Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida)

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1 ARTIGO Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) Aldomario S. Negrisoli Jr., Carla R.C. Barbosa & Alcides Moino Jr. Universidade Federal de Pelotas, FAEM, Departamento de Fitossanidade, C. Postal 54, , Pelotas (RS) Brasil. Universidade Federal de Lavras, Departamento de Entomologia, C. Postal 07, , Lavras (MG) Brasil. Autor para correspondência: Recebido para publicação em 0 / 07 / 007. Aceito em 9 / 0 / 008 Resumo - Negrisoli Jr., A.S., C.R.C. Barbosa & A. Moino Jr Comparação entre metodologias de avaliação da compatibilidade de produtos fitossanitários com nematóides entomopatogênicos. Diferentes metodologias para a avaliação da compatibilidade de produtos fitossanitários com nematóides entomopatogênicos são conhecidas. Procurando selecionar o método mais eficiente e ao mesmo tempo simples e barato de ser aplicado, compararam-se quatro dessas metodologias, a saber: Krishnayya & Grewal (00), Rovesti et al. (988), Hara & Kaya (98) e o protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99). Como base para a comparação entre elas, algumas adaptações foram feitas, e todas incluíram dois parâmetros de avaliação: a viabilidade dos JIs e a infectividade destes em Galleria mellonella. Como padrões, em todos os métodos foram utilizados o produto Glifosato 480 CS (Agripec, ingrediente ativo: glifosato) e os nematóides Steinernema carpocapsae e Heterorhabditis bacteriophora. O glifosato foi considerado compatível com JIs de S. carpocapsae e H. bacteriophora. Não se observaram diferenças nos efeitos da concentração de glifosato e do tempo de exposição sobre JIs de ambas as espécies. A metodologia de menor custo foi a descrita por Rovesti et al. (988), seguida pelo protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99), mas esta última foi considerada a melhor dentre todas quando simplicidade e praticidade também foram consideradas. Palavras-chaves: Nematoda, controle biológico, seletividade, padronização. Summary Negrisoli Jr., A.S., C.R.C. Barbosa & A. Moino Jr A comparison of methodologies for evaluation of the compatibility between agrochemicals and entomopathogenic nematodes. Different methodologies for evaluating the compatibility of agrochemicals with entomopathogenic nematodes are known. To select the most efficient, cheap and practical method to be utilized, four of these methods were compared: Krishnayya & Grewal (00), Rovesti et al. (988), Hara & Kaya (98), and the IOBC / WPRS guideline (Vainio, 99). These methodologies, with a few, necessary adaptations, included evaluation of the viability of the nematode IJs as well their infectivity on Galleria mellonella. As standards in all tested methods, Glifosato 480 CS (Agripec, active ingredient: glyphosate), and the nematodes Steinernema carpocapsae and Heterorhabditis bacteriophora were used. Glyphosate was rated as compatible with JIs of both species. No differences were reported in the effects of glyphosate concentration and in the time of exposition of the IJs of both nematode species to the product. The methodology that rendered the lowest final cost was that of Rovesti et al. (988), followed by the guideline of IOBC / WPRS (Vainio, 99), but the latter was considered the best one due to its simplicity and operational facilities. Key words: Nematoda, biological control, selectivity, standardization. 65

2 Aldomario S. Negrisoli Jr., Carla R.C. Barbosa & Alcides Moino Jr. Introdução Nematóides entomopatogênicos (NEPs) das famílias Steinernematidae e Heterorhabiditidae são alternativas biológicas promissoras ao uso dos produtos fitossanitários químicos. Esses nematóides podem causar a morte de muitas pragas economicamente importantes dentro de 4 a 48 horas. A eficiência destes organismos no campo é limitada pela vulnerabilidade a condições ambientes extremas, como a baixa umidade ou a radiação solar, e também pela tendência de tornarem-se imóveis após a aplicação. Por outro lado, NEPs são relativamente insensíveis a muitos produtos fitossanitários. A compatibilidade com tais produtos indica que possam ser aplicados em associação (Grewal, 00). O solo, o hábitat natural dos NEPs, varia muito em sua composição química, biológica e estrutura física, dificultando a condução de estudos sobre a dinâmica populacional desses organismos em campo (Kaya, 990). NEPs são comumente aplicados em locais e ecossistemas que rotineiramente recebem outros insumos, incluindo agrotóxicos químicos, fertilizantes e corretivos de solo, que, por sua vez, podem interagir com os nematóides, podendo ser desejável sua aplicação conjunta, para economizar tempo e dinheiro (Grewal, 