Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal

Transcrição

1 ARTIGO Lucas M. de Souza, Alcides Moino Júnior, Natália R. Mertz, Marco Aurélio T. da Silva, Flávio M. Soares & Ronald Z. Bonete Filho Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal Lucas M. de Souza 1*, Alcides Moino Júnior 2, Natália R. Mertz 2, Marco Aurélio T. da Silva 3, Flávio M. Soares 4 & Ronald Z. Bonete Filho 2 1 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, PqEB, Avenida W5 Norte (final), C. Postal 02372, Brasília (DF) Brasil. 2 Universidade Federal de Lavras, C. Postal 3037, Lavras (MG) Brasil. 3 Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Fitotecnia, Florianópolis (SC) Brasil. 4 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Entomologia; C. Postal 3037, Lavras (MG) Brasil. *Autor para correspondência: lucas.souza@embrapa.br Recebido para publicação em 7 / 01 / Aceito em 15 / 02 / 2012 Editado por Luiz Carlos C.B. Ferraz Resumo - Souza, L.M., A. Moino Júnior, N.R. Mertz, M.A.T. Silva, F.M. Soares & R.Z. Bonete Filho Nematoides entomopatogênicos e compatibilidade com imidaclopride visando ao controle de Spodoptera frugiperda em viveiro florestal. A patogenicidade e a virulência de isolados de nematoides entomopatogênicos (NEPs) dos gêneros Steinernema e Heterorhabiditis em lagartas de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera) foram avaliada em laboratório. Além disso, avaliaram-se a viabilidade e a infectividade dos isolados mais virulentos combinados com o inseticida imidaclopride visando à utilização sinérgica em mudas de eucaliptos em viveiros florestais. A compatibilidade dos melhores isolados incluídos no primeiro experimento (H. amazonensis RSC05, Heterorhabditis sp. JPM4 e H. bacteriophora HP88) com o imidaclopride foi avaliada usando a metodologia de Negrisoli et al. (2008), com modificações. Todas as concentrações de Heterorhabditis causaram mortalidade, com exceção da testemunha, sendo H. amazonensis RSC05 o isolado mais virulento. Verificou-se, ainda, que os isolados de Heterorhabditis, de modo geral, foram mais virulentos que os de Steinernema. O imidaclopride não afetou a viabilidade nem a infectividade dos NEPs, nas comparações com a testemunha sem o produto. Palavras-chaves: controle microbiano, Heterorhabditidae, Steinernematidae. Summary - Souza, L.M., A. Moino Júnior, N.R. Mertz, M.A.T. Silva, F.M. Soares & R.Z. Bonete Filho Entomopathogenic nematodes and their compatibility with imidacloprid in the control of Spodoptera frugiperda in a forest nursery. The pathogenicity and virulence of isolates of the entomopathogenic nematodes (EPNs) Steinernema and Heterorhabiditis to Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) were evaluated under laboratory conditions. Aiming the synergistic use on eucalypt plants in forest nurseries, the viability and infectivity of the most virulent isolates combined with the insecticide imidacloprid were also investigated. This compatibility study was based on the methodology used by Negrisoli et al. (2008) with modifications. All concentrations of the Heterorhabditis isolates used caused mortality, except for the control, and H. amazonensis RSC05 was rated as the most virulent isolate. Moreover, in a general sense, the Heterorhabditis isolates were more virulent than those of Steinernema. Imidacloprid did not affect the viability and infectivity of the NEPs compared with the control treatments without the insecticide. Key words: biological control, Heterorhabditidae, Steinernematidae. 32 Vol. 36(1-2)

2 Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal Introdução O Brasil apresenta área total de florestas plantadas de hectares, dos quais hectares correspondem a espécies de eucalipto. Segundo a Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas (ABRAF, 2010), plantios de eucalipto no Brasil se destinam, basicamente, à produção de celulose, papel e carvão vegetal. O processo de propagação vegetativa por miniestaquia em tubetes de plástico, para atender à produção massal de mudas de Eucalyptus spp. em viveiros florestais, é das fases mais importantes na implantação de povoamentos florestais e, devido ao menor custo e às vantagens de operação, tem sido adotado pela maioria das empresas eucaliptocultoras brasileiras (Alfenas et al., 2004). A qualidade das mudas no momento do plantio no campo garante uma floresta de alta produtividade e depende, entre outros fatores, do manejo adequado de certas