AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PRÉ-TRATAMENTOS PARA DESCONSTRUÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PRÉ-TRATAMENTOS PARA DESCONSTRUÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA T. D. MENDES 1, T. F. PACHECO 1, F. B. P. CARVALHO 1, D. K. NAKAI 1, D. S. RODRIGUES 1, C. M. M. MACHADO 1, M. AYRES 2 1 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Agroenergia 2 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Cerrados E-mail para contato: thais.demarchi@embrapa.br RESUMO Para produção de glicose a partir da biomassa lignocelulósica e fermentação desta para produção de etanol, a celulose deve ser disponibilizada à ação enzimática por meio do pré-tratamento da biomassa. Os pré-tratamentos, além de removerem componentes indesejados como a lignina e hemicelulose, por exemplo, reduzem a cristalinidade e o grau de polimerização da celulose, facilitando o acesso da enzima. Este trabalho avaliou, para a forrageira Brachiaria brizantha cv. Marandu, sete estratégias de pré-tratamento: ácido 1,5% (v/v), ácido 1,5% seguido de básico 1,5 e 4%, ácido 1,5% seguido de organosolv sem e com catalisador básico, peróxido de hidrogênio e ácido 1,5% seguido de peróxido de hidrogênio. Após os pré-tratamentos, estes materiais foram caracterizados quanto ao teor de celulose e foram submetidos à hidrólise enzimática. A melhor estratégia observada foi de pré-tratamento ácido 1,5% seguido de básico 4% o mais eficiente, que resultou em material com 90% de celulose. A hidrólise enzimática deste material atingiu 50% de conversão da celulose em glicose em 8 horas e 95% de conversão em 72 horas. Na sequência, tem-se o ácido seguido de organosolv com catalisador básico (82% de celulose no material e 35% de conversão em 8 horas) e ácido 1,5% seguido de básico 1,5% (80% de celulose e conversão de 35% em 8 horas). Para B. brizantha a remoção quase completa de lignina é fundamental para o máximo rendimento de hidrólise da celulose utilizando complexo enzimático comercial. 1. INTRODUÇÃO O desenvolvimento de uma estratégia de produção de etanol a partir de matérias-primas lignocelulósicas (dito de segunda geração), por ser a busca por um processo que segue os preceitos de sustentabilidade e satisfaz as exigências da economia verde, cuja vigência é iminente, tem sido alvo de cada vez mais estudos, com níveis de complexidade cada vez maiores, na tentativa de esmiuçar e consequentemente solucionar os entraves que tornam a tecnologia técnica e economicamente inviável. Um dos principais problemas associados a essas matérias-primas é a necessidade de um pré-tratamento que deixe a celulose disponível para a ação dos processos enzimáticos. As propriedades dos materiais lignocelulósicos não tratados, como a rigidez estrutural conferida pela lignina, grau de acetilação da hemicelulose e o próprio grau de polimerização e

cristalinidade da celulose (cujas regiões amorfas são mais facilmente hidrolisadas), atuam como um bloqueio, impedindo o acesso das enzimas celulolíticas (SUN e CHENG, 2002). Diferentes tipos de pré-tratamento tem sido idealizados e testados para eliminar as barreiras estruturais da biomassa que prejudicam o rendimento do processo. O emprego de solução ácida, por exemplo, não tem a capacidade de remover a lignina, mas consegue hidrolisar quase a totalidade da hemicelulose presente na matéria-prima (HSU et al., 2010). O pré-tratamento com solução alcalina, por outro lado, tem como alvo a remoção de lignina, além da redução da cristalinidade da celulose, aumentando a porosidade da mesma e aumentando a superfície de contato para as enzimas (WAN et al., 2011; ZHENG et al., 2009). O tratamento com peróxido de hidrogênio tem efeito similar ao processo alcalino, no que diz respeito à remoção da lignina, e sua utilização tem se dado, principalmente, em conjunto com outros pré-tratamentos, com o intuito de maximizar a extração da mesma (CARVALHEIRO et al., 2008). Outra abordagem muito estudada, por exemplo, é a utilização de solventes orgânicos para solubilizar componentes da matéria-prima, como a lignina e a hemicelulose (PAN et al., 2006). Nesse caso, podem ser utilizados catalisadores (ácidos ou básicos, por exemplo) para potencializar a extração de determinado componente (SOARES e ROSSEL, 2011). A escolha do solvente envolve aspectos como a disponibilidade, preço e facilidade de recuperação do mesmo (KUMAR et al., 2009). Além da escolha do método de pré-tratamento, há diversas variáveis que devem ser analisadas, como a temperatura do processo, concentração das soluções, tempo de processo, para estabelecer as melhores condições para cada tratamento (CARDOSO et al., 2011). Essa análise permite evitar problemas como a formação de inibidores, derivados da degradação da matéria-prima, e a perda de celulose durante o processo, que podem diminuir o rendimento das etapas biológicas subsequentes e, em última instância, inviabilizar o processo global (JING et al., 2009). O emprego de forrageiras para produção de etanol pode representar uma alternativa para viabilização do processo, por apresentar características vantajosas como baixo teor de lignina, a não competição com a produção de alimentos ou problemas de sazonalidade. O objetivo deste trabalho, portanto, foi avaliar sete diferentes estratégias de prétratamento para a forrageira Brachiaria brizantha cv. Marandu, analisando o teor de celulose do material após o pré-tratamento e o rendimento em açúcar após a hidrólise enzimática. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material Para avaliação dos diferentes pré-tratamentos, foi empregada a forrageira Brachiaria brizantha cv. Marandu produzida nos campos da Embrapa Cerrados. Para hidrólise enzimática foi utilizado um complexo enzimático comercial Cellic CTec 2, da Novozymes, e

para fermentação alcoólica utilizou-se levedura comercial CAT-1 (cedida pela Usina Jalles Machado). 2.2. Métodos Preparo da biomassa: A Brachiaria brizantha cv. Marandu foi cominuída e seca a 70 C por 48 horas. Em seguida foi processada em moinho de facas com granulometria máxima de 2 mm. Pré-tratamento da biomassa: O material seco e moído foi pré-tratado considerando sete diferentes estratégias, com o objetivo de se avaliar a quantidade de celulose exposta e a facilidade de hidrólise de cada um. - Pré-tratamento ácido: adição de solução de ácido sulfúrico 1,5% (v/v) à biomassa, numa razão sólido/líquido de 1/10. Esta suspensão foi mantida por 30 minutos na autoclave a 121º C. Este material foi filtrado e o sólido foi então lavado com água, utilizando-se o dobro do volume de ácido empregado no pré-tratamento. - Pré-tratamento ácido seguido de básico: realizou-se o procedimento descrito anteriormente e, ao sólido lavado, adicionou-se solução de hidróxido de sódio 1,5% (m/v) numa razão sólido/líquido de 1/10. Esta suspensão foi autoclavada por 30 minutos a 121º C. Este material foi filtrado, e o sólido retirado deste pré-tratamento foi lavado com água fervente (utilizando um volume equivalente a 5 vezes o volume de hidróxido de sódio utilizado). Foi avaliada também, como outra estratégia, a utilização de solução de hidróxido de sódio 4% (m/v) seguindo o mesmo procedimento. - Pré-tratamento ácido seguido de organosolv básico: esse procedimento foi realizado conforme descrito no pré-tratamento ácido seguido de básico, entretanto a solução alcalina foi substituída por uma solução contendo NaOH 1,5% (v/v) e etanol 30% (v/v). - Pré-tratamento ácido seguido de organosolv sem catalisador: realizou-se o prétratamento ácido conforme descrito acima e, após lavagem desse material, adicionou-se, numa razão sólido/líquido de 1/10, solução constituída de 30% de etanol e 70% de água. Este material foi filtrado e o sólido remanescente lavado com água quente, na mesma proporção dos pré-tratamentos alcalinos empregados. - Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio: preparou-se uma solução de peróxido de hidrogênio 3% e, utilizando-se uma razão sólido/líquido de 1/10, incubou-se essa suspensão em shaker rotativo mantido a 30º C por 8 horas. O sólido foi então filtrado e lavado com volume de água equivalente ao dobro do volume de solução de peróxido de hidrogênio empregada. - Pré-tratamento ácido seguido de peróxido de hidrogênio: foi feito o pré-tratamento ácido segundo procedimento descrito anteriormente. Após lavagem do sólido, adicionou-se solução de peróxido de hidrogênio 7,5% numa razão sólido/líquido de 1/10 e manteve-se a suspensão em agitação magnética por uma hora a 25º C.