00). Estudos mostram que Steinernema carpocapsae (Weiser, 955) e Heterorhabditis bacteriophora Poinar, 976 podem sobreviver quando expostos a vários tipos de agrotóxicos químicos (Zimmerman & Cranshaw, 990; Koppenhöfer & Kaya, 998; Koppenhöfer et al., 000). Em alguns casos, o produto pode ter efeito nematostático, mas, quando removido por lavagem, os nematóides voltam ao comportamento normal (Kaya, 990). Trabalhos que abordam a interação entre NEPs e produtos fitossanitários estão disponíveis, avaliando aspectos da viabilidade, do comportamento e/ ou da infectividade dos JIs, relativamente a um inseto padrão, como Galleria mellonella L., ou para determinada praga agrícola de interesse. Porém, as metodologias empregadas para essas avaliações não seguem uma padronização, o que dificulta a comparação entre os resultados obtidos. O objetivo deste trabalho foi comparar quatro diferentes metodologias de avaliação da compatibilidade de nematóides entomopatogênicos com produtos fitossanitários, bem como os custos totais de cada uma delas, visando selecionar a melhor. Material e Métodos O produto utilizado foi Glifosato 480 Agripec CS (ingrediente ativo: glifosato), 6 l do produto comercial por hectare, baseando-se nos resultados obtidos por Carvalho (00), que avaliou a compatibilidade deste ingrediente ativo e formulação (outro produto comercial) com S. carpocapsae. Nesse trabalho, o produto foi considerado compatível, causando mortalidade dos JIs de até,9 % e infectividade das lagartas de até, %, 0 horas após os JIs terem sido expostos ao produto. Os nematóides entomopatogênicos utilizados nos experimentos foram S. carpocapsae Santa Rosa (isolado de Santa Rosa do Viterbo, SP) e H. bacteriophora isolado da Flórida (local desconhecido), ambos provenientes da coleção da Universidade Federal de São Carlos / CCA, Araras (SP) Brasil, cedidos pela Dr. Marineide M. Aguillera, mantidos no Laboratório de Patologia de Insetos da Universidade Federal de Lavras (MG) e armazenados em suspensões aquosas, conforme as exigências térmicas de cada espécie. A multiplicação de ambos foi realizada em lagartas de último ínstar de G. mellonella, de acordo com a técnica descrita por Kaya e Stock (997), pela qual,0 ml da suspensão de JIs na concentração de 00 JIs por ml foi adicionado em uma placa de Petri (9 cm de diâmetro) em duas folhas de papel filtro ao fundo. Dez lagartas foram colocadas na placa e mantidas em estufa incubadora (B.O.D.) a 5 ± º C, 70 ± 0% U.R. Passados cinco a sete dias, os cadáveres das lagartas foram colocados em armadilha de White (White, 97) e a coleta diária dos JIs iniciada com a emergência destes. As suspensões de JIs de cada espécie foram concentradas em 00 JIs por ml e armazenadas. As lagartas foram obtidas da criação de manutenção do Departamento de Entomologia da Universidade Federal de Lavras, tendo sido criadas em dieta artificial, segundo metodologia descrita por Parra (998). Para a comparação dos resultados, os bioensaios de infectividade foram realizados com lagartas de 66 Vol. () - 008

3 Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) último ínstar de G. mellonella, mesmo que originalmente os métodos preconizassem o uso de outros hospedeiros. Metodologia de Krishnayya & Grewal (00). Os JIs de S. carpocapsae permaneceram armazenados em suspensão aquosa a ± o C e os de H. bacteriophora a 5 ± º C. A concentração da suspensão foi mantida em.500 JIs por ml em água destilada e utilizada dentro de um período de quatro a seis semanas após a coleta. Soluções aquosas do produto fitossanitário foram preparadas com o dobro das concentrações de 0, e 0,8 ml do produto por ml de água. A testemunha constituiu-se de água destilada. Cerca de 750 JIs de cada espécie de nematóide contidos em 0,5 ml de água foram misturados em 0,5 ml de cada solução química, adicionados em placas de 4 células e mantidos em estufa incubadora (B.O.D.) a 8 ± o C e 70 ± 0% UR. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro repetições por tratamento. A viabilidade dos JIs expostos ao produto foi avaliada 4, 4, 7 e 0 horas após a exposição, removendo-se três subamostras de 00 µl (média de 75 JIs por amostra) de cada repetição e observandose sob estereoscópio. Nematóides que não responderam aos estímulos oferecidos foram considerados mortos. A infectividade dos nematóides foi avaliada em lagartas de G. mellonella por meio de bioensaio com areia em placas de 4 células, modificado de Grewal et al. (999). Cerca de 50 JIs em 00 µl de água foram colocados em cada célula de cada placa contendo,5 g de areia seca (peneirada; < mm de diâmetro e esterilizada em estufa). Uma lagarta foi adicionada por célula e incubada a ± o C e 70 ± 0% UR. A mortalidade foi