INVESTIGAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DE INÓCULO NO CRESCIMENTO CELULAR DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁTICAS M.D. Rosolen 1, F. Bordini 2, A. M. Fiorentini 3, W.P. Da Silva 4, S. Pieniz 5 1-Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: 96010-900 Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) 3275-7284 e-mail: michele.dutra@gmail.com 2- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: 96010-900 Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) 3275-7284 e-mail: fernandawbordini@gmail.com 3- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: 96010-900 Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) 3275-7284 e-mail: angefiore@gmail.com 4- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: 96010-900 Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) 3275-7284 e-mail: wladimir.padilha2011@gmail.com 5- Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Pelotas CEP: 96010-900 Pelotas RS Brasil, Telefone: 55 (53) 3275-7284 e-mail: nutrisimone@yahoo.com.br RESUMO O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da concentração inicial de inóculo na curva de crescimento celular de Lactococcus lactis subsp. lactis e Pediococcus pentosaceus. Os inóculos foram padronizados e uma alíquota de 2, 3 e 5% foram adicionados em frascos contendo caldo MRS e avaliadas quanto ao número de células viáveis (UFC.mL -1 ) por 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h. Os resultados mostraram que para L. lactis a concentração de 3% obteve os melhores resultados na contagem de células viáveis, quando comparado com as concentrações 2 e 5% (p<0,05). No entanto, para P. pentosaceus as diferentes concentrações não apresentaram diferenças significativas entre si. Portanto, conclui-se que a concentração de inóculo inicial apresentou efeito significativo na contagem de células viáveis para L. lactis, diferentemente de P. pentosaceus sob as condições avaliadas. ABSTRACT The aim of the study was to evaluate the effect of initial inoculum concentration on the cell growth of Lactococcus lactis subsp. lactis and Pediococcus pentosaceus. The inoculums were standardized and a 2, 3 and 5% aliquot were added in containing MRS broth and evaluated for viable cell number (CFU.mL -1 ) for 2, 4, 6, 8, 12 and 24 h. The results showed that for L. lactis the concentration of 3% obtained the best results in counting viable cells, when compared with the concentrations 2 and 5% (p <0.05). However, for P. pentosaceus the different concentrations did not present statistically significant differences. Therefore, it was concluded that the initial inoculum concentration had a significant effect on the count of viable cells for L. lactis, unlike P. pentosaceus under the conditions evaluated. PALAVRAS-CHAVE: curva de crescimento; Lactococcus lactis; Pediococcus pentosaceus KEYWORDS: cell growth; Lactococcus lactis; Pediococcus pentosaceus 1. INTRODUÇÃO
Bactérias ácido láticas (BAL) compreendem um grupo de micro-organismos Gram-positivos, geralmente não formadores de esporos, não-móveis, na forma de cocos ou bacilos e anaeróbios facultativos. Os gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus e Streptococcus são importantes membros deste grupo (Shokryazdan, 2017). Alguns destes são utilizados em processos industriais por serem reconhecidos como seguros e estáveis nos processos fermentativos. No entanto, a descoberta de novos isolados de diferentes matrizes alimentares é de grande interesse para a indústria de alimentos e para a comunidade científica, tendo em vista que podem conferir diferentes atributos tecnológicos e sensoriais quando aplicado em alimentos (Gupta e Baja, 2017). Lactococcus lactis está envolvido na fabricação de diversos produtos lácteos, tanto artesanais, quanto industriais como queijo, manteiga e nata. O seu principal papel na produção de lácteos como cultura iniciadora é proporcionar ácido lático a uma taxa eficiente durante a fermentação do leite. Além da acidificação, é responsável por contribuir para o sabor dos produtos lácteos, devido à sua capacidade de produzir diacetil e acetoin. Além disso, está envolvido na segurança microbiana, com alta produção de ácido lático, mas também de agentes antimicrobianos como bacteriocinas. Em função da crescente demanda de produtos com uma ampla gama de novas propriedades organolépticas tem-se impulsionado a investigação sobre a biodiversidade das espécies (Bali et al., 2016). Além disso, Pediococcus pentosaceus é uma das principais espécies utilizadas na produção de pediocina, tendo em vista que essa bacteriocina pode ser aplicada como bioconservante em alimentos. Atualmente, este micro-organismo é comercializado como cultura protetora contra bactérias comuns de deterioração em alimentos. Consequentemente, a aplicação de tais culturas pode contribuir para a melhora da qualidade e dos atributos sensoriais dos alimentos, considerando sua atividade antimicrobiana (Porto et al., 2017). Sendo assim, algumas BAL possuem a capacidade de produzir moléculas biologicamente ativas, garantindo ao produto final um valor nutracêutico, ou até mesmo, quando ingeridos vivos produzirem um efeito metabólico positivo na saúde do consumidor, e assim serem classificados como probióticos. Para isso, deve-se levar em consideração que é indispensável oferecer às BAL, durante os processos tecnológicos, condições ideais para a sua multiplicação. Além do mais, conhecer os fatores que influenciam no processo como temperatura ótima, concentração de inóculo, meio de cultivo, dentre outros fatores, são de grande importância para otimização do processo (Linares et al., 2017). Cabe salientar, que a curva de crescimento microbiano é uma ferramenta de grande importância, haja visto que permite estimar o número de células viáveis, em um determinado meio de cultura, por unidade de tempo, auxiliando os estudos relacionados com os micro-organismos de interesse. Com isso, possibilita a caracterização de parâmetros inerentes de uma população sob determinadas condições (Alves e Guimarães, 2010). Tendo em vista que a concentração de inóculo pode influenciar o ph, acidez do meio, contagem de células viáveis dentre outras variáveis, e que diferentes micro-organismos podem apresentar comportamentos distintos quando submetidos às mesmas condições de incubação (Wardani et al., 2017), o objetivo foi avaliar o efeito da concentração inicial de inóculo na contagem de células viáveis de Lactococcus lactis subsp. lactis (L. lactis) e Pediococcus pentosaceus (P. pentosaceus).