pragas, como Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Conhecida como lagartado-cartucho, as larvas dessa espécie; que se abrigam entre os recipientes das mudas ou em entulhos; atacam as plântulas de eucalipto na altura do coleto, principalmente em reboleira, carregando-as aos esconderijos ou desfolhando-as. Os danos são maiores em plântulas nos primeiros dias após a germinação, ou em brotações novas de matrizes clonais cultivadas em canteiros de areia. A presença de fezes e folhas entre os recipientes e de fios de seda sobre as mudas denunciam a ocorrência das lagartas. A ocorrência é anual, com picos em períodos de maior disponibilidade de mudas com poucos dias ou semanas de idade (Zanetti, 2008). Nessa situação, quando as mudas apresentam caules tenros, uma única lagarta pode cortar dezenas delas e, sob condições favoráveis, entre 50% a 100 % das mudas podem ser destruídas ou severamente danificadas (Anjos et al., 1986). Poucos produtos à base de inimigos naturais das pragas estão disponíveis para as empresas de viveiros florestais, bem como às áreas de plantio, justificando grandes investimentos em insumos, estimados em R$ 7,2 bilhões de reais para o período 2009 a 2014, e gerando problemas ambientais, econômicos e sociais (ABRAF, 2010). O biocontrole de insetos com produtos à base de nematoides entomopatogênicos (NEPs) pode ser uma alternativa viável, eficiente e segura, dadas certas características que os tornam vantajosos, como compatibilidade com produtos fitossanitários (Koppenhöfer, 2007; Negrisoli Jr. et al., 2010) e alta capacidade de adaptação a novos ambientes (Hominick et al., 1996; Lewis et al., 2006). A combinação de NEPs com imidaclopride, inseticida com baixo impacto ambiental e baixa toxicidade aos vertebrados, pode vir a constituir boa alternativa ao uso isolado deste, em larga escala, nos viveiros florestais (Elbert et al., 1991). Dessa forma, os objetivos do trabalho, conduzido em laboratório, foram avaliar a patogenicidade e a virulência de isolados de NEPs dos gêneros Steinernema e Heterorhabiditis em relação a lagartas de S. frugiperda e avaliar a compatibilidade de uso dos isolados mais virulentos com o imidaclopride. Material e Métodos Obtenção de isolados de NEPs. Os isolados de NEPs utilizados (Tabela 1) foram obtidos do banco de entomopatógenos do Laboratório de Patologia de Insetos da Universidade Federal de Lavras (Lavras, MG) e do Instituto Biológico (Campinas, SP). Foram mantidos em suspensão aquosa, em frascos de cultura de tecidos armazenados Tabela 1 - Isolados de NEPs utilizados nos ensaios e respectivos locais de origem. Isolados Steinernema brazilense IBCB n-06 Steinernema carpocapsae All Steinernema sp. CB n-27 Heterorhabditis amazonensis RSC 05 Heterorhabditis sp. (JPM 4) Heterorhabditis bacteriophora HP88 Local de origem Porto Murtinho, MT, Brasil Carolina do Norte, EUA Mogi-Guaçu, SP, Brasil Benjamin Constant, AM, Brasil Lavras, MG, Brasil Nova Jersey, EUA Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 33

3 Lucas M. de Souza, Alcides Moino Júnior, Natália R. Mertz, Marco Aurélio T. da Silva, Flávio M. Soares & Ronald Z. Bonete Filho em câmara climatizada a 16ºC. A multiplicação foi feita por métodos in vivo modificados de White (1927), Woodring & Kaya (1988) e Molina & López (2001), utilizando lagartas de último ínstar de Galleria mellonella, provenientes de criações já estabelecidas. Os juvenis infectantes (JI) foram usados após dois dias da emergência, no máximo, com 95% de viabilidade. Patogenicidade e virulência de isolados de NEPs a Spodoptera frugiperda. O bioensaio foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado e avaliando-se a ação de seis isolados em cinco concentrações distintas [zero (testemunha), 70, 150, 300 e 600 JI], em 0,5 ml de água destilada por inseto, aplicadas topicamente com auxílio de pipeta. Cada combinação isolado / concentração representou um tratamento, que consistiu de 42 exemplares de S. frugiperda dispostos em sete repetições com seis por repetição, acondicionados em copos plásticos de 50 ml com tampa acrílica. Consideraram-se patogênicos às lagartas os isolados que mataram no mínimo um indivíduo dentro das combinações, com causa devidamente confirmada, sendo, portanto, a patogenicidade uma variável categórica. Por outro lado, a virulência foi tratada como variável contínua e comparada em diferentes concentrações para cada isolado. Lagartas de 10 dias de idade (entre 3º. e 4.