avaliada 7 horas após a inoculação. Os valores de mortalidade de lagartas e nematóides foram submetidos à análise de variância. As diferenças na viabilidade e infectividade das espécies de NEPs foram determinadas utilizando-se o teste de Scott- Knott (P < 0,05). A interação entre tempo de exposição e concentração do produto foi determinada pela regressão polinomial em cada espécie de NEP. Metodologia de Rovesti et al. (988). Os JIs, obtidos de lagartas de G. mellonella, foram coletados de armadilhas de White. No caso de S. carpocapsae, foram armazenados em suspensão aquosa a ± ºC, e com H. bacteriophora, a 5 ± º C, sendo mantidos nessas condições até uma semana antes de serem utilizados. Soluções aquosas do produto fitossanitário foram preparadas com o dobro das seguintes concentrações: 0 (testemunha); 0,00; 0,0; 0,; e 0,4 (recomendada pelo fabricante) ml do produto por ml de água. Cerca de,0 ml de suspensão contendo.000 JIs de cada espécie de nematóide foram misturados em outros,0 ml de cada concentração de produto, adicionados em tubos de ensaio cobertos por filme plástico de PVC (Magipack ) e mantidos em B.O.D. a 0 ± o C e 70 ± 0 % UR. A avaliação da viabilidade foi feita com base no comportamento dos JIs. Assim, 0,5 ml (média de 70 JIs por amostra) de cada tubo de ensaio (repetição) foram extraídos e observados os JIs sob estereoscópio, 4 e 7 horas após exposição ao produto, classificando-os por meio de escala de notas proposta pelos idealizadores do método. A infectividade foi determinada após 7 horas de exposição dos JIs ao produto, transferindo-se os conteúdos dos tubos de ensaio para copos plásticos de 5 ml; os copos plásticos foram completados com água destilada e os JIs decantados por 0 minutos. Os primeiros 0 ml foram descartados completando-se o copo com outros 0 ml de água destilada. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes. Após a terceira vez, 0,4 ml (média de 00 JIs por alíquota) foram pipetados de cada copo plástico e inoculados em placas de Petri (9 cm de diâmetro) contendo duas folhas de papel de filtro. Dez lagartas de G. mellonella foram adicionadas nas placas e mantidas em B.O.D. a ± o C e 70 ± 0 % UR. A primeira avaliação foi feita três dias após a inoculação nas placas. As lagartas ainda vivas foram mantidas por outros três dias, adicionando-se água destilada quando necessário. Lagartas mortas, com coloração típica correspondente ao gênero do nematóide (Heterorhabditis = avermelhada; Steinernema = castanho-clara), foram colocadas em armadilhas de White para observação da emergência; as lagartas que não apresentaram sintomas foram dissecadas para eventual verificação de nematóides. 67

4 Aldomario S. Negrisoli Jr., Carla R.C. Barbosa & Alcides Moino Jr. A infectividade foi também observada após 7 horas de exposição dos NEPs aos produtos. Para isso, areia fina esterilizada foi umedecida com água destilada (0 ml por kg de areia) e 70 g colocados em recipientes plásticos cilíndricos (4 cm altura; 6 cm de diâmetro). Duas lagartas de G. mellonella foram colocadas na superfície do copo com areia, imobilizadas dentro de armadilhas confeccionadas com tubo eppendorff perfurado (,5 ml) para promover a penetração dos JIs. O conteúdo de cada tubo de ensaio foi removido com auxílio de uma seringa e ml injetado no fundo de cinco recipientes (repetições) do lado oposto ao das lagartas. Dessa forma, os nematóides injetados (.000 JIs por recipiente) foram inoculados a 4 cm de distância das lagartas. Os recipientes foram mantidos em B.O.D. a 0 ± o e C 70 ± 0 % UR por seis dias. A mortalidade das lagartas foi observada 44 horas após inoculação; os JIs foram considerados infectivos nas repetições em que pelo menos uma lagarta foi parasitada. Apesar de o método não preconizar análise estatística, os valores de mortalidade de lagartas foram submetidos à análise de variância. A diferença na infectividade das espécies de NEPs foi determinada utilizando-se o teste de Scott-Knott (P < 0,05). A interação entre tempo de exposição e método de inoculação foi determinada pela regressão polinomial em cada espécie de NEP. Metodologia de Hara & Kaya (98). Os JIs, obtidos de lagartas de G. mellonella, foram coletados de armadilhas de White. Os JIs de S. carpocapsae foram armazenados em suspensão aquosa a ± ºC, e H. bacteriophora a 5 ± º C, sendo mantidos em suspensão aquosa na concentração de 400 JIs por ml por um período de três ou quatro semanas. Soluções aquosas do produto fitossanitário foram preparadas com o dobro das seguintes concentrações: 0 (testemunha); 0,00; 0,0; 0,; e 0,4 ml (recomendado pelo fabricante) do produto por ml de água;,0 ml da suspensão aquosa de JIs foram pipetados em placas de Petri (6 cm de diâmetro) e