UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA DE ENGENHARIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA DE ENGENHARIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS LUCIANO BARROS ZINI Porto Alegre 2016

2 LUCIANO BARROS ZINI CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS Dissertação de Mestrado apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Engenharia. Orientadora: Profª. Drª. Mariliz Gutterres Soares Co-orientador: Prof. Dr. Pedro Rafael Bolognese Fernandes Porto Alegre 2016

3 I UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL ESCOLA DE ENGENHARIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação Contaminação de Agrotóxicos na Água para Consumo Humano no RS: Avaliação de Riscos, Desenvolvimento e Validação empregando Método SPE e LC-MS/MS, elaborada por Luciano Barros Zini, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia. Comissão Examinadora: Prof. Dr. Renato Zanella Universidade Federal de Santa Maria - Departamento de Química. Prof. Dr. Marco Ferrão Universidade Federal do Rio Grande do Sul IQ, PPGQ. Prof. Dr. Jorge Otávio Trierweiler Universidade Federal do Rio Grande do Sul - DEQUI, PPGEQ. Porto Alegre 2016

4 Ao povo gaúcho, a quem eu sirvo com todo patriotismo e dedicação.

5 I AGRADECIMENTOS Inicialmente, gostaria de agradecer aos meus orientadores, professora Mariliz e professor Pedro, por terem acreditado na minha capacidade, aceitado me orientar e por terem dado liberdade às minhas ideias. Foi uma oportunidade incrível unir as áreas potenciais de cada um e construir em conjunto este trabalho. Gostaria de agradecer à comissão do PPGEQ; ter sido representante discente no ano de 2015 ultrapassou as fronteiras convencionais de aprendizado que um mestrado pode proporcionar, oportunizando acompanhar e aprender a respeito da gestão universitária feita por professores altamente qualificados. Gostaria de agradecer a todos os professores do Departamento de Engenharia Química da UFRGS, formação que eu tenho muito orgulho de ter tido. Gostaria de agradecer a todo o pessoal do Centro Estadual de Vigilância em Saúde, à direção e às chefias pelo apoio incondicional, em especial à minha chefe do VIGIAGUA, Julce Clara da Silva, engenheira química também e que há mais de 20 anos toca este programa no RS, e ao nosso estagiário, quase engenheiro químico, Cálvin Guedes Reis, que acompanhou e apoiou em diversas etapas deste trabalho. À Jupira de Souza, da Fundação Estadual de Pesquisa em Saúde, pelo apoio e gestão de todo o material de coleta. A todo o grupo técnico de agrotóxicos do CEVS, em especial Vanda, Salzano e Elaine. Aos motoristas Gilnei e Leandro que atravessaram junto comigo diversas vezes o estado para coletar amostras de água. Gostaria de agradecer aos 19 coordenadores regionais do VIGIAGUA e todos os fiscais dos 497 municípios que contribuem diariamente para o controle e a vigilância da qualidade da água para consumo humano no estado e alimentam o banco de dados que também foi ferramenta do presente trabalho. Gostaria de agradecer ao Bruno Todeschini, perito da Polícia Federal, pelo know how da técnica passado, e intermediário do primeiro contato com o LANAGRO. Gostaria de agradecer imensamente ao LANAGRO, pela oportunidade de aprendizado e uso das técnicas, por toda a infraestrutura e know how disponibilizados. Em especial ao Fabiano Barreto, coordenador substituto do LANAGRO RS e responsável pelo laboratório de análises de resíduos de pesticidas e medicamentos veterinários RPM, onde foi executada a parte experimental. Gostaria muito de agradecer a Louise Jank, também do RPM, por todo apoio,

6 todo conhecimento transmitido durante todo este tempo de trabalho. Ao Fabrício Pedrotti, por todas as dicas oriundas de sua vasta experiência com águas e técnicas analíticas. Gostaria de agradecer à toda a equipe do LACOURO, coordenada pela Profa. Mariliz, em especial à doutoranda Caroline Agustini, por todas as dicas no laboratório e nos equipamentos e materiais, a todos os bolsistas que contribuíram em diferentes etapas, Eduardo, Dimitrius e em especial à Amanda e ao Carlos, que foram cruciais, principalmente na fase final. Gostaria de agradecer aos meus amigos Guilherme Aydos, Lucas Foppa e Fernando Favaretto, pelas revisões e discussões antes do Oktoberforum. Gostaria de agradecer ao prof. Gilmar por ter revisado o português e à minha amiga Mirela por ter revisado a formatação. Gostaria de agradecer aos meus amigos Ana Cardinale, Henrique Mezzomo e Claudia Rohloff, pela parceria, sempre. Gostaria de agradecer aos meus amigos e colegas da turma de trainees 2012 do Grupo Votorantim, que me fizeram vislumbrar a rota da carreira acadêmica. Por último, e mais importante, gostaria de agradecer à minha família, especialmente à minha mãe, Ana Maria de Barros, e à minha tia e madrinha, Regina Maria de Barros, pelo apoio incondicional, sempre.

7 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS RESUMO Os agrotóxicos, quando presentes na água, são definidos como micropoluentes: mesmo em baixas concentrações, conferem à água características de toxicidade. Aponta-se o RS como o quarto estado do Brasil com maior volume de vendas anuais de agrotóxicos, chegando a mais de 50 mil toneladas por ano. Desde 2014 está em vigência no território gaúcho uma portaria estadual que acrescenta a exigência de 46 parâmetros de agrotóxicos no padrão de potabilidade da água, além dos 27 já exigidos pela portaria nacional. Neste trabalho, 89 pesticidas foram avaliados conforme três métodos teóricos de predição de risco de contaminação em mananciais subterrâneos e superficiais: índice Ground Ubiquity Score (GUS), método Screening da USEPA e método de GOSS, baseados nas propriedades físico-químicas dos pesticidas. Nos anos de 2015 e 2016, foram realizadas 143 coletas de água para consumo humano em 45 municípios da bacia hidrográfica do Alto Jacuí (G-50), a que possui a maior taxa de aplicação de agrotóxicos do estado, para análises de vigilância através de laboratório contratado, envolvendo os 89 pesticidas presentes na portaria nacional e estadual. Em paralelo, 183 pesticidas presentes em uma solução-padrão foram empregados no desenvolvimento de um novo método de análise multiresíduos, com etapas de pré-tratamento por filtração seguidas por extração em fase sólida e LC-MS/MS, aplicada para os três maiores municípios da G-50 (Carazinho, Soledade e Cruz Alta) em amostras de água bruta e tratada, durante quatro períodos de aplicação de agrotóxicos dos principais cultivos agrícolas da região. Dos pesticidas mencionados nas portarias nacional e estadual, 12 foram classificados com o maior risco de contaminação tanto em água superficial e subterrânea de acordo com os três métodos teóricos empregadas. Nas análises de vigilância foi detectado permetrina em Carazinho e alaclor em Espumoso. No método desenvolvido, 75 pesticidas foram validados de acordo com os critérios propostos e atingiram limites de detecção (LD) e limites de quantificação (LQ) que variaram de 10 a 300 ng L -1. Na aplicação do método nas coletas dos três municípios da G-50 não houve detecção de nenhum pesticida. Palavras-chave: predição teórica, pesticidas, contaminação das águas, padrão de potabilidade, SPE e LC-MS/MS Luciano Barros Zini Dissertação de Mestrado PPGEQ UFRGS Orientadora: Profª. Drª. Mariliz Gutterres Soares Co-orientador: Prof. Dr. Pedro Rafael Bolognese Fernandes

8 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS ABSTRACT Agrochemicals, when present in water, are defined as micropollutants, thus giving the water toxic characteristics, even at low concentrations. The Rio Grande do Sul state in Brazil was found to rank fourth in annual agrochemical sales in the country, surpassing 50 thousand tons per year. A state regulation in effect in the RS state since 2014 requires the inclusion of 46 new agrochemical parameters concerning the standards for potable drinking water, in addition to 27 existing parameters mandated by national ordinance. Seventy-five pesticides were evaluated based on three theoretical methodologies of contamination risk prediction in underground and surface water sources, by measuring the physicochemical properties of pesticides: GUS index, USEPA screening method and Goss method. In 2015 and 2016, 143 water samples were collected from sources of potable water in 45 municipalities located in the Alto Jacuí river basin, a region which has the highest pesticide application rate in the RS state. A private laboratory analyzed samples from 89 pesticides present in the national and state regulation. Paralely, 183 pesticides were evaluated by a new multi-residue analysis method. Filtration was conducted in the pre-treatment steps, followed by a solid phase extraction liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis (SPE-LC-MS/MS) of raw and treated water samples from the three largest G-50 municipalities (Carazinho, Soledade and Cruz Alta), during the four pesticide application periods of the main crops cultivated in the region. Twelve pesticides were classified as of high risk in terms of contamination for both surface and groundwater, in accordance with the three theoretical methodologies implemented. During analysis of the surveillance data collected, the pesticides permethrin and alachlor were found in Carazinho and Espumoso, respectively. Through the methodology developed, 75 pesticides were evaluated according to the criteria proposed, reaching lower detection limit (LD) and quantification limit (LQ) ranging from 10 to 300 ng L-1, respectively. During the implementation of the methodology for sample collections in the three G-50 municipalities, no pesticides were detected. Keywords: theoretical prediction; pesticides; water contamination; potability standards, SPE- LC-MS/MS Luciano Barros Zini Dissertação de Mestrado PPGEQ UFRGS Orientadora: Profª. Drª. Mariliz Gutterres Soares Co-orientador: Prof. Dr. Pedro Rafael Bolognese Fernandes

9 I SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Objetivos Metodologia da Pesquisa Estrutura da Dissertação REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Poluição das Águas Agrotóxicos Legislação sobre agrotóxicos no padrão de potabilidade da água Classificações dos Agrotóxicos Técnicas Analíticas para Análise de Agrotóxicos na Água Amostragem Pré-tratamento das amostras Extração em Fase Sólida Microextração em Fase Sólida Extração Sortiva em Barra Magnética Microextração Líquido-Líquido Dispersiva Técnicas Analíticas Separação: Cromatografia Gasosa e Cromatografia Líquida Identificação: Espectrometria de Massas Ionizadores Analisadores Detector Modos de Operação Acoplamento Técnicas Analíticas Implementadas no RS Validação de métodos analíticos Seletividade Exatidão Precisão Linearidade e curva analítica Limite de detecção e limite de quantificação... 40

10 2.5.6 Efeito matriz Predição Teórica Materiais e Métodos Materiais Padrões Instrumentação Reagentes, solventes e materiais utilizados Métodos Banco de Dados do Sistema de Informação de Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano (SISAGUA) Procedimentos Experimentais Predição Teórica Resultados e Discussões Informações do SISAGUA População e forma de captação de água dos municípios Municípios e população sem análises de controle de agrotóxicos na água Resultados das análises de vigilância de agrotóxicos na água realizadas na G Resultados da Validação da Técnica Analítica SPE LC-MS/MS e Aplicações Estudos exploratórios realizados em Porto Alegre Resultados da Predição Teórica Conclusões REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES... 92

11 LISTA DE FIGURAS Figura Representação esquemática das etapas envolvidas na SPE: condicionamento do sorvente, adição da amostra, remoção dos interferentes e eluição do analito Figura Componentes de um espectrômetro de massas Figura Localização geográfica da Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí G Figura 4.1. Fluxograma das formas de captação de água - superficial ou subterrânea, com número de municípios e respectiva população Figura 4.2. Cromatograma do pesticida propamocarbe LISTA DE TABELAS Tabela Consumo anual de pesticidas em diferentes países Tabela Vendas de agrotóxicos e afins no RS Tabela Parâmetros de agrotóxicos exigidos no padrão nacional de potabilidade de água da Portaria MS 2914/ Tabela Parâmetros adicionais de agrotóxicos exigidos ao padrão de potabilidade de substâncias químicas, no controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano no RS, conforme Anexo I da Portaria SES RS nº 320/ Tabela 2.5. Trabalhos publicados sobre a detecção da presença de agrotóxicos na água de mananciais do RS Tabela 3.1. Municípios onde ocorreram as 143 coletas para análise de agrotóxicos na água para consumo humano nos anos de 2015 e Tabela 3.2. Critérios de classificação de lixiviação conforme índice de GUS Tabela 3.3. Classificações do potencial de contaminação das águas de superfície por pesticidas de acordo com os critérios do método de GOSS Tabela 4.1. Dados do abastecimento de água dos 15 municípios com maior população abastecida por ETAs do RS e totais Tabela 4.2. Municípios, populações e vazões das estações de tratamento de água com captação superficial da G Tabela 4.3. Cronograma de coletas de água Tabela 4.4. Critérios definidos para a validação do método Tabela 4.5. Resultados dos 75 pesticidas validados conforme a técnica SPE-LC-MS/MS Tabela 4.6. Estudos exploratórios de pesticidas em águas coletadas em Porto Alegre e Alvorada/Viamão... 72

12 Tabela 4.7. Classificação do risco de contaminação para os pesticidas previstos na Portaria MS 2914/2011 conforme os três métodos empregados no trabalho Tabela 4.8. Estimativa dos riscos de contaminação para os pesticidas previstos na Portaria MS 2914/ Tabela 4.9. Classificação do risco de contaminação para os pesticidas previstos na Portaria SES RS 320/2014 conforme os três métodos empregados no trabalho Tabela Estimativa dos riscos de contaminação para os pesticidas previstos na Portaria SES RS 320/ LISTA DE QUADROS Quadro 2.1. Propriedades físico químicas utilizadas nas predições teóricas Quadro 4.1. Informações a respeito dos municípios onde houve detecção de agrotóxicos na água para consumo humano LISTA DE APÊNDICES Tabela A Pesticidas do Pool AG 03/15 LANAGRO-GO e suas propriedades físico-químicas Tabela B Municípios e populações abastecidos por estações de tratamento de água com captações superficiais, população de municípios que possuem ETA e é abastecida por captação subterrânea e municípios abastecidos a partir de sistema interligado no RS Tabela C Municípios e respectiva população sem informação de controle de agrotóxicos na água para consumo humano no RS Tabela D - Parâmetros do analisador de massas dos analitos e padrões internos, por ionização por eletrospray no modo positivo

13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A - Potencial Perigoso APTAS - Alto Potencial de Transporte das águas superficiais Associado ao Sedimento ANA - Agência Nacional das Águas ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária APCI - Atmospheric pressure chemical ionization API - Atmospheric pressure ionization APTDA - Alto Potencial de Transporte das águas superficiais via Dissolução em Água BPTAS - Baixo Potencial de Transporte das águas superficiais Associado ao Sedimento BPTDA - Baixo Potencial de Transporte das águas superficiais via Dissolução em Água CAS - Chemical Abstracts Service CG - Cromatografia gasosa DLLME - microextração líquido-líquido dispersiva - dispersive liquid-liquid microextraction EM - Electron Multiplier EPA - Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos Environmental Protection Agency ESI - Ionização por eletronebulização - electrospray ionization FEPPS - Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde G-50 - Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí GC-ECD - Cromatografia Gasosa com Detecção por Captura de Elétrons GC-MS - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa HPLC-DAD - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos HPLC-UV - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Captura de Elétrons IA - Ingredientes Ativos IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ICH - International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia IQA - Índice de Qualidade da Água ISO - International Organization for Standardization IUPAC - União Internacional de Química Pura e Aplicada LACOURO - Laboratório de Estudos em Couro e Meio Ambiente LANAGRO - Laboratório Nacional Agropecuário

14 LC - Cromatografia líquida LC-ESI-MS/MS - Cromatografia Líquida com Ionização por Eletronebulização Acoplada à Espectrometria de Massas Sequencial LC-MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada por Espectrômetro de massa em modo tandem LD - limite de detecção LQ - limite de quantificação MPTAS - Médio Potencial de Transporte das Águas Superficiais associado ao sedimento MPTDA - Médio Potencial de Contaminação das Águas Superficiais via dissolução em água MS - Ministério da Saúde N - não atende ao critério NC - não contaminante NSP - Nonpoint Source Pollution PC - Contaminante em potencial PPB - partes por bilhão PPT - partes por trilhão Q1 - primeiro quadrupolo Q2 - segundo quadrupolo Q3 - terceiro quadrupolo QqQ - triplo quadrupolo RS - Rio Grande do Sul RSDR - repetitividade RSDR - reprodutibilidade ou precisão intermediária SBSE - Extração sortiva em barra magnética - stir bar sorptive extraction SCS - Soil Conservation Service SES RS - Secretaria Estadual da Saúde RS SIM - Single Ion Monitoring SIS - Selected Ion Storage SISAGUA - Sistema de Informação de Vigilância e Controle da Qualidade da Água para Consumo Humano SPE - Extração em Fase Sólida Solid Phase Extraction SPISP - Soil Pesticide Interaction Screening Procedure SPME - microextração em fase sólida - solid phase microextraction t - Toneladas TOF - Analisador do tipo Tempo de Voo - Time of Flight

15 VIGIAGUA - Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano VMP - Valor Máximo Permitido LISTA DE SÍMBOLOS a: coeficiente angular b. coeficiente linear CV: coeficiente de variação DL50: Dose Letal 50% K : coeficiente de adsorção à matéria orgânica do solo Kh: constante de Henry Koc: coeficiente de adsorção no solo Kw: solubilidade em água pka: constante de ionização ácida pkb: constante de ionização básica R: recuperação, ou fator de recuperação r 2 : coeficiente de determinação RSD: desvio padrão relativo - relative standard deviation S: desvio padrão Sw solubilidade em água t1/2 água: tempo de meia vida na água t1/2 solo: tempo de meia vida no solo

16 8 1 INTRODUÇÃO Os produtos químicos utilizados como pesticidas são extremamente importantes para a manutenção de um equilíbrio entre as pragas das lavouras e o volume de produção da agricultura necessário para a subsistência. Após a Segunda Guerra Mundial, como armas foram trocadas por arados, a agricultura global cresceu rapidamente para proporcionar maior fornecimento de alimentos de alta qualidade. Produtos para controle de pragas se tornaram amplamente utilizados, sendo elementos de alto valor para a agricultura, a saúde pública e o controle residencial de pragas. Ao mesmo tempo, as aplicações de pesticidas representam ameaças para cursos de água e terras manejadas, e o conhecimento disponível a respeito dos riscos são imperfeitos ou limitados (KRIEGER, 2001). No uso e tratamento de água para consumo humano, destaca-se a questão da vulnerabilidade dos mananciais hídricos superficiais ou subterrâneos cuja qualidade da água é decorrência da combinação entre as características naturais de sua bacia hidrográfica e os fatores antrópicos que conduzem à sua modificação (BRASIL, 2006). Água potável limpa e segura é cada vez uma prioridade maior por causa da poluição global. Os meios para alcançar a manutenção de fontes de água potável requerem politicas eficazes de identificar, documentar e reduzir os riscos das bacias hidrográficas. Estes riscos são definidos por seu potencial impacto para a saúde humana. As poluições resultantes do despejo de esgotos nos mananciais, produtos químicos a partir de efluentes industriais e contaminação por pesticidas a partir do uso na agricultura constituem os maiores riscos associados à água potável para consumo humano (DAVIES e MAZUMDER, 2003). As normas de potabilidade têm se apresentado como um instrumental técnico jurídico elaborado pelas autoridades sanitárias, com o apoio de instituições técnico científicas, a ser cumprido pelos órgãos de fiscalização e vigilância do setor saúde e pelas empresas públicas e privadas de abastecimento de água. Essas normas constituem-se como referências técnicas que imprimem um padrão de qualidade ao "produto" água, seja ele obtido diretamente da natureza (sem tratamento ou água bruta) ou por meio de processos físicos e químicos em estações de tratamento. No Brasil a Portaria MS 2914/2011 estabelece o padrão de potabilidade em todo o território nacional, incluindo em seu anexo VII 27 parâmetros de agrotóxicos. No Rio Grande do Sul (RS) há uma portaria estadual, a SES RS 320/2014, que acrescenta 46 parâmetros de agrotóxicos na avaliação de potabilidade da água no território gaúcho.