De todos os pré-tratamentos realizados foram retiradas frações sólidas para caracterização e determinação de umidade em estufa de secagem, a 92ºC. Foram também retiradas amostras das frações líquidas para determinação da perda de açúcares. Caracterização da biomassa: O material bruto e frações sólidas obtidas nos prétratamentos foram caracterizados segundo metodologia de hidrólise ácida adaptada de Gouveia et al. (2009), para determinação de seus componentes. Hidrólise enzimática: Os materiais pré-tratados foram submetidos à hidrólise enzimática em tampão citrato de sódio/ácido cítrico 0,1 M e ph 5,0 numa razão sólido/líquido de 1/10. Foi utilizado 30 FPU do extrato enzimático comercial Cellic CTec2 (Novozymes) por grama de substrato seco. A hidrólise foi conduzida em shaker rotativo, a 50 C e 200 rpm por 8 horas. Para a melhor estratégia observada, ou seja, aquele que permitiu maior rendimento de hidrólise em 8 horas, repetiu-se o pré-tratamento e conduziu-se a hidrólise enzimática nas mesmas condições por 72 horas. Fermentação: O material hidrolisado foi centrifugado e a fração líquida dos prétratamentos ácido seguido de básico 1,5 e 4% foram fermentados para assegurar a inexistência de inibidores. De posse da análise da concentração de glicose presente no hidrolisado, adicionou-se glicose até que a concentração final do meio atingisse 100 g/l. Não foi feita suplementação de sais no meio. O meio foi inoculado com 25 g/l em base seca da levedura comercial CAT-1. Incubou-se o meio em shaker rotativo de bancada a 31 C e 100 rpm. Foram realizadas amostragens periódicas para determinação da curva de consumo de glicose e produção de etanol. As fermentações foram conduzidas até completo consumo da glicose presente no meio. O rendimento das fermentações foi calculado com base no rendimento teórico de uma fermentação alcoólica (0,511 g de etanol por g de glicose consumida). A produtividade, grandeza cinética que expressa a velocidade média de produção de etanol, foi definida como a razão da concentração de etanol obtida pelo tempo total de fermentação, expressa em g etanol /L.h. As amostras de caracterização dos sólidos nas diferentes etapas dos pré-tratamentos, hidrólise enzimática e fermentação foram analisados por método colorimétrico de dosagem de glicose e por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia descrita por Gouveia et al. (2009), e adaptada para a análise de frações líquidas. As amostras foram diluídas e clarificadas em cartuchos C18, e em seguida foram analisadas utilizando coluna aminex HPX 87 H e detector de índice de refração. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Para atingir o máximo aproveitamento da celulose da biomassa para produção de etanol é necessário facilitar o acesso da enzima a este substrato. Neste trabalho sete estratégias de pré-tratamento foram utilizadas e os resultados são apresentados na Tabela 1, que mostra o teor de celulose em cada um dos pré-tratamentos e no material bruto, calculada segundo procedimento descrito em Gouveia et al. (2009).

Tabela 1 Porcentagem de celulose para biomassa bruta e cada um dos pré-tratamentos avaliados. Pré-tratamento % celulose Material bruto 37,29 Ácido 1,5% 53,94 Ácido seguido de básico 1,5% 80,01 Ácido seguido de básico 4% 92,36 Ácido seguido de organosolv básico 1,5% 81,69 Ácido seguido de organosolv sem catalisador 53,31 Peróxido de hidrogênio 39,95 Ácido seguido de peróxido de hidrogênio 55,77 Fica evidente que os pré-tratamentos promovem o enriquecimento do teor de celulose em comparação com o material bruto. Pode-se observar que o pré-tratamento ácido seguido de alcalino 4% resultou em um sólido com maior teor de celulose dentre os pré-tratamentos avaliados, indicando que a hemicelulose e lignina foram majoritariamente retiradas da fase sólida. Entretanto, tem a vantagem de não ser rigorosa o suficiente para que ocorra a quebra da celulose e perda da glicose nas frações líquidas. A soma da glicose perdida nos prétratamentos ácido e alcalino representa aproximadamente 0,8% da glicose obtida após a hidrólise enzimática, valor de perda aceitável do ponto de vista industrial. Nota-se que os pré-tratamentos ácido 1,5%, ácido seguido de organosolv sem catalisador, peróxido de hidrogênio e ácido seguido de peróxido de hidrogênio não promoveram o enriquecimento em celulose muito superior ao material bruto, provavelmente pela dificuldade de remoção da lignina. O pré-tratamento ácido seguido de organosolv básico 1,5%, também promoveu bom enriquecimento em celulose, porém, comparado com o prétratamento ácido seguido de básico 1,5% não elevou o teor de celulose a ponto de justificar o emprego do solvente orgânico no pré-tratamento. Entretanto, a seleção do pré-tratamento depende, além do enriquecimento de celulose, da facilidade de hidrólise enzimática. Os resultados dessa hidrólise são apresentados na Figura 1, para cada um dos pré-tratamentos avaliados.

