EFICIÊNCIA DE ISOLADOS DE NEMATÓIDES ENTOMOPATOGÊNICOS (RHABDITA: STEINERNEMATIDAE E HETERORHABDITIDAE) NO CONTROLE BIOLÓGICO DE

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1 EFICIÊNCIA DE ISOLADOS DE NEMATÓIDES ENTOMOPATOGÊNICOS (RHABDITA: STEINERNEMATIDAE E HETERORHABDITIDAE) NO CONTROLE BIOLÓGICO DE Agrotis ipsilon (Hufnagel,1766) Gabriela Souza Doneze (PIBIC/Fundação Araucária-UENP), Elaine Aparecida Soares, Marcelo Zart, Viviane Sandra Alves (Orientadora), vivialves@uenp.edu.br Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus Cornélio Procópio. Ciências Agrárias - Agronomia Palavras-chave: Heterorhabditis, Steinernema,Lagarta-rosca Resumo A lagarta-rosca, Agrotis ipsilon (Lepidóptera: Noctuidae), é considerada uma importante praga de várias culturas devido seu hábito polífago. Na cultura do milho é uma praga chave pois ataca plantas jovens, causando a morte destas. O manejo da praga é baseado principalmente com inseticidas químicos, podendo causar sérios danos ao meio ambiente. O uso de nematoides entomopatogênicos (NEPs) pode ser uma alternativa viável, pois o inseto passa grande parte do seu ciclo em contato com o solo, local onde os NEPs se encontram. Assim, este trabalho, tem como objetivo, avaliar o potencial de produção de nematoides entomopatogênicos em lagartas de A. ípsilon em laboratório. Foram utilizados três isolados IBCB -n02 (Steinernema carpocapsae), IBCB-n05 (Heterorhabditis indica) e ALHO (Heterorhabditis sp.), previamente identificados como os mais eficientes no controle da praga. Cada isolado foi inoculado separadamente em lagartas de A ípsilon e Galleria mellonela, agrupadas em 10 lagartas por placas, o que totalizou 40 lagartas para cada espécie. Após o início da saída dos NEPs das lagartas, estes foram contados de cada placa até o fim de sua emergência. O trabalho foi realizado em esquema fatorial 3x2, considerando 3 isolados e 2 espécies de lagarta. Com as medias de nematoides por placa foi realizado analise de variância e comparadas pelo teste de Tukey (p>0,05). O isolado IBCB-02 não apresentou diferença na produção entre as espécies avaliadas. Já os isolados IBCB-05 e ALHO apresentaram produção de NEPs superior em G. mellonela quando comparado com A. ípsilon. Introdução A lagarta-rosca, Agrotis ípsilon (Lepidóptera: Noctuidae), pode atacar uma vasta lista de espécies de plantas de importância econômica, levando a perdas consideráveis nas culturas como as solanáceas; as curcubitáceas; e também crucíferas. Além disso, pode atacar as grandes culturas como milho, soja e feijão (Silva et al., 1968; Link & Pedrolo, 1987; Vendramim et al., 1982 appud Bento et al., 2007). As lagartas iniciam suas atividades se alimentando do tecido foliar das plantas e depois migram para o solo, quando seccionam a haste da planta, podendo causar a morte desta. São insetos de difícil controle por terem hábitos noturnos e subterrâneos e por serem pouco estudados, com escassez de dados sobre sua biologia, comportamento e interações com o meio ambiente dificultando até mesmo o uso de agrotóxicos (Souza, 2005). Uma forma viável para o controle desse inseto é o uso de nematoides entomopatogênicos (NEPs), pois estes ocupam o mesmo ambiente, e necessitam de condições ambientais bem semelhantes as exigidas pela praga, indicando que seu uso pode vir a ser uma alternativa viável para seu controle.

