DETECÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA POR FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS À Costus spiralis (jacq) Roscoe (Costaceae) Nome dos autores: Geovanka Marcelle Aguiar Leão 1 ; Profa. Dra. Juliana Fonseca Moreira da Silva 2 ; 1 Aluno do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; e-mail: geovankamarcelle@hotmail.com/geovankamarcelle@gmail.com PIVIC/UFT 2 Orientador(a) do Curso de Medicina; Campus de Palmas; e-mail: julianafmsilva@mail.uft.edu.br RESUMO Fungos endofíticos habitam o interior das plantas sem causar-lhe danos, sendo encontrados em órgãos e tecidos vegetais como folhas e ramos. Os pressupostos da interação endófito-planta hospedeira sugerem que as propriedades terapêuticas podem estar no fungo e não na planta ou, provavelmente, na interação entre ambos; por isso é crescente o interesse por endófitos de plantas medicinais. A bactéria gram-positiva Streptococcus pneumoniae e a gram-negativa Klebsiella pneumoniae são bactérias patogênicas importantes, já que atuam como agentes de infecções, incluindo doenças respiratórias e infecções hospitalares. Este trabalho teve como objetivo a obtenção de compostos voláteis de fungos endofíticos isolados da planta medicinal Costus spiralis (jacq) Roscoe (Costaceae) e a avaliação antibacteriana dos mesmos contra S. pneumoniae e K. pneumoniae. O teste de verificação de substâncias voláteis foi realizado utilizando placas de Petri com remoção da faixa do ágar da porção central, a fim de evitar o efeito de difusão. Foi inoculado, em lados opostos da placa, o endofítico e o patógeno e as placas foram seladas com parafilme. Os controles negativos foram realizados com a inoculação de cada patógeno no meio de cultura sem o antagonista, sendo que não foi constatada a inibição do crescimento dos patógenos incubados na presença do endofítico teste, comparando-se com o controle. Desse modo, a descoberta de novos antibióticos se faz importante devido o Página 1
aparecimento de patógenos resistentes, bem como a evolução de novas doenças e a toxicidade de medicamentos que já existem. Palavras-chave: Fungos endofíticos, plantas medicinais, compostos voláteis. INTRODUÇÃO A utilização de fungos endofíticos como produtor de compostos voláteis bioativos, demonstrou ser promissora ao combate de uma ampla gama de patógenos fúngicos e bacterianos de plantas e humanos (STROBEL, 2002;) Dentre tantas plantas medicinais a escolhida para estudo deste é a Costus spiralis (Jacq.) Roscoe, espécie denominada popularmente de cana do brejo tem sido usada na medicina popular brasileira. Alguns estudos têm confirmado estas propriedades medicinais (VIEL et al., 1999; ANTUNES et al., 2000; SILVA & PARENTE, 2004), evidenciando a importância do conhecimento de sua biologia reprodutiva para sua conservação e manejo. Tendo em vista a utilização dos compostos bioativos adquiridos dos fungos presentes na planta Costus spiralis, o trabalho teve como objetivo a utilização destes como inibidores dos patógenos de importância médica Streptococcus pneumoniae (Gram positiva) e Klebsiella pneumoniae (Gram negativa) que são as causas mais comuns de pneumonia bacteriana e infecção hospitalar. Portanto o referente projeto se deseja detectar fungos produtores de compostos voláteis com poder antibacteriano. MATERIAL E MÉTODOS a) Obtenção e reativação dos fungos endofíticos Os fungos endofíticos associados à Costus spiralis (jacq) Roscoe (Costaceae) foram obtidos na Coleção de Cultura Carlos Augusto Rosa do Laboratório de Página 2
Microbiologia Geral e Aplicada da Universidade Federal do Tocantins UFT. Os microrganismos foram reativados em Agar Batata Dextrose (MERCK) após a reativação foram incubados a 28C por aproximadamente 7 dias. b) Reativação dos patógenos A bactéria K. pneumoniae (ATCC 13883) foi reativada do meio de cultura BHI (Brain Heart Infusion KASVI) e S. pneumoniae (ATCC 49619) em meio de cultura Ágar sangue adicionando sangue de carneiro ao meio. Esses patógenos foram utilizados como microrganismos alvo na triagem de fungos endofíticos para a produção de substâncias inibidoras. Os isolados foram armazenados em 15% de glicerol a -80ºC. c) Teste de antagonismo Os fungos endofíticos foram testados quanto à produção de substâncias voláteis contra os patógenos: K. pneumoniae (ATCC 13883) e Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619). Foi utilizado placas com divisórias e inoculado, em lados opostos da placa, o endofítico no meio