Figura 1 - Formação de glicose na hidrólise enzimática para cada um dos pré-tratamentos avaliados A Tabela 2 mostra a porcentagem de conversão de celulose em glicose em 8 horas de hidrólise enzimática. Tabela 2 Conversão de celulose em glicose na hidrólise enzimática para os diferentes prétratamentos Pré-tratamento Conversão (%) Ácido 1,5% 32,51 Ácido 1,5% seguido de básico 1,5% 35,03 Ácido 1,5% seguido de básico 4% 46,05 Ácido 1,5% seguido de organosolv básico 1,5% 34,29 Ácido 1,5% seguido de organosolv sem catalisador 27,46 Peróxido de hidrogênio 9,25 Ácido 1,5% seguido de peróxido de hidrogênio 28,67 Pode-se observar que o pré-tratamento ácido seguido de alcalino 4%, além de fornecer maior quantidade de celulose, garante maior velocidade de conversão da celulose em glicose, ou seja, facilita a hidrólise em razão da alteração da estrutura do material lignocelulósico. Ocorre, com a remoção da hemicelulose e lignina, um aumento da área superficial acessível além da alteração da cristalinidade de celulose. Sabe-se que as microfibrilas de celulose tem regiões cristalinas e amorfas, e que o complexo enzimático hidrolisa com maior facilidade regiões amorfas. O pré-tratamento ácido seguido de alcalino reduz a cristalinidade da celulose, facilitando o ataque enzimático.

A sequência de pré-tratamento ácido seguido de alcalino 4% apresentou conversão de 46,05% em 8 horas de hidrólise enzimática, se destacando entre todos os pré-tratamentos. Para esta condição, foi feita nova hidrólise enzimática, com 72 horas, para avaliar o potencial de hidrólise da Brachiaria brizantha nessas condições. Para comparação, foi efetuada também a hidrólise enzimática do material que passou apenas pelo pré-tratamento ácido. A Figura 2 mostra a evolução dessas hidrólises enzimáticas, que foi realizada sob as mesmas condições anteriormente mencionadas. Figura 2 - Hidrólise enzimática de Brachiaria brizantha pré-tratada com ácido seguida de alcalino 4% e apenas com ácido. Para o pré-tratamento ácido seguido de alcalino 4%, obteve-se, com 72 horas de hidrólise enzimática, 87,4 g/l de glicose no meio. O potencial de formação de glicose, dado pela metodologia de caracterização, era de 92,36 g/l, ou seja, foi atingida conversão de 94,62% com a utilização da combinação de pré-tratamento ácido e alcalino. A hidrólise enzimática do material que sofreu apenas tratamento ácido atingiu 26,2 g/l de glicose, correspondente a 48,6% de conversão. Pode-se observar que, para esse pré-tratamento, a partir de 30 horas de hidrólise, não há aumento da concentração de glicose no meio, ou seja, a celulose remanescente não é hidrolisável. Tal fato ocorre porque a lignina, principal responsável pela recalcitrância de materiais lignocelulósicos à degradação enzimática, não foi removida. Para as estratégias de pré-tratamento mais eficazes (ácido, ácido seguido de básico 1,5% e 4% e ácido seguido de organosolv básico) foram conduzidas fermentações dos hidrolisados. Para isso, estes hidrolisados foram centrifugados e suplementados com glicose até que atingissem 100 g/l, tornando possível a comparação do tempo e rendimento da fermentação para cada um dos pré-tratamentos. As fermentações apresentaram perfis de consumo de glicose semelhantes, com duração aproximada de 6 horas para completo consumo do substrato. A fase Lag pode ser considerada curta, indicando rápida adaptação dos microrganismos aos meios hidrolisados. O rendimento médio em etanol das fermentações foi

