo de vida do R. prolixus consiste de três fases distintas de ovo, cinco estágios de ninfa e o estágio adulto (macho ou fêmea), cujo desenvolvimento depende de uma metamorfose incompleta. A cada estádio o exoesqueleto antigo é

16 substituído por um novo, para que a muda ou metamorfose ocorra (CARCAVALLO et al, 1997) em um processo denominado muda ou ecdise (ANDERSON et al, 1973). O inseto adulto necessita também de sangue para a reprodução, sendo que para o R. prolixus um único repasto sanguíneo é suficiente para haver a ecdise ou ovipostura (GARCIA et al., 1975) O desenvolvimento adequado está diretamente relacionado à temperatura ideal (em média 27 a 30ºC). Alterações na temperatura ambiental podem acarretar anormalidades morfológicas e até mesmo a morte do inseto (AZAMBUJA et al., 1991a). Recentemente, recursos genômicos para vetores invertebrados de patógenos humanos aumentaram significativamente, e R. prolixus tem sido uma das principais espécies estudadas entre os triatomíneos. T. cruzi, a fim de completar o seu desenvolvimento no trato digestivo do R. prolixus precisa superar as reações imunes e atividade da microbiota do intestino (CASTRO et al., 2012). O R. prolixus remove a partir do seu hospedeiro mamífero um volume de sangue suficiente para aumentar o seu próprio peso em cerca de dez vezes na fase larval e de duas a três vezes na fase de insetos adultos. Neste estado intumescido, o inseto é vulnerável a predação e deve eliminar o excesso de água e sal para reduzir o seu próprio volume. Para reduzir o volume e concentrar a parte nutritiva da refeição, e, além disso, evitar a diluição da sua hemolinfa, o inseto rapidamente excreta em grande quantidade um fluido hiposmótico com grande quantidade de Sódio (MADDRELL, 1963; 2009). Uma vez que R. prolixus é capaz de ingerir uma grande quantidade de sangue, é necessário um sistema excretor eficiente para evitar a perda de componentes do sangue para a nutrição (MADDRELL, 2009). No R. prolixus, a distensão abdominal intensa causada pela ingestão de sangue ativa receptores de estiramento que induzem a liberação de hormônios diuréticos das massas gânglio torácicas e estimula o transporte rápido de água e íons através da parede do estômago para a hemolinfa e túbulos de Malpighi (TMs) (MADDRELL et al., 1991; 2004; MADDRELL ; OVERTON, 1990). O sistema de TMs é um tipo de sistema excretor osmorregulatório encontrado em alguns insetos. O sistema consiste de túbulos de ramificação que se estendem a partir do canal alimentar que absorve solutos, água e os resíduos a partir da hemolinfa circundante. A maior parte do metabolismo dos insetos é regulada tanto pelos TMs quanto pelo intestino grosso. Os TMs filtram a hemolinfa e secretam um

17 líquido que é muitas vezes comparado com a urina primária em vertebrados. A absorção de fluidos, íons e materiais residuais é denominada como urina primária e é transportada para dentro do lúmen do túbulo (DOW, 2002; COAST et al., 2002). Uma revisão abrangente do assunto pode ser encontrada em WIGGLESWORTH (1931). Um tema recorrente em estudos de TMs de insetos é a elevada taxa de transporte de íons alcançado pelos túbulos durante a diurese. Alguns elementos como Cl, K e Ca aparecem como importantes para o balanço de fluidos corpóreos, fortalecimento e sistema imune na literatura (KRISTIANSEN et al, 1997; WHITE, 1999; BRAVO et al, 2007; KRACHLER ; IRGOLIC, 1999; CORNELIS et al, 1996, 1992; BÁRÁNY et al, 2005; KUMAR et al, 2002). O fluido secretado pelo TM superior (distal) é uma mistura aproximadamente equimolar de NaCl (cloreto de sódio) e KCl (cloreto de potássio) e é iso-osmótica com a hemolinfa do inseto, mas hiperosmótica à refeição de sangue (COLLIER ; O DONNELL, 1997). O sangue a partir do qual mamíferos ou aviários se alimentam, geralmente, contém pelo menos 1,5 m mol L -1 (60 µg ml -1 ) de Cálcio (ALTMAN ; DITTMER, 1974). Alimentado, o R. prolixus parece enfrentar um excesso de Cálcio consideravelmente maior do que a maioria dos outros insetos e, de fato, do que a maioria dos outros animais (MADDRELL et al., 1991). A regulação do transporte dos TMs é um dos pontos fundamentais para a homeostase do inseto e, certamente, é importante também para a transmissão do T. cruzi (MARTINI et al., 2007). No entanto, os transportes elementares em alguns invertebrados são ainda relativamente desconhecidos. Os elementos em questão, em triatomíneos, ainda não foram previamente descritos como elementos traço importantes para a diurese a partir da alimentação de sangue. O objetivo geral deste trabalho é investigar as mudanças elementares observadas na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de R. prolixus comparados quando alimentados com sangue, e com sangue misturado a cloreto de mercúrio utilizando a abordagem analítica da técnica SR-TXRF. Neste trabalho, as análises por SR-TXRF foram realizadas na linha de luz de Fluorescência de Raios X (D09B- XRF) do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Projetos XRF-10959 e XRF- 11776). Este estudo pode ser dividido em dois objetivos específicos: 1. avaliação das possíveis variações nas concentrações elementares de Cl, K e Ca observadas na urina, hemolinfa e túbulos de Malpighi de R. prolixus após o

18 repasto com sangue de coelho (MANTUANO et al., 2012a) em função do tempo pósalimentação; e 2. avaliação das variações nas concentrações elementares de Cl, K e Ca observadas na urina e hemolinfa de R. prolixus alimentadas com sangue misturado a cloreto de mercúrio (HgCl 2 ) simulando o processo de contaminação (MANTUANO et al., 2012b). Este metal tóxico apesar de ainda muito presente na poluição de solos, água e alimentos, é muito estudado quando administrados a outros animais, e através de outras técnicas analíticas, principalmente em vertebrados (MONTSERRAT et al, 2007; MARÍA et al, 2007; WILHELM ; BLOOM, 2000; COUNTER ; BUCHANANB, 2004; POWELL, 1983; YANNAI ; SACHS, 1978) porém, pouco explorado para o R. prolixus. O método SR-TXRF, tal como aplicado no presente trabalho, provou ser bastante simples e rápido. Geralmente, em estudos de larga escala, o número de amostras investigadas pode ser da ordem das centenas, e as vantagens da técnica TXRF são realmente predominantes. Este método permite que uma pequena quantidade de amostra coletada na ordem de µl possa ser utilizada. Nossos resultados apontam que o método SR-TXRF pode ser utilizado de forma eficiente para estudar a regulação do transporte de Cl, K e Ca em fluidos de insetos R. prolixus (amostras obtidas na ordem µl) saudáveis ou contaminados com Mercúrio. Uma descrição geral do uso e as vantagens do SR-TXRF foram apresentadas por STRELI et al (2008). A SR-TXRF não consome a amostra como ocorre em outras técnicas. No próximo capítulo, serão discutidos sucintamente alguns conceitos físicos importantes para o bom entendimento deste trabalho e uma breve descrição do inseto R. prolixus e seu sistema excretor. No capítulo 2 será apresentada a metodologia utilizada para obtenção das concentrações elementares para urina, hemolinfa e túbulo de Malpighi e a preparação das amostras. Serão descritas também as características da instrumentação utilizada. Os resultados obtidos são apresentados e discutidos no capítulo 3. As conclusões estão no capítulo 4.