2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Micro-organismos As amostras de L. lactis e P. pentosaceus foram obtidas da coleção em estoque do Laboratório de Nutrifisiogenômica da Faculdade de Nutrição e do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, respectivamente. Os micro-organismos foram devidamente identificados pelo 16S rrna sendo o L. lactis isolado de queijo ricota e o P. pentosaceus de presunto cozido. 2.2 Condições de cultivo Os isolados previamente armazenados em glicerol a 80 ºC foram pré-incubados em meio de cultura seletivo caldo de Man Rogosa and Sharp (MRS) (Merck, USA) a 37 ºC por 24 h a 120 rpm. Após, foram estriados por esgotamento em placas contendo ágar MRS, a fim de se obter culturas puras. 2.3 Determinação de células viáveis A contagem de células viáveis foi realizada por meio de diluição seriada em peptona bacteriológica 0,1%. A viabilidade celular foi verificada pela técnica de drope plate em ágar MRS, incubadas em jarras de anaerobiose a 37 ºC por 48 h. 2.4 Padronização do inóculo e curva de crescimento Para a curva de crescimento seguiu-se metodologia realizada por Eckert (2016), com algumas modificações. Uma colônia isolada foi reinoculada em meio MRS líquido e novamente incubados a 37 ºC por 24 h a 120 rpm. A concentração de inóculo foi estimada baseada no número de unidades formadoras de colônias em placas contendo ágar MRS a 37 ºC por 48 h de incubação em jarras de anaerobiose. Os inóculos foram padronizados e uma alíquota de 2, 3 e 5% foram adicionadas em frascos contendo caldo MRS e avaliadas quanto ao número de células viáveis (UFC.mL -1 ) por 2, 4, 6, 8, 12 e 24 h. 2.5 Análise estatística Os resultados das análises de todos os experimentos foram calculados a partir da média de experimentos independentes. Os dados foram analisados utilizando a análise de variância (ANOVA) com auxílio do programa GraphPad Prism 7.0, tomando como base os níveis de significância maiores que 95% (p< 0,05). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Figura 1 estão relacionadas as curvas de crescimento para os micro-organismos L. lactis (a) e P. pentosaceus (b) com diferentes concentrações iniciais de inóculo 2, 3 e 5% (v/v) durante 24 h de incubação. Verificou-se que ambos os isolados apresentaram um perfil de crescimento semelhante,
não ultrapassando uma concentração de células viáveis de 8,75 log UFC.mL -1 em 24 h. No entanto, pode-se observar ainda que L. lactis e P. pentosaceus atingiram a fase estacionária em 6 e 12 h de incubação, respectivamente. As células microbianas possuem um padrão de crescimento que reflete as suas adaptações às diferentes condições, representado por meio da curva de crescimento. Dessa forma, é possível controlar as fases em que as células serão utilizadas e assim otimizar o processo de fermentação (Alves e Guimarães, 2010). Figura 1- Concentração de células viáveis (log UFC.ml -1 ) de L. lactis (a) e P. pentosaceus (b) a partir de diferentes concentrações iniciais de inóculo (2, 3 e 5%) em 24 h de incubação a) b) Os resultados encontrados foram semelhantes aos de Agresti (2014) em que o crescimento máximo foi de 9,0 log UFC.mL -1 após 24 h de fermentação de diferentes linhagens de Lactococcus lactis. Já P. pentosaceus, no estudo de Pinto (2017), após 48 h de incubação apresentou uma concentração de células viáveis de 9,5 log UFC.mL -1. Cabe salientar que o metabolismo, a velocidade de crescimento e o desenvolvimento das bactérias é estirpe dependente, mas ainda assim sofre diretamente a influência do ambiente, como a concentração de células iniciais, temperatura, agitação e fonte de energia (Linares et al., 2017). Com relação a concentração de inóculo inicial, avaliou-se o efeito na contagem de células viáveis de ambos isolados em 24 h de incubação conforme demonstrado na Tabela 1.