º ínstares) foram obtidas de criação na qual se utilizava dieta artificial baseada em Cruz (2009). Uma lagarta foi colocada no interior do copo plástico sobre pedaço de papel filtro (tamanho suficiente para cobrir o fundo do copo) e com dieta artificial suficiente para o inseto se alimentar durante o experimento. Salienta-se que não se utilizou mais de um indivíduo por copo devido ao canibalismo da espécie e à necessidade de repetições independentes. Durante cinco dias de exposição, verificou-se diariamente a mortalidade de lagartas. Os insetos mortos foram retirados e armazenados em copos plásticos (50 ml), em condições semelhantes a uma câmara seca por cinco dias, tempo necessário para a multiplicação dos nematoides no cadáver. Após esse período, foram feitas dissecações com auxílio de bisturi e agulha histológica, para confirmação do agente causal. A mortalidade das lagartas foi utilizada para determinar a patogenicidade de cada isolado, bem como a virulência, em diferentes concentrações. Análise de regressão polinomial foi realizada, seguida de análise de variância. Os dados de mortalidade foram analisados em modelos lineares generalizados (função glm) com distribuição binomial, obtendo DL 50 por logit. Os modelos foram comparados pela DL 50, considerando tratamentos iguais aqueles que apresentaram intervalos de confiança que se sobrepõem. A variável explicativa é concentração (NEP / inseto) e a variável resposta é mortalidade em que as curvas representam o modelo de cada isolado. As análises foram realizadas pelo programa estatístico R (R Development Core Team, 2010) a 5 % de significância. Compatibilidade dos isolados de NEP com o imidaclopride. Foram selecionados os isolados H. amazonensis RSC05, Heterorhabditis sp. JPM4 e H. bacteriophora HP88, devido à maior mortalidade apresentada no experimento anterior, para avaliar a compatibilidade com o produto imidaclopride, de uso comum em viveiros florestais. Foi adotada a metodologia de Negrisoli Júnior et al. (2008) com modificações, considerada técnica adequada devido à simplicidade de montagem, avaliação precisa e baixo custo total. Um litro da formulação do produto comercial foi preparado, proporcionalmente à concentração recomendada em alta infestação (500 g / 100 litros de água). Os tratamentos consistiram de cinco repetições, formadas cada uma por placas de Petri com 20 ml da calda do produto e JI suspensos em 1 ml de água destilada dos respectivos isolados. A parte de baixo foi fechada com filme PVC e tampada com a parte de cima da placa, a fim de se evitar evaporação da mistura durante o período de armazenamento. Em seguida, as placas foram acondicionadas em câmara climática a 25 ºC ± 2 C, UR de 70 ± 10 % e 12 horas de fotoperíodo. Como testemunha, 1 ml da suspensão do isolado foi misturado a 20 ml de água destilada. Optou-se por utilizar placas de Petri de 9 cm de diâmetro devido à grande área apresentada, evitando problemas de decantação e não expondo os JI a uma concentração acima do desejado no experimento. A viabilidade dos nematoides foi avaliada 48 horas 34 Vol. 36(1-2)

4 Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal após a exposição. Para tanto, alíquotas foram retiradas da suspensão e 100 JI de cada repetição foram observados em estereoscópio para determinar a mortalidade. Foram considerados mortos aqueles que não responderam a repetidos estímulos com estilete. A infectividade dos nematoides foi testada no mesmo período que a viabilidade. Os NEPs foram lavados em 200 ml de água destilada, por 30 segundos, para retirar o imidaclopride com auxílio de peneiras de 500 mesh evitando perdas de JI. Após a lavagem, uma alíquota de 0,2 ml (cerca de 100 JI) foi pipetada em oito lagartas individualizadas em copos plásticos com papel filtro e dieta artificial. O bioensaio foi acondicionado em condições semelhantes às dos experimentos anteriores. Os dados de viabilidade de JI e mortalidade de lagartas foram submetidos à análise de variância. Foram verificadas as premissas da ANOVA utilizandose o teste Shapiro-Wilk como teste de normalidade e teste de Levene para homocedasticidade. Para o cálculo da eficiência de infectividade (E), procedeu-se à correção pela fórmula: E% = (1 mt / mc) x 100, em que mt = mortalidade do tratamento e mc = mortalidade do controle, de acordo com Peters & Poullot (2004), baseado na International Organisation for Biological and Integrated Control of Noxious Animals and Plants (IOBC). Os