19 1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 1.1 Espectroscopia por fluorescência de raios X Por volta de 1890 muitos cientistas estavam pesquisando a natureza dos raios catódicos emitidos por um tubo de vidro evacuado, chamado tubo de Crookes, com dois eletrodos metálicos aos quais se aplicava uma diferença de potencial. Philipp Lenard modificou os tubos de Crookes colocando uma janela de alumínio, e colocando um anteparo fluorescente verificou que até uma distância de 8 cm ele detectava luminescência devida aos raios catódicos. Wilhelm Conrad Rontgen, professor de física da universidade de Wurzburg, na Alemanha, decidiu repetir o experimento embrulhando o tubo com um papel preto e ligando e desligando o tubo percebeu que a luminescência aparecia e desaparecia respectivamente. Percebeu então que os novos raios eram mais penetrantes que os raios catódicos e não sofriam desvio com o campo magnético. Percebeu então que esses raios tinham a capacidade de ultrapassar diferentes materiais com diversas espessuras e até líquidos. Nomeiam-se desde então esses raios desconhecidos de raios X. Após um ano da descoberta, mais de 1000 artigos tinham sido escritos por cientistas do mundo todo e Rontgen foi agraciado com o primeiro Prêmio Nobel de Física, em 1901 (OKUNO ; YOSHIMURA, 2010). Com o passar dos anos, as técnicas para utilizar esses fenômenos para a área da saúde, biológica, científica em geral se aprimorou bastante. Com o surgimento, na década de 70, de detectores de alta capacidade a fluorescência de raios X por dispersão de energia foi aperfeiçoada. Nesta técnica, os raios X interagem com os detectores e produzem pulsos eletrônicos proporcionais às energias dos raios X. Os detectores proporcionais a gás, os cintiladores sólidos de NaI(Tl) e os semicondutores de Si(Li) e Ge(Li) são os mais usados (SIMABUCO, 1993). A escolha entre os detectores semicondutores de Si(Li) e Ge(Li) deve ser feita em função da faixa de energia de interesse, sendo, normalmente, o primeiro utilizado na faixa de 1 a 50keV, e o segundo acima de 30keV, por apresentar uma maior eficiência de detecção (SIMABUCO, 1993). Dentre algumas formas de trabalhar com XRF temos as técnicas de fluorescência por dispersão em energia (ED-XRF) (NASCIMENTO et al, 1991, 1993; 1994), espectrômetros por dispersão

20 por comprimento de onda (WD-XRF), por reflexão total (TXRF), e a XRF com micro feixe (μ-xrf). A ED-XRF com relação às suas variantes: Fluorescência de raios X por reflexão total (TXRF), possui vantagens como a necessidade de quantidades diminutas de amostras (na faixa de µl), baixa radiação de fundo (background) e limites de detecção menores comparados com a ED-XRF convencional (SIMABUCO; MATSUMOTO, 2000; WOBRAUSCHEK, 2007; NASCIMENTO 1999a, 1999b; MATSUMOTO; SIMABUCO, 1999; PARREIRA et al, 1999); Microfluorescência de raios X (µ-xrf), a única variação que fornece informações sobre a distribuição elementar na amostra, também muito utilizada em áreas como a biologia e a biomedicina (PEREZ et al, 2010; LEROUGEA et al, 2010). Fluorescência de raios X por dispersão de comprimento de onda (WD-XRF), dá preferência à amostras sólidas, com tamanhos geralmente na faixa de gramas, não exige qualquer procedimento de dissolução das amostras, mas os limites de detecção são muito mais elevados, na faixa de dezenas a centenas de µgg -1 (LABRECQUE, 2004; BERTIN, 1978). Algumas diferenças fazem essas técnicas serem utilizadas para diferentes trabalhos, diferentes tipos de amostras, e diferentes tratamentos, mas a diferença básica entre elas é a geometria. Cada técnica tenta minimizar efeitos indesejados, como efeito matriz, por exemplo, e otimizar as medidas. A fluorescência de raios X (XRF) é uma técnica multielementar capaz de fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a composição elementar dos materiais sujeitos a radiação. A XRF age de forma não destrutiva, não exige preparações prévias das amostras a serem utilizadas e possui tempo curto para aquisição de dados. Esta técnica é empregada em amostras diversas como biológicas, ambientais, geológicas, industriais, entre outras. A XRF é baseada na medida das intensidades dos raios X característicos emitidos pelos elementos químicos que compõem a amostra quando devidamente excitada por uma fonte de raios X, seja por um tubo, fonte síncrotron, ou outras fontes. Quando um átomo de uma amostra é excitado, este tende a ejetar os elétrons dos níveis interiores dos átomos e, como consequência disto, elétrons dos níveis mais externos realizam um salto quântico para preencher a vacância. Cada

21 transição eletrônica constitui uma redução de energia para o elétron, e esta energia é emitida na forma de um fóton de raios X, de energia característica bem definida para cada elemento. Esta excitação ocorre quando a amostra é irradiada com um feixe de fótons de energia maior que a energia de ligação daquele elétron ligado ao átomo, alguns elétrons tendem a ser ejetados deste átomo com a instabilidade causada. Este elétron pode se tornar um elétron livre ou pode ser absorvido dentro do próprio átomo. O átomo torna-se então ionizado. De forma instantânea inicia-se então o processo de transição eletrônica de forma a preencher a vacância causada pelo elétron ejetado. Esta energia proveniente do preenchimento da vacância é igual à diferença de energia de ocupação das camadas, inicial e final, nas quais ocorre a transição, e é diretamente proporcional ao quadrado do número atômico (Z) do elemento excitado, como mostrado na equação (1) (SIMABUCO, 1993). 2 1 1 E 13,65 Z b 2 2 (1) n f n i Onde: E = energia dos raios X (ev); n i, nf = número quântico principal do nível inicial e final do salto quântico; Z = número atômico do elemento emissor dos raios X; b = constante de Moseley, com valores iguais a 1 e 7,4 para as camadas K e L, respectivamente. Logo se espera uma energia bem definida para cada elemento (Z) por isso o nome de energia característica. Este efeito de transição de camadas denomina-se Efeito fotoelétrico, como ilustra a figura 1. Para excitação da amostra normalmente empregam-se tubos de raios X, raios X ou gama que são emitidos por fontes radioativas e, mais recentemente, radiação Síncrotron.

22 Figura 1: Esquema para o efeito fotoelétrico. De modo resumido, a análise por fluorescência de raios X consiste de três fases: Excitação dos elementos que constituem a amostra; Dispersão dos raios X emitidos pela amostra; Detecção dos raios X emitidos. Por exemplo, para a emissão de energia nomeada Kα, quando o fóton emitido adquire uma energia igual ou superior à energia de ligação do elétron da camada K do material do alvo, este fóton pode interagir com o elétron dessa camada e ao quebrar a barreira de potencial do elétron naquele nível de energia, retira-o do orbital. O átomo fica então num estado chamado excitado, instável, e tende a se estabilizar preenchendo a vacância causada com um elétron da camada L. Como mencionado anteriormente, para que ocorra a transição entre dois estados quânticos, é necessário que um elétron seja liberado do átomo. Para que isso ocorra, a energia de excitação mínima deve ser igual ou superior a energia de ligação do elétron daquele orbital. Essa energia de transição eletrônica é também denominada energia de corte de absorção. Por exemplo, para um elétron do nível K o corte de absorção será E k. A figura 2 representa a energia de ligação (ou corte de absorção) dos níveis K, L e M em função dos números atômicos (Z).

23 Figura 2: Energia de ligação ou corte de absorção dos elétrons dos níveis K, L e M em função do número atômico (Z) (KANDEL ; SCHWARTZ, 1985). Então a equação (1) pode também ser escrita como: Este exemplo é ilustrado na figura 3. (2) Figura 3: Esquema para o efeito fotoelétrico para as transições entre as camadas K e L. Na passagem do elétron da camada L para a camada K, a diferença de energia E é emitida como um quantum de radiação eletromagnética de energia Kα.

Contagem/Canal 24 Tem-se então os picos discretos no espectro contínuo de raios X para cada energia característica correspondente ao elemento atingido (SIMABUCO ; MATSUMOTO, 2000), como mostra a figura 4. 10 5 Ga* 10 4 Zn Ar Ca Fe 10 3 10 2 S K Ti Cr Mn V Ni Cu 10 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Energia (kev) Figura 4: Exemplo de espectro de raios X característico para uma amostra de águas pluviais por SR- TXRF (SIMABUCO ; MATSUMOTO, 2000). A intensidade de qualquer linha espectral é proporcional ao número de átomos emitindo fótons de energias atribuídas a esta linha. Porém vários fatores devem ser levados em conta numa quantificação, como métodos de correção e efeito matriz. O efeito matriz ocorre quando as intensidades da radiação emitida não são lineares com as concentrações e surge a partir de interações de elementos da amostra. Esse efeito é menor na TXRF devido à pouca espessura da amostra (filme fino) à alta energia dos raios X normalmente utilizados na excitação (como em SR- TXRF) e devido à geometria que envolve fonte, amostra e detector. A fração da radiação incidente que leva à emissão de uma determinada linha de raios X característicos é determinada pela probabilidade de excitação, que é o produto de três outras probabilidades (LACHANCE ; CLAISSE, 1994) PE i P P P (3) nível linha fluorescência Onde: P nível é a probabilidade de que a radiação incidente retire elétrons de um dado nível quântico. Pode ser o nível K, L, M, N, etc.;