17 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 9 Apesar de possuir uma norma de potabilidade desde 1977, a vigilância da qualidade da água para consumo humano só foi implementada no Brasil como um programa, a partir da criação do Sistema Nacional de Vigilância Ambiental em Saúde (FUNASA, 2002). O Programa Nacional de Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano (VIGIAGUA) encontrase estruturado como um subsistema, e tem como uma de suas responsabilidades a coordenação de um sistema de informação de vigilância e controle da qualidade da água de consumo humano (SISAGUA). As informações que vêm alimentando o banco de dados dizem respeito aos aspectos físico-químicos, químicos e microbiológicos e dados sobre a qualidade, a vazão, a população abastecida e a localização do sistema. O SISAGUA vem sendo alimentado com informações geradas pelos responsáveis pela operação dos sistemas de abastecimento de água (dados de monitoramento microbiológico, químico e físico-químico obtidos no controle da qualidade da água) e é gerenciado e utilizado por fiscais da vigilância da qualidade da água, pertencentes às esferas federal, estadual e municipal, representados pelo Ministério da Saúde e pelas secretarias estaduais e municipais de saúde. Uma das alternativas de se avaliar o risco de contaminação de pesticidas na água, seja oriunda de manancial superficial ou subterrâneo, é através da predição teórica ou estimativa de risco. Predições teóricas servem como um resumo conciso e preciso de conhecimento do comportamento de pesticidas no ambiente, explorá-los é uma maneira extremamente eficiente de acessar este conhecimento (COHEN, 1995). Quanto tempo os agrotóxicos permanecem no solo depende de suas propriedades físico-químicas e de qual a influência que cada um vai sofrer dos diferentes componentes do solo e o quão prontamente cada pesticida é degradado. (ESTÉVEZ et al., 2007). A análise de agrotóxicos na água envolve as etapas de amostragem, pré-tratamento das amostras, medida (técnicas de detecção) e tratamento dos dados. Um dos maiores desafios na área de micropoluentes na água é a separação dos poluentes de interesse dos componentes da matriz e o alcance de baixos níveis de detecção. Há diferentes técnicas disponíveis de concentração ou remoção da matriz e são escolhidas de acordo com as características químicas dos poluentes, bem como a necessidade de identificação de poluentes desconhecidos (BRUZZONITI et al., 2000).Os pesticidas evoluíram ao longo do tempo indo de persistentes/não degradáveis, para mais polares e degradáveis, tornando-se importante analisar estes produtos da degradação. A extração em fase sólida (solid phase extraction SPE) seguida pela Cromatografia Líquida acoplada por Espectrômetro de Massa em modo tandem LC- MS/MS representa o método mais moderna de determinação de pesticidas e seus produtos de

18 10 degradação, muitos deles polares, de baixa volatilidade, e/ou compostos termo -instáveis (KUSTER et al., 2006). 1.1 Objetivos O objetivo geral deste trabalho é realizar levantamento quanto aos riscos e à presença de agrotóxicos na água para consumo humano no RS. Os objetivos específicos são: - Extrair do SISAGUA informações do RS sobre: - A forma de captação (superficial ou subterrânea), municípios, população abastecida, bem como um panorama detalhado da G Quais os municípios não possuem análises de controle de agrotóxicos na água para consumo humano. - Os resultados das 143 análises de vigilância contratadas pela fiscalização estadual nos anos de 2015 e Desenvolver, validar e aplicar um método analítico capaz de analisar traços de multiresíduos de pesticidas, na ordem de ppt. - Avaliar, a partir de predições teóricas, os riscos associados à contaminação em mananciais hídricos, dos agrotóxicos exigidos nas portarias nacional e estadual, para atender ao padrão de qualidade da água para consumo humano no território gaúcho. 1.2 Metodologia da Pesquisa A metodologia baseou-se em análises do banco de dados disponível no SISAGUA com informações sobre o cadastro, controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano em todo o RS. A parte experimental contemplou o desenvolvimento e a validação de método analítico, com etapas de pré-tratamento com filtração, extração em fase sólida, evaporação e concentração da amostra seguida da injeção via LC-MS/MS e posterior tratativa dos dados. A aplicação da técnica analítica na água bruta e tratada foi nos três municípios com a maior população que capta água superficial da Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí (G-50): Carazinho, Soledade e Cruz Alta. A amostragem ocorreu durante os quatro principais períodos de aplicação de agrotóxicos na região da G-50, nos anos de 2015 e Após a coleta, as amostras foram

19 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 11 armazenadas em caixa de isopor com gelox, garantindo temperatura abaixo de 4 ºC, e transportadas em percurso que chegou a distar 353 Km de Porto Alegre (Cruz Alta). Também foi realizada a aplicação de estudos teóricos a respeito da predição dos riscos de pesticidas contaminarem mananciais superficiais e subterrâneos, a partir do levantamento das principais propriedades físico químicas dos pesticidas presentes nas portarias nacional e estadual. 1.3 Estrutura da Dissertação A presente dissertação está estruturada em 5 capítulos. No capítulo 2 será apresentada uma revisão teórica a respeito da poluição das águas, com um breve panorama mundial, passando por aspectos do Brasil e finalizando com a situação no RS. Também é dada uma especial ênfase para os agrotóxicos, bem como os principais mecanismos de contaminação de corpos hídricos, explanando a definição conforme a legislação nacional, uma visão global sobre o volume de agrotóxicos aplicados em alguns países do mundo, no Brasil e no RS, classificações, legislação e toxicologia. São apresentadas três predições teóricas para avaliação de riscos de pesticidas em mananciais superficiais e subterrâneos, bem como técnicas analíticas aplicadas para análises de agrotóxicos na água e os principais aspectos avaliados na validação de métodos analíticos. No capítulo 3 será feita a descrição da parte metodológica, que aborda a ferramenta nacional que fornece informações sobre o abastecimento público de água, o SISAGUA, os materiais e a infraestrutura utilizados para o desenvolvimento e a validação da técnica analítica, bem como todos os métodos detalhados. É feita a descrição da técnica analítica em si, desde o pré-tratamento até as condições dos equipamentos utilizados, os critérios da validação e a aplicação do método analítico para os pesticidas validados e, ainda, os critérios utilizados para cada predição teórica a fim de classificar os riscos de contaminação de mananciais superficiais e subterrâneos. No capítulo 4 serão apresentados e discutidos os resultados obtidos a partir da análise do banco de dados do SISAGUA, os resultados do desenvolvimento, validação e aplicação do método analítico e os resultados da predição teórica para avaliação do risco de contaminação de mananciais superficiais e subterrâneos aplicados aos parâmetros de agrotóxicos da portaria nacional e estadual. No capítulo 5 serão apresentadas as conclusões e sugestões para trabalhos futuros.

20 12 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA O presente capítulo traz uma abordagem a respeito das diferentes formas de poluição em um contexto a nível mundial, passando pelo Brasil, até chegar no Rio Grande do Sul. Os agrotóxicos são apresentados em suas diferentes classificações, desde grupos químicos até classes toxicológicas. São descritos os fundamentos das principais técnicas analíticas implementadas para análises de agrotóxicos na água, bem como critérios para validação do método analítico. E por último são apresentados três métodos de predições teóricas para avaliação de riscos. 2.1 Poluição das Águas A água, depois do ar, é o bem mais essencial para a sobrevivência humana. Sem água, a vida não seria possível. Felizmente, o ar é purificado adequadamente pela natureza, com o mínimo de ajuda dos seres humanos. Entretanto, este não é o caso da água. No passado, a água era purificada naturalmente pela chuva; todavia, hoje em dia a água da chuva geralmente é contaminada com diversos poluentes que são acrescentados na atmosfera. A poluição de mananciais superficiais e subterrâneos tem exigido que a água passe por operações unitárias de purificação para que seja transformada em potável (AHUJA, 2014). A poluição de águas doces é um problema para metade da população mundial. O aumento das atividades humanas e industrialização têm elevado os níveis de poluentes físicos, químicos e biológicos em mananciais. Além disso, a população mundial aumenta em um ritmo acelerado. Agricultura, indústria e cidades estão utilizando mais água. A demanda por água está dobrando a cada 21 anos, e isso acontece mais rapidamente em algumas regiões específicas (ANIRUDDHA e KUMAR, 2015; AHUJA, 2014). Ahuja (2014) aponta alguns dados mundiais extremamente preocupantes em relação à água: - Mais de 80 países no mundo sofrem com a falta de água. - Aproximadamente 1,2 bilhões de pessoas ao redor do mundo bebem água não tratada. - A escassez de água afetará aproximadamente 2,7 bilhões de pessoas em 2025 de acordo com as Nações Unidas. - Doenças relacionadas à água matam de 5 a 10 milhões de pessoas, a maior parte crianças, ao redor do mundo a cada ano.

21 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 13 Ahujah (2014) destaca que mesmo um país avançado como os Estados Unidos enfrenta crises de água. Em águas para consumo humano que não são tratadas, quando a origem é diferente de um sistema de abastecimento público de água, mais de 700 compostos químicos diferentes são encontrados e destes, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency - EPA) classifica 129 como perigosos. Os processos de tratamento de água são compostos por técnicas e operações unitárias, as quais, por sua vez, variam em função de aspectos como qualidade da água bruta, custos envolvidos e vazão a ser tratada. O tratamento convencional (ou ciclo completo) é composto essencialmente de: coagulação, floculação, decantação, filtração e desinfecção, e, normalmente, não é capaz de remover de maneira satisfatória substâncias químicas presentes na água, incluindo agrotóxicos (PRINCE, 2006). Além das conhecidas formas de poluição oriundas do desenvolvimento, como instalações industriais, esgoto doméstico, atividade agrícola, entre outras atividades da civilização moderna, é importante tomar medidas de identificação e controle em poluições difusas (nonpoint source pollution NPS), definidas pela EPA como resultado do escoamento superficial da terra, precipitação, deposição atmosférica, drenagem, infiltração ou modificação hidrológica. Os poluentes naturais e os poluentes produzidos pelo homem, são espalhados até finalmente depositarem-se em lagos, rios, zonas úmidas, águas costeiras e subterrâneas. Uma das fontes de NPS preocupantes é o uso excessivo de fertilizantes, herbicidas, fungicidas e inseticidas na agricultura, tanto de grande escala quanto de escala familiar. Ahuja (2014) destaca ainda a diferença da poluição das águas doces entre os países em desenvolvimento e os desenvolvidos. Menciona que turistas em viagem para países da África, Ásia e América Latina são advertidos para não beberem a água local, sujeita à contaminação biológica. O rio Yangtze, na China, que atravessa as áreas de maior densidade populacional do mundo, possui alta poluição devido à agricultura e à indústria, tal degradação pode vir a comprometer o abastecimento de água potável para essa população nos próximos anos. Bangladesch possui um dos lençóis freáticos mais poluídos do mundo, atingindo cerca de 85% do seu território. Neste caso, a maior contaminação é por arsênio, presente naturalmente no solo. A poluição das águas também ocorre em países desenvolvidos, inclusive do Velho Continente. A Irlanda possui rios poluídos com esgoto e fertilizantes. O rio Sarno na Itália é um dos mais poluídos da Europa, devido a fontes de esgoto, resíduos da agricultura não tratados, resíduos da indústria e contaminações químicas. O rio Reno, que atravessa diversos países europeus, possui ao longo do seu percurso e nos arredores de suas margens, cerca de um quinto de toda a produção química do mundo. O rio King, na Austrália sofre com severas condições

22 14 ácidas em virtude de atividades de mineração. 40% dos rios dos Estados Unidos não são recomendados para pesca, natação entre outras atividades aquáticas. Pior ainda são os lagos, dos quais 46% se encontram nesta situação. O rio Mississipi nos Estados Unidos transporta cerca de 1,5 milhões de toneladas de poluição por nitrogênio até o Golfo do México todos os anos. Aproximadamente 4,5 trilhões de litros de esgoto não tratado, águas pluviais, e resíduos industriais são descarregados nos Estados Unidos anualmente. Tanto os países desenvolvidos quanto os países em desenvolvimento possuem seus problemas de contaminação da água. Para assegurar a sustentabilidade da água, é necessário monitorar rigorosamente tanto os aspectos pontuais quanto difusos de poluição e minimizá-los. No Brasil, conforme dados da ANA (2012), foram monitorados 1988 pontos no país no ano de 2010, tanto em áreas urbanas como rurais, avaliando o índice de qualidade da água (IQA). O IQA considera nove parâmetros da qualidade das águas: oxigênio dissolvido, coliformes termotolerantes, ph, demanda bioquímica de oxigênio, temperatura, nitrogênio total, fósforo total, turbidez e sólidos totais, sendo que as classes ruim ou péssima são águas impróprias para tratamento convencional visando abastecimento público, sendo necessário tratamentos mais avançados. Observou-se condição ótima apenas em 6% dos pontos monitorados, boa em 75%, regular em 11%, ruim ou péssima em 7%. Analisando-se apenas os corpos d água em áreas urbanas, observa-se que, no ano de 2010, 47% dos pontos monitorados apresentaram condição péssima ou ruim, reflexo da alta taxa de urbanização observada no País e dos baixos níveis de coleta e tratamento de esgotos domésticos. Esses rios urbanos geralmente apresentam suas bacias em grande parte impermeabilizadas, poluídas pelos esgotos domésticos, efluentes industriais, resíduos sólidos e cargas difusas, que impactam a qualidade de vida nas cidades brasileiras, pois degradam a paisagem urbana, reduzem as oportunidades de lazer e permitem a veiculação de doenças. No Rio Grande do Sul, as indústrias concentram-se na bacia do rio Guaíba, tendo como principais polos Porto Alegre e Caxias do Sul. Segundo o Plano Estadual de Recursos Hídricos do Rio Grande do Sul, as maiores cargas de poluentes estão localizadas nas bacias dos rios Gravataí (indústrias mecânica, alimentícia e de bebidas), Sinos (indústrias coureiro-calçadista, metal-mecânico e de autopeças) e Lago Guaíba (RIO GRANDE DO SUL, 2007 apud ANA, 2012). O panorama da qualidade das águas superficiais do Brasil (ANA, 2012) cita ainda o cultivo de arroz, que ocorre em extensas áreas do Rio Grande do Sul, gerando conflitos pontuais com o abastecimento humano, principalmente no trecho médio das unidades hidrográficas dos rios Guaíba, Patos, Mirim, no Litoral Norte Riograndense, além de ser forte potencial de poluição difusa na região, em função do uso de defensivos agrícolas.