valores de eficiência do inseticida para cada isolado foram classificados como: 1 = não tóxico (< 30 %); 2 = levemente tóxico (30 a 79 %); 3 = moderadamente tóxico (80 a 99 %); e 4 = tóxico ( > 99 %). Resultados e Discussão Patogenicidade e virulência dos isolados de NEPs a Spodoptera frugiperda. Houve mortalidade em todos os isolados, indicando serem patogênicos, porém detectaram-se diferenças na virulência (Figura 1). Devido à ausência de mortalidade nas testemunhas, não foi necessário comparar com a mortalidade confirmada. A morte causada por outro agente pode ser considerada baixa o suficiente para não haver diferenças estatísticas entre ambas as mortalidades. Os dados de DL 50 mostram que H. amazonensis RSC 05, Heterorhabditis sp. JPM 4 e H. bacteriophora HP88 foram os isolados mais virulentos (Tabela 2). H. amazonensis RSC 05 foi o mais virulento entre eles, enquanto os outros dois mostraram-se iguais devido à sobreposição do intervalo de confiança. Não foi possível obter DL 50 para S. carpocapsae All devido à Mortalidade (%) 110 y = -0,0006x²+0,4625x+16,364 R²=0, y=0,1274x+10, R²=0, y=-0,0003x²+0,2455x+11,304 R²=0, y=0,0467x+0, R²=0, HP88 RSC05 JPM4 CB27 CB02 CB06 y=3e-05x²-0,0051x+0,5404 R²=0,8345 y=4e-07x³-0,0004x²+0,0741x-0,312 R²=0,9223 HP88 RSC05 JPM4 CB27 CB02 Figura 1 - Curvas de mortalidade (%) em relação à concentração para cada isolado de NEP. Tabela 2 - Valores de DL 50 determinados para os isolados de NEPs incluídos no estudo. Isolados DL 50 (EP) JI/inseto Heterorhabditis amazonensis RSC ± 20,45 a Heterorhabditis bacteriophora HP ± b Heterorhabditis sp. (JPM 4) ± b Steinernema brazilense IBCB n ± c Steinernema sp. CB n ± d Steinernema carpocapsae All - Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 35

5 Lucas M. de Souza, Alcides Moino Júnior, Natália R. Mertz, Marco Aurélio T. da Silva, Flávio M. Soares & Ronald Z. Bonete Filho baixa mortalidade apresentada por esse isolado. Entre os isolados comparados neste estudo, H. amazonensis RSC 05 mostrou-se o mais adequado para uso em trabalhos futuros afins, devido à menor concentração de nematoide necessária para matar a praga, o que torna o controle menos oneroso. De forma geral, nas condições do experimento, os isolados de Heterorhabditis foram mais virulentos que os de Steinernema. Apesar de estes últimos terem sido patogênicos, apresentaram baixa virulência para as lagartas de 10 dias. Por outro lado, Garcia et al. (2008) obtiveram altas taxas de mortalidade de S. frugiperda com doses relativamente baixas de Steinernema brazilense, sugerindo que algum fato possa ter contribuído para as grandes diferenças de mortalidade obtidas. Novos estudos devem ser realizados procurando conhecer a causa, ou causas, que levaram a essas diferenças, contribuindo à padronização de produtos à base de NEP. Os presentes resultados corroboram os de Tol & Raupp (2005), que verificaram que algumas espécies de insetos são mais suscetíveis a espécies de Heterorhabditis do que de Steinernema. Além disso, diferenças na virulência de NEPs podem ser atribuídas à especificidade, à morfologia, à origem e à variabilidade genética dos isolados, bem como à tolerância do hospedeiro (Stuart et al., 2006). Anteriormente, Alves et al. (2009) verificaram que isolados de Heterorhabditis foram mais virulentos do que os de Steinernema no controle da cochonilha da raiz do cafeeiro (Dysmicoccus texensis), obtendo-se mortalidades máximas de 100% e 34%, respectivamente, à concentração de 100 JI / inseto. Quanto à morfologia do nematoide, Adams & Nguyen (2002) demonstraram que a maioria dos Heterorhabditidae tem tamanho menor que o dos Steinernematidae, o que pode explicar, pelo menos em parte, o maior sucesso dos isolados de Heterorhabditis em relação aos de Steinernema. Isso porque o menor tamanho facilita a penetração, além de permitir maior acesso de JI no hospedeiro. Como se utilizaram lagartas com 10 dias de idade, pertencentes aos ínstares iniciais, as aberturas do corpo (boca, ânus e espiráculos) são proporcionalmente menores, dificultando a penetração dos JI de Steinernema. Portanto, baseado no tamanho dos JI, os resultados deste trabalho não descartam a possibilidade de os isolados do gênero Steinernema, que não mataram ou mataram poucas lagartas, serem patogênicos e mais virulentos em outras condições. A possível barreira física imposta pelas lagartas de ínstares iniciais poderia ser eventualmente superada em ínstares mais avançados, em que