25 P linha é a probabilidade que uma determinada energia seja emitida dentro de sua série. Para um elétron retirado do nível K podemos ter as seguintes transições do nível L: K-L2 e K-L3; P fluorescência é a probabilidade de ocorrer emissão de fluorescência de raios X ao invés do processo Auger, a partir de uma transição realizada entre dois estados quânticos. A probabilidade de a radiação incidente retirar elétrons de um determinado nível está fortemente ligada com a fração da radiação que é absorvida no mesmo nível (LACHANCE; CLAISSE, 1994) O rendimento de fluorescência ω é definido como a probabilidade para que o fóton produzido seja liberado do átomo sem ser reabsorvido. Assim, ω pode ser representado como: n n s (4) p n p n n (5) s A Onde: n s é o número de fótons produzidos como fluorescência de raios X; n p é o número de fótons que são produzidos devido às vacâncias nos níveis e subniveis atômicos; n A é o número de fótons que são reabsorvidos dentro do átomo. O rendimento de fluorescência para a linha K é dado pelo número de eventos de ionização da camada k que dão origem aos raios X (n K ), para todas as linhas K, dividido pelo total de eventos de ionização da camada k (N K ) devido às transições entre os estados quânticos. Assim, tem-se: n K L nk L... n 3 2 K K (6) N N É possível obter o rendimento de fluorescência ω L para as linhas L tendo três diferentes valores: ω L1, ω L2, ω L3. O rendimento de fluorescência pode ser definido como sendo o número de raios X efetivamente emitidos em relação ao número de vacâncias produzidas em uma dada camada, representado na figura 5. k K

26 Nota-se que há um baixo rendimento de fluorescência no nível K para elementos leves (de número atômico abaixo de 20), no nível L até para os elementos de número atômico 60 e no nível M para praticamente todos os elementos (NASCIMENTO, 1999). Figura 5: Rendimento da fluorescência das camadas K, L e M em função do número atômico (Z) (KANDEL ; SCHWARTZ, 1985).

27 1.1.1 Fluorescência de raios X por reflexão total utilizando luz síncrotron (SR-TXRF) YONEDA (1963) publicou o primeiro trabalho mostrando o fenômeno da reflexão total dos raios X, e em YONEDA ;HORIUCHI (1971) utilizaram como método analítico, classificando-o de microanálise. A análise por fluorescência de raios X por reflexão total (TXRF) vem se desenvolvendo principalmente nos últimos 30 anos por ser uma poderosa ferramenta analítica com respeito à faixa de elementos possíveis a serem detectados, simplicidade de quantificação e baixo limite de detecção (SIMABUCO, 2000). Essas características tornam-se ainda mais evidentes com o uso da luz síncrotron (SR-TXRF). A análise rápida, realizada em poucos segundos, e a determinação simultânea dos elementos presentes na amostra também são características importantes da técnica. TXRF é uma técnica especialmente adequada para análise de elementos traço e ultratraços para análise de amostras diversas. É vantajosa quando comparada a outras técnicas como espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), espectrometria de massa com plasma acoplado (ICP-MS), e espectrometria de absorção atômica (AAS) por ser multielementar e de baixo custo (KLOCKEMKÄMPER et al, 2006). Em algumas aplicações, o fato de ser não destrutiva é uma importante característica a ser destacada, como em análise forense e outras investigações como as que requerem poucas quantidades de amostra. Sendo uma técnica de dispersão em energia (ED-XRF) em uma geometria de excitação em baixos ângulos, excita-se a amostra com feixes incidindo abaixo do ângulo critico do fenômeno da reflexão total, sendo perfeitamente adequada para estas investigações. Aplicações típicas incluem a análise de SR-TXRF de água potável, água de rio, água da chuva, água do mar, águas residuais, fluidos corporais, tecidos, pureza de produtos químicos (ácidos, bases, solventes, etc), óleos e graxas, aerossóis, cinzas, solos, forense e arte (objetos históricos), o estudo de camadas finas e perfis de profundidade, elementos traço e assim por diante. As aplicações atingem também o campo da medicina e amostras biológicas. Com novas técnicas e ideias é possível a modificação de propriedades físicas da radiação primária, ou seja, feixes monoenergéticos, linearmente polarizados, de alta intensidade, ou um detector de alta resolução, alta capacidade de contagem, área ou matrizes mais abrangentes de detectores, são novas perspectivas que se

28 abrem para a técnica dando espaço então a fluorescência de raios X por reflexão total utilizando luz síncrotron (SR-TXRF) (STRELI, 2003; WOBRAUSCHEK, 2007; VON BOHLEN, 2009; KLOCKENKÄMPER et al, 2006; TOLG, 1993).A fonte de excitação ótima para TXRF pode ser então um anel de armazenamento síncrotron (KLOCKEMKÄMPER et al, 2006, PÉREZ, 1999). A técnica SR-TXRF permite a análise de elementos presentes na amostra em baixas concentrações, na faixa de parte por milhão (ppm ou mg.ml -1 ) (MOREIRA et al, 2006). A base física da SR-TXRF é o fato de que a parte real do coeficiente de refração n é menor que a unidade, n é representado por: Onde os parâmetros e são o decréscimo do índice de refração e o índice de absorção, respectivamente. está relacionado com o coeficiente de atenuação de massa µ definido por: A mudança de fase e atenuação associados à distância de propagação x são dadas respectivamente por: e Onde é a intensidade incidente, é a intensidade final e o comprimento de onda. Com isso nota-se que a mudança de fase e a absorção do feixe de raios X, ao atravessar um objeto, depende de ambos, e do objeto que está sendo atravessado pelo feixe. O índice de refração do vácuo (e para aplicações práticas, do ar), é um pequeno número positivo entre 10-5 e 10-6 para materiais sólidos de interesse prático e radiação eletromagnética na região de energia dos raios X. pode ser derivado da teoria clássica da dispersão (AIGINGER, 1991): Onde Z é o número atômico do elemento, é a densidade (g/cm 3 ) do material, o comprimento de onda dos raios X (cm) e é a massa atômica do elemento (g.mol -1 ).

29 Como sugere a figura 6, a lei de refração normalmente usada leva à fórmula para o ângulo crítico como (AIGINGER, 1991): Figura 6: Representação da refração e reflexão de um feixe de radiação incidindo em um material com um ângulo Ө 1 e refletido com um ângulo Ө 1r. Logo, a teoria de SR-TXRF é baseada no fenômeno óptico de reflexão total como sugere o nome. A excitação da amostra é efetuada pela incidência do feixe de luz síncrotron por um ângulo de miliradianos. Esse ângulo está abaixo do ângulo crítico do material refletor (figura 7) quando ocorre o fenômeno de reflexão total (KLOCKEMKÄMPER et al, 1996) e o feixe primário colimado é totalmente refletido. Figura 7: Representação esquemática do fenômeno de refração e reflexão (AIGINGER, 1991).

30 Essa geometria é alcançada pelo ajuste da amostra com uma inclinação em torno de 1mrad (0,06 ) para o feixe primário (figura 8). Figura 8: Esquema de arranjo experimental para TXRF. O feixe é refletido a partir da superfície plana polida do refletor, saindo com um ângulo igual ao do feixe incidente e possui quase a mesma intensidade do feixe primário (intensidade totalmente refletida) exceto para uma pequena porção que é refratada e penetra o meio refletor. Essa onda infinitesimal perde intensidade exponencialmente uma vez que penetra mais profundamente no meio. Quanto menor a densidade do material refletor, menor a penetração da radiação no meio e mais refletido é então o feixe primário. O resultado efetivo para um experimento realizado com SR-TXRF é uma geometria de reflexão total que permite a drástica redução do espalhamento da radiação de fundo (background) no espectro obtido. A radiação síncrotron é produzida em um único acelerador, e é uma única fonte que produz faixas de energia do infravermelho aos raios X. A energia utilizada na SR-TXRF abrange uma faixa de 4 kev 25 kev. É permitida também a utilização de uma polarização linear (preferencial) no plano da órbita. O tamanho da fonte utilizada é pequeno e é determinado por um feixe de elétrons. Na SR-TXRF utiliza-