a quantidade correspondente de produto colocada em cada placa. A viabilidade e a infectividade foram observadas 4, 7, 0 e 68 horas após a exposição dos JIs ao produto. Para cada período de exposição, a suspensão de nematóides foi submetida à centrifugação por duas vezes, a.700 rpm por minuto, e o sobrenadante tirado e reposto com água destilada a fim de remover o produto fitossanitário. Os tubos de ensaio foram divididos em dois grupos. Com o primeiro, observouse a viabilidade, retirando-se 0,5 ml (cerca de 00 JIs) de cada placa e submetendo os JIs a estímulo mecânico com um estilete. Nematóides que não responderam ao estímulo foram considerados como afetados ou mortos. Para avaliar a infectividade, dez lagartas foram colocadas em placas de Petri (9 cm de diâmetro) contendo duas folhas de papel filtro, adicionando-se 00 JIs. Após 48 horas, as lagartas mortas foram lavadas com solução aquosa de hipoclorito de sódio 0,5 % e colocadas em outra placa de Petri com papel filtro umedecido. Sete dias após a inoculação, cada lagarta foi dissecada para a verificação de nematóides. O experimento foi conduzido em B.O.D. a 5 ± ºC e 70 ± 0% UR, com quatro repetições por tratamento. Os valores de mortalidade de lagartas e nematóides foram submetidos à análise de variância. As diferenças na viabilidade e infectividade das espécies de NEPs foram determinadas utilizando-se o teste de Scott-Knott (P < 0,05). A interação entre tempo de exposição e concentração do produto foi determinada pela regressão polinomial em cada espécie de NEP. Protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99). Os nematóides foram obtidos de lagartas de G. mellonella, mantidos em suspensão aquosa a 5 ± º C, no caso de S. carpocapsae e a 5 ± º C, no caso de H. bacteriophora e estocados por até uma semana antes da utilização no experimento. O produto fitossanitário foi preparado com o dobro da maior concentração de ingrediente ativo recomendado pelo fabricante, isto é, 0,8 ml do produto por ml de água. Desta solução, foi retirada alíquota de ml e colocada em cinco tubos de vidro por tratamento, nos quais foram adicionados.500 JIs em ml de água destilada e agitados. O bioensaio foi conduzido em B.O.D. a ± o C e UR de 70 ± 0 %. A viabilidade dos nematóides foi avaliada 48, 0 e 68 horas após exposição aos produtos. Para tanto, uma alíquota de 0, ml da suspensão foi retirada e observados 00 JIs para a determinação da mortalidade. Foram considerados mortos aqueles que não responderam a estímulos com estilete. 68 Vol. () - 008

5 Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) A infectividade dos nematóides foi testada nos mesmos períodos que a viabilidade. Os tubos foram completados com água destilada ( ml) e deixados para decantar por meia hora na geladeira. O sobrenadante (cerca de ml) foi descartado e a lavagem repetida por três vezes. Após a lavagem, 0, ml (cerca de 00 JIs) foram retirados do fundo de cada tubo e pipetados em cinco placas de placas de Petri (9 cm de diâmetro) com papel filtro por tratamento. Cada placa recebeu dez lagartas, sendo mantida em câmara climatizada nas mesmas condições que o anterior, durante cinco dias. As lagartas mortas foram transferidas para placas de Petri (9 cm de diâmetro) contendo uma folha de papel filtro seco e mantidas no escuro por mais três dias, sendo submetidas à dissecação para a verificação de nematóides. Os valores de mortalidade de lagartas e nematóides foram submetidos à análise de variância. As diferenças na viabilidade e infectividade das espécies de NEPs foram determinadas usando o teste de Scott-Knott (P < 0,05). A interação entre tempo de exposição e concentração do produto foi determinada pela regressão polinomial em cada espécie de NEP. Originalmente, o método preconiza que valores de mortalidade de nematóides ou redução de infectividade maiores de 50 % caracterizam o produto como incompatível com os nematóides testados. No entanto, para melhor comparação entre as metodologias, não se utilizou essa classificação, pela grande diferença entre as concentrações e forma de avaliação, como por exemplo a escala de notas proposta na metodologia de Rovesti et al. (988). Análise de custo das metodologias. Foram estimados os custos envolvidos na realização de cada uma das técnicas descritas, como subsídios para a seleção daquela tida como a melhor. O custo total para cada metodologia é o resultado da soma do custo fixo total (CFT) e o custo variável total (CVT). Estes custos referem-se aos insumos (recursos) e operações (mãode-obra) utilizados durante todo o desenrolar da aplicação do método, incluindo o respectivo custo alternativo ou de oportunidade (Reis, 00). Resultados e Discussão Metodologia de Krishnayya & Grewal (00) A viabilidade dos JIs de S. carpocapsae e H. bacteriophora, isto é, a porcentagem de nematóides mortos, foi crescente ao longo do tempo em todos tratamentos, com maior mortalidade nos períodos de 7 e 0 horas de exposição, inclusive na testemunha. A viabilidade entre as espécies de NEPs não diferiu pelo teste de comparação entre médias (Tabela ), exceto nos períodos de 7 horas, com maior sobrevivência de S. carpocapsae, e 0 horas após exposição ao produto, com maior sobrevivência de H. bacteriophora nas concentrações de 0, e 0,8 do produto. Tabela - Mortalidade de nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando a metodologia de Krishnayya & Grewal (00). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora 4 0,8 ±,9 Aa 0,00 ± 0,00 Aa 0,,09 ± 0,9 Aa 0,00 ± 0,00 Aa 0,8,5 ± 0,0 Aa 0,00 ± 0,00 Aa 4 0 9,06 ±,9 Aa 7,9 ± 0,40 Aa 0, 7,0 ± 0,9 Aa 6,06 ± 0,9 Aa 0,8 4,94 ± 0,6 Aa 0,09 ±, Aa 7 0 5,44 ±,88 Aa 54,06 ±,57 Aa 0, 0,94 ±,4 Bb 6,66 ±,9 Aa 0,8,9 ±,50 Bb 7,8 ±,4 Aa ,6 ±,80 Aa 66,88 ±,97 Aa 0, 8,7 ± 4,9 Aa 7,5 ± 7,59 Bb 0,8 87, ±,8 Aa,7 ± 4,5 Bb Valores expressos em porcentagem de juvenis infectivos mortos. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha, ou minúscula na coluna, dentro dos tratamentos, são estatisticamente iguais pelo teste Scott- Knott (P > 0,05). 69

6 Aldomario S. Negrisoli Jr., Carla R.C. Barbosa & Alcides Moino Jr. Tabela - Mortalidade de lagartas de Galleria mellonella inoculadas com nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando a metodologia de Krishnayya & Grewal (00). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora ,5 ±, Aa 94,00 ± 0, Aa 0, 90,75 ± 0, Aa 00,00 ± 0,00 Aa 0,8 94,00 ± 5,98 Aa 00,00 ± 0,00 Aa ,75 ±,8 Aa 69,00 ± 9,8 Ab 0, 87,75 ± 6,5 Aa 69,00 ± 9,8 Ab 0,8 56,5 ± 0,65 Bb 00,00 ± 0,00 Aa ,5 ± 0,64 Aa,50 ± 7,8 Bb 0, 84,50 ±,4 Aa 6,75 ± 5,90 Aa 0,8 66,00 ± 9,69 Aa,5 ± 0,65 Bb ,75 ± 0, Aa 5,50 ± 6,6 Ba 0, 94,00 ± 5,98 Aa 47,00 ±,97 Ba 0,8 56,50 ± 5,6 Aa 59,50 ±,40 Aa Valores expressos em porcentagem de lagartas mortas. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha, ou minúscula na coluna, dentro dos tratamentos, são estatisticamente iguais pelo teste Scott- Knott (P > 0,05). A infectividade de S. carpocapsae e H. bacteriophora não diferiu no período de 4 horas de exposição ao produto (Tabela ), mostrando diferenças nos períodos de 4 e 7 horas na concentração de 0,8, e em 0 horas na concentração de 0,. As testemunhas dos NEPs foram diferentes nos períodos de 7 e 0 horas. Os resultados indicam diminuição da viabilidade de S. carpocapsae e H. bacteriophora quando expostos a diferentes concentrações de glifosato em todos os períodos de exposição, sem que houvesse diminuição da infectividade dos juvenis nos diferentes tratamentos, exceto para S. carpocapsae, após 4 horas de exposição a 0,8. Embora envolvendo espécies diferentes de NEPs, os resultados do presente estudo concordam com Krishnayya & Grewal (00), que verificaram a diminuição da viabilidade de Steinernema feltiae (Filipjev, 94) quando exposto ao nim (Azadirachta indica A. Juss) e a fungicidas seletivos usando a mesma metodologia. A infectividade foi pouco afetada por A. indica, sendo considerados tóxicos os fungicidas cinamaldeído e ácido peróxido acético + dióxido de hidrogênio, causando mortalidade de 00 % dos JIs. Posteriormente, De Nardo & Grewal (00), pelo mesmo método, verificaram a compatibilidade de S. feltiae com 7 produtos fitossanitários utilizados em casa de vegetação, observando viabilidade de mais de 80 % dos JIs expostos por 7 horas aos produtos e concluindo ser possível mistura de tanque de todos os produtos testados, exceto o inseticida terrazole. Metodologia de Rovesti et al. (988). De acordo com as características atribuídas aos JIs pela escala de notas proposta pelos autores, os JIs de S. carpocapsae e H. bacteriophora mostraram-se, de forma geral, moderadamente afetados pelo produto, em comparação com a testemunha (Tabela ). Na interação espécie versus concentração, não houve diferenças das espécies de NEPs nas concentrações em placa de Petri. Já em areia, houve diferenças na testemunha e nas concentrações de 0,0 e 0, (Tabela ). Em contraposição, na interação concentração do produto versus método de inoculação, houve diferenças nas concentrações de 0,00 e 0,4 para S. carpocapsae e somente na concentração 0,00 para H. bacteriophora (Tabela 4). Comparando-se com as outras metodologias, a infectividade nesta foi a menor para ambas as espécies de nematóides em todos tratamentos (concentrações x método inoculação). Os resultados mostram a baixa toxicidade do glifosato, se considerada sobre a viabilidade dos JIs. No entanto, a redução da infectividade foi significativa em alguns períodos de avaliação, fato difícil de ser explicado, tendo em vista a alta mortalidade de lagartas observadas nas outras 70 Vol. () - 008