BDA (MERCK) o patógeno S. pneumoniae em Ágar sangue e K. pneumoniae no meio do meio de cultura MacConkey (KASVI) com o grau de turbidez de 0,5 de acordo com a escala de Mac Farland. As placas foram seladas com parafilme e incubadas na BOD a 30 C. Os controles negativos foram realizados com a inoculação de cada patógeno no meio de cultura sem o antagonista, sendo que a inibição do crescimento foi constatada quantificando-se colônias formadas do patógeno incubado na presença do endofítico teste, comparando-se com o controle. Todos os testes foram realizados em triplicata. As leituras foram realizadas mensurando as unidades formadoras de colônias (UFC) das bactérias testadas com 24 horas de crescimento. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os estudos de antagonismo por compostos voláteis (COV) não é tão frequente na literatura quando comparado aos testes de metabólitos difusíveis (PIMENTA et al., Página 3
2012). Dos 281 isolados testados nenhum inibiu o patógeno teste, comparando-se com o controle. No ágar MacConkey, a bactéria K. pneumoniae produz colônias róseas, brilhantes, com aspecto elevado e de consistência mucoide. As colônias formadas são grandes devido à cápsula mucoide polissacarídica (Antígeno K) que protege contra a fagocitose por granulócitos, contra a ação de fatores bactericidas do soro e ainda tem função de auxiliar na aderência (MARTÍNEZ et al., 2004). No meio de cultura contendo sangue de carneiro, a S. Pneumoniae formam colônias circundadas por um halo esverdeado de hemólise parcial ou hemólise alfa. A cápsula é o principal fator de virulência destas bactérias, protegendo-as da fagocitose e do reconhecimento pelo sistema imunológico, assim permitindo a sua sobrevivência, multiplicação e disseminação para vários órgãos (ANVISA). No teste da K. pneumoniae não foi constatada inibição, provavelmente pela virulência da bactéria, que são resistentes a antibióticos. Essa característica pode estar diretamente relacionada com o uso indiscriminado ou incorreto de antibióticos. A S. Pneumoniae vem sendo estudada por vários pesquisadores tentando identificar o motivo da resistência antimicrobiana desse patógeno, e por ser uma bactéria resistente a antibióticos, mostra que não foi constatada inibição pelo teste de composto volátil. Trabalho publicado por BRANDILEONE e colaboradores mostrou que a maioria das cepas de S. pneumoniae isoladas de infecções invasivas de crianças provenientes de três capitais brasileiras (São Paulo, Recife e Belo Horizonte) foi suscetível à penicilina, sendo que 20% apresentaram resistência intermediária, com apenas 1,4% de resistência elevada. Página 4
LITERATURA CITADA ANTUNES, A.S.; SILVA, B.P; PARENTE, J.P. Flavonol glycosides from leaves of Costus spiralis. Fitoterapia, v.71, p.507-510, 2000. ANVISA modulo 4 Gram-positivos. Streptococcus pneumoniae. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4 /intr_stre.htm BRANDILEONE MC, VIEIRA VS, CASAGRANDE ST, ZANELLA RC, GUERRA ML, BOKERMANN S, ET AL. Prevalence of serotypes and antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae stains isolated in Brazilian children with invasive infections. Microbiol Drug Resist 1997;3(2):141-6. MARTÍNEZ-MARTÍNEZ L, HERNÁNDEZ-ALLÉZ S, ALBERTÍ S, TOMÁS JM, BENEDI VJ, JACOBY GA. In vivo selection of porin deficient mutants of Klebsiella pneumoniae with increased resistance to cefoxitin and expanded spectrum cephalosporins. Antimicrob Agent Chemother 1996; 40:342-8. PIMENTA, R. S.; SILVA, J. F. M. ; BUYER, J. S. AND JANIEWICZ, W. J. Endophytic Fungi from Plums (Prunus domestica) and Their Antifungal Activity against Monilinia. Journal of Food Protection, v.75, n.10, p.1883-1889, 2012. SILVA, B.P; PARENTE J.P. New steroidal saponins from rhizomes of Costus spiralis. Zeitschrift fur Naturforschung, Section C: Journal of Biosciences, v.59, p.81-85, 2004. STROBEL, G.A. Rainforest endophytic and bioactive products. Critical Reviews in Biotecnology, v.22, p.315-333, 2002. VIEL, T.A., DOMINGOS, D.C., SILVA, A.P.M., LIMALANDMAN, M.T.R., LAPA,A.J. & SOUCCAR, C. 1999. Evaluation of the antiurolithiatic activity of the Página 5
extract of Costus spiralis (Jacq.) Roscoe in rats. Journal of Ethnopharmacology 66:193-198. AGRADECIMENTOS Agradeço a organização de pesquisa e extensão e a minha orientadora Juliana Fonseca pela oportunidade de realizar este projeto onde pude ganhar conhecimento no assunto e experiência prática na realização de um trabalho cientifico. Página 6