31 se larguras a meia altura na ordem de milímetros (FWHM x = 0.73 mm ; FWHM y =0.17 mm). Quanto à amostra depositada no refletor, geralmente estão em pequenas quantidades (líquidas), 1-100 μl, pipetadas no centro do refletor para posterior análise. Como resultado do processo de secagem, onde parte do líquido das amostras seca e evapora, o resíduo é distribuído irregularmente no refletor, com uma área de poucos milímetros de diâmetro formando uma amostra extremamente fina. A TXRF oferece as seguintes vantagens: Necessidade de pouca quantidade de amostra a ser coletada e mensurada (ambas na ordem de µl); Não destruição da amostra (relevante importância principalmente nas áreas médica e biológica); Se o ângulo ajustado da radiação primária está abaixo do ângulo crítico, quase 100% dos fótons incidentes são totalmente refletidos, então a radiação penetra pouco no refletor e a contribuição da radiação de fundo para o espalhamento no substrato é drasticamente reduzida; Para a geometria, é possível posicionar o detector perto da superfície refletora, onde no centro está localizada a amostra. Isso resulta em um grande ângulo sólido para a detecção dos sinais de fluorescência; O efeito matriz que afeta na intensidade da radiação emitida de uma forma não linear e surge a partir de interações de elementos da amostra, é menor na TXRF devido à espessura fina da amostra e então a pouca penetração no material refletor. Devido ao efeito matriz, outras técnicas já comparadas com a SR-TXRF necessitam da preparação de uma amostra muito similar às amostras de interesse que devem ser analisadas com o mesmo conjunto de amostras padrão. Consequentemente a quantificação elementar para outras técnicas torna-se muito mais problemática quando comparadas com a SR-TXRF a qual necessita apenas da adição de um elemento químico (monoelemento) em uma concentração conhecida na amostra padrão. Isto caracteriza um padrão interno para todos os outros elementos presentes na amostra (WOBRAUSCHEK, 2007). A relação entre intensidade e concentração na SR-TXRF apresenta-se linear para o elemento

32 considerado. O padrão interno torna-se então referência para a calibração do espectrômetro, estabiliza a curva de relação entre intensidade e concentração deixando a curva referente ao padrão interno para possível determinação da sensibilidade para cada elemento presente na amostra (curva de sensibilidade), permitindo ainda, a partir de sua concentração previamente conhecida, determinar a concentração dos elementos desconhecidos e suas intensidades em relação à intensidade do padrão interno (esta relação será apresentada no item 1.1.2 pela equação (18)).

33 1.1.2 Análise quantitativa por TXRF Na técnica de TXRF, uma alíquota de 1 a 100µL de amostra líquida, in natura ou digerida, é pipetada em um suporte e posta a evaporar. Forma-se uma amostra circular, um filme fino, com uma massa entre 10pg e 10µg, e aproximadamente 5mm de diâmetro pronta para ser analisada (MOREIRA et al, 2006). Não ocorre nenhum efeito de absorção nem se faz necessário nenhum aprimoramento como ocorre nas técnicas de ED-XRF e WD-XRF logo, não se faz necessário corrigir o efeito matriz devido a pouca espessura da amostra. Então, a análise quantitativa é descrita por: Onde = intensidade dos raios X característicos (cps) da linha K ou L do elemento ; = concentração (ppm ou µg ml -1 ) do elemento ; e = sensibilidade elementar do sistema para o elemento (cps/ppm ou cps ml µg -1 ). Como em TXRF a amostra é usualmente ultrafina, e os efeitos de matriz são desprezados, essa técnica permite a determinação simultânea da sensibilidade para vários elementos usando uma solução padrão multielementar, contendo elementos com baixas concentrações (na faixa de ppm) e energias de raios X característicos não muito próximas evitando assim a ocorrência de sobreposição de picos. Para realizar a análise quantitativa, um padrão interno é adicionado para a amostra corrigir a instabilidade do sistema como oscilações no gerador de raios X, emissão dos raios X pelo anodo, detecção dos raios X; e erros operacionais tais como o posicionamento não homogêneo das amostras. Isso tem sido feito com elementos como Ge e Ga para amostras de água e Co e Y para outros tipos de amostra. Através da equação (12) podemos estabelecer a relação entre a intensidade do elemento e o padrão interno (Ga): Fazendo:

34 e Tem-se: Onde = intensidade relativa, = intensidade do elemento na amostra; = concentração do elemento na amostra, = intensidade do padrão interno (Ga) na amostra; = sensibilidade do sistema para o elemento ; = sensibilidade do detector para o padrão interno (Ga); e = sensibilidade relativa do sistema para o elemento. Portanto, através da equação (14), obtêm-se as sensibilidades relativas (adimensionais) para o elemento. A concentração do elemento de interesse é, então, calculada usando a equação: Onde é a concentração do elemento de interesse (ppm ou mg ml -1 ); é a concentração do padrão interno (ppm ou mg ml -1 ); é a sensibilidade relativa (em relação ao elemento usado como padrão interno); é a intensidade do raio X característico (cps); e é a intensidade do padrão interno (cps). Como existe uma correlação entre as sensibilidades elementares e os números atômicos dos elementos, é possível estimar a sensibilidade para um elemento detectado na amostra e não contido no padrão interno, baseado na sensibilidade elementar dos elementos da solução padrão, e, consequentemente, para estimar a concentração do elemento na amostra (MOREIRA et al, 2005). Desta forma, a curva de sensibilidade experimental será a relação entre as sensibilidades relativas e o número atômico Z de cada elemento.

35 1.1.3 Limite de detecção (LD) O limite de detecção, LD, (cps) para cada elemento é diretamente relacionado com a intensidade do background ( ), de acordo com a equação (LADISICH et al, 1993): Desde que seja conhecido: Substituindo na equação (17): (20) Onde t é o tempo de medida, em segundos. Os limites de detecção para a técnica TXRF são menores que para a técnica convencional ED-XRF principalmente devido a baixa intensidade de radiação do background abaixo dos picos característicos; o fluxo da radiação primária utilizada para excitar a amostra é mais efetivo; e pela proximidade entre a amostra e o detector. Para os elementos de número atômico abaixo de 13 (Al), o limite de detecção é afetado pelo valor baixo do rendimento de fluorescência e coeficiente fotoelétrico, absorção dos raios X na amostra pela janela de Be (do detector), e devido ao ar atmosférico (entre a amostra e o detector).

36 1.2 Triatomíneos de importância médica Pertencentes à subfamília Triatominae, R. prolixus (figura 9), Triatoma infestans e Panstrogylus megistus são os principais insetos vetores do Trypanosoma cruzi no Continente Americano (FISTEIN ; CHOWDHURY, 1969). Figura 9: Rhodnius prolixus (5 estágio). O Trypanosoma cruzi, após intensa multiplicação no intestino médio do inseto como epimastigotas, sofre transformação para tripomastigota metacíclico, o qual pode ser transmitido para um novo hospedeiro vertebrado juntamente com as fezes durante o repasto sanguíneo (figura 10) (GARCIA et al, 2007). Figura 10: Esquema do ciclo biológico do parasita Trypanosoma cruzi com o inseto vetor Rhodnius prolixus. O inseto alimentado com sangue infectado com a forma tripomastigota os quais se transformam em epimastigotas e alguns spheromastigotes no estômago (A). No intestino, epimastigotas multiplicadas (B) população de parasitas crescendo. No reto, epimastigotas se transformam em tripomastigotas metacíclicas (C) os quais são eliminados com as fezes e a urina (GARCIA et al, 2007).

37 Rhodnius prolixus é uma espécie amplamente estudada e vem ganhando destaque na ciência ao longo dos anos por ser também vetor do Trypanossoma rangeli (BARRETT et al, 2003; MAYA et al, 2007; MELLO et al, 1999; GOMES et al, 2003), este não considerado patogênico ao homem. Esta espécie tem sido usada como modelo de estudo por vários motivos. Primeiramente, pela facilidade de manipulação e criação em larga escala. O hábito alimentar descontínuo dos triatomíenos, de uma maneira geral, tem como vantagem, o fato de que uma única alimentação sanguínea por estádio é capaz de deflagrar sincronicamente eventos fisiológicos relacionados ao seu desenvolvimento, o que culmina com a muda (ecdise) para o próximo estádio. Outra vantagem do uso do R. prolixus, é sua disposição à alimentação pela utilização de um aparato artificial, ao qual é adicionado sangue desfibrinado, contendo anticoagulante. Este comportamento permite, em curto período de tempo, o tratamento oral dos insetos com diferentes drogas e microorganismos, inclusive tripanossomatídeos, pela simples adição ao sangue alimentar. Seu ciclo de vida, no laboratório, necessita, em média, de 6 meses para completar de ovo a adulto (GARCIA et al, 2007), sendo que a longevidade desta espécie favorece os experimentos em laboratório (GARCIA et al., 1975; 1984). Outras características que tornam esta espécie interessante, é o fato que 5º estádio, após o repasto, aumenta seu peso corporal em até 12 vezes favorecendo a farta produção de urina, bem como a obtenção da hemolinfa, além da facilidade de visualização dos órgãos durante a dissecção. 1.2.1 Rhodnius prolixus e o sistema excretor Além do conhecimento de insetos sobre túbulos de Malpighi (TMs), visando o transporte de íons como Na +, K +, Cl -, hormônios, ((PANNABECKER, 1995; BRUGGE, 2002; MARTINI et al, 2007, DOW, 2008), algumas características peculiares do R. prolixus tornam esta espécie interessante como modelo de estudo mais abrangente sobre sistema excretor, tais como: Perda de água extremamente rápida a partir do sangue ingerido (com o qual são alimentados); A taxa de movimento da água através do intestino é de alguma forma corresponder à entrada nos túbulos de Malpighi. Do contrário, ocorreria uma