7 Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) Tabela - Mortalidade de nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando a metodologia de Rovesti et al. (988). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora , , , + + 0, , , , , Valores expressos segundo escala de notas proposta por Rovesti et al. (988). Tabela 4 - Mortalidade de lagartas de Galleria mellonella inoculadas com nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, em dois métodos de inoculação, utilizando a metodologia de Rovesti et al. (988). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora Areia 0 4,00 ±,45 Ba 4,00 ±,45 Aa 0,00 0,00 ± 0,00 Ab 6,00 ±,45 Aa 0,0 8,00 ±,74 Ba 4,00 ± 4,00 Aa 0, 4,00 ± 4,00 Ba 0 ± 0,00 Aa 0,4 6,00 ±,45 Aa 0 ± 0,00 Aa Placa 0 9,00 ±,8 Aa 0,00 ±,5 Aa 0,00 9,75 ±,96 Aa 6,75 ±,04 Ab 0,0 0,00 ±,5 Aa 9,00 ±,0 Aa 0, 0, 00 ±,0 Aa 9,00 ±,96 Aa 0,4 7,00 ±, Ab 0,00 ±,9 Aa Valores expressos em porcentagem de lagartas mortas. Dentro das concentrações, as médias seguidas de mesma letra maiúscula nas linhas ou minúscula nas colunas são estatisticamente iguais pelo teste Scott-Knott (P > 0,05) técnicas testadas. Rovesti et al. (988), utilizando a mesma metodologia, avaliaram os efeitos de 5 herbicidas sobre H. bacteriophora, verificando serem reduzidos nos casos de viabilidade e infectividade dos JIs, em todas as concentrações testadas. Os mesmos produtos foram depois testados com S. carpocapsae, apresentando resultados semelhantes (Rovesti & Deseö, 990). Estes resultados concordam ainda com os relatados por Rovesti & Deseö (99), que avaliaram a compatibilidade de glifosato e mais quatro herbicidas com JIs de Heterorhabditis heliothidis (= H. bacteriophora), verificando compatibilidade na viabilidade e infectividade destes. Metodologia de Hara & Kaya (98). Não houve diferença significativa entre a viabilidade dos JIs de ambos os NEPs testados em nenhum dos tratamentos, exceto no período de 7 horas na testemunha e na concentração de 0,0 (Tabela 5). Em todos os tratamentos, houve aumento da mortalidade após o período de 4 horas de exposição. Houve redução significativa da infectividade de H. bacteriophora em relação a S. carpocapsae, nos períodos de 4 e 7 horas, em todas as concentrações do produto. No período de 0 horas, isso ocorreu na testemunha e nas concentrações 0,00 e 0,4 e após 68 horas, nas concentrações de 0,0 e 0,4 (Tabela 6). 7

8 Aldomario S. Negrisoli Jr., Carla R.C. Barbosa & Alcides Moino Jr. Tabela 5 - Mortalidade de nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando a metodologia de Hara & Kaya (98). Tempos Concentrações Nematóides Valores expressos em porcentagem de juvenis infectivos mortos. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha ou minúscula na coluna, dentro dos tratamentos, são estatisticamente iguais pelo teste Scott- Knott (P > 0,05). 7 Vol. () Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora 4 0,00 ± 4,7 Aa 6,00 ±,9 Ab 0,00 9, ±,0 Aa,00 ± 5,0 Aa 0,0 5,00 ±,8 Aa 7,00 ± 5, Aa 0, 5,00 ± 8,44 Aa,00 ± 8,45 Aa 0,4 9,00 ± 5,6 Aa,00 ± 5,74 Aa 7 0,00 ± 4,9 Ba 8,80 ±,49 Ab 0,00 8, ± 6,9 Aa 7,00 ± 4,5 Aa 0,0 0,80 ±,75 Bb 5,00 ± 6,66 Aa 0, 47,00 ± 5,90 Aa 54,00 ± 8,0 Aa 0,4,00 ±,86 Aa 47,00 ±, Aa 0 0 5,00 ±,57 Ab 0,9 ± 4,04 Ab 0,00 5,00 ± 5,99 Ab,8 ± 5,04 Aa 0,0,00 ±,4 Aa 7,00 ± 6,0 Aa 0, 60,00 ± 7,9 Aa 5,00 ± 9, Aa 0,4 5,00 ± 8,9 Aa 65,5 ± 8,4 Aa 68 0,00 ±,86 Ab 9,45 ±, Ab 0,00 4, 00 ± 8,64 Aa,6 ±,0 Ab 0,0 8,00 ± 9,6 Aa 48,6 ± 8, Aa 0, 59,0 ±,67 Aa 67,07 ±,07 Aa 0,4 5,00 ± 0,94 Aa 8,07 ± 8,0 Aa Tabela 6 - Mortalidade de lagartas de Galleria mellonella inoculadas com nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando a metodologia de Hara & Kaya (98). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora ,50 ±,50 Aa 5,0 ± 5,00 Bb 0,00 57,5 ± 6,0 Aa,50 ± 6,9 Ba 0,0 75,0 ± 6,45 Aa 5,00 ± 8,9 Ba 0, 7,5 ± 0, Aa 0,00 ±.9 Ba 0,4 70,0 ± 9, Aa 5,00 ± 9,57 Ba ,00 ±,90 Aa,50 ± 8,54 Bb 0,00 00 ± 0,00 Aa 45,00 ± 9,6 Ba 0,0 75,00 ± 5,00 Aa 4,50 ± 4,9 Ba 0, 97,50 ±,50 Aa 55,00 ± 4,4 Ba 0,4 85,00 ± 5,00 Aa 80,00 ± 7,07 Aa ,00 ± 9, Aa,5 ± 9,46 Bb 0,00 85,0 ± 5,00 Aa 0,0 ± 4,08 Bb 0,0 57,5 ± 7,0 Aa 57,5 ±,09 Aa 0, 85,0 ± 8,66 Aa 60,0 ± 4,08 Aa 0,4 6,5 ±7,50 Aa 0,00 ± 7,07 Bb ,50 ± 7,77 Aa 55,00 ± 0,4 Aa 0,00 47,50 ±,50 Aa 50,00 ±,9 Aa 0,0 77,50 ±,50 Aa 7,50 ± 4,79 Bb 0, 50,00 ±,9 Aa 5,00 ± 0,4 Aa 0,4 95,00 ± 5,00 Aa 5,0 ± 8,66 Ba Valores expressos em porcentagem lagartas mortas. Médias seguidas de mesma letra maiúscula na linha ou minúscula na coluna, dentro dos tratamentos, são estatisticamente iguais pelo teste Scott- Knott (P > 0,05).