Tabela 1 Efeito da concentração de inóculo na contagem de células viáveis (log UFC.mL -1 ) de L. lactis e P. pentosaceus após 24 h de incubação a 37 0 C a 120 rpm Concentração de inóculo (%) L. lactis P. pentosaceus ---- log UFC.mL -1 ---- 2 7,41 ± 0,11 b 8,41 ± 0,20 a 3 8,44 ± 0,06 a 8,75 ± 0,06 a 5 7,54 ± 0,16 b 8,64 ± 0,40 a a,b Letras diferentes representam diferenças significativas (p<0,05) para os valores da mesma coluna. Para o L. lactis a concentração de 3% obteve os melhores resultados na contagem de células viáveis, quando comparado com as concentrações 2 e 5% (p<0,05). No entanto, para P. pentosaceus as concentrações de 2, 3 e 5% de inóculo não apresentaram diferenças entre si. Wardani et al (2017) estudaram o efeito da concentração de inóculo no crescimento celular de Lactobacillus plantarum e verificaram que o aumento da concentração de inóculo de 1% para 5%, após 20 h de incubação aumentou o número de células viáveis significativamente. 4 CONCLUSÕES Tendo em vista a importância de conhecer os fatores que podem afetar a atividade metabólica de cada micro-organismo, pode-se concluir que a concentração de inóculo apresentou diferentes respostas quando aplicadas nos isolados estudados. Para L. lactis a concentração de 3% (v/v) apresentou os melhores resultados na contagem de células viáveis ao longo de 24 h de incubação. Para P. pentosaceus a concentração de 2, 3 e 5% não apresentou diferença significativa no crescimento microbiano sob as condições avaliadas. Sendo assim, pode-se inferir que diferentes estirpes podem apresentar diferentes comportamentos quando submetidas às mesmas condições de ensaio. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agresti, P. M. (2014). Utilização de uma linhagem invasiva de Lactococcus lactis como veículo para a entrega de um plasmídeo vacinal codificando o antígeno Ag85A de Mycobacterium tuberculosis a células mamíferas e avaliação do perfil de resposta imunológica gerado em modelo murino. (Tese de doutorado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. Alves, E. A.; Guimarães, A. C. R. (2010). Cultivo celular. Fiocruz. Bali, V.; Panesar, P.S.; Bera, M.B.; Kennedy, J.F. (2016). Bacteriocins: Recent trends and potential applications. Critical Rewiews in Food Science and Nutrition, 56, 817 834. Eckert, C. (2016). Bactérias láticas: avaliação da resistência ao trato gastrointestinal simulado e encapsulamento com soros lácteos (Dissertação de mesrado). Universidade do Vale do Taquari, Lajeado. Gupta, M., Bajaj, B. K. (2017) Characterization of Potential Probiotic Lactic Acid Bacteria Isolated from Kalarei and Development of Probiotic Fermented Oat Flour. Probiotics & Antimicrobial Proteins, 75, 1-8.
Linares, D., M., Gómez, C., Renes, E., Fresno, J. M., Tornadijo, M. E., Ross, R. P., Staton, C. (2017). Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria with Potential to Design Natural Biofunctional Health- Promoting Dairy Foods. Frontiers in Microbiology, 8(846), 1-11. Pinto, G. D. A. (2017). Capacidade de degradação do agrotóxico clorpirifós por bactérias láticas. (Dissertação de mestrado). Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. Porto, M. C. W., Kuniyoshi, T. M., De Azevedo, P. O., Vitolo, M., Oliveira, R. P. S. Lactococcus spp.: An important genus of lactic acid bacteria and pediocin producers. (2017). Biotechnology Advances, 35(3), 361-374. Shokryazdan, P., Jahromi M. F., Liang, J. B., Ho, Y. W. (2017). Probiotics: From Isolation to Application. Journal of the American College of Nutrition, 36(8), 666-676. Wardani S. K., Cahyanto, M. N., Rahayu, E. S., Utami, T. (2017). The effect of inoculum size and incubation temperature on cell growth, acid production and curd formation during milk fermentation by Lactobacillus plantarum dad 13. International Food Research Journal, 24(3), 921-926.