38 mudança drástica no equilíbrio osmótico na hemolinfa do inseto. Maddrell estudou alguns dos túbulos de Malpighi de R. prolixus e fez algumas medições (MADDRELL, 1963, 1990, 1991, 2004, 2009); O sangue humano contém uma grande quantidade de cálcio o que contribui para que R. prolixus o aloje sob a forma de cristais nos TMs (MANTUANO, 2012a; WIGGLESWORTH, 1962; 1931a); É o inseto cuja distensão do abdômen devido ao sangue ingerido, (monitorado por receptores de estiramento no abdômen) provoca a liberação de serotonina dos nervos abdominais na hemocele; A serotonina e o hormônio diurético atuam sinergicamente para regular a produção de urina primária pelos TMs. Os TMs possuem funções importantes de transporte e regulação de íons e substâncias fundamentais a sobrevivência do inseto (MADDRELL, 1963, 1968, 1990, 1991, 2004, 2009; MANTUANO, 2012a). Como seria de se esperar dada a importância da osmorregulação em um animal terrestre, os insetos desenvolveram um sistema excretor de sofisticação considerável. Análoga para os rins de vertebrados, os TMs são os órgãos excretores primários dos insetos, mas que operam de uma maneira diferente. Neste sentido, a a sua filtração baseia-se na pressão hidrostática. Nos túbulos de insetos, a força motriz para a excreção é o movimento de íons através do epitélio. Além da passagem dos fluidos pela parede do reto, os TMs trazem uma parte adicional importante na reabsorção já que regula o sal e o equilíbrio de água no inseto. A excreção é um processo em duas etapas, com a maior parte dos fluidos que passam pelo intestino grosso absorvidos e reabsorvidos pelos túbulos antes de passar para fora do corpo (figura 11).

39 Figura 11: Mecanismo global de excreção dos insetos (KLOWDEN, 2007). Seu nome é derivado de Marcelo Malpighi, o primeiro a fazer referência aos TMs como "vasa varicose" em 1669 em seu trabalho com o bicho da seda. Malpighi foi o médico do Papa e também um anatomista comparativo que usou o recéminventado microscópio para examinar também muitas outras estruturas biológicas. Sua função como órgãos excretores não foi determinada até 1815. Hoje, a maior parte do que se conhece sobre a função do TM é baseado em três insetos: Rhodnius prolixus, Aedes aegypti, e Drosophila melanogaster (CATHERINE, 1986; BEYENBACH et al, 1993; BEYENBACH ; MASIA, 2002; SANCHEZ ; O DONNELL, 2006; CHAHINE ; O DONNELL, 2009; DUBE et al, 2000). Os túbulos são derivados a partir de duas populações de células que surgem na junção do intestino médio e intestino posterior durante a embriogênese. Assim, o TM do inseto é derivado de duas populações de células diferentes, como no rim de mamíferos. Estas duas populações de células, identificadas durante o desenvolvimento, por sua expressão de fatores de transcrição, dão origem a dois principais tipos de células dos túbulos, as principais células da ectoderma e as células estreladas de mesoderme em uma proporção de cerca de 5:1. As principais células têm grandes concreções intracelulares de complexos metálicos e grandes microvilosidades contendo numerosas mitocôndrias. Eles são ativos no transporte de sódio, potássio e hidrogênio, bem como os fluidos. As células estreladas controlam o fluxo de íons cloreto e carecem de ambas as concreções, Na e K. Ambos os tipos de células podem ainda ser subdivididas em populações de células distintas que podem ser encontradas em diferentes áreas dos túbulos (WIGGLESWORTH, 1962).

40 Os túbulos maduros podem se abrir diretamente para o intestino médio, anteriormente para a válvula pilórica, ou diretamente para o intestino grosso, como tubos longos que contêm um centro oco, ou lúmen, que está fechado na extremidade distal (figura 12). As suas paredes consistem de uma única camada de células poliplóides e são diferenciados pela estrutura e função em vários tipos de células ao longo do comprimento do túbulo. Os quatro túbulos longos de Drosophila, de aproximadamente 2-mm, estão ligados ao canal alimentar em pares por meio do curto ureter (figura 12), e um dos pares ligados tem um segmento inicial alargado. Figura 12: Túbulos de Malpighi de Drosophila (WESSING ; EICHELBERG, 1978). Em insetos hematófagos, como o R. prolixus, o túbulo distal superior contém células binucleadas com microvilosidades abundantes e concreções intracelulares que são agregados de cálcio, magnésio e potássio, mas as células da parte inferior do túbulo faltam os cristais e têm microvilosidades menores. A parte superior dos túbulos secreta íons e solutos orgânicos para o lúmen, e as regiões inferiores do túbulo fazem reabsorção (figura 13).

41 Figura 13: Mecanismo de absorção de túbulo de Malpighi e secreção (BRADLEY, 1998). Na hemocele, as células dos TMs expostas à hemolinfa, são cobertas por uma membrana e uma rede de invaginações da membrana plasmática (WIGGLESWORTH, 1962, 1931b). A membrana celular que enfrenta o lúmen tubular contém uma borda com microvilosidades abundantes que são ricas em retículo endoplasmático e mitocôndrias. Essas microvilosidades aumentam a área de superfície disponível para o transporte de sal e de água entre a célula e o lúmen do túbulo. A região intermediária no interior da célula contém aparelho de Golgi, retículo endoplasmático rugoso e numerosos vacúolos. Os túbulos deitam livres na cavidade do corpo e estão rodeados por músculos longitudinais que lhes permitem participar em movimentos de contorção que aumentam o contato entre os túbulos e a hemolinfa. Em alguns insetos as extremidades distais do túbulo são fisicamente associadas com o intestino grosso, dispostos em um sistema criptonefridiano que aumenta a reabsorção de água a partir do intestino grosso (segmento terminal dos túbulos que são diretamente associados às paredes do reto). Os TMs iniciam o processo de excreção. Sua captação de fluidos, íons, e materiais residuais é denominada urina primária a qual é transportada para o lúmen dos túbulos (figura 14). O número total de túbulos varia em diferentes espécies de 2 ou mais do que 250. Esta urina primária viaja através do lúmen da

42 região distal para as regiões proximais do túbulo e depois para o canal alimentar onde se mistura com os produtos finais de digestão do intestino. Figura 14: A formação de urina primária e secundária no sistema excretor (MADDRELL, 1981). Geralmente isosmótico com a hemolinfa, a maioria dos insetos contém uma elevada concentração de K + e concentrações mais baixas de Na + do que estão presentes na hemolinfa. Além dos produtos de excreção, tais como o ácido úrico, a urina primária pode conter outros íons, açúcares e aminoácidos que são reabsorvidos mais tarde no processo de excreção. A secreção rápida pelo segmento principal em conjunto com a reabsorção que ocorre na parte inferior do túbulo e no intestino posterior, permite que resíduos metabólicos sejam apurados a partir da hemolinfa sem a perda significativa de água. De lá, a urina primária passa através do intestino grosso e do reto, onde é modificada pela reabsorção contínua pelas glândulas retais para produzir uma urina secundária que é expelida através do ânus. Em comparação com os seres humanos, em que o processo de filtração trata o volume extracelular em cerca de 12 vezes por dia, os TMs e o reto de um mosquito, por exemplo, pode filtrar seu volume extracelular até 200 vezes por dia. (KLOWDEN, 2007) As células dos túbulos de Malpighi de Rhodnius pode cada uma secretar um volume de fluido equivalente ao volume de sua própria célula a cada 15 segundos. Ideias sobre o mecanismo da formação da urina primária foram baseadas nas técnicas experimentais desenvolvidas por RAMSAY (1953).