9 Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) Hara & Kaya (98), utilizando essa metodologia, observaram a diminuição da viabilidade de S. carpocapsae com o aumento da concentração e do tempo de exposição quando exposto a produtos inseticidas e nematicidas. As concentrações de 0,0 e 0, mg por ml dos produtos testados nesse trabalho possibilitaram altas viabilidade e infectividade do nematóide em todos os períodos de exposição, ao contrário ao observado no presente trabalho, em que houve grande variação da viabilidade e infectividade em todas as concentrações testadas, dentro dos períodos avaliados. Zimmerman & Crashaw (990), utilizando a metodologia de Hara & Kaya (98) modificada, observaram a compatibilidade de S. carpocapsae, Steinernema bibionis (= S. feltiae) e H. bacteriophora ( HP88 ) com nove pesticidas empregados em gramados. Pentacloronitrobenzeno, benomil, clorotalonil e dicamba não reduziram a viabilidade dos NEPs no período de 4 e 48 horas de exposição. Carbaril, bendiocarbe e diazinon foram muito tóxicos a H. bacteriophora e menos tóxicos a S. carpocapsae, concordando com o presente estudo, apesar de os produtos fitossanitários testados não terem sidos os mesmos. Calo-clor e um fungicida mercurial foram altamente tóxicos a todos os NEPs. Protocolo da IOBC/WPRS (Vainio, 99). Houve diferença na viabilidade dos JIs na testemunha, e nos períodos de 0 e 68 horas. Na interação tempo versus concentração, para S. carpocapsae houve diferença no período de 68 horas na concentração de 0,8. No entanto, para H. bacteriophora, as diferenças ocorreram nas testemunhas de 48 e 68 horas (Tabela 7). Quanto à infectividade, não houve diferenças entre as espécies de NEPs e na interação tempo versus concentração (Tabela 8). O produto glifosato apresentou baixo ou nenhum efeito negativo sobre os JIs de S. carpocapsae e H. bacteriophora em todas as metodologias ora testadas. Tabela 7 - Mortalidade de nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando o protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora ,00 ±,6 aa 0,00 ± 0,00 ba 0,8,80 ±, aa,40 ± 0,4 aa 0 0,00 ± 0,67 aa 0,40 ± 0,45 ab 0,8 0,40 ± 0,45 aa 8,8 ± 5,69 aa 68 0,40 ±,8 aa 0,80 ± 0,45 bb 0,8 4,6 ±,69 ba,80 ± 5,9 aa Valores expressos em porcentagem de juvenis infectivos mortos. Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, dentro dos tratamentos, são estatisticamente iguais pelo teste Scott-Knott (P > 0,05). Tabela 8 - Mortalidade de lagartas de Galleria mellonella inoculadas com nematóides entomopatogênicos previamente expostos a diferentes concentrações de Glifosato 480 Agripec CS, utilizando o protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99). Tempos Concentrações Nematóides Steinernema carpocapsae Heterorhabditis bacteriophora ,00 ± 9,9 aa 90,00 ± 5,6 aa 0,8 76,00 ±,58 aa 8,00 ± 7,89 aa 0 0 6,00 ± 9,8 aa 70,00 ± 0, aa 0,8 74,00 ± 6,88 aa 7,00 ± 7,07 aa ,00 ± 9, aa 00,00 ± 0,00 aa 0,8 8,00 ± 7,7 aa 00,00 ± 0,00 aa Valores expressos em porcentagem de lagartas mortas. Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, dentro dos tratamentos, são estatisticamente iguais pelo teste Scott-Knott (P > 0,05). 7

10 Aldomario S. Negrisoli Jr., Carla R.C. Barbosa & Alcides Moino Jr. Esses dados concordam com os relatados por Carvalho (00), que avaliou a compatibilidade de S. carpocapsae com o mesmo produto (outra formulação comercial) utilizando o protocolo de Vainio (99). A viabilidade de S. carpocapsae foi de cerca de % em todos os períodos de exposição e a redução de infectividade em relação à testemunha foi de 5 % (48 horas de exposição dos JIs ao produto) e de, % (0 horas), sendo assim o produto considerado como compatível, conforme estabelecido pela metodologia. Do mesmo modo, Forchler et al. (990) também avaliaram os efeitos desse produto sobre JIs de S. feltiae, resultando em valores de cerca de 0 a 5 % de mortalidade de JIs quando expostos a diferentes concentrações do produto, apresentando uma baixa CL 50 (0,97 nematóides por lagarta) em G. mellonella. Em todas as metodologias aqui testadas, não foi evidenciada diferença entre a viabilidade e infectividade dos JIs, comparando-se os tratamentos (concentração do produto versus tempo de exposição) e a testemunha, o que sugere baixa interferência da concentração do produto, bem como do tempo de exposição a ele, nos resultados obtidos. Análise de custo das metodologias. A metodologia que concorreu ao menor custo de aplicação foi a de Rovesti et al. (988), seguida pelo protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99) (Tabela 9). A metodologia mais viável economicamente foi a de Rovesti et al. (988), apresentando menor custo total e menor tempo de realização do bioensaio (menor tempo de execução). No entanto, não foi a melhor tecnicamente pela subjetividade da escala de notas adotada para a avaliação da viabilidade dos JIs e pelo fato de o teste de infectividade em areia não apresentar resultados consistentes. Assim, o protocolo da IOBC / WPRS (Vainio, 99), pela simplicidade de sua realização e