aberturas maiores tornassem mais fácil a penetração dos JI e os isolados mais virulentos. O fato de algumas lagartas mortas não apresentarem nematoides após dissecadas não descarta totalmente a possibilidade terem sido mortas pelo mesmos. Além disso, a técnica de dissecação pode apresentar dificuldades na visualização de NEPs, quando a ocorrência destes é escassa. A ausência de mortalidade nas testemunhas permite inferir que a morte de lagartas causada por outro agente causal foi baixa ou inexistente. Portanto, é possível que a lagarta de S. frugiperda não seja um hospedeiro adequado à multiplicação de JI do gênero Heterorhabditis, apesar da alta infectividade. As curvas de mortalidade dos diferentes tratamentos de Heterorhabditis são apresentadas nas Figuras 2, 3 e 4. Devido à baixa mortalidade apresentada pelos tratamentos do gênero Steinernema, optou-se por representar graficamente apenas as curvas dos isolados de Heterorhabditis. As concentrações 150, 300 e 600 JI / inseto foram representadas em apenas uma curva de mortalidade (-0,0292x 3 + 0,1895x 2-0,0437x - 0,0295) para simplificar o modelo, pois apresentaram TL 50 iguais. A curva apresentou TL 50 = 2,12, enquanto que a curva de mortalidade da concentração 70 (-0,0287x 3 + 0,2081x 2-0,1987x + 0,0009) foi 2,82. Segundo Ffrench-Constant & Bowen (1999), NEPs matam os hospedeiros em até 48 horas, porém as curvas indicam o início da mortalidade a partir de 24 horas. Como foi feita apenas uma avaliação diária, no primeiro dia não se detectou mortalidade, iniciando-se a partir do segundo dia. Provavelmente, o início da mortalidade ocorreu próximo da segunda avaliação, fato que poderia ser confirmado com uma eventual avaliação no intervalo de tempo intermediário de 36 horas. As curvas das concentrações 150, 300 e 600 de H. amazonensis RSC05, quando comparada à da 36 Vol. 36(1-2)

6 Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal 1,0 Mortalidade 0,8 0,6 0,4 0,2 [70] [0] [150] [300] [600] 0, Tempo (dias) Figura 2 - Curvas de mortalidade de S. frugiperda submetida ao isolado H. amazonenses RSC05, em diferentes concentrações, durante cinco dias. Mortalidade 1,0 0,8 0,6 0,4 [0] [70] [150] [300] [600] 0,2 0, Tempo (dias) Figura 3 - Curvas de mortalidade de Spodoptera frugiperda submetida ao isolado Heterorhabditis bacteriophora HP88, em diferentes concentrações, durante cinco dias. 1,0 0,8 [0] [150] [70] [300] [600] Mortalidade 0,6 0,4 0,2 0, Tempo (dias) Figura 4 - Curvas de mortalidade de Spodoptera frugiperda submetida ao isolado Heterorhabditis sp. JPM4, em diferentes concentrações, durante cinco dias. Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 37

7 Lucas M. de Souza, Alcides Moino Júnior, Natália R. Mertz, Marco Aurélio T. da Silva, Flávio M. Soares & Ronald Z. Bonete Filho concentração 70, demonstraram mortalidade mais rápida e intensa. Rápida penetração no corpo do hospedeiro, morte deste por septicemia e elevada virulência em baixas concentrações são características importantes demonstradas pelo isolado H. amazonensis RSC05, principalmente na concentração de 150 JI / inseto, visando à seleção do mesmo como possível agente de controle de S. frugiperda em viveiros florestais. As equações das curvas das concentrações 70, 150 e 300 e 600 são 0,01x 2 + 0,04x - 0,01, -0,1x 2 + 0,17x - 0,05 e -0,02x 2 + 0,32x - 0,10, respectivamente. Por sua vez, as TL 50 das concentrações e 600 foram 5,04 e 2,24 dias, respectivamente. Não se representou o TL 50 na concentração 70 por ter excedido ao número de dias do ensaio. As curvas do isolado de H. bacteriophora HP88 mostraram mortalidade concentrada no período de 1 a 3 dias, exceto na testemunha, com pouca queda após esse período (Figura 3). A diferença de mortalidade entre os tratamentos foi maior, comparada com a dos tratamentos de H. amazonensis RSC05. Houve diferenças de mortalidade em todos os tratamentos com nematoides, exceto entre as concentrações 150 e 300. Nesse caso, para se atingir uma mortalidade semelhante à observada com o isolado anterior seriam necessárias grandes quantidades de JI por inseto, acarretando custo bem maior em eventual formulação para ser aplicada em viveiro florestal. As curvas de sobrevivência do isolado Heterorhabditis sp. JPM4 (Figura 4) mostram período de mortalidade das lagartas entre o segundo e o quinto dia de avaliação. As curvas indicam maior demora em iniciar a mortalidade, além de mostrarem mortalidade por tempo mais longo. Nesse caso, o