25 a 28 de novembro de 2014 Câmpus de Palmas

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1 UTILIZAÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS A Eugenia dysenterica DC (cagaita) COMO ANTAGONISTAS DOS FUNGOS FITOPATOGÊNICOS: Aspergillus parasiticus, Colletotrichum gloeosporioides e Monilinia fructicola. Thamar Holanda da Silva 1 ;; Camila Martins Malta 2 Raphael Sanzio Pimenta 3 1 Aluna do Curso de Ciências Biológicas ; Campus de Porto Nacional ; thamarhs@gmail.com; PIBIC/CNPq. Co-orientadora Doutoranda do Curso de Doutorado BIONORTE.; Campus de Palmas.; camillamalta_17@hotmail.com 3 Orientador do Curso de Medicina; Campus de Porto Nacional; biorapha@yahoo.com.br RESUMO Fungos endofíticos podem estar presentes em todos os órgãos de uma planta hospedeira podendo sua colonização se dar de forma inter ou intracelular, localizada ou sistêmica. Alguns micro-organismos (bactérias, leveduras e fungos filamentosos) têm a capacidade de exercer um efeito antagonista sobre diferentes patógenos sendo empregados para controlar diversas enfermidades de frutos e vegetais. Este estudo objetivou identificar os fungos filamentosos endofíticos presentes em indivíduos de Eugenia dysenterica DC que apresentaram potencial no controle contra Monilinia fructicola, Aspergillus parasiticus e Colletotrichum gloeosporioides in vitro. Entre os fungos isolados (36,5 %) demonstraram atividade antagonista contra pelo menos um dos fitopatógenos alvo. Dos antagonistas positivos 31 (32,2 %) produziram substâncias voláteis, 42 (43,7%) produziram substâncias difusíveis e 23 (23,9 %) produziram ambas as substâncias. Portanto 96 dos 263 fungos endofíticos obtidos apresentaram potencial para o biocontrole dos fitopatógenos avaliados. As colônias fúngicas foram agrupadas em 77 morfoespécies de acordo com sua semelhança macroscópica. A curva de riqueza mostrou que o método de coleta não atingiu o limite de saturação, embora tenha se adequado aos objetivos propostos neste trabalho. A frequência de colonização global obtida neste trabalho para Eugenia dysenterica DC foi de 57,82 %.Foram realizadas extração de DNA e agrupamento por PCR s. Palavras-chave: antagonismo; controle biológico, identificação molecular. Página 1

2 INTRODUÇÃO Eugenia dysenterica DC (Myrtaceae), popularmente conhecida como cagaita ou cagaiteira, é uma árvore frutífera nativa dos cerrados, e pode atingir até 10 m de altura, tronco e ramos tortuosos, casca grossa, fissurada. Os frutos têm formato globoso, bagáceo, com cor amarelo-clara, levemente ácido, epicarpo membranoso, com peso entre 14 a 20 g, comprimento de 3 a 4 cm e diâmetro de 3 a 5 cm (RIZZINI, 1971). Fungos endofíticos crescem em tecidos vegetais internos sem causar quaisquer sintomas(shipunov et al., 2008). Se o endofítico for isolado de uma planta saudável, pressupõe-se uma relação simbiótica entre as espécies. As doenças de plantas são responsáveis por grandes perdas nas culturas de importância econômica, principalmente aquelas que ocorrem durante a pós-colheita. Os fungos são os principais causadores de doenças pós-colheita em frutas (SNOWDON,1990). Aspergillus flavus e A. parasiticus, contaminam numerosos alimentos em climas quentes onde podem produzir aflatoxinas em diferentes pontos da cadeia produtiva (SARDIÑAS et. al., 2011). C. gloeosporioides é o mais expressivo agente causador da antracnose, principal doença pós-colheita de frutos (BENATO, 1999; ROZWALKA et. al, 2008). Monilinia fructicola é responsável pela podridão parda, a qual constitui a doença mais importante das frutas de caroço, como o pêssego, representando também significativas perdas para a economia mundial (MOREIRA e MAY-DE MIO, 2009). Portanto, este estudo objetiva identificar os fungos endofíticos isolados de Eugenia dysenterica DC (cagaita) que apresentaram potencial na produção de metabólitos com atividade antimicrobiana contra os fitopatógenos Aspergillus parasiticus, Colletotrichum gloeosporioides e Monilinia fructicola. MATERIAL E MÉTODOS Todos os isolados de fungos endofíticos obtidos tiveram suas colônias fotografadas (frente e verso) e agrupadas em morfoespécies, de acordo com as seguintes características macromorfológicas: cor da colônia (frente e verso), textura da superfície (frente e verso), aspecto da borda e produção de pigmentos. Página 2