23 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 15 Além da poluição pontual e NPS, TANG et al. (2016) avaliaram o risco de acidente com poluentes emergentes em mananciais devido ao tráfico de caminhões de cargas perigosas em pontes que foram construídas acima de pontos de captação para o abastecimento público de água. Um modelo foi desenvolvido para um rio da China e nele aplicado e concluiu que fatores como tipo de caminhão, visibilidade, tempo dirigindo, idade dos motoristas, gênero do motorista, resposta do caminhão, julgamento humano, estrada e meio ambiente são associados como os de maiores riscos. No Rio Grande do Sul, estes riscos existem em grandes cidades como Porto Alegre, como a ponte do Guaíba que liga a capital ao sul do estado; Pelotas, com uma ponte na BR 116 que passa acima da barragem Santa Barbara, a qual abastece mais de 50% da população do município; ou mesmo em municípios menores como Vacaria, que também possui uma ponte na BR 116 acima do ponto de captação de água para o abastecimento público da cidade. Os agrotóxicos, quando detectados na água, são definidos como micropoluentes, compostos químicos que, mesmo em baixas concentrações, conferem à água características de toxicidade tornando-a assim imprópria para grande parte dos usos. Muitos destes compostos provocam efeitos no sistema nervoso central humano que são bastante fortes e deletérios à saúde, além de características carcinogênicas, mutagênicas e até mesmo teratogênicas (BRASIL, 2006). A poluição oriunda da atividade agrícola é considerada do tipo difusa, de difícil identificação, monitoramento, e, consequentemente, controle. Enquanto os riscos devido à presença de agentes patogênicos constituem problema imediato, agudo e, por vezes, associados a surtos de grandes proporções, os riscos químicos configuram-se, normalmente, como um problema de longo prazo, cujos efeitos crônicos, muitas vezes, são de difícil detecção. A preocupação maior ocorre para a ingestão contínua de água contaminada a baixas concentrações, o que configuraria um risco crônico (NETO, 2010). 2.2 Agrotóxicos Os agrotóxicos são definidos como produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas, além do uso em ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-la da ação danosa de seres

24 16 vivos considerados nocivos, conforme conceito disposto na Lei Federal nº 7802 de 1989 (BRASIL, 1989). A contaminação de um corpo d água por agrotóxicos ocorre principalmente de forma difusa, o que evidentemente dificulta a adoção de medidas que impeçam sua chegada aos rios, lagos e captações subterrâneas, pois tais medidas dependem da recuperação da mata ciliar. Os agrotóxicos podem chegar à água por fatores intrínsecos às substâncias, como propriedades do solo, condições climáticas e formas de aplicação do produto. Os principais mecanismos responsáveis pela movimentação dos princípios ativos são: retenção, transformação e transporte. Os processos de retenção são condicionados pela interação entre a partícula de solo e o princípio ativo (adsorção). A transformação refere-se à degradação (natural ou não) do produto, podendo ter natureza química ou biológica. O transporte do agrotóxico entre os diferentes meios pode ocorrer mediante a volatilização, lixiviação, escoamento superficial ou evaporação (NETO, 2010). A única forma de combate ao problema é por meio de uma racionalização no uso de agrotóxicos, envolvendo campanhas esclarecedoras e utilização de mecanismos institucionais e legais para limitação de seu emprego. No Brasil, antes da comercialização, um agrotóxico passa pela avaliação de três órgãos de governo: 1) Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) avaliação da questão ambiental; 2) Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) avaliação da questão de toxicidade humana; 3) Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento avaliação da eficiência agronômica. O uso de agrotóxicos tem afetado a saúde da população e o meio ambiente. Pesticidas têm sido amplamente distribuídos, e seus traços têm sido detectados em todas as áreas do meio ambiente: ar, água e solo (YADAV, 2015). ABHILASH e SINGH (2009) relataram que aproximadamente 2 milhões de toneladas de pesticidas eram consumidos no mundo a cada ano, sendo 24% nos EUA, 45% na Europa e os 25% remanescentes no restante do mundo. A Tabela 2.1 relaciona a quantidade de pesticidas utilizada anualmente, bem como de ingredientes ativos (IA) de alguns países do mundo.

25 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 17 Tabela Consumo anual de pesticidas em diferentes países País t IA t Pesticidas Bangladesh Camboja China Coreia do Norte Índia Coreia do Sul Fonte: Abhilash e Singh (2009). Malásia Myanmar Nepal Paquistão Fiilipinas Sri Lanka Tailândia Vietnã Em 2008, o Brasil se tornou o maior mercado consumidor de agrotóxicos do mundo, um total de vendas desses produtos no valor de US$7,125 bilhões, superior aos US$6,6 bilhões do segundo colocado, os Estados Unidos (ANDEF, 2009 apud IBAMA, 2010, apud ANA, 2012). Em 2010, o mercado nacional de agrotóxicos (produtos formulados) atingiu cerca de 790 mil toneladas, com marcas comerciais registradas, contemplando 369 ingredientes ativos (MAPA, 2012, apud ANA, 2012). No Brasil, as vendas anuais de agrotóxicos e afins, entre os anos de 2000 a 2013, mais que dobraram, aumentando de ,53 toneladas de IA em 2000 para ,55 toneladas em O crescimento mais acentuado ocorreu na Região Centro-Sul do País, com destaque para os Estados de São Paulo, Paraná, Mato Grosso, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul e Goiás. O RS configura-se como o quarto estado de maior volume de vendas, com cerca de 10% do volume nacional (IBAMA, 2013). Na Tabela 2.2, observa-se um aumento de 51% no volume de vendas de agrotóxicos no RS no período de 2009 a 2013.

26 18 Tabela Vendas de agrotóxicos e afins no RS Unidade de medida = toneladas de IA Ano t IA , , , , ,87 Fonte: IBAMA, Legislação sobre agrotóxicos no padrão de potabilidade da água A Portaria BSB nº 56/1977, foi a primeira da legislação nacional que estabeleceu o padrão brasileiro de potabilidade de água, após assinatura do Decreto Federal nº /1977. Esse Decreto previu a competência do Ministério da Saúde para legislar sobre as normas e o padrão de potabilidade da água para consumo humano. A Portaria BSB nº 56/1977 foi revisada em 1990 e resultou na Portaria GM nº 36/1990, seguida da Portaria MS nº 1469/2000, Portaria MS nº 518/2004 até o texto vigente inserido na Portaria MS nº 2914/2011. No Anexo VII (Tabela 2.3) da Portaria MS 2914/2011 são exigidas, com frequência semestral, análises de controle de 27 parâmetros de agrotóxicos por parte dos responsáveis pelo abastecimento público de água. Na Tabela 2.3, além do nome dos compostos e identificação do número de registro CAS (Chemical Abstracts Service), é indicado também o valor máximo permitido (VMP). O estabelecimento do padrão de potabilidade para substâncias químicas que representam risco à saúde é conduzido a partir da avaliação quantitativa do risco. O VMP para cada substância é, geralmente, estabelecido a partir de evidências toxicológicas ou epidemiológicas, as quais permitem estimar um nível de efeito adverso não observado (NETO, 2010). Tabela Parâmetros de agrotóxicos exigidos no padrão nacional de potabilidade de água da Portaria MS 2914/ Parâmetro CAS (1) Unidade VMP (2) 2,4 D + 2,4,5 T (2,4 D) (2,4,5 T) μg/l 30 Alaclor μg/l 20 Aldicarbe + Aldicarbesulfona + Aldicarbesulfóxido (aldicarbe) (aldicarbesulfona) (aldicarbe sulfóxido) μg/l (aldrin) (dieldrin) μg/l 0,03 Aldrin + Diedrin Atrazina μg/l 2 1 Anexo VII - Portaria MS N 2914/2011

27 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 19 Parâmetro CAS (1) Unidade VMP (2) Carbendazim + benomil (carbendazim) (benomil) μg/l 120 Carbofurano μg/l 7 Clordano μg/l 7 Clorpirifós + clorpirifós-oxon (clorpirifós) (clorpirifós-oxon) μg/l 30 DDT+DDD+DDE p,p'-ddt ( ) p,p'- DDD ( ) p,p'-dde μg/l 1 ( ) Diuron μg/l 90 Endossulfan (α β e sais) (3) ; I ( ); II ( ); sulfato ( ) μg/l 20 Endrin μg/l 0,6 Glifosado + AMPA (glifosato) (AMPA) μg/l 500 Lindano (gama HCH) μg/l 2 Mancozebe μg/l 180 Metamidofós μg/l 12 Metolacloro μg/l 10 Molinato μg/l 6 Parationa Metílica μg/l 9 Pendimentalina μg/l 20 Permetrina μg/l 20 Profenofós μg/l 60 Simazina μg/l 2 Tebuconazol μg/l 180 Terbufós μg/l 1,2 Trifluralina μg/l 20 (1) CAS é o número de referência de compostos e susbtâncias químicas adotado pelo Chemical Abstract Service. (2) Valor Máximo Permitido (3) Somatório dos isômeros alfa, beta, e os sais de endossulfan, como exemplo o sulfato de endossulfan Fonte: Ministério da Saúde (2011). Em um levantamento realizado pela Secretaria Estadual da Saúde do RS (SES RS), foram identificados e quantificados os agrotóxicos utilizados nas principais culturas agrícolas de cada bacia hidrográfica do RS, com a finalidade de adequar o monitoramento da qualidade da água para consumo humano à realidade de uso dos agrotóxicos no estado. No ranqueamento dos princípios ativos com maior risco à saúde humana usados nas culturas do RS, considerando como variáveis as principais características físico-químicas dos compostos, o volume total

28 20 utilizado nas lavouras e a toxicidade descrita, foi constatado que, dos 10 parâmetros avaliados como mais críticos, sete não estavam contemplados na Portaria Nacional MS 2914/2011. Com base nesses resultados, foi elaborada e publicada a Portaria SES RS 320/2014 que acrescenta 46 compostos (Tabela 2.4) à exigência de análises semestrais dos responsáveis pelo abastecimento público de água no território gaúcho. Além disso, o levantamento também apontou que a Região Noroeste do Estado, correspondente à Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí, é a que apresenta os maiores volumes anuais de aplicação de agrotóxicos por km², chegando a 919 L km - ² ano -1, tendo um volume anual estimado de litros de calda (mistura líquida do produto defensivo em água) (BARRETO et al., 2012). Tabela Parâmetros adicionais de agrotóxicos exigidos ao padrão de potabilidade de substâncias químicas, no controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano no RS, conforme Anexo I da Portaria SES RS nº 320/2014. Parâmetro CAS (1) Unidade VMP (2) Abamectina μg/l 12 Acefato + Metamidofós (acefato) (metamidofós) μg/l 4,8 Bifentrina μg/l 120 Carbaril μg/l 18 Cianamida μg/l 12 Cipermetrina μg/l 300 Ciproconazol μg/l 60 Cletodim μg/l 60 Clorimurom-etilico μg/l 120 Clorotalonil μg/l 180 Cresoxim-metil μg/l 2400 Diazinona μg/l 12 Difenoconazole μg/l 60 Diflubenzuron μg/l 120 Dimetoato μg/l 12 Ditianona μg/l 60 Epoxiconazol μg/l 18 Etoxosulfuron μg/l 240 Fenitrotiona μg/l 30 Fenoxaprop-p-etilico μg/l 15 Fentiona μg/l 42 Fipronil μg/l 1,2 Flutriafol μg/l 60 Folpet μg/l 600 Fomesafem μg/l 18 Gama-cialotrina μg/l 6 Hidrazida maleica μg/l 1800 Imazetapir μg/l 1500

29 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 21 Parâmetro CAS (1) Unidade VMP (2) Imidacloprido μg/l 300 Indoxacarbe μg/l 60 Iodosulfurom-metilico μg/l 180 Ioxinil octanoato μg/l 30 Lambda-cialotrina μg/l 30 Mesotriona μg/l 30 Metalaxil-m (Mefenoxam) μg/l 480 Metamitrona μg/l 150 Metidationa μg/l 6 Metiram + Mancozebe (metiram) (expresso em CS2) (mancozebe) μg/l 180 Metsulfuron metil μg/l 60 Picoxistrobina μg/l 258 Tembotriona μg/l 2,4 Tetraconazol μg/l 30 Tiametoxam μg/l 120 Tiodicarbe μg/l 180 Tiofanato-metilico + Carbendazim + Benomil ( μg/l) - (expresso em carbedazim) (tiofanato-metilico) (carbendazim) (benomil) μg/l 120 Triciclazol μg/l 180 (1) CAS é o número de referência de compostos e susbtâncias químicas adotado pelo Chemical Abstract Service. (2) Valor máximo permitido Fonte: SES RS (2014) Classificações dos Agrotóxicos Uma das formas de se classificar os pesticidas é de acordo com o objetivo da aplicação: de eliminar determinados organismos. São os herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicida, acaricida e raticida (PLIMMER, 2001). As principais classificações dos agrotóxicos em termos de composição química, relacionadas às características estruturais dos compostos são: organofosforados, organoclorados, carbamados e piretróides (CORDATA, 2009). O desenvolvimento de novos compostos é muito rápido, e novas classes têm surgido como triazinas, amidos (haloacetanilides), benzonitrilos, tiocarbamatos, dinitroanilinas, ureias, ácidos fenoxi, éteres difenil, piridazinonas, compostos bipyridinuum, ureias e uracilos, sulfonilureias, imidazolinonas, ácidos carboxílicos halogenados, orgânicos e organometálicos (PLIMMER, 2001).

30 22 A classificação por composição química é importante por indicar a reatividade potencial e serve como base para estimar propriedades físico-químicas e comportamento no meio ambiente. Organoclorados afetam a transmissão neural, enquanto que carbamatos e organofosforados, os quais são mais suscetíveis à degradação ambiental que a maioria dos organoclorados, são inibidores de acetilcolinesterase. Para contornar o aumento de resistência dos diferentes organismos pesticidas, novos modos de ação foram desenvolvidos, desencadeando em novos inseticidas, como por exemplo a introdução de piretroides, que atuam no sistema nervoso central, minimizando estes efeitos de desenvolvimento de resistência. Além disso, um dos aspectos que deve se atentar são os metabólitos destes novos pesticidas presentes no meio ambiente. Eles geralmente são mais polares e mais solúveis em água do que seus compostos de origem (PLIMMER, 2001). Os organoclorados foram os pioneiros dos agrotóxicos sintéticos. Em relação à estrutura molecular, são constituídos de hidrocarbonetos clorados e, além do cloro, alguns deles podem possuir oxigênio. São derivados do clorobenzeno, do ciclo-hexano e/ou do ciclodieno. Foram muito utilizados na agricultura como inseticidas; contudo, seu emprego tem sido progressivamente restringido ou mesmo proibido (BAIRD, 2002 apud DONATO, 2012). A resistência à biodegradação no solo parecia ser uma vantagem econômica nesta classe de agrotóxicos; entretanto, a detecção de resíduos em peixes e outros animais indicou que estes pesticidas estavam sendo transportados além do ponto de aplicação e que algumas espécies selvagens poderiam estar em risco. Os organoclorados afetam a transmissão neural (PLIMMER, 2001). ABHILASH e SINGH (2009) alertam que muitos pesticidas que foram vastamente usados no passado e hoje são proibidos ainda são encontrados no ar, água e solo devido à característica de persistência. Atrelam também à dosagem em excesso como causa. Os organofosforados foram os primeiros a substituírem os representantes dos organoclorados, aos quais os insetos já apresentavam resistências. Quanto à sua estrutura molecular, são ésteres, amidas ou derivados tiol dos ácidos de fósforo. São compostos biodegradáveis e, portanto, apresentam curta persistência no solo. A hidrólise sob condição de alcalinidade é o principal meio de degradação no ambiente (JOKANOVIC, 2001). São universalmente aplicados por causa de seu baixo custo, pronta disponibilidade, ampla gama de eficácia, capacidade para combater um grande número de espécies de pragas e pelo fato de serem menos estáveis no ambiente do que os compostos organoclorados, não se caracterizando como persistentes (TANKIEWICZ, 2010). São normalmente estáveis à temperatura ambiente, mas a temperaturas elevadas, bons níveis de isômero podem ser obtidos. E a isomerização de organofosforados é algo importante na relação de toxicidade. Por exemplo, a ligação P=S pode

31 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 23 ser isomerizada para P-S- e o produto pode ser substancialmente mais tóxico para mamíferos. (PLIMMER, 2001). Carbamatos são agrotóxicos orgânicos derivados do ácido carbâmico e podem ser inseticidas, herbicidas ou fungicidas. Geralmente, são compostos instáveis e vários fatores influenciam a degradação, como, por exemplo, umidade, temperatura, luminosidade e volatilidade (BARBOSA, 2004 apud DONATO, 2012). A toxicidade para mamíferos é geralmente mais baixa que organofosforados. Os carbamatos são degradados no solo; todavia em solos arenosos, sulfóxido e aldicarbe sulfona, os principais metabólitos do aldicarbe, são lixiviados o suficiente para chegar à água a partir do solo (PLIMMER, 2001). Piretroides são inseticidas cuja presença é encontrada na natureza a partir de extratos de piretro, obtido a partir de flores secas de Chrysanthemum cinerariifolium e Chrysanthemum coccineum. Extratos de piretro são uma mistura de ácido crisantêmico e três ésteres correspondentes de ácido e álcool oriundos do piretro. Piretróides possuem efeito rápido sobre insetos, causando paralisia e baixa toxicidade para mamíferos. O uso dos piretróides naturais é limitado na agricultura porque degradam rapidamente na luz do Sol. Enquanto isso, os piretróides sintéticos atingiram o objetivo de estabilidade sem perda de atividade do inseticida após aplicação e representam um avanço em termos de desenvolvimento por afetar apenas sítios do sistema nervoso central (PLIMMER, 2001). Uma outra classificação pertinente em relação aos agrotóxicos é no que diz respeito a toxicidade. Uma característica normalmente utilizada para avaliar a toxicidade aguda dos agrotóxicos e outras substâncias químicas é a Dose Letal 50% (DL50), que é definida como a quantidade (dose única) da substância necessária para matar 50% dos animais testados nas condições experimentais utilizadas. Esta medida varia muito com o tipo de composto (MARTEL, 2013). Neste sentido, os agrotóxicos são agrupados em quatro classes toxicológicas, de acordo com a DL50, com as concentrações variando de 0-50 na Classe I até > 5000 mg Kg -1 para a Classe IV. A identificação dos rótulos desses produtos é feita através de faixas coloridas, de acordo com as características toxicológicas. Assim, os rótulos dos produtos da Classe I que são extremamente tóxicos possuem uma faixa vermelha. Altamente tóxicos são os da classe II de faixa amarela; medianamente tóxicos os da classe II, faixa azul; e cor verde a classe IV identificando os pouco tóxicos (BARBOSA, 2004 apud NETO, 2010).