crescimento das lagartas durante os cinco dias ou mesmo a idade das mesmas pode ter sido fator desfavorável à infectividade do isolado. As equações das curvas das concentrações 70, 150 e de Heterorhabditis sp. JPM4 são 0,02x 2-0,06x - 0,02, 0,03x 2-0,05x + 0,01 e -0,03x 2-0,04x - 0,01, respectivamente. As TL 50 das concentrações 150 e foram 5,02 e 4,30 dias, respectivamente. Não se representou o TL 50 na concentração 70 por ter excedido o número de dias do ensaio. Segundo Boff et al. (2000), a duração do ciclo do NEP no hospedeiro depende de vários fatores, como a espécie do inseto, o tamanho do JI, a temperatura ambiente e a quantidade de JI que penetra no inseto, sendo, portanto, alguns indicativos do maior intervalo sem mortes desse isolado e de sua menor virulência. Assim, considera-se que o isolado Heterorhabditis sp. JPM4 não apresenta as características desejáveis para ser trabalhado em testes em viveiros florestais, pois, além de apresentar baixa mortalidade, é lento em sua ação. Compatibilidade dos isolados de NEP com o imidaclopride. A viabilidade dos isolados H. amazonensis RSC 05, H. bacteriophora HP88 e Heterorhabditis sp. JPM 4 imediatamente antes da montagem dos experimentos foi de 99,43 % (M) ± 0,38 % (DP), 95,84 % ± 0,97 % e 83,43 % ± 1,10 %, respectivamente. Foi realizada comparação estatística entre os isolados, mas a análise principal é a comparação dentro do mesmo isolado, verificando-se apenas o efeito do produto fitossanitário na viabilidade dos JI. A análise de variância mostrou que pelo menos um tratamento analisado difere estatisticamente dos outros (F 5,24 = 131,05; p = 2,2-16 ). O teste de normalidade Shapiro-Wilk e o teste de homocedasticidade de Levene foram favoráveis à aplicação da análise de variância: W = 0,927, p = 0,061; F = 1,42, p = 0,25, respectivamente. Não houve diferenças na viabilidade dos JI entre tratamentos com H. amazonensis RSC 05 e H. bacteriophora HP88, após dois dias de exposição ao imidaclopride, e testemunha (nematoide sem exposição ao produto). Entretanto, houve diferença na viabilidade do isolado Heterorrhabditis, sp. JPM4 quando comparada à da testemunha e do tratamento imidaclopride (Tabela 3). O protocolo IOBC sugere a classificação 1 (não tóxico) para inseticidas que resultem em Eficiência de Mortalidade (E) abaixo de 30 % nas avaliações de infectividade, não havendo aplicação dessa escala para a variável viabilidade. Porém, apesar de verificada diferença estatística no teste de viabilidade de Heterorhabditis sp. JPM4, a diferença foi inferior a 30 %, comparada ao tratamento controle, o que permitiria classificá-lo como produto não-tóxico, se 38 Vol. 36(1-2)

8 Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal Tabela 3 - Porcentagem de viabilidade (M±DP) após dois dias de exposição dos isolados de Heterorhabditis testados frente ao imidaclopride. Tratamento Viabilidade (%) H. amazonensis RSC 05 H. bacteriophora HP88 Heterorhabditis sp. (JPM 4) Testemunha 98,23 ± 0,20 a 93,16 ± 0,54 a 78,46 ± 3,1 a Imidaclopride 97,33 ± 0,77 a 91,70 ± 2,39 a 68,34 ± 4,24 b Médias seguidas por letras distintas nas colunas diferem entre si. Tabela 4. Porcentagem de infectividade [M ± EP(M)] dos isolados de Heterorhabditis às lagartas de S. frugiperda após dois dias em contato com imidaclopride. Tratamento Mortalidade Total (%) E% 1 C 2 H. bacteriophora HP88 + Imidaclopride 80,00 ± 18,96 a <1,00 1 H. bacteriophora HP88 72,50 ± 18,54 a - H. amazonensis RSC 05 65,00 ± 20,54 a - Heterorhabditis sp. JPM 4 + imidaclopride 62,50 ± 26,52 a <1,00 1 Heterorhabditis sp. JPM 4 62,00 ± 12,50 a - H. amazonensis RSC 05 + imidaclopride 60,92 ± 20,92 a 11, Eficiência de mortalidade calculada pela fórmula: E% = 100 (1 t / mc) x Classificação toxicológica do inseticida: 1 = não-tóxica (< 30%) Mortalidade (%) Tratamentos Tempo (dias) Figura 5 - Curva de mortalidade (%) de Spodotera frugiperda submetida aos isolados de Heterorhabditis após dois dias de exposição ao imidaclopride. fosse levada em conta a mesma classificação utilizada para a infectividade. Resultados semelhantes foram obtidos no estudo de Andaló et al. (2004), em que não houve efeito prejudicial sobre a viabilidade de Steinernema arenarium, quando em contato com o imidaclopride. A infectividade dos NEPs testados em lagartas de 3º. a 4º. ínstar de S. frugiperda não foi afetada pela exposição dos JI ao produto fitossanitário imidaclopride (Tabela 4). A partir do teste de Shapiro- Wilk, aceitou-se a