2 Os NEPs pertencem à ordem Rhabditida (Nematoda), na qual estão localizadas as famílias Steinernematidae e Heterorhabditidae. Entre as vantagens apresentadas por estes patógenos, destaca-se a presença de associação simbiótica com bactérias, que levam a morte rápida do inseto hospedeiro, garantindo a sobrevivência e multiplicação no nematoide no seu interior (Gaugler e Kaya, 1990). Em laboratório foi realizado estudo de seleção de NEPs para o controle da lagarta-rosca com isolados demonstrando eficiência. Estudos básicos ainda necessitam ser realizados para uma maior compreensão do controle dessa praga no campo. Com isso este estudo teve como objetivo avaliar a produção de NEPs de diferentes isolados em lagartas de A. ípsilon e Galleria mellonela. Material e métodos O experimento foi realizado no Laboratório de Entomologia e Controle Microbiano (LECOM) da Universidade Estadual do Norte do Paraná (UENP), Cornélio Procópio, Paraná. Os insetos da espécie A. ipsilon utilizados foram multiplicados conforme a metodologia modificada de Ávila & Milanez (2004). Os insetos foram mantidos em câmara climatizada (temperatura de 25± 1 C, umidade 70 ± 10% e fotofase de 14horas). As lagartas foram alimentadas em placas de petri, 9 cm de diâmetro, contendo a dieta artificial (Bento et al., 2007) (ingredientes descritos na Tabela 1) para a alimentação, onde permaneceram até serem utilizadas nos experimentos. Uma parte das lagartas foi mantida até a fase de pupa, para a manutenção da criação em laboratório. Tabela 1. Ingredientes para a dieta para Agrotis ipsilon. Ingredientes Quantidade Feijão 75g Germe 60g Proteína de soja 30g Caseína 30g Levedura de cerveja 37,5g Solução vitamínica 9 ml Ac. Ascórbico 3,6g Ac. Sórbico 1,8g Nipagin 3g Tetraciclina 0,11g Formol 40% 3,6 ml Ágar 27g Água 1,2 L Os insetos de G. mellonella utilizados durante o experimento foram multiplicados em laboratório conforme a metodologia descrita por Molina e López (2001), com as lagartas colocadas em potes plásticos, forrados com folha sulfite contendo dieta artificial (tabela 2) e favos para servir de alimento. Os isolados utilizados foram adquiridos da Universidade Federal de Lavras (UFLA) e do Instituto Biológico de Campinas (IBC) e permaneceram armazenados em suspensão aquosa e em temperatura de 17 ± 1ºC na ausência de luz, e quando necessário, foram multiplicados em larvas de último instar de G. mellonella conforme descrito Molina e López (2001). Tabela 02. Ingredientes para dieta de Galeria mellonella. Ingredientes Quantidade Farinha de trigo Farelo de trigo

3 Leite em pó 400g Levedo de cerveja 120g Gérmen de trigo Mel 240g Glicerina 130g Água destilada 20ml Fonte: Cláudia Dolinski (comunicação pessoal) Para fazer a multiplicação dos NEPs, foram utilizadas 10 lagartas de G. mellonella, colocadas em placas de Petri de 9 cm de diâmetro, contendo duas folhas de papel filtro e 2 ml de suspensão aquosa contendo em média 500 JI/mL. As placas foram mantidas durante cinco dias em câmara climatizada á 25º C. As lagartas mortas foram transferidas para armadilha de White, que constitui de placa de Petri de 9 cm contendo um papel filtro suspenso por uma tampinha, e foi acrescentado aproximadamente 5 ml de água destilada, onde os NEPs ficaram depois de abandonar o cadáver do hospedeiro. Essa água, com os NEPs em suspenção, foi recolhida e armazenada em potes plásticos para permanecer em câmaras com temperatura controlada de 17 ºC. Após a emergência dos juvenis infectivos (JIs) das lagartas de G. mellonella foi realizado a quantificação dos NEPs de cada isolado. Foram utilizados os isolados IBCB -n02 (Steinernema carpocapsae), IBCB-n05 (Heterorhabditis indica) e ALHO (Heterorhabditis sp.) Cada isolado de nematoide foi aplicado na concentração de 100JIs/cm 2 em placas de Petri de 9 cm contendo papel filtro duplo, onde em seguida foram colocadas dez lagartas de G. mellonela ou A. ipsilon, conforme o tratamento sendo cada placa com 10 insetos considerada uma repetição (parcela). As placas foram mantidas sob temperatura de 25±2 C, UR de e no escuro constante durante 48h, em câmara de germinação, de acordo com metodologia de Taylor e Shields (1990). Após esse período, as larvas infectadas foram colocadas em placas de Petri com papel filtro seco e limpo (câmara seca), a uma temperatura de 25±2ºC, UR de 70% por cinco dias em câmara de germinação, tempo no qual foi observada a sintomatologia típica de infecção por NEPs dos gêneros, os quais deixam as lagartas de cor amarela até cor café (Steinernema) e de coloração roxo a preto (Heterorhabditis) para as larvas infectadas. As larvas que não apresentaram essa sintomatologia foram descartadas. Em seguida as lagartas foram transferidas para armadilhas de White, para facilitar a emergência e recuperação dos NEPs. Uma vez observada a emergência de JIs, estes foram coletados diariamente até a observação do esgotamento da lagarta. A suspensão de JIs foi coletada diariamente das armadilhas de White, e vertida em proveta graduada para estabelecimento do volume total diário, e em seguida a suspensão foi quantificada e calculado o total de produção/dia por repetição. Para tanto, cinco repetições de 50 μl, foram colocados individualizados em placas do tipo Eliza para quantificação do número de JIs produzidos. Esse procedimento foi realizado cinco vezes para cada repetição. Conhecendo o volume total e o número total de nematoides em 50 μl, foi estabelecido o número de JIs por ml, possibilitando realizar o cálculo do número de juvenis emergidos do hospedeiro por dia. O experimento foi conduzido em fatorial 3x2, com 3 isolados avaliados por 2 espécies de lagartas, e com 4 repetições por tratamento, totalizando 24 parcelas. As variáveis avaliadas foram produção diária (número total de JIs emergidos/dia) e produção acumulada (número total de JIs que emergiram até o esgotamento do hospedeiro). Com as medias de nematoides por placa foi realizado analise de variância e comparadas pelo teste de Tukey (p>0,05). Resultados e Discussão