32 Técnicas Analíticas para Análise de Agrotóxicos na Água A análise de agrotóxicos na água envolve as etapas de amostragem, pré-tratamento das amostras, medida (técnicas de detecção) e tratamento dos dados. Neste capítulo será feita uma revisão do que consiste cada etapa das técnicas de análise de agrotóxicos na água mais implementadas atualmente, bem como sua evolução Amostragem A amostragem envolve a coleta das amostras de água no campo para avaliação de riscos. É uma das partes primordiais e seu planejamento deve incluir a avaliação climática. Como a água das chuvas é a principal forma de transporte dos agrotóxicos, após a aplicação no solo, até os mananciais superficiais ou subterrâneos, o ideal é que a coleta ocorra após períodos de chuvas Pré-tratamento das amostras Um dos maiores desafios na área de micropoluentes na água é a separação dos poluentes de interesse dos componentes da matriz e o alcance de baixos níveis de detecção. Há diferentes técnicas disponíveis de concentração ou remoção da matriz e são escolhidas de acordo com as características químicas dos poluentes, bem como a necessidade de identificação de poluentes desconhecidos (Bruzzoniti et al., 2000). Caldas et al. (2011) publicaram uma revisão a respeito da extração, correspondente à etapa de pré-tratamento que inclui o isolamento e a pré-concentração dos analitos, sendo no caso agrotóxicos em água. O desenvolvimento de diferentes técnicas visa o preparo de amostra de forma rápida e de baixo custo, com menor uso de volumes de solventes e que atendam as faixas aceitáveis de recuperação. Os métodos tradicionais de preparo, tais como a extração líquido-líquido, requerem grandes volumes de solventes orgânicos, apresentam custo elevado, são de difícil automação e trabalhosos. Os contaminantes, se existentes nas amostras, estão muito diluídos e podem estar no meio de uma matriz complexa, conforme ressaltado por Picó et al. (2007). A extração em fase sólida tem vantagens em relação à extração líquido-líquido: menor tempo de análise e uso de solvente, evita a formação de emulsões, facilidade de automação, altas porcentagens de recuperação do analito, capacidade de aumentar seletivamente a concentração do analito e

33 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 25 disponibilidade comercial de muitos equipamentos e sorventes. A seguir são apresentadas as quatro principais técnicas de extração utilizadas atualmente para análise de agrotóxicos em água Extração em Fase Sólida A técnica de SPE consiste em isolar os analitos presentes em uma matriz complexa, a partir da sorção por meio de uma fase sólida. As etapas da extração resumem-se na ativação do sorvente, percolação da amostra/sorção dos analitos no sorvente, eliminação dos interferentes da matriz, eluição dos analitos e posterior concentração do composto de interesse, conforme demonstrado na Figura 2.1. Figura Representação esquemática das etapas envolvidas na SPE: condicionamento do sorvente, adição da amostra, remoção dos interferentes e eluição do analito. Fonte: CALDAS et al. (2011) Os sorventes podem ter diferentes composições. Os sorventes poliméricos são usados para diversas classes de agrotóxicos. A escolha do sorvente depende da polaridade do analito e da possível coextração de interferentes. A etapa de condicionamento do cartucho destina-se a ativar o sorvente, e o solvente a ser utilizado nessa etapa dependerá principalmente do material a ser ativado. Um estudo de GATIDOU et al. (2005) otimizou os parâmetros da extração SPE, avaliando o tipo de sorvente

34 26 e de solvente orgânico para a eluição. Os resultados obtidos da pesquisa demonstraram que o uso de metanol como solvente apresentou melhor resposta ao processo de extração. Os três surfactantes avaliados (step pak, ENV e Envi-Chrom) obtiveram os mesmos resultados, possibilitando a escolha pelo de menor custo Microextração em Fase Sólida A microextração em fase sólida (solid phase microextraction - SPME) consiste em uma técnica de extração na qual uma fibra de sílica fundida envolvida em um filme polimérico é imersa na amostra, absorvendo os analitos. Posteriormente é realizada a extração sortiva que pode ser por um mecanismo térmico ou utilizando um solvente (ARTHUS, 1990). A técnica pode ser aplicada também para frutas, todavia é acrescentado um solvente orgânico no intuito de extrair os possíveis contaminantes da fase sólida que posteriormente será aplicado a SPME. Conforme uma revisão de Picó et al. (2007), em mais de 100 publicações referentes aos anos de 2003 e 2006, as técnicas mais aplicadas foram SPE e SPME, respectivamente, em 17 e 25% dos artigos. As demais técnicas mencionadas estavam presentes em menor número de publicações Extração Sortiva em Barra Magnética A extração sortiva em barra magnética (stir bar sorptive extraction - SBSE) foi proposta para preparo de amostra sem solvente, visando extrair e pré-concentrar compostos orgânicos de amostras aquosas. A SBSE consiste na absorção do analito em um sólido, uma camada polimérica que reveste uma barra magnética envolta em uma camada de vidro. BALTUSSEN et al. (1999) observaram que compostos mais apolares são extraídos de forma mais significativa que os menos apolares. A observação da polaridade das moléculas na eficiência da extração pode ser explicada pela relação de fases de equilíbrio. A barra de agitação está revestida com a fase extratora (filme de sorvente, normalmente polidimetilsiloxano), conforme as moléculas interagem entre a fase aquosa e o sorvente, ocorre a partição do analito entre a fase aquosa e a extratora, até estabelecer o equilíbrio entre as fases. De acordo com a concentração de fase extratora na barra magnética há alteração da capacidade de extração e eficiência do processo. Os limites de detecção encontrados são na ordem de partes por bilhão (ppb) para a maioria dos analitos polares enquanto que para os compostos apolares são na ordem de 10 partes por trilhão

35 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 27 (ppt). Compostos voláteis também podem ser analisados por esta técnica e alcançam detecção da ordem de ppt Microextração Líquido-Líquido Dispersiva O princípio básico da microextração líquido-líquido dispersiva (dispersive liquid-liquid microextraction - DLLME) consiste na dispersão de um solvente extrator (imiscível em água) e um solvente dispersor (miscível em água e no solvente extrator) em uma solução aquosa, o que proporciona uma grande área de contato entre a fase aquosa e o solvente extrator. Uma mistura apropriada do solvente dispersor e do solvente extrator é injetada rapidamente, com auxílio de uma seringa, na solução aquosa. Após leve agitação, uma solução turva com micro gotas é formada. As micro gotas consistem no solvente extrator mais o analito já extraído. Após a centrifugação, ocorre a sedimentação das micro gotas formando uma fase sedimentada, que é retirada com o auxílio de uma seringa, e após efetuada a quantificação dos analitos pela técnica mais apropriada. Fatores como o solvente para extração, solvente dispersor, volume de solvente para extração, volume de solvente dispersor e tempo de extração são variáveis importantes a serem definidas para um resultado otimizado de extração. Comparando com a SPME é uma técnica rápida, simples e barata (REZAEE et al., 2006) Técnicas Analíticas Há diversas técnicas disponíveis para análises de agrotóxicos em água. A escolha depende desde propriedades físico-químicas dos agrotóxicos a serem analisados até as condições disponíveis para uso e otimização. Um dos principais objetivos desta parte da revisão é demonstrar brevemente os mecanismos de algumas técnicas, sua empregabilidade, com maior enfoque para as com melhor sinal/resposta e limites de detecção que alcancem a ordem de ppt. Neste presente item serão abordadas as técnicas de separação (cromatografia líquida e gasosa) e a espectrometria de massas com as suas principais combinações de componentes para identificação. Após, será descrito sobre os acoplamentos entre estas técnicas, que podem trazer benefício para ambas as áreas, tanto separação quanto identificação, especialmente com as novas exigências de melhoria na sensibilidade dos métodos, aumento na complexidade das amostras, exigência de maiores critérios de identificação de compostos de interesse na área ambiental, forense, alimentos e outras (LANÇAS, 2009). Finalmente, uma abordagem sobre publicações das técnicas aplicadas no RS para análise de agrotóxicos em água desde 1999.

36 Separação: Cromatografia Gasosa e Cromatografia Líquida A escolha da técnica de separação depende das características dos pesticidas de interesse. A cromatografia gasosa (CG) se aplica para compostos voláteis, semi-voláteis e compostos termicamente estáveis. Enquanto que não voláteis e termicamente instáveis são mais indicados para Cromatografia Líquida (LC) que pode separar um grande número de compostos similares. Os pesticidas empregados atualmente são mais polares, termicamente instáveis ou não voláteis, o que prioriza o uso de LC (TETTE et al., 2016) A cromatografia é uma técnica na qual os componentes de uma mistura são separados com base nas diferenças de velocidade nas quais são transportados através de uma fase estacionária (coluna cromatográfica) por uma fase móvel líquida (cromatografia líquida) ou gasosa (cromatografia gasosa). Um detector é posicionado ao final da coluna cromatográfica para registrar o sinal do analito, eluído da coluna para análise qualitativa e quantitativa deste composto (SKOOG, 2008) Identificação: Espectrometria de Massas Um número considerável de trabalhos nesses últimos anos tem utilizado o espectrômetro de massas como detector para análises de agrotóxicos em água, pois permite a obtenção de limites de quantificação menores, bem como a confirmação dos compostos presentes na amostra ao gerar os respectivos espectros de massas. Além disso, possui maior seletividade e minimiza a necessidade de se obterem separações cromatográficas com grande resolução, já que é possível a quantificação de compostos que coeluem. O espectrômetro de massas fornece informações estruturais para confirmações inequívocas, as quais são de grande importância para a análise de multi-resíduos (CALDAS et al., 2011; TETTE et al., 2016). O espectrômetro de massas consiste em uma fonte de íons, um analisador ou separador de massas e um detector, sendo que os dois últimos são operados sob condições de baixas pressões. A fonte de íons não necessariamente estará sob baixas pressões, podendo ficar em pressão atmosférica (GROSS, 2004). Na Figura 2.2 é possível verificar os componentes básicos de um espectrômetro de massas.

37 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 29 Figura Componentes de um espectrômetro de massas Fonte: Cabrera (2012) Ionizadores A sensibilidade da resposta no espectrômetro de massa é claramente dependente da tecnologia de interface aplicada. Há três interfaces que representam a melhor escolha para análise de agrotóxicos: atmospheric pressure ionization (API), atmospheric pressure chemical ionization (APCI) e ionização por eletronebulização (electrospray ionization ESI). A escolha do ionizador ideal depende da classe de compostos investigada. Pesticidas neutros e básicos são mais sensíveis utilizando APCI, enquanto herbicidas catiônicos e aniônicos são melhores ionizados com ESI. Uma ionização ótima também vai depender da fase móvel da coluna. Os compostos se comportam de diferentes formas. Por isso, a seleção da fase móvel e do ionizador são avaliados de forma experimental e dificultam a escolha quando há pesticidas com diferentes propriedades físico-químicas (KUSTER et al., 2006). Na parte experimental deste trabalho, a interface utilizada para ionização será a ESI. A ESI segue o seguinte mecanismo: o eluato da coluna contendo o analito de interesse passa através de um capilar, à pressão atmosférica, mantido sob alta voltagem. Na saída desse capilar são formadas pequenas gotas altamente carregadas (spray) que são dessolvatadas ao se deslocarem em sentido contrário ao posicionamento de um eletrodo em uma região de pressão atmosférica. Essa dessolvatação é assistida por um fluxo contínuo de gás seco (geralmente N2), e à medida que ocorre dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido até o ponto em que a força de repulsão entre as cargas similares torna-se maior que as forças de coesão da fase líquida

38 30 (tensão superficial). Nesse momento, ocorre a chamada explosão coulômbica, que gera gotas com tamanhos equivalentes a 10% do tamanho das gotas a partir das quais se originaram, são então produzidos os íons do analito após serem submetidos a uma série dessas explosões, os mesmos são transferidos para o interior do espectrômetro de massas por uma série de dispositivos de focalização. A ESI possibilita a ionização de compostos sensíveis à temperatura sem que estes sofram degradação, uma vez que, a ionização ocorre diretamente em solução. É ideal para análise de moléculas mais polares, de maior massa molecular (CHIARADIA et al., 2008) Analisadores Os analisadores de massa separam os íons de acordo com a relação m/z existente entre suas massas (m) e cargas (z). A escolha do mais apropriado deve ser feita considerando-se a aplicação (ex. faixa de massas desejada), desempenho desejado (ex. resolução) e custo (em função do tipo de analisador). Segundo VÉKEY (2001), a diferença mais importante entre os espectrômetros de massas é o tipo de analisador utilizado, sendo característica fundamental do instrumento. Alguns exemplos são: quadrupolo, triplo quadrupolo e tempo de voo. O tipo quadrupolo é o analisador de massas mais difundido devido, principalmente, à sua simplicidade, preço relativamente baixo e boa linearidade em análises quantitativas. É composto de quatro barras, usualmente feitas de metal, dispostas em dois pares. Um destes pares é mantido em um potencial elétrico positivo, enquanto que o outro a um potencial negativo. Uma combinação de corrente contínua (DC) e radiofrequência (Rf) é aplicada nas barras. Ajustando-se apropriadamente as voltagens (DC e Rf), uma trajetória estável é criada para que os íons de certa razão m/z passem através do analisador e sejam detectados. Os demais íons que entrarem no quadrupolo terão suas trajetórias instáveis e, como consequência, atingirão as barras e serão eliminados pela bomba de vácuo (LANÇAS, 2009; CHIARADIA et al., 2008; STASCHENKO e MARTÍNEZ, 2010). O analisador do tipo triplo quadrupolo, como o nome sugere, é constituído por três quadrupolos em série. O íon de interesse é pré-selecionado no primeiro quadrupolo (Q1). Após, no segundo quadrupolo (Q2), ou cela de colisão, o íon precursor proveniente do primeiro quadrupolo é acelerado por um potencial elétrico para uma região de baixas pressões onde ocorrem repetidas colisões com um gás inerte de elevada energia (normalmente argônio, hélio ou nitrogênio), resultando em um aumento de energia potencial deste íon até ocasionar sua

39 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 31 fragmentação, conduzindo à formação de íons produto. Os fragmentos desta colisão, são analisados no terceiro quadrupolo (Q3) (PÍCO et al., 2004; CHIARADIA et al., 2008). O analisador triplo quadrupolo é extremamente útil quando a separação cromatográfica não é completa. A ausência da varredura permite que o equipamento focalize apenas o precursor e o produto, aumentando a sensibilidade para o monitoramento, que é associado a um aumento na seletividade (CHIARADIA et al., 2008). KUSTER et al. (2006) apontam a configuração LC-MS/MS como a mais usada para análise de resíduos de pesticidas no sistema LC acoplado com um triplo quadrupolo (QqQ) e API interface. O princípio de operação dos analisadores do tipo Tempo de Voo (Time of Flight - TOF) baseia-se na medida do tempo de voo de um íon dentro do espectrômetro de massas. Uma vez que as dimensões do tubo e a energia cinética dos íons são bem conhecidas, o cálculo da razão m/z torna-se simples. A principal limitação deste analisador é a baixa resolução (LANÇAS, 2009). Resíduos de pesticidas continuam sendo o foco de muitas pesquisas ambientais, e o número de artigos descrevendo o desenvolvimento de novos métodos somente aumenta. KUSTER et al. (2006) apontam para o futuro uma expectativa de desenvolvimento de analisadores de massa, tal como um triplo quadrupolo, ou um híbrido quadrupolo tempo de voo Detector O detector é o último módulo de um espectrômetro de massas. Assim como o analisador é considerado o coração de um espectrômetro de massas, o detector pode ser entendido como seus olhos. Existe atualmente uma grande variedade de detectores para MS, os mais empregados são Chapas Fotográficas, Detector de Faraday e os detectores baseados na multiplicação de elétron, Electron Multiplier (EM), sendo que, este último é o mais empregado atualmente para detecção de íons, por apresentar uma boa razão entre custo e benefício. O detector registra a carga induzida ou a corrente produzida quando um íon atravessa uma superfície ou atinge sua superfície. A varredura realizada pelo detector irá gerar um espectro de massas que é um registro dos íons detectados em função da razão m/z (LANÇAS, 2009). O detector por multiplicação de elétrons será aplicado no presente trabalho. Este detector utiliza como cátodo, um metal, óxido metálico ou liga que apresenta facilidade em perder elétrons quando atingida por íon. Sendo assim, quando um íon atinge o metal e remove elétrons, estes são direcionados para outro eletrodo por diferença de potencial retirando outros elétrons e assim sucessivamente. Este processo é, então, multiplicado em cascata em vários

40 32 eletrodos colocados no tubo até que ao final do processo é coletado um grande número de elétrons, provenientes de cada íon que chegou inicialmente no cátodo. O fator de ampliação é de mais de elétrons para um único íon incidente na Multiplicadora de Elétrons (LANÇAS 2009) Modos de Operação Modos de operação são as maneiras que o espectrômetro de massas pode ser programado para aquisição dos dados SCAN No modo product ion scan ou SCAN, de operação o espectrômetro de massas é programado de forma a analisar todas as massas do seu espectro de operação dentro de uma faixa determinada de m/z. (VÉKEY, 2001). No modo Selected Ion Storage (SIS) ou Single Ion Monitoring (SIM) após a ionização o espectrômetro faz a separação de somente um íon específico, o que aumenta a sensibilidade uma vez que os íons correspondentes ao ruído são ejetados sem chegar ao detector. Em alguns equipamentos podem ser selecionados até três íons simultaneamente (VÉKEY, 2001) Acoplamento O desenvolvimento de agrotóxicos polares, que, em geral apresentam menor persistência e toxicidade quando comparados com os compostos apolares, exigiu a adequação dos métodos de análise existentes, uma vez que a maioria destes novos compostos não apresenta uma boa resposta quando analisados por GC, pois a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) limita a técnica à análise de compostos voláteis e semivoláteis de baixa polaridade e baixa massa molecular. A combinação da LC com o acoplamento de analisadores com grandes capacidades de detecção possibilitou o desenvolvimento de métodos que possuem como característica maior seletividade, sensibilidade e especificidade (CALDAS et al., 2011; LANÇAS, 2013). Dentre os detectores que podem ser utilizados na cromatografia líquida e na gasosa, a Espectrometria de Massas tem apresentado grande destaque pela sua versatilidade de uso com ambas as técnicas, além disso, a combinação destas duas técnicas tem como vantagens a alta