de 93% com produtividade aproximada de 10 g etanol /L.h. Fica constatado que as estratégias de pré-tratamento avaliadas garantem a completa fermentação da glicose com alto rendimento em etanol. Ainda que ocorra, durante as etapas do pré-tratamento, formação de produtos inibidores de processos biológicos, as lavagens promovidas no sólido retiram grande parte destes compostos, não havendo interferência nos processos enzimáticos ou fermentativos. 4. CONCLUSÕES Fica evidente que o emprego de pré-tratamentos à biomassa lignocelulósica é indispensável para posterior hidrólise da celulose, principalmente pela remoção da lignina, diminuição do grau de cristalinidade da celulose e aumento da área superficial acessível ao ataque enzimático. Foram avaliadas sete diferentes estratégias de pré-tratamento para a biomassa lignocelulósica Brachiaria brizantha cv. Marandu e o pré-tratamento ácido seguido de básico 4% apresentou os melhores resultados dentre os avaliados. Este resultou em um material com 92,36% de celulose, sua hidrólise enzimática apresentou conversão de 94,62% da celulose em glicose em 72 horas e o processo fermentativo forneceu 93% do rendimento teórico de produção de etanol. Dentre as estratégias avaliadas foi possível estabelecer uma adequada à biomassa proposta. A utilização de Brachiaria Brizantha é, inclusive, uma nova abordagem para a produção de etanol celulósico, visto que não foram encontrados relatos na literatura para de sua aplicação para a produção de etanol. 5. REFERÊNCIAS CARDOSO, W. S.; SANTOS, F. A.; MOTA, C. M.; TARDIN, F. D.; RESENDE, S. T.; QUEIROZ, J. H. Pré-tratamentos de biomassa para produção de etanol de segunda geração. Revista Analytica, v. 56, p. 64-76, 2011. CARVALHEIRO, F.; DUARTE, L. C. e GÍRIO, F. M. Hemicellulose biorefineries: a review on biomass pretreatments. Journal of Scientific & Industrial Research, v. 67, p. 849-864, 2008. GOUVEIA, R.; NASCIMENTO, R. T.; SOUTO-MAIOR, A. M; ROCHA, G. J. M. Validação de metodologia para a caracterização química de bagaço de cana-de-açúcar. Química Nova, v. 32, n. 6, 2009. HSU, T.; GUO, G.; CHEN, W.; HWANG, W. Effect of dilute acid pretreatment of rice straw on structural properties and enzymatic hydrolysis. Bioresource Technology, v. 101, p. 4907-4913, 2010. JING, X.; ZHANG, X.;BAO, J. Inhibition Performance of Lignocellulose Degradation Products on Industrial Cellulase Enzymes During Cellulose Hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol., v. 159, p. 696 707, 2009.

KUMAR, P., BARRETT, D. M., DELWICHE, M. L J. E.; STROEVE, P. Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Ind. Eng. Chem. Research., v. 48, p. 3713-3729, 2009. PAN, X.; GILKES, N.; KADLA, J.; PYE, K.; SAKA, S.; GREGG, D.; EHARA, K.; XIE, D.; LAM, D.; SADDLER, J. Bioconversion of hybrid poplar to ethanol and co-products using an organosolv fractionation process: optimization of process yields. Biotechnol. Bioeng., v. 94, p. 851-861, 2006. SOARES, P. A.; ROSSELL, C.E.V. Conversão da Celulose pela Tecnologia Organosolv. São Paulo: NAIPPE/USP, vol. 3, 29p. SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: A review. Bioresource Technol., v. 83, p. 1-11, 2002 TAHERZADEH, M. J.; KARIMI, K. Enzymatic-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review. BioResources. v. 2, p. 707-738, 2007. WAN, C.; XHOU, Y.; LI, Y. Liquid hot water and alkalinepretreatment of soybean straw for improving cellulose digestibility. Bioresource Technology, v. 102, p. 6254-6259, 2011. ZHENG, Y.; PAN, Z. e ZHANG, R. Overview of biomass pretreatment for cellulosic ethanol production. Int J Agric & Biol Eng, v. 2(3), p. 51-68, 2009.