43 Há um transporte ativo dos íons de Na/K (ATPases) para a hemolinfa, e canais iônicos permitem que íons de Cl sejam transportados passivamente. Embora insetos fitófagos transportem principalmente K, insetos hematófagos como o mosquito, transportam Na e Cl, e hematófagos hemípteros, como o R. prolixus, transportam ambos, Cl, Na e K. A V-ATPase é um transporte ativo chamado de bomba de prótons, ela regula a concentração e dirige o movimento dos íons no organismo do inseto. Substâncias de baixo peso molecular são removidas da hemolinfa se movendo através das células dos túbulos por difusão passiva. Moléculas mais pesadas como componentes tóxicos, são removidas da hemolinfa pelo transporte ativo. Ânions orgânicos também são transportados pelas células dos túbulos, permitindo-lhes dispor de inseticidas e outros componentes tóxicos indesejáveis. Para a diurese do R. prolixus, há dois fatores que a regulam: um hormônio peptídico diurético e a 5-hidroxitriptamina (5-HT), ambos atuam em sinergia para estimular a secreção de fluidos pelos túbulos após a alimentação com sangue. A 5- HT inibe a ATPase Na/K, e a inibição resultante do movimento de sódio na hemolinfa em vez de se mover para o lúmen do túbulo. Hormônios diuréticos em R. prolixus aumentam as taxas de secreção dos TMs em até 1000 vezes depois de alimentados (RAYMOND, 1974,1979; LYNDEN, 1979). Na figura 15, podemos ver algumas esferas de cálcio nos túbulos de Malpighi.

44 Figura 15: Micrografias eletrônicas de cortes longitudinais através do túbulo de Malpighi de Rhodnius prolixus com esferas de cálcio (MADDREL, 1991). Insetos diversos prevêem maravilhosos exemplos de como um tecido particular ou órgão, que é usado para uma função específica, é modificado para imprimir outra função. Seguem-se exemplos de como os TMs tornaram-se modificados para desempenhar várias funções em diferentes insetos como mostra a figura 16. Figura 16: Diferentes funções em diferentes insetos que o túbulo de Malpighi pode assumir. As principais características dos túbulos de Malpighi vem mostrar a importância deste órgão para a excreção em muitos insetos com maior atenção dada ao invertebrado R. prolixus. Muitos estudos mostram sua importância e muitos

45 trabalhos permeiam mais informações sobre a excreção de alguns insetos (MADDREL, 1968; QUINLAN et al, 1997; BERRIDGE, 1969; PANNABECKER, 1995; BRADLEY, 1983; GEOFFREY, 1997; O'DONNELL, 2000; MORGAN, 1985; NICOLSON, 1993; WIGGLESWORTH, 1931a, 1931b, 1962).

46 2 METODOLOGIA 2.1 Preparação de amostras 2.1.1 Alimentação dos insetos Foram coletadas larvas no quinto estágio de Rhodnius prolixus da colônia mantida no Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Insetos na Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. Os insetos escolhidos estavam em jejum de 15 a 20 dias. Nesta etapa separou-se metade dos insetos para amostra de controle, os quais foram alimentados apenas com sangue de coelho, e a outra metade para amostras de insetos tratados, alimentados com sangue de coelho misturado a cloreto de mercúrio na proporção de 1 µg de HgCl 2 por ml de sangue. A alimentação de ambos os grupos foi feita através de um adaptador artificial de alimentação desenvolvido no laboratório e descrito por GARCIA et al (1984) como mostra a figura 17. Figura 17: Adaptador artificial de alimentação para o Rhodnius prolixus.

47 2.1.2 Coleta de urina, hemolinfa e túbulo de Malpighi Os microtubos tipo Eppendorf utilizados para as coletas das amostras foram submetidos à lavagem para remoção dos agentes contaminantes. A lavagem foi realizada com solução aquosa de HNO 3 a 10% onde os frascos permaneceram submersos por 24 horas e depois secos a temperatura ambiente. As larvas de Rhodnius prolixus foram separadas para coleta em diferentes dias após a alimentação para amostras de urina, hemolinfa e túbulo de Malpighi, sendo um grupo de insetos utilizado para análise de urina (1 e 2 dias) e hemolinfa (2 dia); outro grupo de insetos para análise somente de hemolinfa (5 dia) e um terceiro grupo de insetos para análise dos túbulos de Malpighi (1, 2 e 5 dias). Na preparação das amostras inicialmente coletou-se a urina dos insetos no primeiro e segundo dia após a alimentação de acordo com GARCIA et al (1984) como mostra a figura 18. Figura 18: Suportes para coleta de urina no 1º e no 2º dia após alimentação. Cada inseto foi alocado em um Epperdorf com furo e acoplado dentro de um segundo Eppendorf trocado a cada dia para a coleta da urina como mostra a figura 19 (GARCIA; AZAMBUJA, 1997).

48 Figura 19: Eppendorf acoplado para coleta de urina 1 e 2 dias após a alimentação. Através da remoção de uma das patas dos insetos, e com auxílio de um capilar, coletaram-se as amostras de hemolinfa para o segundo e o quinto dia após a alimentação (figura 20). Figura 20: Coleta de hemolinfa através de um capilar 2 e 5 dias após a alimentação.

49 As amostras de túbulo de Malpighi foram coletadas a partir da dissecação dos insetos 1, 2 e 5 dias após a alimentação. A dissecação foi feita com um corte no abdômen ao longo do eixo sagital através de um estereoscópico microscópio como mostra a figura 21. Figura 21: Fixação do inseto no microscópio para dissecação e coleta das amostras de túbulo de Malpighi. Todas as coletas foram realizadas usando uma pipeta calibrada, sendo as amostras mantidas a -20 C até o momento de preparação das amostras. 2.1.3 Procedimento de preparação de amostra para análise de SR-TXRF As amostras foram preparadas tendo alíquotas de hemolinfa e urina a partir de diferentes grupos insetos, as quais foram então homogeneizadas e reunidas por meio de pipetas volumétricas e transferidas para frascos calibrados. Para as amostras dos TMs, foram digeridos quatro túbulos por Eppendorf com 100 µl de ácido nítrico puro ultra concentrado. Como o depósito da solução em um refletor é não homogêneo, ocorrem mudanças no valor da concentração de cada elemento na amostra causando variações significativas na contagem total em diferentes espectros para a mesma amostra. Sendo assim, para efetuar a análise quantitativa, um padrão interno foi

50 adicionado à amostra, a fim de corrigir a instabilidade do sistema e erros operacionais. Neste trabalho, Ga (Aldrich 84378) foi utilizado como um padrão interno a uma concentração de 8,27 µg ml -1. A concentração final de Ga para a amostra de cada um foi de 1:10 (1 parte de Ga e 9 partes de amostra). Pequenas amostras (5μL) da solução final (Ga + amostra) foram pipetadas no suporte de Perspex (poli (metacrilato de metilo) - PMMA) para a evaporação mais tarde sob uma lâmpada de infravermelho. Os valores de sensibilidade diferentes para cada elemento analisado foi determinada por meio de soluções aquosas padrões dopadas com diferentes concentrações multielementares previamente conhecidas. Limites de detecção similares foram encontrados para os tecidos analisados e estão de acordo com a literatura (PÉREZ et al, 1999).

51 2.2 Preparo de amostras padrão Para realizar a calibração do sistema de detecção, e posteriormente calcular a sensibilidade relativa, foram preparadas cinco soluções padrão contendo os elementos Na, Si, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Se, Sr, Mo e Ga. O elemento Ga foi utilizado como padrão interno. Cada solução foi preparada usando padrões monoelementares da Sigma-Aldrich. A tabela 1 apresenta os valores das concentrações, em µg ml -1, dos monoelementos e do padrão interno em cada solução padrão. Os padrões foram irradiados por 100s e os espectros obtidos foram ajustados usando o software QXAS (BERNASCONI et al, 2000). Através das relações entre as intensidades relativas medidas e as concentrções para os elementos presentes em cada solução padrão, foi possível obter as sensibilidades relativas S R para cada elemento usando a equação (3). Tabela 1: Concentrações para Solução Padrão. SOLUÇÃO PADRÃO FINAL COM Ga 8,27 µg mlˉ¹ CONCENTRAÇÕES (µg mlˉ¹) Série K Z ELEMENTO 1K 2K 3K 4K 5K 11 Na 116,55 171,53 214,99 235,69 259,74 14 Si 116,32 171,18 214,56 235,22 259,22 20 Ca 11,56 17,02 21,33 33,40 36,81 22 Ti 11,68 17,19 21,54 33,74 37,18 25 Mn 11,64 17,14 21,48 33,64 37,07 26 Fe 11,66 17,15 21,50 33,67 37,11 28 Ni 11,66 17,15 21,50 33,67 37,11 34 Se 11,66 17,15 21,50 33,67 37,11 38 Sr 11,60 17,07 21,39 33,50 36,92 40 Mo 11,67 17,17 21,52 33,70 37,14 31 Ga 8,27 8,27 8,27 8,27 8,27 2.3 Instrumentação e medidas As medidas de SR-TXRF foram realizadas na linha de Fluorescência de raios X (D09B XRF) no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas, Brasil (PÉREZ et al, 1999). Todas as medidas foram realizadas em condições normais de

52 pressão e temperatura. Todas as amostras foram excitadas com um feixe branco com energia máxima de 20 kev. Fótons fluorescentes foram detectados com um detector de Silício Si(Li) de 165 ev a 5,9 kev de resolução com uma janela de Berílio (Be) de 8 µm de espessura, 30 mm 2 de área, acoplado a um módulo amplificador e analisador multicanal. A linha de trabalho onde as medidas foram realizadas, D09B- XRF, é indicada na figura 22. Figura 22: Foto da linha D09B-XRF do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). As amostras foram excitadas por 100 segundos cada uma em triplicata, e os espectros de raios X obtidos foram processados pelo software AXIL, QXAS, distribuído pela Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA) para obter as intensidades dos raios X característicos para cada elemento e as incertezas associadas a cada um. (BERNASCONI et al, 2000) Uma das principais vantagens da TXRF com respeito à outra técnica de XRF é a fácil quantificação. Uma análise quantitativa multielementar torna-se possível depois de obtidas as intensidades dos raios X simultaneamente (PRANGE, 1989; KLOCKENKÄMPER ; VON BOHLEN, 1996).