41 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 33 seletividade e separação eficiente, proveniente da cromatografia, e informações estruturais e aumento da seletividade oriundo da espectrometria de massas (LANÇAS, 2009). Apesar de ser uma excelente técnica de separação, a LC necessita de uma técnica confirmatória quando a análise qualitativa (confirmação da identidade química) é também necessária. Dentre as várias opções existentes, a espectrometria de massas é a técnica que melhor oferece informações estruturais; o acoplamento entre estas duas técnicas dá origem a uma ferramenta analítica versátil e de grande potencial na análise qualitativa e quantitativa: a LC/MS (Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas) (LANÇAS, 2013). Os pesticidas evoluíram ao longo do tempo indo de persistentes/não degradáveis, para mais polares e degradáveis, tornando-se importante analisar estes produtos da degradação. LC- MS/MS representa o método mais moderna de determinação de pesticidas e seus produtos de degradação, muitos deles polares, de baixa volatilidade, e/ou compostos termo -instáveis. O acoplamento LC-MS/MS utiliza o analisador triplo quadrupolo, onde o primeiro e o terceiro quadrupolos fazem análises, o primeiro do íon, e o terceiro de fragmento do íon, após fragmentação no segundo quadrupolo, sendo devido a estas duas análises a denominação MS/MS. A LC-MS/MS possibilita eliminar interferências espectrais e minimizar o problema de coeluição de substâncias presentes na matriz, sendo o detector de massas uma ferramenta analítica essencial para análise e confirmação dos analitos de interesse em baixas concentrações (KUSTER et al., 2006). 2.4 Técnicas Analíticas Implementadas no RS As pesquisas científicas no Estado do Rio Grande do Sul corroboram para a avaliação da presença de agrotóxicos na água, constatando inclusive, diversos parâmetros que não são exigidos nas portarias nacional e gaúcha, e propulsionando reformulações nas legislações. Grupos de pesquisa presentes na Universidade Federal de Santa Maria, Universidade Federal de Pelotas, Fundação Universidade Federal de Rio Grande, Universidade de Passo Fundo, entre outras, avaliaram a presença de diversos agrotóxicos em mananciais hídricos superficiais e subterrâneos em diferentes regiões do RS, de água bruta e tratada. As análises foram realizadas por cromatografia líquida ou gasosa, acompanhadas de diferentes tipos de detectores. Abaixo seguem as técnicas utilizadas: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC- DAD);

42 34 Cromatografia Gasosa com Detecção por Captura de Elétrons (GC-ECD); Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Captura de Elétrons (HPLC-UV); Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-MS); Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas Sequencial (LC-MS/MS); Cromatografia Líquida com Ionização por Eletronebulização Acoplada à Espectrometria de Massas Sequencial (LC-ESI-MS/MS). A escolha entre as técnicas depende da instrumentação disponível em cada laboratório. Na Tabela 2.5 há um compilado desde o ano de 1999, com diversos trabalhos publicados a partir de pesquisas no RS. Tabela 2.5. Trabalhos publicados sobre a detecção da presença de agrotóxicos na água de mananciais do RS Técnica Pesticidas Manancial Água Coletas Período Fonte Analítica (1) Superficial Bruta Região Central do RS HPLC-DAD ZANELLA et al., 2002 (2) Superficial Bruta Agudo 2003 HPLC-UV e CG-ECD BORTOLUZZI et al., 2006 (3) Superficial e Subterrânea Bruta e Tratada Agudo, Arvorezinh a e Cristal GC-ECD e HPLC-DAD BORTOLUZZI et al., 2007 (4) Superficial Bruta Rio Vacacaí e Vacacaí- Mirim HPLC-UV MARCHESAN et al., 2007 (5) Superficial Bruta Canal São Gonçalo e Rio Piratini HPLC-DAD e GC-ECD GRÜTZMACH ER et al., 2008 (6) Superficial Bruta Camaquã HPLC-DAD e CG-MS MACEDO et al., 2009 (7) Superficial Bruta 18 municípios LC-MS/MS DIECSON et al., 2009

43 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 35 Pesticidas Manancial Água Coletas Período Técnica Analítica Fonte (8) Superficial Bruta Vacacaí e Vacacaí- Mirim HPLC-DAD, LC-MS/MS e GC-ECD MARCHEZAN et al., 2010 (9) Subterrânea Bruta Rio Grande HPLC-DAD e LC-ESI- MS/MS CALDAS et al., 2010 (10) Superficial Bruta e Tratada Rio Grande e Santa Vitória do Palmar LC-ESI-MS- MS DEMOLINER et al., 2010 (11) Superficial Bruta Rios Uruguai e Ibicuí 2010 LC-MS/MS TODESCHINI et al., 2010 (12) Subterrânea Bruta 18 municípios LC-MS/MS DIECSON et al., 2011 (13) Superficial Bruta Eldorado do Sul 2011 LC-MS/MS TODESCHINI et al., 2011 (14) Superficial Bruta e Tratada São Sepé 2013 LC-MS/MS TODESCHINI, 2012 *Água de poço artesiano para fins de consumo humano S = Superficial SB = Subterrâneo B = Bruta T = Tratada (para consumo humano) (1) clomazona (2) imidacloprid, atrazina, simazina e clomazone por HPLC-UV; clopirifós, flumetralin e iprodione por CG-ECD (3) clorpirifos, imidacloprido, atrazina, simazina e clomazona (4) clomazone, propanil e quinclorac (5) quinclorac, carbofurano e clomazona por HPLC-DAD; fipronil e betaciflutrina por GC-ECD (6) fipronil e clomazona (7) clomazona, quinclorac, penoxsulam, imazethapyr, imazapic, carbofurano, 3-hidroxi-carbofurano, fipronil e tebuconazol. (8) clomazona, quincloraque, propanil, bentazona, 2,4-D, imazethapir, carbofurano e fipronil (9) carbofurano, clomazona, tebuconazol e 2,4 D (10) clomazona, tebuconazol, diurom, irgarol, atrazina, simazina, metsulfurom-metilico, quinclorac, 2,4-D, pirazosulfuron-etil, bentazona, propanil, carbofurano, imazetapir, imazapic, fipronil, bispiribacsodico, fenoxsulam. Também foram analisados os metabólicos 3,4-DCA e 3-hidroxi carbofurano (11) azoxistrobina, piraclostrobina, difeconazole, pirazofós, trifloxistrobina, clomazona, piridato, carbaril, fipronil, desltametrina, imidacloprido e pirimifós metil

44 36 (12) clomazona, imazapic, imazethapyr, penoxsulam, quinclorac, 3-hidroxi-carbofuran (metabólito do carbofurano), carbofurano, fipronil e tebuconazol (13) azoxistrobina, carbendazim, ciproconazol, imazetapir, clomazona, metsulfurom metílico, propiconazol, tebuconazol e tiabendazol (14) carbofurano, clomazona, fipronil, imidacloprido e tebuconazol. Fonte: Elaborada pelo autor. A maioria das análises atuais por LC realizadas emprega detecção por espectrofotometria, condutividade elétrica, fluorescência ou espectrometria de massas. Entre os detectores espectrofotométricos mais adequados, estão os equipamentos com detecção por arranjo de diodos (DAD) que permitem obter um espectro de absorção a cada segundo, gerando informações que possibilitam a confirmação dos compostos (CALDAS et al., 2011). Ainda de acordo com CALDAS et al. (2011), um número considerável de trabalhos nos últimos anos tem utilizado o espectrômetro de massas como detector para análises de agrotóxicos em água, pois este detector, além de permitir a obtenção de limites de quantificação (LQs) menores, também propicia a confirmação dos compostos presentes na amostra ao gerar os respectivos espectros de massas. Além disso, possui maior seletividade e reduz a necessidade de se obterem separações cromatográficas com grande resolução, uma vez que esta técnica permite identificar e quantificar compostos que coeluem. 2.5 Validação de métodos analíticos A validação de um método analítico preconiza confiabilidade dos resultados a serem obtidos a partir da implementação de um novo método, ou seja, a validação verifica se os requisitos especificados são adequados para um uso pretendido. GOSETTI et al. (2010) diferenciam dois métodos no âmbito geral de validação: validação no laboratório e validação completa. A validação no laboratório é utilizada nas etapas preliminares do desenvolvimento de um método e na publicação de artigos para revistas científicas, enquanto a validação completa envolve todas as características de desempenho e um estudo interlaboratorial e segue protocolos internacionalmente aceitos. A validade de um método analítico é parcialmente dependente da escolha da orientação, da terminologia e da metodologia. É extremamente importante ter clara definição dos critérios de validação e, consequentemente, estar de acordo com os métodos estatísticos, que são relevantes nestas definições, com o objetivo da validação e com o intuito do método analítico (ROZET et al., 2007). Organizações e instituições como a International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human

45 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 37 Use (ICH); a União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC); a International Organization for Standardization (ISO); a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO) e outras exigem o item validação de métodos analíticos como um requisito fundamental no credenciamento para qualidade assegurada e demonstração de competência técnica; entretanto as diferentes terminologias e até algumas características de desempenho do método têm, em sua maior parte, o mesmo significado, porém descrito de uma maneira distinta, para aplicações diferentes (GOSETTI et al., 2010). Os diversos aspectos operacionais ou as potenciais causas de variação devem ser incluídos nos experimentos de validação, para prever as situações de rotina. As fontes de desvio de processo são contempladas pelos principais parâmetros de desempenho analítico: seletividade, exatidão, precisão, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação e efeito matriz. ROZET et al. (2007) ressaltam que a maioria dos documentos regulatórios não recomenda os critérios de aceitação para apoiar o analista na decisão se o processo é satisfatório. É uma competência do laboratório definir e justificar a empregabilidade de um método analítico, desde que haja interpretação estatística dos resultados obtidos a partir de uma definição adequada e consistente do critério utilizado Seletividade A seletividade é a propriedade de um sistema de medição, utilizado com um procedimento de medição especificado, segundo a qual o sistema fornece valores medidos para um ou vários mensurandos, tal que os valores de cada mensurando sejam independentes uns dos outros ou de outras grandezas associadas ao fenômeno, corpo ou substância em estudo (MAPA, 2011). A seletividade é um parâmetro que deve ser demonstrado e é dependente do método analítico utilizado. Para os métodos cromatográficos, a seletividade é avaliada no sentido de garantir que o pico de resposta do analito (avaliado no tempo de retenção característico) seja proveniente exclusivamente dele e não de outros compostos (interferentes) presentes na amostra. Por isso, há a importância da aplicação da espectrometria de massas, como teste de pureza do pico (PASCHOAL e RATH, 2008). Conforme GOSETTI et al. (2010), uma maneira de se medir a seletividade é através da avaliação a partir do espectrômetro de massas, comparando-se o espectro do pico obtido na

46 38 separação com o de um padrão e utilizando-se este resultado como uma indicação da presença do composto puro Exatidão A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro. Para impurezas, recomenda-se que a análise seja feita pelo método de adição de padrão, no qual se adiciona quantidades conhecidas das impurezas. A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança (ANVISA, 2003). A recuperação, ou fator de recuperação (R), é definida como a proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e passível de quantificação obtida pela fortificação (acréscimo do padrão na amostra). A limitação do procedimento de recuperação versa que a substância adicionada não está, necessariamente, nas mesmas condições físico-químicas que a presente na amostra. Isso pode implicar, por exemplo, na presença de substâncias adicionadas em uma forma que proporcione melhor detecção, ocasionando avaliações excessivamente otimistas da recuperação ou interferência de outros componentes da matriz na separação, detecção ou na quantificação da substância. Nesse contexto, a exatidão é sempre considerada a um dado nível de confiança, ou seja, aparece sempre associada a valores de precisão (GOSETTI et al., 2011). O documento-guia de SANCO (2013) relata que medir a exatidão é equivalente a estimar a incerteza da medida, pois a exatidão, quando aplicada a uma série de resultados de ensaios, implica uma combinação de componentes de erros aleatórios e sistemáticos. A avaliação da exatidão como característica de desempenho na validação de um método analítico é cada vez mais importante com o aumento da dependência da incerteza de medição como um indicador-chave de adequação à finalidade e à confiabilidade dos resultados Precisão A precisão do procedimento analítico expressa o grau de concordância (grau de dispersão) entre uma série de medições obtidas a partir de amostragem múltipla da mesma

47 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 39 amostra homogênea nas condições prescritas. A precisão mensura o erro randômico associado ao procedimento analítico, a dispersão dos resultados em relação à média dos valores, sendo representada pela estimativa do desvio padrão (s), estimativa do desvio padrão relativo (Relative Standard Deviation - RSD) ou coeficiente de variação (CV). A estimativa da precisão é independente do valor real ou do significado da estimativa da exatidão (ROZET et al., 2007). Segundo GOSETTI et al. (2010), a precisão em validação de métodos é considerada em três níveis diferentes: repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade: Repetitividade: envolve várias medições da mesma amostra, em diferentes preparações; é, algumas vezes, denominada precisão intraensaio ou intracorrida e é determinada através da estimativa do desvio padrão relativo. Precisão intermediária: indica o efeito das variações dentro do laboratório devido a eventos como diferente temporalidade, analistas, equipamentos ou mesmo uma combinação desses fatores. O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar que, em um mesmo laboratório, o método fornecerá os mesmos resultados. Reprodutibilidade: é o grau de concordância entre os resultados das medições de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (mudança de operador, local, equipamentos, etc.). A reprodutibilidade expressa a precisão entre laboratórios Linearidade e curva analítica A linearidade é a capacidade de o método apresentar resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. A faixa de trabalho linear da curva de calibração deve necessariamente contemplar a faixa de concentração esperada para a amostra de ensaio. Recomenda-se que o limite de quantificação seja avaliado no quesito linearidade. Sempre que possível, o valor esperado para a amostra de ensaio deve-se situar em torno do centro da curva de calibração (MAPA, 2011). De acordo com INMETRO (2010), a linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser determinado na amostra real. A equação da reta que relaciona as duas variáveis é: Equação (2.1): y = ax + b onde: y = resposta medida (área do pico);

48 40 x = concentração; a = inclinação da curva analítica = sensibilidade; b = interseção com o eixo y, quando x=0. O método é mais sensível quando pequenas variações da concentração resultam em maior variação na resposta, ou seja, maior inclinação (b). Além dos coeficientes a e b, também é possível calcular, a partir dos pontos experimentais, o coeficiente de correlação r, o qual fornece uma estimativa da qualidade da curva obtida. O r 2, quanto mais próximo de 1, indica a menor dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor incerteza dos coeficientes de regressão estimados. Conforme destacam PASCHOAL e RATH (2008), os procedimentos recomendados pelas agências reguladoras para estabelecer a curva analítica e determinação da linearidade não são harmonizados. Segundo recomendações do MAPA (2011), são aceitos valores de coeficiente de determinação (r 2 ) de 0,95 para curvas preparadas em matriz e de 0,97 para curvas preparadas em solvente em solvente para análise cromatográfica Limite de detecção e limite de quantificação O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em análise que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental. O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração da substância em análise que pode ser mensurada, utilizando um determinado procedimento experimental. O LQ representa um compromisso entre a concentração, precisão e exatidão exigidas (GOSETTI et al., 2010). Consoante à IUPAC, os limites de quantificação são características de performance que demonstram a habilidade de um método mensurar adequadamente a quantidade de um analito. O LD e o LQ são geralmente expressos em unidade de concentração, e podem ser calculados de três maneiras diferentes: método visual, método relação sinal-ruído e método baseado em parâmetros da curva analítica (RIBANI et al., 2004): Método visual: a menor concentração visualizada no cromatograma. Método da relação sinal-ruído: é feita a comparação entre a medição dos sinais de amostras em baixas concentrações conhecidas do composto de interesse na matriz (sinal) e um branco (ruído).

49 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 41 Método baseado em parâmetros da curva analítica: o LD pode ser expresso como: Equação (2.2): LD = 3,3 s S onde: s = estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação; S = a inclinação ou coeficiente angular da curva analítica. ROZET et al. (2007) ressaltam que a melhor forma de computar os limites de quantificação é usando o perfil de exatidão encontrado demonstrando os erros dos resultados conhecidos e níveis aceitáveis de erro sistemático e randômico Efeito matriz Efeito matriz é um estudo de seletividade que averigua possíveis interferências causadas pelas substâncias que compõem a matriz amostral gerando, basicamente, fenômenos de diminuição ou ampliação do sinal instrumental ou resposta instrumental (MAPA, 2011). O efeito matriz, ou a supressão do sinal, é causado principalmente por componentes indesejáveis que coeluem na separação cromatográfica e alteram o processo de ionização. O efeito matriz é causado pela competição entre o analito e as espécies interferentes coeluídas; estas podem ser compostos da amostra, compostos adicionados durante o processo de extração ou reagentes adicionados na fase móvel. As propriedades químicas dos analitos, o tipo de matriz, o processo de extração, as condições cromatográficas, bem como as condições do tipo de espectrômetro de massas e ionização podem ser causas da supressão do sinal. Analitos mais polares são mais suscetíveis à supressão iônica enquanto solventes orgânicos geralmente aumentam o sinal da ESI especialmente em ionização positiva. Para evitar ou minimizar o efeito matriz, sugere-se o uso de uma matriz semelhante às que serão analisadas, mas sem a presença do analito (GOSETTI et al., 2010).