hipótese de normalidade dos dados de infectividade (W = 0,96; p = 0,27) e do teste de Levene aceitou-se a homogeneidade dos dados (F = 0,31; p = 0,90), permitindo a realização da análise de variância (F 5,24 = 1,41; p = 0,26). Como os tratamentos são iguais estatisticamente, apenas um modelo foi criado para representar a curva de sobrevivência (Figura 5). Baseado no protocolo pela IOBC, o neonicotinoide imidaclopride pode ser considerado compatível com os isolados de Heterorhabditis testados. O mesmo foi observado por Koppenhöfer et al. (2000a, b), que mostraram que a combinação com inseticidas neonicotinoides não afetou a infectividade e a patogenicidade do NEP aplicado, nem a reprodução no hospedeiro ou a infectividade e a patogenicidade da sua progênie. Mesmo sob condições extremas, às quais o nematoide poderia ser Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 39

9 Lucas M. de Souza, Alcides Moino Júnior, Natália R. Mertz, Marco Aurélio T. da Silva, Flávio M. Soares & Ronald Z. Bonete Filho submetido quando misturado em tanques com os inseticidas, essas variáveis avaliadas foram afetadas. Além disso, a compatibilidade do imidaclopride com JI de H. bacteriophora foi avaliada por Koppenhöfer & Kaya (1998), que observaram a inviabilidade de apenas 0,7 % a 3 % dos JI, considerando o produto compatível com aquela espécie de NEP. Andaló et al. (2004) verificaram que S. arenarium causou 80 % de mortalidade em lagartas de G. mellonella quando em contato com o produto imidaclopride, resultados que foram corroborados pelos obtidos no presente estudo. Entretanto, considera-se a utilização de S. frugiperda, como hospedeiro para os testes de infectividade, de importância prática maior em relação aos objetivos finais do estudo do que utilizar G. mellonella, o hospedeiro para multiplicação dos NEPs. Um dos motivos que justificam a compatibilidade mostrada nesses trabalhos é que imidaclopride é um inseticida neonicotinoide com toxicidade relativamente baixa a vertebrados e baixa a invertebrados benéficos (Kunkel et al., 2001). Negrisoli Jr. et al. (2010) demonstraram a interação de diversos produtos registrados para a cultura do milho (não inclui imidaclopride) em dose sub-letal com NEP para controle de S. frugiperda, representando a possibilidade de utilizar esse sinergismo com as tecnologias de aplicação atuais. Entretanto, os autores registraram baixa eficiência da mistura para o controle da praga, necessitando de mais estudos para determinar a concentração ótima de produto e NEP a ser utilizada em campo. Os resultados deste trabalho demonstram que não há necessidade de aplicar grandes quantidades de NEP para se obter um resultado satisfatório e igual às maiores concentrações na mortalidade das lagartas em laboratório. Sugere-se que, em campo, os resultados possam ser semelhantes ao observado em laboratório e o isolado H. amazonensis RSC05, considerado o mais virulento, possa também ser utilizado em baixas concentrações. Os resultados deste trabalho ganham maior expressão ao considerar que H. amazonensis RSC05 é um isolado nativo e pode ser produzido em escala industrial para gerar um produto que passe por menores barreiras no processo de registro. Com base nos resultados apresentados nesse trabalho, é possível a associação do produto fitossanitário imidaclopride com os isolados Heterorhabditis testados. O isolado H. amazonensis RSC05 apresentou-se o mais aconselhável a ser utilizado em viveiros florestais para controle de S. frugiperda. Porém, é importante a continuidade de uma avaliação criteriosa em viveiro florestal para a inserção desses organismos compatíveis com imidaclopride para verificar possíveis efeitos aditivos ou sinérgicos em programas de manejo integrado de pragas para o controle de S. frugiperda. Literatura Citada ABRAF - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PRODUTORES DE FLORESTAS PLANTADAS Anuário Estatístico da ABRAF 2010 Ano Base ABRAF, Brasília DF, 140 p. ADAMS, B.J. & K.B. NGUYEN. Taxonomy and systematic In: GAUGLER, R. (ed). Entomopathogenic Nematology. Rutgers University, N. Jersey - EUA, p ALFENAS, A.C., A.A.V. ZAUZA, R.G. MAFIA & T.F. DE ASSIS Clonagem e doenças do eucalipto. Editora UFV, Viçosa, 442 p. ALVES, V.S. A. MOINO JUNIOR, L.V.C.S. CECILIA, V. ANDALÓ & G.C. SOUZA Patogenicidade de nematoides entomopatogênicos a cochonilha-da-raizdo-cafeeiro Dysmicoccus texensis (Tinsley) (Hemiptera: Pseudococcidae) em laboratório. Arquivos do Instituto