precisão na avaliação, foi considerada como a melhor técnica. Além disso, essa metodologia foi a que apresentou o segundo mais baixo custo total. A baixa diferença da viabilidade de ambos os NEPs e a infectividade na interação tempo versus concentração do produto no protocolo da IOBC / WPRS sugerem a adoção dessa metodologia, eventualmente modificada, como padrão na realização de testes de compatibilidade de produtos fitossanitários com nematóides entomopatogênicos. Assim, os períodos de avaliação da viabilidade e infectividade passariam a ser de 48 horas de exposição ao produto, utilizandose lagartas de G. mellonella como espécie padrão na avaliação de infectividade. Agradecimentos Ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Dr. Luís Garrigós Leite e à Dra Marineide Mendonça Aguillera pela contribuição na melhoria do presente trabalho. Literatura Citada CARVALHO, V.A.M. 00. Avaliação de fungos e nematóides entomopatogênicos e sua compatibilidade com produtos fitossanitários visando o controle da cochonilha-da-raiz-do-cafeeiro, Dysmicoccus texensis Tinsley (Hemiptera: Pseudococcidae). (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Lavras (MG), 8 p. DE NARDO, E.A.B. & P.S. GREWAL. 00. Compatibility Tabela 9 - Comparação dos custos entre quatro metodologias de avaliação da compatibilidade de um produto fitossanitário e uma espécie / isolado de nematóide entomopatogênico, baseada em Reis (00). Parâmetros Krishnayya & Grewal Rovesti et al. Hara & Kaya IOBC / WPRS Custo operacional fixo total 84,60 77,97,68 80,60 Custo alternativo fixo total 8,5 80,4 68,9 8,69 Custo fixo total 68, 58,9 9,07 6,9 Custo operacional variável total 7,04 79,67 9, 6,87 Custo alternativo variável total 5,46,59 6,8 4,4 Custo variável total 78,50 8,6 5,50, Custo operacional total 57,64 57,64 44,80 97,47 Custo total 546,6 44,65 76,57 48,50 74 Vol. () - 008

11 Comparação entre Metodologias de Avaliação da Compatibilidade de Produtos Fitossanitários com Nematóides Entomopatogênicos (Nematoda: Rhabditida) of Steinernema feltiae (Nematoda: Steinernematidae) with pesticides and plant growth regulators used in glasshouse plant production. Biocontrol Science and Technology, (4): FORSCHLER, B.T., J.N. ALL & W.A. GARDNER 990. Steinernema feltiae activity and infectivity in response to herbicide exposure in aqueous and soil environments. Journal of Invertebrate Pathology, 55: GREWAL, P.S. 00. Formulation and application technology. In: GAUGLER, R. (ed). Entomopathogenic Nematology. CABI, Wallingford (U.K.), p GREWAL, P.S., V. CONVERSE & R. GEORGIS Influence of production and bioassay methods on the infectivity of two ambush foragers (Nematoda: Steinernematidae). Journal of Invertebrate Pathology, 7: HARA, A.H. & H.K. KAYA. 98. Toxicity of some selected organophosphate and carbamate pesticides to infective juveniles of the entomopatogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Enviromental Entomology, : KAYA, H.K. & P.S. STOCK Techniques in insect nematology. In: LACEY, L.A (ed). Manual of Techniques in Insect Pathology. Academic, San Diego, 8 p. KAYA, H.K Soil ecology. In: GAUGLER, R. & H.K. KAYA (ed) Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. CRC, Boca Raton, p. 9-. KOPPENHÖFER, A.M. & H.K. KAYA Synergism of imidacloprid and an entomopathogenic nematode: a novel approach to White Grub (Coleoptera: Scarabaeidae) control in turfgrass. Journal of Economic Entomology, 9: KOPPENHÖFER, A.M., I.M. BROWN, R. GAUGLER, P.S. GREWAL, H.K. KAYA & M.G. KLEIN Synergism of entomopathogenic nematodes and imidacloprid against white grubs: greenhouse and field evaluation. Biological Control, 9: KRISHNAYYA, P.V. & P.S. GREWAL. 00. Effect of neem and selected fungicides on viability and virulence of the entomopathogenic nematode Steinernema feltiae. Biocontrol Science and Technology, : PARRA, J.R.P Criação de insetos para estudos com patógenos. In: ALVES, S.B. (ed) Controle Microbiano de Insetos. ª. ed. FEALQ, Piracicaba, p REIS, R.P. 00. Fundamentos de Economia Aplicada. Universidade Federal de Lavras (MG), 95 p. ROVESTI, L. & K.V. DESEÖ Compatibility of selected pesticides with the entomopathogenic nematodes, Steinernema carpocapsae Weiser and S. feltiae Filipjev (Nematoda: Steinernematidae). Nematologica, 6: ROVESTI, L. & K.V. DESEÖ. 99. Compatibility of chemical pesticides with the entomopathogenic nematode Heterorhabditis heliothidis. Nematologica, 7: -. ROVESTI, L., E.W. HEINZPETER, F. TAGLIENTE & K.V. DESEO Compatibility of pesticides with the Entomopathogenic Nematode Heterorhabditis bacteriophora Poinar (Nematoda: Heterorhabditidae). Nematologica, 4: VAINIO, A. 99. Guideline for laboratory testing of the side-effects of pesticides on entomophagous nematodes Steinernema spp. IOBC / WPRS Bulletin, 5: WHITE, G.F. 97. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science, 66: 0-0. ZIMMERMAN, R.J. & W.S. CRANSHAW Compatibility of entomogenous nematodes (Rhabditida) in aqueous solutions of pesticides used in turfgrass maintenance. Journal of Economic Entomology, 8 ():