50 Predição Teórica A predição teórica pode ser feita a partir de funções matemáticas que, aplicadas a uma massa de dados, conseguem identificar padrões ocultos e prever o que poderá ocorrer. A predição teórica aplicada a agrotóxicos tem como objetivo avaliar o risco de contaminação das águas subterrâneas e superficiais por agrotóxicos, baseado nas suas características físicoquímicas, com auxílio de modelos e parâmetros matemáticos pré-existentes (MARTINI et al., 2012). As pesquisas nesta linha se desenvolveram bastante na década de 80 a partir de pressões de órgãos de fiscalização em diferentes esferas, a fim de estimar a probabilidade de ocorrência de pesticidas em água de abastecimento público (GUSTAFSON, 1989). São muitas as variáveis envolvidas no processo de transferência no solo, o desafio é selecionar as mais importantes para calcular o balanço hidráulico e avaliar o transporte de pesticidas (COHEN et al., 1995). A dinâmica dos agrotóxicos é governada pelo processo de adsorção, o qual é responsável pela ligação desses às partículas do solo, influenciando na disponibilidade para os demais processos como transformação, degradação e transporte, seja pela volatilização, lixiviação e/ou por escoamento superficial (MARTINI et al., 2012). A estrutura molecular e as propriedades físico-químicas dos pesticidas, como solubilidade em água, coeficiente de adsorção, tempo de meia vida no solo, pressão de vapor, entre tantas outras, contêm informações as quais podem predizer o comportamento de cada substância no meio ambiente (SOARES et al., 2012). Em modelos utilizados para a representação de algum fenômeno, sempre há uma incerteza relacionada à falta de conhecimento dos mecanismos que governam os fenômenos de interesse. A incerteza é uma característica intrínseca da avaliação de riscos. Essas incertezas não são erros, e uma análise que exponha as incertezas não perde seu valor (ROBERTS e HAYNS, 1989 apud GOMES, 2008). BECK (1987) apud GOMES (2008), apresenta um trabalho a respeito de análise de incerteza quanto à modelagem matemática da qualidade da água, analisando quatro áreas em detalhe: a incerteza sobre a estrutura dos modelos; a incerteza em relação aos valores estimados dos parâmetros do modelo; a propagação dos erros de previsão; e o projeto de experimentos com o objetivo de reduzir as incertezas críticas associadas ao modelo. São exemplos de fontes de incerteza em relação ao contaminante: coeficiente de difusão, dispersividade, fator de retardo e taxa de decaimento (meia vida) que depende da localização geográfica e tipo de solo. Algumas variáveis são difíceis de serem consideradas nos modelos, como, por exemplo: incertezas do modelo, formulações e macroporos. Modelos não refletem a realidade, mas

51 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 43 simplificam o comportamento químico no ambiente, e a interpretação deve considerar esta simplificação. Além disso, os modelos devem ser validados com resultados experimentais. Há desvios significativos entre resultados previstos por modelos e resultados reais. Os modelos preditivos têm maior validade quando o solo é pequeno e homogêneo e quando dados específicos de cada região são obtidos (COHEN et al., 1995). O escoamento superficial favorece a contaminação das águas superficiais, através do transporte do agrotóxico adsorvido às partículas do solo erodido ou dissolvido em água. A lixiviação dos agrotóxicos através do perfil do solo tende a resultar em contaminação das águas subterrâneas, e, nesse caso, as substâncias químicas são carreadas em solução juntamente com a água que alimenta os aquíferos (SPADOTTO et al, 2004 apud MARTINI, 2012). O Quadro 2.1 apresenta as principais propriedades físico-químicas envolvidas no processo de transferência dos agrotóxicos até os mananciais. Quadro 2.1. Propriedades físico químicas utilizadas nas predições teóricas Propriedades Fisico-quimicas Solubilidade em água Meia-vida Descrição Indica o quão rápido um agrotóxico se dissolve em água, sendo expressa em termos da quantidade máxima da substância que irá dissolver em um litro de água, cujas principais unidades são: mg.l -1 e µg.l -1. Quanto maior o valor deste parâmetro, mais solúvel é o agrotóxico e mais rapidamente ele poderá ser transportado para distâncias maiores, em relação ao ponto de aplicação original da substância, pelo escoamento da água de chuva ou água de irrigação. Refere-se ao tempo necessário para que metade da concentração inicial de um agrotóxico aplicado seja decomposta em produtos de degradação. Normalmente, a meia-vida é expressa em intervalo de dias. Diversos fatores condicionam as taxas de degradação dos agrotóxicos, como: temperatura e ph do solo, teor de microrganismos e exposição ou não da substância à luz, oxigênio e água.

52 44 Propriedades Fisico-quimicas Coeficiente de adsorção no solo (K oc) Constante de Henry Descrição Corresponde à medida da tendência de um material em adsorver as partículas do solo, sendo formalmente definido como a razão entre a massa de agrotóxicos adsorvida, por unidade de massa de solo, em relação à massa de agrotóxico que permanece na solução em equilíbrio. Os valores de Koc dependem do solo e de seu ph, razão pela qual alguns dados de literatura são reportados em termos de faixas de valores. Moléculas fortemente adsorvidas ao solo não lixiviam ou se movem. Assim, agrotóxicos com valores elevados de Koc são geralmente pouco solúveis em água, apresentando tendência para aderirem às partículas do solo e não serão carreados para outros locais pela água de chuva, por exemplo, mas por partículas de sedimentos. Valores reduzidos de Koc indicariam pequena ou nenhuma adsorção e, por conseguinte um potencial para a lixiviação. Essa propriedade define a tendência de uma substância em volatilizar da solução para o ar. Valores elevados desta constante indicam maior volatilização e o contrário sinaliza aquelas substâncias que podem persistir no solo ou na água. É expresso em Pa m 3 mol -1 ou atm m 3 mol -1, sendo que 1 atm equivale a 1, Pa. Fonte: Elaborada a partir de EXTOXNET (1993); PAN (2006); PESSOA et al. (2004) apud NETO (2010). O Índice de GUS foi desenvolvido e proposto em 1988 pela empresa Monsanto. Aplicase como ferramenta auxiliar para identificação de pesticidas a serem priorizados nas atividades de monitoramento ambiental in loco. O índice de GUS avalia o risco de pesticidas contaminarem águas subterrâneas, ou seja, é uma forma de estimar o potencial de lixiviação de um pesticida sem precisar de propriedades como a solubilidade da água, coeficiente de partição octanol/água e volatilidade. Pode ainda evitar modelagens ou experimentos específicos para medir a lixiviabilidade de um pesticida no campo. É um método para avaliar a persistência e a mobilidade química a partir de uma equação empírica que relaciona o tempo de meia-vida de um determinado composto no solo e o coeficiente de adsorção à matéria orgânica no solo. O tempo de meia-vida é matematicamente representado por uma equação de primeira ordem e representa a persistência de um composto pela taxa de degradação, embora mascare alguns

53 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 45 efeitos físicos como dissipação, pré-tratamento, capacidade biológica e teor de umidade do solo. O tempo de meia-vida já considera o efeito da volatilidade. Ao se mensurar a dissipação pelo tempo de meia vida, mais a volatilidade, estaria sendo contando duas vezes o fator volatilização (PRIMEL et al., 2005; GUSTAFSON, 1989; MARTINI et al., 2012; COHEN et al., 1995). O método de GOSS, ou Soil Pesticide Interaction Screening Procedure (SPISP), apresenta um procedimento capaz de auxiliar o controle das interações entre os agrotóxicos e o solo, cujo desenvolvimento atendia ao Soil Conservation Service (SCS), nos Estados Unidos. Este método foi concebido para auxiliar os técnicos na avaliação de perdas de agrotóxicos em quantidades tais que prejudicassem recursos hídricos de interesse (GOSS, 1992 apud NETO, 2010). Segundo esse método, o transporte de agrotóxicos pode ser separado em dois grupos: transporte de agrotóxicos dissolvidos em água e transporte adsorvido ao sedimento, sendo classificados como alto, médio e baixo potencial (MARTINI et al., 2012). COHEN et al. (1995) descrevem as propriedades físico-químicas e propriedades do solo necessárias para a aplicação do método. GOSS (1992) propôs o método resultante de uma generalização a partir de inúmeras simulações do modelo GLEAMS, que é um modelo matemático detalhado, com dados de entrada típico dos Estados Unidos. O objetivo do método é orientar a seleção de agrotóxicos para aplicação. Assim, os resultados são relativos, e não absolutos, ou seja, indicam quais substâncias não apresentam riscos, e quais merecem maior investigação (tem potencial de contaminação). Uma parte do método envolve as características do solo, de acordo com o seu potencial de produzir sedimentos. O método Screening da USEPA é simples em conceito, mas complexo em execução. São critérios numéricos de comparação entre propriedades de persistência e mobilidade. São nove os critérios aplicados pela USEPA (COHEN et al., 1995): solubilidade em água >30 mg.l -1 ; coeficiente de adsorção à matéria orgânica do solo (Koc) < ; constante da Lei de Henry (Kh)<10-2 Pa.mol -1 ; especiação: negativamente carregado a ph normal do ambienta (ph 5-8); meia vida no solo < 14-21d; meia vida na água > 175 d; pluviosidade anual > 250 mm; aquífero não confinado;

54 46 solo poroso. Os pesticidas podem ser transportados pelos processos de erosão e infiltração e são dependentes da capilaridade da água nos poros do solo. A erosão é o veículo de transportes de nutrientes e pesticidas que são insolúveis em água. Já quando os agrotóxicos perpassam na medida em que o solo é saturado, caracteriza a infiltração. As forças envolvidas no equilíbrio de pesticidas no solo são gravidade, carga hidráulica e tensão superficial. No solo, pode haver processos de movimentação vertical ou horizontal. O maior risco para contaminação de mananciais está associado à movimentação vertical (COHEN et al., 1995). LOURENCETTI et al. (2005) apud NETO (2010) descrevem que algumas limitações devem ser consideradas nos modelos, como a ausência dos dados de alguns agrotóxicos e metabólitos, assim como o enfoque individual nas substâncias, em detrimento de possíveis misturas e efeitos combinados. Alguns outros modelos preveem o transporte de pesticidas pela percolação ou escoamento de água. LEONARD (1990) apud COHEN et al. (1995) identificou que as concentrações de pesticidas são proporcionais às concentrações das primeiras camadas de cima modelos como CRAMS/HFPF. Outro fator que pode influenciar no risco de contaminação de mananciais é o modo de aplicação, por exemplo quando os pesticidas são aplicados nas folhagens das culturas (inseticidas e fungicidas) o risco é menor pela maior absorção nas folhagens e exposição ao vento e ao Sol. Já aplicações que são feitas diretamente no solo são mais suscetíveis a serem transportadas até um manancial, seja superficial ou subterrâneo (COHEN et al., 1995). Conforme concluem PRIMEL et al. (2005), é de grande importância se conhecer o nível de herbicidas nas águas, mais estudos são necessários para determinar exatamente os processos de dispersão de herbicidas aplicados na lavoura, tais como volatilização, degradação por microrganismos e luz solar, adsorção no solo, pois os herbicidas podem ser prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente, demonstrando esses efeitos mesmo em pequenas concentrações.

55 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 47 3 Materiais e Métodos A primeira etapa do presente trabalho se constituiu na análise do banco de dados do SISAGUA. O SISAGUA é um instrumento do Programa VIGIAGUA que tem como finalidade auxiliar o gerenciamento de riscos à saúde associados à qualidade da água para consumo humano. Esse gerenciamento é realizado com base nos dados gerados rotineiramente por parte dos responsáveis pelos serviços de abastecimento de água (controle) e profissionais do setor saúde (vigilância). A partir do SISAGUA foi possível obter os resultados de 143 laudos de análises de vigilância de agrotóxicos na água para consumo humano, cujas coletas ocorreram nos anos de 2015 e É importante ressaltar, que o autor da presente dissertação, como trabalha para o programa do VIGIAGUA no nível central do CEVS, no cargo de especialista em saúde/engenheiro químico, participou da etapa de planejamento e coordenação destas ações para vigilância de agrotóxicos na água para consumo humano junto às quatro coordenadorias regionais de saúde e os respectivos 45 municípios da G-50. O desenvolvimento do método analítico embasou-se no conjunto de melhores condições encontradas na literatura para cada etapa: pré-tratamento das amostras a partir de filtração em quatro malhas, extração via SPE e posterior análise e quantificação dos agrotóxicos extraídos por LC-MS/MS. O método foi validado a partir dos seguintes critérios: linearidade, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão. Além disso, foram avaliados limite de detecção, limite de quantificação, efeito matriz (supressão do sinal) e a perda na etapa de filtração. A validação foi feita a partir da injeção de um padrão contendo 183 pesticidas, oriundos do LANAGRO de Goiás, em uma matriz de água bruta do Lago Guaíba. Além de estudos prévios exploratórios nos municípios de Porto Alegre e Alvorada, para aplicação do método, foram selecionados os três maiores municípios da bacia hidrográfica do Alto Jacuí G-50: Carazinho, Soledade e Cruz Alta. Foram coletas amostras de água bruta e tratada nos quatro principais períodos de aplicação de agrotóxicos nos anos de 2015 e 2016, de acordo com os cultivos agrícolas majoritários da região. O objetivo de coletar e analisar água bruta e tratada é poder avaliar se o processo convencional de tratamento de água remove o pesticida, caso algum pesticida seja detectado na água bruta. Os pesticidas presentes nas portarias nacional e gaúcha, direcionadores das análises de vigilância e controle de agrotóxicos na água para consumo humano dentro do território gaúcho foram avaliados em termos de riscos segundo três modelos preditivos: método de GOSS, índice de GUS e método Screening da USEPA. Os resultados permitem avaliar os riscos de

56 48 contaminação por agrotóxicos das duas diferentes formas de captação de água bruta: subterrânea e superficial. 3.1 Materiais Padrões Os agrotóxicos avaliados neste trabalho foram adquiridos a partir de uma solução mista de pesticidas Pool AG 03/15, produzido no LANAGRO-GO em 07/01/2015 contendo 183 pesticidas, concentração de 5 µg ml -1, listados em Apêndice, na Tabela A, juntamente com a classe, grupo químico e propriedades físico-químicas buscadas para este trabaho. A solução Pool AG 03/15 foi utilizada na fortificação das amostras da validação e também foi diluída até a concentração de 1 µg ml -1 para os pontos de menor concentração, a fim de diminuir os erros que a pipetagem de alíquotas muito baixas poderiam ocasionar Instrumentação Os equipamentos utilizados no desenvolvimento deste trabalho estão descritos abaixo: Bomba de vácuo a ar comprimido (Prismatec); Gerador de Nitrogênio (Peak Scientific); Evaporador (Tec-Vap TE) 0914 marca Tecnal; Pré-coluna com recheio C18 4 x 3 mm (Security Guard Guard Cartridges kit); Coluna Venusil XBP 3 µm 150 Å 2,1 x 100 mm (Agela Tecnonogies); Sistema para extração em fase sólida (Manifold); Ultrapurificador de água mastersystem (Gehaka); CL-EM/EM: cromatógrafo líquido 1200 Series, marca Agilent, acoplado a espectrômetro de massas modo tandem API 5000, marca SCIEX Reagentes, solventes e materiais utilizados Acetona 99% (Tedia); Metanol 99,98% (Tedia); Ácido fórmico 91,1% (J.T. Baker);

57 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 49 Formiato de amônio 98% (Sigma-Aldrich); Ácido acético glacial 100% (Merck); Membranas para filtração (150 mm, 125 mm, 45 µm, 0,45µm); Vidraria comum de laboratório analítico; Cartucho para SPE Strata-X 33µ Polymeric Reversed Phase 200 mg / 6 ml (Phenomenex); Solução padrão mista de pesticidas Pool AG 03/15, solvente acetonitrila 5 µg ml -1 armazenamento a -18 C, produzido no LANAGRO-GO em 07/1/2015 válida até 07/10/ Métodos Banco de Dados do Sistema de Informação de Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano (SISAGUA) Para avaliar informações sobre o abastecimento público de água no Rio Grande do Sul, os municípios, as populações abastecidas, as formas de captação (superficial ou subterrânea), os dados de controle e os dados de vigilância de agrotóxicos na água para consumo humano foi analisado o banco de dados presente no sistema de informação de vigilância da qualidade da água para consumo humano, disponível em: Foi possível obter o panorama do abastecimento de água no Rio Grande do Sul, a partir das seguintes informações disponíveis no banco de dados do sistema de informações do Programa VIGIAGUA: - Cadastro (Sistema de Abastecimento de Água, Solução Alternativa Coletiva e Solução Alternativa Individual), as definições de cada forma de abastecimento são estabelecidas na Portaria MS 2914/2011. A partir do cadastro é possível obter qual a população abastecida por cada forma de abastecimento. - Infraestrutura de abastecimento de água. Foi possível a partir destes dados levantar o número de estações de tratamento de água no Estado. As estações de tratamento de água representam as captações superficiais e o restante, as captações subterrâneas.

58 50 - Localidades e populações abastecidas. A partir deste item foi possível levantar dados populacionais de todo o estado e da G-50 e cruzar com as formas de captações. - Qualidade da água e condições do abastecimento de água. Neste item são disponibilizados os resultados das análises de controle e vigilância de todos os parâmetros previstos pela portaria nacional e estadual. Neste módulo pôde-se realizar o levantamento das análises de agrotóxicos na água para consumo humano realizadas pela vigilância, bem como o número de municípios que não possuem análises de controle, de competência dos responsáveis pelo abastecimento público de água. Durante o ano de 2015 e 2016, foram coletadas 143 amostras de água oriundas tanto de poços artesianos quanto de estações de tratamento de água, nos 45 municípios (Tabela 3.1) da Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí (Figura 3.1), a que possui a maior taxa de aplicação de agrotóxicos do estado. Os resultados foram fornecidos pela Secretaria Estadual da Saúde e as análises foram realizadas em laboratório contratado, contemplando os 27 agrotóxicos presentes na portaria nacional e os 46 na portaria estadual.