53 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste capítulo serão apresentados os resultados obtidos pelas medidas de SR-TXRF para as amostras de urina, hemolinfa e túbulo de Malpighi para os grupos controle e tratado com HgCl 2 em diferentes dias. 3.1 Análise por TXRF No capítulo 1 item 1.1.1 descreveram-se os fundamentos da análise quantitativa para SR-TXRF. As concentrações elementares são obtidas de acordo com a equação 9 a partir da medida das intensidades dos raios X fluorescentes emitida pelo elemento i em função da sensibilidade do sistema. Para tal análise foram obtidos espectros das intensidades dos raios X característicos em função da energia através do software AXIL (BERNASCONI et al, 2000). A figura 23 mostra um espectro típico obtido para uma dada amostra de túbulo de Malpighi. Figura 23: Espectro característico típico obtido para uma amostra de túbulo de Malpighi.

Sensibilidade Relativa 54 3.1.1 Curva de Sensibilidade A figura 24 apresenta a curva de sensibilidade relativa experimental obtida para a série K, utilizando a metodologia descrita no item 2.2. Os dados experimentais foram ajustados usando o software OriginPro 8 (R 2 =0,99). S Ri = -30,15078 + 1,97876 * Z - 0,03552 * Z 2 + 9,46359 * 10-5 * Z 3 1 R 2 = 0,99514 0,36788 0,13534 0,04979 0,01832 0,00674 Experimental Ajustada 0,00248 9,11882E-4 3,35463E-4 1,2341E-4 4,53999E-5 1,67017E-5 10 20 30 40 N atômico Z Figura 24: Curva de sensibilidade elementar para série K. A precisão dos resultados e a confiabilidade dos procedimentos analíticos foram checadas com o auxílio de dois materiais de referência: Soro de ovelha Sigma S2263 (Sigma-Aldrich, origem EUA, esterilizada por filtração, cultura de células testada) e Soro humano Sigma H4522 (Sigma-Aldrich, a partir de plasma humano macho AB, esterilizada por filtração) com valores certificados de 1,81 μg ml -1 e 0,77 μg ml -1, respectivamente, para concentração de Fe. Os resultados obtidos estão em boa concordância com os valores certificados. O desvio padrão para a concentração de Fe entre repetições independentes (n = 5) foi inferior a 10% para ambos os materiais de referência.

Limite de Detecçao (ug ml -1 ) 55 3.1.2 Limite de detecção As curvas para os limites de detecção para os elementos químicos do Si ao Mo obtidas para as amostras de túbulo de Malpighi, urina e hemolinfa são apresentadas nas figuras 25, 26 e 27 respectivamente. Todas as curvas foram ajustadas usando o software OriginPro 8 através de um ajuste polinomial de terceira ordem. 148,41316 LD = 22,6369-1,45265 * Z + 0,00704 * Z 2 + 4,10767 * 10-4 * Z 3 R 2 = 0,99 54,59815 20,08554 7,38906 2,71828 1 0,36788 0,13534 0,04979 0,01832 Experimental Ajustada 10 20 30 40 N atômico Z Figura 25: Curva obtida para o limite de detecção da linha K para as amostras de túbulo de Malpighi de Rhodnius prolixus.

Limite de detecçao(ug ml 1 ) Limite de detecçao(ug ml 1 ) 56 148,41316 LD = 2,40678 + 0,76071 * Z - 0,06984 * Z 2 + 0,00127 * Z 3 R 2 = 0,96 54,59815 20,08554 7,38906 2,71828 1 0,36788 0,13534 0,04979 0,01832 Experimental Ajustada 20 30 40 N atômico(z) Figura 26: Curva obtida para o limite de detecção da linha K para as amostras de hemolinfa de Rhodnius prolixus. 148,41316 LD = 2,50637 + 0,70386 * Z - 0,06334 * Z 2 + 0,00112 * Z 3 R 2 = 0,97 54,59815 20,08554 7,38906 2,71828 1 0,36788 0,13534 0,04979 0,01832 Experimental Ajustada 20 30 40 N atômico(z) Figura 27: Curva obtida para o limite de detecção da linha K para as amostras de urina de Rhodnius prolixus. Os valores de R 2 para as amostras dos TMs, urina e hemolinfa foram respectivamente R 2 = 0,99, R 2 =0,97 e R 2 =0,96. Os valores obtidos para os LDs estão de acordo com o esperado para a técnica SR-TXRF (PÉREZ et al, 1999).

57 3.2 Análise dos resultados Foram monitoradas primeiramente, possíveis variações nas concentrações elementares em amostras de urina, hemolinfa e túbulo de Malpighi de ninfas de quinto estágio de Rhodnius prolixus após repasto com sangue desfibrinado de coelho. Essa etapa foi considerada como avaliação de amostras controle. Esses resultados foram apresentados durante o evento científico 2012 EXRS (European Conference on X-Ray Spectrometry) e submetidos para publicação no periódico X- Ray Spectrometry (MANTUANO et al, 2012a). Na segunda etapa, foram monitoradas as variações nas concentrações elementares na urina e hemolinfa causadas pela adição de HgCl 2 (1µg de HgCl 2 para 1 ml de sangue) ao sangue de coelho com o qual as ninfas de quinto estágio de Rhodnius prolixus foram alimentados. Esta etapa foi chamada de avaliação de amostras tratadas com HgCl 2. Esses resultados foram publicados em MANTUANO et al (2012b). 3.2.1 Avaliação de amostras controle A análise quantitativa foi realizada para os elementos traço Cl, K e Ca para todas as amostras. A tabela 2 apresenta os valores das concentrações (mg ml 1 ) experimentais médias obtidas e o respectivo desvio padrão. Os resultados foram analisados usando o teste-t para amostras independentes. A diferença entre as concentrações calculadas foi considerada estatisticamente significativa para P 0,01.

58 Tabela 2: Comparação das concentrações elementares (mg ml -1 ) para amostras de túbulos de Malpighi, urina e hemolinfa coletadas em diferentes dias após a alimentação. Concentração (mg ml -1 ) (valor médio ± desvio padrão) Cl K Ca Túbulos de Malpighi 1 dia (n=12) 0,40 ± 0,19 0,96 ± 0,28 11,42 ± 1,75 2 dias (n=12) 0,71 ± 0,42 1,47 ± 0,72 15,61 ± 3,03 5 dias (n=8) 1,42 ± 0,22 4,08 ± 0,48 16,22 ± 4,65 Urina 1 dia (n=54) 9,20 ± 3,47 1,84 ± 0,5 0,14 ± 0,03 2 dias (n=18) 17,88 ± 4,66 7,73 ± 1,91 0,49 ± 0,09 5 dias NC NC NC Hemolinfa 1 dia NC NC NC 2 dias (n=20) 18,65 ± 4,77 2,05 ± 0,44 2,07 ± 0,59 5 dias (n=42) 13,89 ± 3,63 1,61 ± 0,36 2,11 ± 0,38 NC - não coletado R. prolixus no seu estágio ainda jovem se alimenta de grandes quantidades de sangue chegando a ficar com o peso 12 vezes maior que o seu peso quando em jejum. Isto acelera a ação de vários sistemas que juntos permitem que o líquido excedente seja liberado e íons contidos na refeição sejam transportados para o intestino pela hemolinfa e, então, para fora da hemolinfa pela produção de urina e sua excreção em quantidades relativamente grandes pelos túbulos de Malpighi (MADDRELL, 2009). As concentrações de K e Cl são altas na urina (MADDREL, 1993) no 1 e 2 dias em comparação ao túbulo de Malpighi e a hemolinfa respectivamente (P < 0,01) (figuras 28 e 29).