Biológico, 76 (1): ANDALÓ, V., A. MOINO JÚNIOR & L.V.R.S. CECÍLIA Compatibilidade de nematoides entomopatogênicos com produtos fitossanitários utilizados na cultura do cafeeiro. Nematologia Brasileira, 28 (2): ANJOS, N., G.P. SANTOS & J.C. ZANUNCIO Pragas do eucalipto e seu controle. Informe Agropecuário, 12 (141): BOFF, M.I.C., G.L. WIEGERS, L.J.M. GERRITSEN & P.H SMITS Development of the entomopathogenic nematode Heterorhabditis megidis strain NLH-E87.3 in Galleria mellonella. Nematology, 2 (3): CRUZ, I Métodos de criação de agentes entomófagos de Spodoptera frugiperda. In: BUENO, V.H.P. (ed). Controle Biológico de Pragas: Produção Massal e Controle de Qualidade. Editora UFLA, Lavras, p ELBERT, A., B. BECKER, J. HARTWIG & C. ERDELEN Imidacloprid: a new systemic insecticide. Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 44 (2): FFRENCH-CONSTANT & R.H.; BOWEN, D.J., Photorhabdus toxins: novel biological insecticides. Current Opinion in Microbiology, 2 (3): Vol. 36(1-2)

10 Nematoides Entomopatogênicos e Compatibilidade com Imidaclopride Visando ao Controle de Spodoptera frugiperda em Viveiro Florestal GARCIA, L.C., C.G. RAETANO & L.G. LEITE, Application technology for the entomopathogenic nematodes Heterorhabditis indica and Steinernema sp. (Rhabditida: Heterorhabditidae:Steinernematidae) to control Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in Corn. Neotropical Entomology, 37(3): HOMINICK, W.A., A.P. REID, D.A. BOHAN & B.R. BRISCOE Entomopathogenic nematodes: biodiversity, geographical distribution and the convention on biological diversity. Biocontrol Sci. and Technology, 6 (3): KOPPENHÖFER, A.M Nematodes. In: LACEY, L.A. & H.K. KAYA (ed). Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Springer, New York., p KOPPENHÖFER, A.M. & H.K. KAYA Synergism of imidacloprid and an entomopathogenic nematode: a novel approach to white grub control in turfgrass. Journal of Economic Entomology, 91 (3): KOPPENHÖFER, A. M., P.S. GREWAL & H.K. KAYA. 2000a. Synergism of imidacloprid and entomopathogenic nematodes against white grubs: the mechanism. Entomologia Experimentalis et Applicata, 94 (3): KOPPENHÖFER, A.M., I.M. BROWN, R. GAUGLER, P.S. GREWAL, H.K. KAYA & M.G. KLEIN. 2000b. Synergism of entomopathogenic nematodes and imidacloprid against white grubs: greenhouse and field evaluation. Biological Control, 19 (3): KUNKEL, B.A., D.W. HEALD & D.A. POTTER Lethal and sublethal effects of bendiocarb, halofenozide, and imidaclopid on Harpalus pennsylvanicus (Coleoptera: Carabidae) following different modes of exposure in turfgrass. Journal of Economic Entomology, 94 (1): LEWIS, E. E., J. CAMPBELL, C. GRIFFIN, H.K. KAYA & A. PETERS Behavioral ecology of entomopathogenic nematodes. Biol. Control, 38 (1): MOLINA, J.P. & N.J.C. LÓPEZ Producción in vivo de tres entomonemátodos con dos sistemas de infección en dos hospedantes. Revista Colombiana de Entomología, 27 (1/2): NEGRISOLI JÚNIOR, A.S., C.R.C. BARBOSA & A. MOINO JÚNIOR Avaliação da compatibilidade de produtos fitossanitários com nematoides entomopatogênicos (Rhabditida: Steinernematidae: Heterorhabditidae) utilizando o protocolo da IOBC/ WPRS. Nematologia Brasileira, 32 (2): NEGRISOLI JÚNIOR, A.S., M.S. GARCIA & C.R.C.B. NEGRISOLI Compatibility of entomopathogenic nematodes (Nematoda: Rhabditida) with registered insecticides for Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) under laboratory conditions. Crop Protection, 29 (6): NGUYEN, K.B., C.M.A. GINARTE, L.G. LEITE, J.M. SANTOS & R. HARAKAVA Steinernema brazilense n. sp. (Rhabditida: Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from Mato Grosso, Brazil. Journal of Invertebrate Pathology, 103 (1): PETERS, A. & D. POULLOT Side effects of surfactants and pesticides on entomopathogenic nematodes assessed using advanced IOBC guidelines. IOBC / WPRS Bulletin, 27 (6): STUART, R.J., M.E. BARBERCHECK, P.S. GREWAL, R.A.J. TAYLOR & C.W. HOY Population biology of entomopathogenic nematodes: concepts, issues, and models. Biol. Control, 38 (1): WHITE, G.F A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science, 66: WOODRING, J.L. & H.K. KAYA Steinernematid and heterorhabditid nematodes: a handbook of biology and techniques. Arkansas Exp. Station, 28 p. ZANETTI, R Manejo de pragas de viveiros florestais. In: DAVIDE, A.C. & E.A.A. SILVA (ed). Produção de Sementes e Mudas de Espécies Florestais. Editora UFLA, Lavras, p Nematologia Brasileira Piracicaba (SP) Brasil 41