59 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 51 Tabela 3.1. Municípios onde ocorreram as 143 coletas para análise de agrotóxicos na água para consumo humano nos anos de 2015 e 2016 Municípios Agudo Ibarama Pinhal Grande Alto Alegre Ibirapuitã Quinze de Novembro Arroio do Tigre Ibirubá Saldanho Marinho Boa Vista do Incra Ivorá Salto do Jacuí Cachoeira do Sul Jacuizinho Santa Bárbara do Sul Campos Borges Julio de Castilhos Santo Antônio do Planalto Carazinho Lagoa Bonita do Sul São João do Polêsine Colorado Lagoa dos Três Cantos Segredo Cruz Alta Lagoão Selbach Dona Francisca Mormaço Sobradinho Ernestina Não me Toque Soledade Espumoso Nicolau Vergueiro Tapera Estrela Velha Nova Palma Tio Hugo Faxinal do Soturno Novo Cabrais Tunas Fortaleza dos Valos Paraíso do Sul Victor Graff

60 52 Figura Localização geográfica da Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí G-50. O planejamento foi realizado a partir do resultado de entrevistas com engenheiros agrônomos e agricultores da região, elaboradas e fornecidas pela secretaria estadual da saúde do RS, as coletas foram definidas e realizadas durante os quatro períodos de aplicação de agrotóxicos dos principais cultivos agrícolas do território da G Procedimentos Experimentais Limpeza dos Materiais de Laboratório A limpeza dos materiais utilizados é de extrema importância para qualquer tipo de análise e constitui etapa crítica na análise de compostos em nível de traço, uma vez que a quantidade do analito é muito pequena e, portanto, qualquer contaminação interfere na análise, podendo até mesmo mascarar o composto de interesse. Toda vidraria e materiais comuns de laboratório foram lavados com detergente neutro comercial diluído e enxaguados com água destilada em abundância, reenxaguado com água ultrapura e, por último, com acetona comercial. A vidraria não volumétrica foi levada ao forno

61 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 53 a 300 C por duas horas e, depois de fria, foi embalada com papel alumínio. O material volumétrico, após o enxágue com acetona comercial e evaporação da mesma à temperatura ambiente, foi enxaguado novamente com hexano p.a. e, após estar completamente seco, foi embalado com papel alumínio Pré-tratamento das amostras Com os objetivos de se evitar a presença de compostos que interferissem na análise e saturassem os cartuchos no momento da extração em fase sólida, as amostras da validação e as de água bruta e tratada da aplicação do método foram filtradas com membranas inertes de diferentes tamanhos de poros, na respectiva ordem de malhas: 150 mm, 125 mm, 45 µm e 0,45 µm. Após a filtração, as amostras foram submetidas à técnica de extração em fase sólida. O volume de 250 ml foi definido a partir de estudos prévios de volume de quebra realizados por TODESCHINI (2012). Foram preparadas todas as alíquotas em balões volumétricos de 250 ml para iniciar a extração em cartuchos (sorventes) do tipo Strata X 200 mg. A ativação do sorvente foi realizada a partir do acréscimo de duas soluções: 3 ml de acetona com 0,3% de ácido acético e 3 ml de metanol a 5%. As alíquotas de 250 ml foram, então, percoladas para serem sorvidas no cartucho, com velocidade constante, controlada pela bomba Prismatec no sistema Manifold. A eluição dos analitos foi feita com adição dos solventes: 6 ml de metanol, 0,3% de ácido acético e 6 ml de acetona, contendo 0,3% de ácido acético, conforme estudos prévios de otimização realizados por JANK (2014). O volume final de 12 ml retém os analitos da validação e os possíveis analitos da aplicação retidos nos cartuchos. Posteriormente, efetuouse a concentração destas soluções, através da secagem em fluxo de nitrogênio a 45 C. Após secagem das amostras, estas foram suspendidas novamente em 1,0 ml água ultrapura: acetonitrila (80:20 v/v). As soluções foram injetadas no LC-MS/MS Condições do sistema LC-MS/MS A escolha das condições de espectrometria de massas baseou-se nas indicações fornecidas pelos técnicos do LANAGRO/GO. Os parâmetros referentes à fonte de ionização foram: CUR: 20; CAD: 6; GS1: 50; GS2: 50; IS: 5500; TEM: 400 C.

62 54 Já as condições cromatográficas foram desenvolvidas no LANAGRO RS. A fase móvel consiste em uma mistura binária de (A) água 0.1% de ácido fórmico; 5 mm formiato de amônio e (B) metanol 0.1% de ácido fórmico; 5 mm formiato de amônio. O gradiente inicia com 80% de A, que decresce durante 10 minutos até 5%. Nos 10 minutos seguintes, essa condição é mantida e, então, A aumenta até 80% durante 1 minuto. Mantém-se essa condição no último minuto da corrida, perfazendo um tempo total de análise de 20 minutos. Entre análises, é mantido um tempo de equilíbrio de 3 minutos com a condição inicial. A coluna utilizada é uma Agela Venusil RP C18 (3 µm, 150 Å, 2.1 x 100 mm), com vazão de 300 µl min -1. O volume de injeção é de 4 µl Validação do método analítico Para a validação, foram coletados e usados como matriz 12 litros de água bruta da estação de tratamento de água Belém Novo, em Porto Alegre, acondicionadas em vidro âmbar e refrigeradas até o pré-tratamento. Esta amostra serviu como matriz para a validação do método a fim de avaliar a seletividade, linearidade, exatidão, precisão, LD, LQ e efeito matriz. Como inovação, em relação às referências bibliográficas citadas no presente trabalho, foi realizada avaliação da perda decorrente da etapa de filtração. As soluções foram analisadas em duplicata real e duplicata de injeção. a) Seletividade A seletividade foi avaliada a partir da comparação de três análises: a amostra da matriz, o branco, a amostra da matriz fortificada e a adição do padrão diretamente no solvente. Os picos de resposta de cada analito, em seu respectivo tempo de retenção característico, puderam ser avaliados se eram provenientes exclusivamente do padrão, se já estavam presentes na matriz ou se sofreram a interferência de algum outro composto presente na matriz. Uma vez que a resposta da espectrometria de massas de um analito é caracterizada por seu íon molecular e confirmada por seus íons de quantificação e de qualificação, essa técnica já é considerada uma técnica altamente seletiva; portanto, já apresenta resultados adequados em relação ao critério de seletividade para a validação. Todavia, os cromatogramas de analitos que não tiveram suas áreas bem definidas e separadas não foram considerados validados.

63 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 55 b) Linearidade As equações das curvas analíticas bem como os parâmetros da linearidade - coeficiente de determinação (r 2 ), coeficiente angular (a) e linear (b) -, foram obtidas a partir da regressão linear no Microsoft Office Excel. Com base nesses dados, determinaram-se as faixas de linearidade para cada analito. A faixa de trabalho selecionada para a curva foi obtida a partir dos pontos oriundos das soluções analíticas nas concentrações de 40, 100, 200, 300 e 400 ng L -1. Foram também injetados pontos abaixo (10 e 20 ng L -1 ) e acima (1000 e 2000 ng L - 1 ) da faixa de trabalho selecionada a fim de possibilitar a quantificação de amostras mais diluídas ou mais concentradas utilizando-se a curva de acordo com a faixa de trabalho necessária. c) Exatidão Para avaliar a exatidão da análise, seis amostras foram processadas pelo método SPE: três amostras fortificadas na concentração 200 ng L -1 e três amostras brancas. As amostras brancas foram fortificadas ao final da extração, antes da injeção, e foram consideradas o 100%, para comparação com amostras fortificadas antes do processo extrativo. Os resultados das extrações foram comparados à concentração do padrão diluído no extrato branco da matriz, através dos cálculos de recuperação demonstrados na equação 3.1. Equação 3.1 Onde R(%) = C1 C C3 C1 = concentração das amostras fortificadas antes da extração C2 = concentração determinada no padrão (extrato da matriz) C3 = concentração das amostras fortificadas após a extração (100%) Também foi avaliada a veracidade global, relacionando a média global de três amostras analisadas durante três dias, totalizando nove soluções preparadas para a avaliação e comparadas com o valor da fortificação. d) Limite de Detecção e Limite de Quantificação

64 56 Amostras com concentrações decrescentes foram processadas para avaliação do menor nível em que é possível detectar (sinal/ruído>3) e quantificar (sinal/ruído>10) para cada um dos analitos. As concentrações utilizadas foram as mesmas da curva de calibração. e) Precisão Para avaliar a repetitividade, cinco soluções foram preparadas a partir da fortificação das amostras de 250 ml na concentração de 200 ng L -1 do padrão, processadas e injetadas. Para a reprodutibilidade, o mesmo procedimento foi repetido durante três dias. Para calcular a precisão e a precisão intermediária, os dados foram tratados no programa Microsoft Office Excel, a partir da ferramenta de análise de dados, ANOVA fator único, obtendo-se o desvio padrão relativo intradia e interdia. A repetitividade (RSDr) foi obtida a partir dos resultados entre todos os três dias e a precisão intermediária (RSDR) a partir dos resultados entre cada dia. f) Avaliação do Efeito Matriz A avaliação do efeito matriz nas determinações por LC ESI-MS/MS foi obtida a partir da comparação entre três amostras fortificadas (soluções de concentração 200 ng L -1 ) e posteriormente processadas por SPE, três amostras diretamente fortificadas no solvente (1 ml H2O:ACN; 80:20) e o branco (amostra do Guaíba sem fortificação) de acordo com a equação 3.2: Equação 3.2: Supressão do Sinal(%) = (área matriz área branco)x 100 área solvente Desse modo, a determinação da supressão do sinal foi realizada através da infusão póscoluna de uma solução mista dos analitos em solvente, injeção de um solvente puro e de uma amostra da matriz através da coluna cromatográfica, simulando uma análise normal e observando-se o efeito dos interferentes da matriz no sinal do analito. g) Perdas na Filtração Com o objetivo de avaliar a perda decorrente da etapa de filtração, uma amostra foi fortificada em um balão de 250 ml na concentração de 200 ng L -1 e comparada com as outras

65 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 57 amostras que foram fortificadas após a filtração. É uma inovação em relação às referências bibliográficas consultadas. h) Aplicação da técnica analítica SPE LC-MS/MS Foram coletadas nas estações de tratamento de água de Carazinho, Soledade e Cruz Alta amostras de água bruta e tratada em quatro períodos de aplicação de agrotóxicos nos anos de 2015 e Foi coletado um litro em cada ponto, armazenado em frasco de vidro âmbar, para evitar fotodegradação, e acondicionado em isopor com gelox a fim de se manter a temperatura baixa e constante durante o transporte até Porto Alegre. Essas etapas de acondicionamento e logística das amostras foram apoiadas pela Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) e pela SES RS, por intermédio do Centro Estadual de Vigilância em Saúde (CEVS), a partir do Programa de Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano. As amostras foram filtradas no mesmo dia da coleta no Laboratório de Estudos em Couro e Meio Ambiente (LACOURO) do Departamento de Engenharia Química da UFRGS e após dividias em três balões volumétricos de 250 ml para extração em triplicata no Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO) Porto Alegre, infraestrutura que oportunizou as demais etapas. Após a evaporação e concentração no vial, foram refrigeradas para posterior injeção no sistema LC-MS/MS. Estudos exploratórios também foram realizados no município de Porto Alegre e Alvorada/Viamão Predição Teórica Os pesticidas das Portarias Nacional e Gaúcha foram avaliados nos critérios de três predições teóricas: índice de GUS e método Screening USEPA para avaliação de risco em mananciais subterrâneos e método de GOSS para mananciais superficiais. Os métodos se baseiam nas propriedades físico-químicas dos pesticidas. Conforme apontado por SOARES et al. (2012), a maior parte dos dados disponíveis na literatura foram obtidos para condições referentes aos Estados Unidos e à Europa, e podem não corresponder ao clima e ao solo do território brasileiro. Assim, por exemplo, os valores típicos de meia vida no solo (DT50) representam a média de resultados de diferentes tipos de solos destes países, correspondendo também às características microbiológicas destes, assim como condições

66 58 climáticas, insolação, etc. Para este estudo, os valores típicos de meia vida no solo reportados na literatura foram considerados para aplicação dos três modelos. O índice de GUS foi calculado através da equação 3.3 de acordo com GUSTAFSON (1989). Equação (3.3): GUS=log(t1/2)*[4-log(Koc)] onde: t1/2 solo: tempo de meia vida no solo Koc: coeficiente de partição com o carbono orgânico do solo. O resultado desse cálculo possibilita classificar os compostos em três categorias de acordo com os dados da Tabela 3.2. Tabela 3.2. Critérios de classificação de lixiviação conforme índice de GUS Índice de Gus Classificação dos pesticidas GUS < 1,8 não sofrem lixiviação (IL) 1,8 <GUS< 2,8 faixa de transição (TL) GUS > 2,8 provavelmente lixiviados (PL) Fonte: GUSTAFSON (1989) O método Screening USEPA foi avaliado de acordo com os critérios sugeridos por COHEN et al. (1995): - solubilidade em água (a 25 C) > 30 mg L -1 ; - coeficiente de adsorção à matéria orgânica do solo (Koc) < cm 3 g -1 ; - constante da Lei de Henry (KH) < 10-2 Pa m 3 mol -1 ; - especiação (presença de forma aniônica em ph na faixa de 5 a 8); - t1/2 solo > 7-21 dias; - t1/2 água > 175 dias. Além destas propriedades físico-químicas, também se consideram os critérios de pluviosidade anual > 250 mm, aquífero não confinado e solo poroso. Cada critério é classificado como atende ao potencial perigoso (A), ou não atende ao critério (N), e, posteriormente, o pesticida foi classificado como contaminante em potencial (PC) ou não contaminante (NC). Como o método adota valores destas propriedades para a classificação das substâncias, no presente trabalho foi considerado para classificação como contaminante em potencial Koc < 500 e t1/2,solo > 7 dias, para fins de uma avaliação mais conservadora. O método original ainda

67 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 59 indica a especiação para cada pesticida, a pluviosidade e o tipo de solo que dependem de cada região e ambos não foram considerados neste trabalho. Foram classificados como potencialmente críticos todos os pesticidas que atenderam a três ou mais dos critérios previstos no método Screening USEPA. Para avaliar o potencial de contaminação das águas de superfície por pesticidas, foi utilizado o método de GOSS, o qual considera a meia-vida do pesticida no solo, sua solubilidade em água a 25 C e a constante de adsorção à matéria orgânica no solo. Este modelo não leva em conta as condições ambientais, e por este motivo, constitui uma estimativa da probabilidade dos riscos de poluição por pesticidas (SOARES, 2012). Como o método envolve as características do solo, no presente trabalho é assumido que os solos considerados são de alto potencial de produzir sedimentos. Segundo o método de GOSS, os pesticidas são divididos nos seguintes grupos: Alto Potencial de Transporte das Águas Superficiais, devido ao transporte associado ao sedimento em suspensão (APTAS); Baixo Potencial de Transporte das Águas Superficiais, consoante ao transporte associado ao sedimento em suspensão (BPTAS); Alto Potencial de Transporte das Águas Superficiais via dissolução na água (APTDA); e Baixo Potencial de Transporte das Águas Superficiais via dissolução na água (BPTDA). As classificações conforme cada critério estão colocadas na Tabela 3.3. Os compostos que não se enquadram em nenhum destes grupos são considerados com potencial médio, ou seja, Médio Potencial de Contaminação das Águas Superficiais via Dissolução na Água (MPTDA) ou associado ao sedimento em suspensão (MPTAS) (CABRERA, 2008). Tabela 3.3. Classificações do potencial de contaminação das águas de superfície por pesticidas de acordo com os critérios do método de GOSS t 1/2 solo Classificação (dias) K oc (cm 3 g -1 ) Solubilidade em água (mgl -1 ) APTAS APTAS ,5 BPTAS < 1 BPTAS ,5

68 60 t 1/2 solo Classificação (dias) K oc (cm 3 g -1 ) Solubilidade em água (mgl -1 ) BPTAS BPTAS ,5 BPTAS APTDA > 35 < > 1 APTDA > 35 < BPTDA > BPTDA < 1 < 100 BPTDA < 35 < 0,5 Fonte: elaborado a partir de CABRERA (2008).

69 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 61 4 Resultados e Discussões Este capítulo apresenta os dados extraídos do SISAGUA referente à população do estado que é abastecida por captação superficial e subterrânea e seus respectivos municípios. É apresentado o levantamento da população e dos municípios que não possuem análises de controle no SISAGUA, no ano de Adicionalmente um mapeamento da Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí, com os resultados das análises de vigilância, escopo da amostragem pelo órgão de fiscalização estadual, no período de 2015 e início de São apresentados os resultados do desenvolvimento e validação do método analítico SPE-LC-MS/MS, com todos os pesticidas que atenderam aos critérios de validação propostos. Os resultados de sua aplicação em Carazinho, Soledade e Cruz Alta e alguns estudos exploratórios prévios no município de Porto Alegre. Por último, são analisados os resultados dos três métodos de predição teórica, com os pesticidas que se enquadraram como potenciais riscos de contaminação separados por forma de captação: superficial ou subterrânea. 4.1 Informações do SISAGUA População e forma de captação de água dos municípios A população do RS, de 11,2 milhões de pessoas, tem 8,07 milhões de pessoas com abastecimento de água para consumo humano oriunda de captações superficiais, e 3,13 milhões por captações subterrâneas. No Estado do RS existem 210 estações de tratamento de água, instaladas em 164 dos 497 municípios. São 180 municípios abastecidos por ETAs, sendo que 22 destes, a partir de sistema interligado, ou seja, utilizam ETA de outro município para garantir o suprimento da demanda de consumo. Por exemplo, a ETA de Canela abastece os municípios de Gramado e Canela. Destes 22 municípios, 6 possuem outras ETAs no território, além da oriunda de outro município do sistema interligado. A população abastecida por água proveniente de estação de tratamento de água é a da população que é abastecida por captação superficial, entretanto não compõe a totalidade da população do município. A diferença entre a população total do município e a população que é abastecida pela ETA compõe a parcela que é abastecida por soluções comunitárias, normalmente, água subterrânea, por estarem localizadas na área rural

70 62 dos territórios municipais. Para os municípios abastecidos por ETA, a população atendida por soluções comunitárias está próxima a 1,43 milhões de pessoas. Em relação à captação subterrânea, há 164 municípios abastecidos pela empresa estatal com captação exclusivamente subterrânea, 142 municípios com ETA no território que abastece exclusivamente ao respectivo município e 22 com sistema interligado referente à parcela da população que não é coberta pelas ETAs. Além de 169 municípios que são abastecidos pelo governo executivo municipal ou associações comunitárias através de captações subterrâneas. O fluxograma da Figura 4.1 apresenta as formas de abastecimento no RS, municípios e populações. RS: 497 municípios População: 11,2 milhões de pessoas 8,07 milhões Captação Superficial 210 ETAs abastecem180 municípios 3,13 milhões Captação Subterrânea 497 municípios 164 municípios com ETAs no território 142 municípios dos territórios exclusivos das ETAs 1,43 milhões 186 municípios 164 empresa estatal + 22 com sistema interligado 1,02 milhões 16 municípios abastecidos exclusivamente por sistema interligado (ETA em outro município 169 municípios sem informação 674,93 mil Figura 4.1. Fluxograma das formas de captação de água - superficial ou subterrânea, com número de municípios e respectiva população. Fonte: O autor (dados do SISAGUA 2015) As 30 maiores ETAs do estado abastecem mais da metade da população do estado, somando 5,85 milhões de pessoas. Os municípios podem possuir apenas uma ETA, como Santa Maria, Novo Hamburgo e Rio Grande ou mais, como Pelotas com 4, Porto Alegre com 6 e Caxias do Sul com 8. A Tabela 4.1 mostra os 15 municípios com maior população abastecida a partir de ETA, o número de ETAs, população do município, e abastecimento por captação superficial e por subterrânea, bem como o total do estado. A Tabela B do Apêndice, apresenta o detalhamento do município sede, o número de estações de tratamento de água, a população

71 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 63 do município, a população que é abastecida pela ETA e a população que é abastecida por captação subterrânea, bem como os municípios que são abastecidos pelo sistema interligado. Tabela 4.1. Dados do abastecimento de água dos 15 municípios com maior população abastecida por ETAs do RS e totais. Município Sede Número de ETAs Município População Abastecida Captação Superficial Abastecida por Captação Subterrânea Municípios com Sistema Interligado PORTO ALEGRE CAXIAS DO SUL ALVORADA Viamão PELOTAS CANOAS ESTEIO Sapucaia do Sul e Canoas SANTA MARIA CACHOEIRINHA Gravataí NOVO HAMBURGO PASSO FUNDO RIO GRANDE CAMPO BOM URUGUAIANA GUAIBA BAGE TOTAL* População** Municípios Sede Número de ETAs Município Captação Superficial Captação Subterrânea Portão, Sapiranga e Estância Velha Eldorado do Sul Municípios Abastecido por Sistema Interligado * Considerando todos os dados presentes na Tabela B em Apêndice. **A soma da população dos municípios não fecha com as captações superficiais e subterrâneas devido aos 22 municípios do sistema interligado.