3 A avaliação da riqueza observada foi realizada a partir dos dados de agrupamento morfológico em morfoespécies, utilizando-se o estimador de riqueza Jaccknife 1, obtido através do programa EstimateS, versão 8.20 para Windows. Para se revelar a suficiência do esforço amostral, foi produzida curva de acumulação de morfoespécies por indivíduo vegetal coletado a partir dos valores de Mao-Tau com 200 aleatorizações, obtidas também por meio do programa EstimateS. A frequência de colonização, que corresponde ao número de fragmentos colonizados, foi calculada utilizando-se a fórmula: Nd/Nt x 100, onde Nd e Nt correspondem, respectivamente, ao número de amostras das quais foi possível isolar um ou mais fungos endofíticos e ao número total de fragmentos amostrados para folha e caule individualmente e para o vegetal como um todo (TAYLOR et al., 1999). A extração do DNA total foi realizada de acordo com De Hoog et al. (2003). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% utilizando tampão TBE 0,5X (54g de tris base, 27,5g de ácido bórico, 20 ml de EDTA 0,5M, ph 8,0). Os géis foram corados com solução de Gel Red, visualizados sob luz ultravioleta. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram isolados 263 endofíticos de Eugenia dysenterica DC (cagaita) e avaliados quanto ao seu potencial contra os fitopatógenos A. parasiticus (IMI ), C. gloeosporioides (CG INCOPER 02) e M. fructicola (MFA 3635). Sendo que 96 dos isolados (36,5%), demonstraram atividade antagonista contra pelo menos um dos fitopatógenos alvo. Dos antagonistas positivos 31 endófitos (32,2%) produziram substâncias voláteis, 42 (43,7%) produziram substâncias difusíveis e 23 (23,9 %) produziram ambas as substâncias. Dos 96 indivíduos endofíticos que apresentaram atividade antagonista, 44 (46,8%) foram capazes de inibir o crescimento de A. parasiticus (IMI ). Contra C. gloeosporioides (CG INCOPER 02) 68 isolados (70,8%) apresentaram atividade antagonista. Já contra o fitopatógeno M. fructicola (MFA 3635) apenas 17 fungos foram considerados positivos (17,7 %). As colônias fúngicas foram agrupadas em 77 morfoespécies de acordo com sua semelhança macroscópica: cor da colônia (frente e verso), textura da superfície (frente e verso), aspecto da borda e produção de pigmentos. Foi observada a presença de poucas Página 3

4 morfoespécies dominantes e várias presentes de forma esporádica neste hospedeiro. Resultados semelhantes foram observados por Rakotoniriana et al. (2007) em Centella asiatica, caracterizado por duas espécies endofíticas mais frequentes e numerosas outras com rara ocorrência. No entanto, normalmente se observa a presença de uma ou duas espécies dominantes no hospedeiro e um número maior de espécies mais raras (PIMENTA et. al, 2012). A curva de riqueza de morfoespécies indicou a grande probabilidade de que fossem encontradas mais morfoespécies caso o esforço amostral tivesse sido maior, o que foi confirmado a partir do resultado obtido através do estimador de riqueza empregado (Jackknife 1). Com isso, percebemos que o método de coleta não atingiu o limite de saturação, embora tenha se adequado aos objetivos propostos neste trabalho. A frequência de colonização global obtida neste trabalho para Eugenia dysenterica DC foi de 57,82 %. O cálculo foi realizado utilizando-se o número de colônias fúngicas totais iniciais, ou seja, 901 colônias. Sabe-se que fatores ambientais tais como, intensidade de luz e calor, nível de precipitação, déficit hídrico, influenciam a colonização e permanência de microrganismos em seus hospedeiros. Todos os isolados positivos para o teste de volátil foram submetidos a extração de DNA total e dosados em espectrofotômetro (Nanodrop ND2000 ). Sendo possível inferir que o material biológico fornece o DNA de bom rendimento e adequada pureza, requeridos para a realização de procedimentos em Biologia Molecular. O agrupamento molecular dos isolados encontra-se em fase final de elaboração e provavelmente resultará na descrição de espécies novas de fungos filamentosos. LITERATURA CITADA ( BENATO, E. A. Controle de doenças pós-colheita em frutos tropicais. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 25, n. 1, p , JANISIEWICZ, W. J; KURTZMAN, C. P.; BUYER, J. S. Yeasts associated with nectarines and their potential for biological control of brown rot. Yeast. 27: , Página 4

5 MOREIRA, L. M.; MAY-DE MIO, L. L. Controle da podridão parda do pessegueiro com fungicidas e fosfitos avaliados em pré e pós-colheita. Ciênc. Agrotec., v. 33, n. 2, p , PIMENTA, R. S.; DA SILVA, J. F. M.; BUYER, J. S.; JANISIEWICZ, W. J. Endophytic Fungi from Plums (Prunus domestica) and Their Antifungal Activity against Monilinia fructicola. Journal of Food Protection, v. 75, p , RAKOTONIRIANA, E. F.; MUNAUT, F.; DECOCK, C.; RANDRIAMAMPIONONA, D.; Endophytic fungi from leaves of Centella asiatica: occurrence and potential interactions within leaves. Antonie van Leeuwenhoek, RIZZINI, C.T. Aspectos ecológicos da regeneração em algumas plantas do Cerrado. In: Simpósio sobre o cerrado, 3, São Paulo, SP. Anais. São Paulo: Edgard Blucher, p RODRIGUES, K. F. The foliar fungal endophytes of the Amazonian palm Euterpe oleracea. Mycologia, v. 86, p , SARDIÑAS, N.; VÁZQUEZ, C.; GIL-SERNA, J.; GONZÁLEZ-JAÉN, M. T.; PATIÑO, B. Specific detection and quantification of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus inwheat flour by SYBR Green quantitative PCR. International Journal of Food Microbiology. v. 145, p , SHIPUNOV, A.; NEWCOMBE, G.; RAGHAVENDRA, A. K. H.; ANDERSON, C. L. Hidden diversity of endophytic fungi in an invasive plant. American Journal of Botany, 95(9): , SNOWDON, A. L. (Ed.). Papayas. A colour atlas of post-harvest diseases and disorders of fruits and vegetables: general introduction and fruits. London: Wolfe Scientific, chap. 3, p TAYLOR, J. E.; HYDE, K. D.; JONES, E. B. G. Endophytic fungi associated with the temperate palm, Trachycarpus fortunei, within and outside its natural geographic range. New Phytologist, v. 142, p , 1999 AGRADECIMENTOS Ao Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia da UFT pela oportunidade, espaço e material cedido. Aos amigos de graduação pelo acompanhar do trabalho. O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil. Página 5