4 Observou-se que o isolado IBCB-n02 apresentou valores semelhantes de produção nos dois hospedeiros, mas os outros isolados obtiveram produção maior em G. mellonella, com valores para Alho de 1.1x10 5 IJs/lagarta e IBCB-n05 9.4x10 4 IJs/lagarta (Tabela 03). Além disso, embora o isolado IBCB-n02 tenha apresentado produção semelhante aos outros dois isolados quando multiplicado em G. mellonella, em A. ípsilon a produção do isolado IBCB-n02 foi menor quando comparada aos isolados Alho e IBCB-n05. Outra informação significativa foi a produção ao longo do tempo, onde em G. mellonella, houve exaustão do recolhimento dos NEPs em aproximadamente 10 dias. Por outro lado, a produção em A. ípsilon durou cerca de 30 dias e, embora o período de produção tenha sido maior, a produção total foi inferior, como é possível observar na Tabela 03. Adams e Nguyen (2002) afirmam que a produção de nematoides entomopatogénicos dependem do tamanho do hospedeiro e o armazenamento de alimentos do mesmo, e de acordo com Stuart (2006), existem diferenças relativas a virulência de NEPs que pode ser atribuída à especificidade, morfologia, origem e até mesmo a variabilidade genética desses isolados. O menor tamanho de JIs de Heterorhabditis facilita a penetração e um melhor acesso desses JIs, que se multiplicam, por terem menor tamanho corpóreo e o hospedeiro pode tolerar um número maior de gerações, tendo mais indivíduos de NEPs no final do ciclo. Tabela 3: Produção in vivo de nematóides entomopatogênicos em Agrotis ípsilon e Galleria mellonella. Temperatura de 25 ± 2ºC, UR 70 ±10% e fotofases de 12 horas. Isolates Hosts Agrotis ípsilon Galleria mellonella IBCB-n02 4.7x10-4 ±Aa* 4.2x10-4 Aa IBCB-n05 2.3x10 Aa -4 9,4x10 ABb -4 ALHO 3.3x10-4 Aa 1,1x10-5 Bb * Médias com mesmas letras maiúsculas nas colunas, e minúsculas nas linhas, não diferem entre sí pelo teste de Tukey (5<p) Conclusões Os resultados obtidos em laboratório indicam que todos os isolados testados foram patogênicos as lagartas Galleria mellonella e Agrotis ípsilon. O isolado Alho foi o que apresentou maior produção quando multiplicado em lagarta de G. mellonella. Agradecimentos À Fundação Araucária, pela concessão da bolsa de iniciação científica ao primeiro autor. Referências SILVA, M.N.; SIMONI, L. de. Quarto catalogo dos insetos que vivem nas plantas do Brasil, seus parasitos e predadores. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura, p. Parte II, 2o tomo. LINK, D.; PEDROLO, S.S. Aspectos biológicos de Agrotis ipsilon (Hufnagel, 1767) em Santa Maria - RS. Revista de Ciências Rurais, v.17, p , BENTO, F.M.M.; MAGRO. S.R.; FORTES, P.; ZÉRIO, N.G.; PARRA, J.R.P.; Biologia e tabela de vida de fertilidade de Agrotis ipsilon em dieta artificial. Pesquisa Agropecuária brasileira, v.42, n.10, p , out

5 POINAR JR, G. O Biology and taxonomy of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: GAUGLER, R. & KAYA, H. K. (eds). Entomopathogenic nematodes in biological control. CRC Press Inc.; Boca Raton, FL, pg SOUZA, J. C. Principais aspectos sobre as pragas do milho em plantios direto e convencional. Circular técnica da Epamig, Nº. 180 Março de 2005 MOLINA, J.P.; LÓPEZ, N.J.C. Producción in vivo de três entomonematodos con dos sistemas de infección en dos hospedantes. Revista Colombiana de Entomología, 27: 73-78, TAYLOR, P.S.; SHIELDS, E.J.A Microcomputer-controlled system of environmental chambers suitable for thestudy of thermoperiodic effects. Environmental Entomology, 19: , STUART, R.J. Population biology of entomopathogenic nematodes: concepts, issues, and models. Biological Control, 38: , Silva et al., 1968; Link & Pedrolo, 1987; Vendramim et al., 1982 appud Bento et al., 2007) ÁVILA, C.J.; MILANEZ, J.M. Larva-alfinete. In: Salvadori, J.R.; Ávila, C.J.; Silva SILVA, A.G.A.; GONÇALVES, C.R.; GALVÃO, D.M.; GONÇALVES, A.J.L.; GOMES J.; SILVA, M.N.; SIMONI, L. Quarto catalogo dos insetos que vivem nas plantas do Brasil, seus parasitos e predadores. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura, p. ADAMS, B.J.; NGUYEN, K.B Taxonomia e sistematica pp In: GAUGLER. R. ed. Nematoide entomopatogenico CABI, New York, NY, USA, p. 367.