72 Municípios e população sem análises de controle de agrotóxicos na água No Rio Grande do Sul há 169 municípios que não possuem cadastrado no SISAGUA dados de análises semestrais de controle de agrotóxicos na água para consumo, referente ao ano de 2015, sendo que deveriam ter análise de frequência semestral, de acordo com a Portaria MS 2914/2011. Os 169 municípios somam uma população de 674,93 mil pessoas sem avaliação e a forma de abastecimento é através de captação subterrânea. Na Tabela C do Apêndice, são citados todos os municípios com sua respectiva população. Esta ausência de informações sugere a não realização de análises e deve-se principalmente por se tratar de municípios de pequeno porte e por aspectos socioeconômicos. É uma situação de risco, tendo em vista que a maior parte da economia destes municípios gira em torno da agricultura. Soma-se ainda 1,43 milhões de pessoas que são abastecidas de forma complementar por captações subterrâneas nos municípios onde há ETAs, totalizando 2,1 milhões de pessoas sem informações de controle de agrotóxicos na água para consumo humano a partir de captações subterrâneas no RS. Onde há estações de tratamento de água, com a população abastecida por captação superficial, salvo algumas exceções, as análises são realizadas semestralmente Resultados das análises de vigilância de agrotóxicos na água realizadas na G-50 Os 45 municípios da Bacia Hidrográfica do Alto Jacuí somam uma população de 520 mil pessoas. Destes, os 9 municípios que possuem abastecimento por captação superficial em estações de tratamento de água, somando uma população de 261 mil pessoas, são colocados na Tabela 4.2. É importante ressaltar que as estações não abastecem à totalidade da população do município. A diferença entre a população total do município e a abastecida pela captação superficial é a que pertence, geralmente, à zona rural do município e provavelmente abastecida por captação subterrânea. Além disso, há 18 dos 169 municípios pertencentes à G-50 sem informação de análises de agrotóxicos, e corresponde a uma população de 65,6 mil pessoas.

73 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 65 Tabela 4.2. Municípios, populações e vazões das estações de tratamento de água com captação superficial da G-50. Município População População Município Abastecida Vazão L s -1 Agudo ,12 Dona Francisca Paraíso do Sul ,3 Carazinho ,62 Soledade ,48 Cachoeira do Sul ,83 Sobradinho ,22 Cruz Alta ,46 Salto do Jacuí Fonte: SISAGUA 2015 Na Tabela 4.3 é apresentado um resumo do cronograma de coletas de água realizadas nos respectivos períodos de aplicação de agrotóxicos no território da G-50. O segundo período contempla a aplicação de inseticidas, fungicidas e herbicidas, por este motivo teve maior número de amostras. Tabela 4.3. Cronograma de coletas de água Período Aplicação Nº de Coletas Municípios Superficial Subterrânea 1º 15/06-15/07/2015 herbicidas º 15/08-10/10/2015 inseticidas, fungicidas e herbicidas º 01/11-20/12/2015 4º 15/12-15/02/2016 herbicidas inseticidas e herbicidas Nenhum dos 46 agrotóxicos, chamados de parâmetros na Portaria SES RS 320/2014 foi detectado nas 143 análises realizadas. A forma de transporte principal dos agrotóxicos aplicados na agricultura até os mananciais é a água das chuvas. Uma das principais hipóteses de se justificar a ausência de detecção é que todas as coletas foram realizadas em dias em que o tempo estava ensolarado, conforme registrado nos protocolos de coleta. Outro fator que pode justificar a não detecção é a representatividade da amostra. Foram coletados 3 litros de água em altas

74 66 vazões de estações de tratamento de água, como por exemplo, a de Cruz Alta que chega a 246 L s -1. Houve detecção de dois pesticidas (Quadro 4.1), da portaria nacional, permetrina em Carazinho, coleta em 07/10/2015, e o pesticida alaclor em Espumoso, coleta em 30/11/2015. Em Carazinho, a coleta foi realizada na estação de tratamento de água do município e a captação é superficial. Em Espumoso, o sistema de abastecimento de água é constituído por sete poços, ou seja, captação subterrânea, e a coleta ocorreu apenas em um deles. Os resultados obtidos em ambos os casos foram acima do limite de detecção (LD) e abaixo do limite de quantificação (LQ), o que leva a concluir que houve a presença, entretanto, sem poder especificar em que quantidade. Como o LD e o LQ são abaixo do valor máximo permitido, garante que, pelo menos no momento da amostragem, não houve risco para a saúde da população que consumiu esta água. Quadro 4.1. Informações a respeito dos municípios onde houve detecção de agrotóxicos na água para consumo humano Município Carazinho Espumoso Captação Superficial Subterrânea População Abastecida Vazão L s ,62 - Pesticida Detectado permetrina alaclor Portaria nacional nacional 4.2 Resultados da Validação da Técnica Analítica SPE LC-MS/MS e Aplicações Os parâmetros do analisador de massas para os 183 pesticidas avaliados estão disponíveis na Tabela D em Apêndice. Conforme já mencionado na revisão bibliográfica, referente à validação, a maioria dos documentos regulatórios não recomenda os critérios de aceitação para apoiar na decisão se o processo é satisfatório. O presente trabalho utilizou os critérios mencionados na Tabela 4.4.

75 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 67 Tabela 4.4. Critérios definidos para a validação do método Precisão Parâmetro Critério Referência Recuperação >70% SANTE, 2015 Exatidão % SANTE, 2015 RSDr <17 RSDR <25 JANK, 2014 R 2 >0,95 MAPA, 2011 LD (sinal/ruído)>3 ANVISA, 2003 LQ (sinal/ruído)>10 ANVISA, 2003 De acordo com a Tabela 4.5, foram validados 75 pesticidas do total de 183 avaliados com os critérios propostos.

76 68 Tabela 4.5. Resultados dos 75 pesticidas validados conforme a técnica SPE-LC-MS/MS Pesticidas LD LQ RSDr RSDR Veracidade (%) REC (%) Supressão Perda Filtração R² Acetamiprida , ,1 25,80 30,9 0,9957 Azinfosmetil ,5 7, ,30 7,5 0,9927 Azoxistrobina ,3 5, ,7 19,10 15,7 0,9995 Bitertanol ,4 20, ,9 39,83 28,7 0,9825 Boscalida ,2 28,50 30,5 0,9949 Bromuconazol ,7 13, ,5 32,06 29,4 0,9861 Bupirimato ,9 13, ,6 42,63 24,9 0,957 Carbaril ,1 8, ,3 36,00 18,8 0,9942 Carbendazim ,5 6, , ,50 12,9 0,9979 Ciproconazol ,9 9, , ,70 16,6 0,9925 Clorbomuron ,7 9, ,5 25,40 27,6 0,9957 Clorfenvinfós ,5 10, ,9 17,31 12,9 0,9844 Clorimuron ,6 9, ,2 21, ,998 Dicrotofos , ,5 2, ,9543 Dicrotofos , , , ,9543 Dimetoato ,2 6, ,9 16,00 19,9 0,9946 Dimetomorfe , ,8 23,80 16,7 0,9986 Dimoxistrobina ,2 10, ,2 7,43 17,2 0,9956 Dissulfotonsulfona ,7 6, ,9 28,90 14,9 0,991 Dissulfotonsulfóxido , ,80 6,4 0,9971 Diuron ,9 6, ,9 22,70 17,4 0,9982 Epoxiconazol ,3 11, , ,78 26,5 0,9923 Etiofencarbe sulfona ,2 4, ,1-10,37 17,3 0,9913 Etiofencarbe sulfóxido , ,3 0, ,9917 Etiprole ,3 11, ,7 27, ,9953 Fenamidosulfóxido , ,3-40,00 21,1 0,9957 Fenamifossulfona ,9 10, ,3 32, ,9899 Fenamifósulfóxido , ,3-40,00 21,1 0,9957

77 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 69 Pesticidas LD LQ RSDr RSDR Veracidade (%) REC (%) Supressão Perda Filtração R² Fenarimol , ,6 26,41 36,2 0,9871 Fention Sulfóxido ,8 10, ,2-40,00 26,8 0,9914 Fentionsulfona , ,3 24,80 10,8 0,9966 Fipronil ,8 16, , ,82 35,9 0,991 Flutriafol , ,9 31,30 11,3 0,9965 Foramsulfuron ,9 10, ,5 47,50 23,5 0,9858 Foratosulfona ,1 28,70 15,7 0,9919 Foratosulfóxido ,3 15, ,6-69,49 14,2 0,9929 Fostiazate , ,2 21,40 6,9 0,9991 Hexaconazol ,8 15, ,9 44,80 10,9 0,9956 Imidacloprido ,7 7, , ,99 16,3 0,9989 Iprovalicarbe , ,3 14,30 11,2 0,9949 Isocarbofós ,4 17, ,8 43,10 21,8 0,9984 Isoproturon ,5 7, ,5 21,20 13,9 0,9917 Linuron ,5 6, ,5 30, ,9777 Metazaclor , ,3 22, ,9828 Metconazol ,6 13, ,3 37,58 13,6 0,9719 Metilsulfuxon metil ,1 41,00 37,4 0,9844 Metoxifenozida ,2 6, ,4 136,00 22,7 0,9997 Metoxuron ,8 4, ,1 15,90 13, Miclobutanil ,4 9, ,7 25,10 9,1 0,9976 Nuarimol ,7 10, ,80 8,4 0,9936 Ooxamil-NH ,5 5, ,9 3,97 21,5 0,9576 Oxiacarboxina ,4 5, ,7 12,50 13,4 0,9983 Paclobutrazol , ,8 22,40 11,6 0,977 Paraoxon etil , ,7 61,40 10,7 0,9945 Paration etil ,6 7, ,9-9,10 19,3 0,9946 Penconazol ,7 12, ,7 37,50 19,7 0,9733 Pirifenox ,4 15, ,8 48,50 16,9 0,9526

78 70 Pesticidas LD LQ RSDr RSDR Veracidade (%) REC (%) Supressão Perda Filtração R² Propanil ,3 6, ,6 27,20 40,6 0,9962 Propiconazol , ,4 27, ,9541 Prosulfuron ,1 13, ,2 32,90 15,2 0,9913 Tebucona , ,8 27,00 19,7 0,9912 Ttiabendazol ,8 6, ,7 12,64 26,6 0,9997 Tiacloprido ,1 12,60 9,8 0,9994 Tiametoxam ,1 4, , ,24 13,6 0,9988 Tiametoxan ,1 4, , ,20 13,6 0,9968 Tiflumuron ,1 9, , ,16 21,1 0,9892 Tiocarbe ,9 9, ,9 26,60 9,5 0,9919 Triadimefon ,5 11, ,3 2,97 19,1 0,9735 Triadimenol ,9 5, ,5 19, ,9998 Triadimiferon ,4 9, ,6 30,00 11,5 0,9675 Triazofós ,8 9, ,6 28, ,9881 Trifloxusulfuron ,6 11, ,2 8,40 14,4 0,9941 Triflumuron ,1 9, ,7-170,85 21,1 0,9892 Triforina ,7 10, ,2 21,43 29,7 0,9901 Trinexapaque Etil ,7 9, ,2 37,90 20,7 0,9937

79 CONTAMINAÇÃO DE AGROTÓXICOS NA ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO NO RS: AVALIAÇÃO DE RISCOS, DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO EMPREGANDO SPE E LC-MS/MS 71 O método analítico foi considerado validado para 75 dos compostos na Tabela 4.5 porque os os resultados se enquadram nos critérios apresentados na Tabela 4.4. Os valores de LD e LQ, que variaram de 10 a 300 ng L -1, foram considerados totalmente satisfatórios. Deste modo, o método analítico desenvolvido e validado tem a capacidade de analisar em uma corrida de 20 minutos 75 pesticidas que possam estar presentes em amostras de água para consumo humano concentrações de ng L -1. A fortificação do padrão para a avaliação da curva analítica foi de 1 ml em cada alíquota de 250 ml. Para obter a concentração no ambiente a partir do vial, o resultado foi multiplicado por quatro. Os valores obtidos para repetitividade (RSDr) também foram considerados aceitáveis para os compostos constantes na Tabela 4.5, uma vez que eles se apresentaram abaixo de 17%, conforme estabelecido na Tabela 4.4. O mesmo ocorre para os valores de reprodutibilidade (RSDR), que também estão de acordo com os critérios da Tabela 4.4, abaixo de 25%, deste modo o método pode ser considerado reprodutível. A veracidade refere-se à concordância entre o valor real (valor de referência) da concentração de um analito em uma amostra e o estimado pelo processo analítico. Os valores obtidos de veracidade oscilaram entre 81 (bitertanol) e 78 (paraoxon etil), estando de acordo com a variação aceitável estabelecida na Tabela 4.4. A recuperação (Rec) possui como critérios estabelecidos para sua aceitação valores superiores a 70%. Da mesma forma, este trabalho buscou valores de exatidão que estivessem entre %. Entretanto, valores fora dessa faixa ainda podem ser considerados adequados, desde que o método demonstre ser reprodutível, o que se confirmou para os 75 compostos apresentados na Tabela 4.5, e desde que a curva seja preparada em matriz a cada nova análise. O preparo de curva em matriz acaba por eliminar possíveis problemas decorrentes de valores de recuperação muito baixos ou muito altos, além de normalizar os efeitos causados pela supressão, uma vez que o mesmo fenômeno será observado nas amostras que compõem a curva e, consequentemente, os valores de área tanto das amostras quanto dos pontos da curva serão submetidos aos mesmos efeitos. A perda da filtração também foi avaliada neste estudo, uma vez que é possível perder compostos presentes nas amostras devido ao processo de filtração, influenciando na real quantificação dos pesticidas. Dessa forma, 50 ng dos compostos foram injetados em uma amostra da matriz, que então foi submetida ao processo de filtração seguido de extração e comparado com outra amostra da matriz, fortificada posteriormente, antes da etapa de extração. Os resultados estão presentes na Tabela 4.5. A fim de controlar esse efeito, a cada nova análise deve ser preparada amostra da matriz, conforme descrito acima, com o objetivo de acompanhar esse efeito e corrigi-lo. A linearidade foi considerada satisfatória para todos os compostos, uma vez que as curvas em matriz apresentaram coeficiente de determinação (R²) superior a 0,95. Dos 183 pesticidas avaliados, 108 não foram validados. Destes, 38 não foram extraídos. 34 não atenderam ao critério da linearidade, de R 2 > 0, não atenderam ao critério de veracidade, de recuperação entre % e 8 não atenderam ao critério de precisão. 19 pesticidas não foram validados por não atenderem ao critério de precisão e tiveram veracidade inferior a 150% que seguirão sendo monitorados de forma semiquantitativa, ou seja, a sua

80 72 presença nas amostras não poderá ser traduzida em um valor exato, mas sim, em termos de faixas de concentração. A Figura 4.2 apresenta o cromatograma de um dos pesticidas, o propamocarbe, a título de exemplo. Figura 4.2. Cromatograma do pesticida propamocarbe Estudos exploratórios realizados em Porto Alegre Como parte desta pesquisa, trabalhos exploratórios foram realizados aplicando o método qualitativo no município de Porto Alegre e Alvorada/Viamão. Porto Alegre conta com seis estações de tratamento de água e pontos de captações superficiais distintos, do Rio Gravataí ao Guaíba. Em uma ETA de Porto Alegre que abastece cerca de 470 mil pessoas, cuja captação de água é do Guaíba, foi efetuada coleta de água bruta e tratada, bem como em outra ETA do município de Alvorada que abastece também 70% do município de Viamão, totalizando uma população de cerca de 380 mil pessoas, cuja captação é do Rio Gravataí. Foram encontradas as substâncias apontadas na Tabela 4.6. Tabela 4.6. Estudos exploratórios de pesticidas em águas coletadas em Porto Alegre e Alvorada/Viamão Municípios Pesticidas Porto Alegre Alvorada/Viamão Bruta Tratada Bruta Tratada Azoxistrobina x x ND ND Carbendazim x ND ND ND Diclorvós x x x x Etion x x x x Triciclazol x x x x x: < LQ