59 Figura 28: Gráfico das concentrações para as amostras de urina e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 1 dia após o repasto sanguíneo. Figura 29: Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa, urina e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 2 dias após o repasto sanguíneo.

60 Imediatamente depois que o inseto é alimentado existe um período de rápida diurese pelo qual grande parte de água e sais do sangue ingerido são eliminados. Essa urina é sintetizada pela difusão de íons, carboidratos, aminoácidos, e ureia, dentro do lúmen e do segmento distal do túbulo de Malpighi seguido pela acidificação posterior e também reabsorção de água e íons no segmento proximal, localizado na junção entre o intestino médio e o intestino posterior (MADDRELL et al, 1991). Fortes similaridades são evidentes comparando a composição de diferentes conteúdos retais e de excreção em algumas espécies de triatomíneos. Apenas depois de alimentados, o ph do reto muda de ácido (6,0) para alcalino (8,5) em T. infestans (KOLLIEN et al, 2001) e R. prolixus (WIGGLESWORTH,1931a; 1931b) voltando a ser ligeiramente ácidos um dia depois. Normalmente, sulfato, fosfato e íons de potássio, dominam o conteúdo retal de T. infestans em jejum (KOLLIEN et al, 2001). Na figura 29, é visto que a concentração de K na urina é substancialmente maior que na hemolinfa (P < 0,01). A maior concentração de K na urina está inteiramente de acordo com a expectativa (RAMSAY, 1953). As primeiras gotas de excreção são principalmente uma solução de alta proporção de Na em comparação ao K considerando quantidades de carbonatos e pequenas quantidades de sulfatos e Ca (WIGGLESWORTH,1931a, 1931b). Além disso, o reto revela contagens intensas de Ca, Cl, Na e K, mas apenas traços de carbonetos, Mg e nitratos são observados. Contudo, altos níveis de carboneto foram detectados na fase inicial da diurese (MADDRELL, 1963, 1993; KLOCKENKÄMPER ; VON BOHLEN, 1996). Pode-se verificar a alta concentração de Ca nos túbulos de Malpighi em comparação com os resultados para as amostras de urina e hemolinfa, como mostram as figuras 29 e 30.

61 Figura 30: Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 5 dias após o repasto sanguíneo. Esferas de cálcio nos túbulos de Malpighi mostradas por MADDREL (1991) confirmam a habilidade dos túbulos de Malpighi de reterem o Ca, o que pode impedir o processo de reabsorção do Ca no reto (MADDRELL et al, 1990; 2004). Desta forma, a maior parte dos íons de Ca é depositada nas células do túbulo de Malpighi superior, algo é retido na hemolinfa e relativamente pouco é eliminado do corpo. Os resultados concordam em mostrar que grande parte do Ca da dieta administrada é retida no corpo do inseto.

62 3.2.2 Avaliação de amostras tratadas com HgCl 2 O mercúrio é um elemento não essencial, tóxico, e que se encontra naturalmente disseminado no ambiente (NEVADO et al, 2012) e pode ser encontrado em diferentes produtos químicos e formas físicas (MASON; BENOIT, 2003; WATRAS, C. J.; HUCKABEE, 1992). Sua utilização em atividades industriais vem contribuindo para aumentar os níveis de Hg no ambiente marinho e terrestre (BACCI, 1989; ANDRÉ et al., 1991). A química e a bioquímica do Hg em ambientes aquáticos têm sido largamente estudadas, mas o papel do Hg em animais terrestres foi negligenciado, embora a maioria do Hg total (cerca de 60%) é estimada para ser depositada em ambientes terrestres, que se torna um importante foco de transferência e bioacumulação em cadeias alimentares locais (FITZGERALD; MASON, 1996.). Como resultado, os dados sobre os níveis de espécies de Hg em animais terrestres são escassos. Ampliando o estudo do comportamento e da análise quantitativa das concentrações de alguns elementos após uma alimentação administrada ao inseto, utilizaram-se insetos alimentados com sangue de coelho. Ao sangue alimentar adicionou-se com cloreto de mercúrio (HgCl 2 ) de modo a avaliar o efeito da presença do Mercúrio no balanço iônico nos fluidos de excreção urina e hemolinfa e também pelo principal órgão de transporte, os túbulos de Malpighi. A análise quantitativa foi realizada também para os elementos Cl, K e Ca para todas as amostras. Os valores médios e seus desvios padrão para amostras de túbulo de Malpighi, urina e hemolinfa, estão apresentados na tabela 3. Os resultados desta etapa também são analisados utilizando o teste-t considerando a diferença entre as concentrações calculadas estatisticamente significativas para P 0,01.

63 Tabela 3: Comparação das concentrações elementares (mg ml -1 ) para amostras de túbulos de Malpighi, urina e hemolinfa coletadas em diferentes dias após a alimentação com HgCl 2. Concentração (mg ml -1 ) (valor médio ± desvio padrão) Cl K Ca Túbulos de Malpighi 1 dia (n=12) 0,61 ± 0,3 2,02 ± 0,5 15,96 ± 6,0 2 dias (n=12) 0,32 ± 0,2 0,88 ± 0,3 11,95 ± 3,8 5 dias (n=8) 2,31 ± 0,5 10,73 ± 1,1 14,69 ± 3,4 Urina 1 dia (n=46) 14,0 ± 6,1 1,6 ± 0,6 150 ± 45 a 2 dias (n=6) 26,5 ± 5,6 15,3 ± 2,8 23,7 ± 7,3 a 5 dias NC NC NC Hemolinfa 1 dia NC NC NC 2 dias (n=20) 19,8 ± 4,8 1,9 ± 0,4 1,9 ± 0,3 5 dias (n=36) 11,6 ± 2,1 1,6 ± 0,3 1,9 ± 0,2 a em µg ml -1 Pode-se verificar a alta concentração de Ca nos túbulos de Malpighi em comparação com os resultados para as amostras de urina e hemolinfa, como mostram as figuras 31 e 32.

64 Figura 31: Gráfico das concentrações para as amostras de urina e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 1 dia após o repasto sanguíneo. Figura 32: Gráfico das concentrações para as amostras de hemolinfa, urina e túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 2 dias após o repasto sanguíneo.

65 Este resultado concorda com aqueles obtidos para as amostras de controle. Comparando as concentrações maiores de Cl e menores de Ca do túbulo e da urina, a estatística mostra que são significativamente diferentes no 1º dia após o repasto sanguíneo com HgCl 2 (P < 0,01). Para o 2º dia, as concentrações de Cl e K não se mostraram significativamente diferentes devido aos desvios padrão altos e à pequena quantidade de amostra. Na análise estatística de comparação entre as concentrações elementares no túbulo e na hemolinfa 5 dias após o repasto sanguíneo, todas as variações mostraram diferenças significativas (P < 0,01). A tabela 3 mostra as concentrações elementares para as amostras de túbulo de Malpighi dos insetos após 1, 2 e 5 dias do repasto sanguíneo, onde todas as variações apresentaram-se significativamente diferentes (P < 0,01) quando comparadas as amostras controle (tabela 2). Comparando as concentrações elementares para as amostras de túbulos de Malpighi entre o 1º e 2º dia após a alimentação, os elementos Cl e Ca apresentaram uma redução não significativa em suas concentrações (P > 0,01) (figura 33). Para o K a redução em sua concentração elementar foi significativa (P < 0,01). Comparando o 1º e 5º dia, a análise estatística mostra que há diferença significativa para o aumento da concentração de Cl e K. A concentração de Ca não apresentou redução estatisticamente significativa (P > 0,01) (figura 33).

66 Figura 33: Gráfico das concentrações para as amostras de túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus 1, 2 e 5 dias após o repasto sanguíneo para os insetos de controle e tratados. Para as amostras de urina coletadas 1 dia após alimentação, foi verificado um aumento estatisticamente significativo para a concentração de K em comparação com o grupo controle (figura 34) (P < 0,01). Na urina de insetos tratados, o nível de Cl e Ca foram significativamente maiores em comparação ao grupo controle (P < 0,01). Uma análise similar considerando as amostras coletadas 2 dias após alimentação com metal tóxico mostra que as concentrações apresentam um aumento significativo de K em comparação com amostras de controle (P < 0,01). O nível de Cl não apresenta diferença significativa nas amostras tratadas em relação às de controle. Níveis de Ca em insetos tratados com HgCl 2 são muito menores em comparação aos de controle (figura 34) (P < 0,01).