Alexandre Hitoshi Ebina

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1 Alexandre Hitoshi Ebina Efeitos de benzodiazepinas sobre o fenômeno da aversão condicionada por lugar induzida por estímulo nociceptivo em camundongos. ARARAQUARA SP FCFar/UNESP 2012

2 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DEPARTAMENTO DE PRINCÍPIOS ATIVOS NATURAIS E TOXICOLÓGICOS LABORATÓRIO DE NEUROPSICOFARMACOLOGIA Efeitos de benzodiazepinas sobre o fenômeno da aversão condicionada por lugar induzida por estímulo nociceptivo em camundongos. Alexandre Hitoshi Ebina Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Graduação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para a obtenção do grau de Farmacêutico-Bioquímico. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Luiz Nunes de Souza Co-Orientador: Dr. Tarciso Tadeu Miguel ARARAQUARA SP 2012

3 2 AGRADECIMENTOS Aos meus pai e mãe Shiguemi e Taeco Ebina pelo amor e suporte em todos os momentos de minha vida. Agradeço pelo apoio e investimento em minha formação pessoal e profissional. Às minhas irmãs Kátia e Fernanda Ebina por sempre estarem ao meu lado e serem meu orgulho. Aos meus familiares Kendi, Elisa, Tânia, Sérgio e Guilherme por todo o carinho e preocupação recebidos. À República Intrometeu por ser meu segundo lar durante cinco anos no qual vivenciei grandes momentos. Aos amigos de república Leandro (Roça), Felipe (Bozo), Luan (Pimpão), Diego T. (Borges), Guilherme (Molejo), Gustavo (Lacraia), Diego K. (Chambinho), Leonardo (Fimose), Silvio (França) e Fabrício pelo companheirismo e amizade em todos os momentos. Às amigas, Beatriz Trevizan, Marianna Gouveia, Mariana Penasso, Diana Marcussi, Mariana Lauar, Camila Leal e Juliane Vicentino pelo convívio, conversas e amizade.

4 3 Ao professor Ricardo pela oportunidade fornecida. Agradeço sua orientação, confiança, paciência, disponibilidade em ajudar e sua amizade. Ao amigo e co-orientador Tarciso pela contribuição e suporte dedicados a esse projeto. Seu auxílio e companheirismo foram essenciais para o desenvolvimento e finalização do mesmo. Aos colegas de laboratório, Karina, Kelciane, Tatiane, Diego, Ludimila, Matheus, Beatriz, Igor, Carolina, Natália e Ana Cláudia pela colaboração durante o período de estágio. Às colaboradoras do laboratório Bete, Rô e Tirene pela disponibilidade e grande vontade em ajudar sempre, pela paciência e tempo dedicados ao laboratório. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP pelo suporte físico e a todos seus funcionários pela atenção disponibilizada.. Ao CNPq pelo apoio financeiro.

5 4 SUMÁRIO página RESUMO... 6 LISTA DE ILUSTRAÇÕES... 8 LISTA DE TABELAS... 8 LISTA DE ABREVIATURAS INTRODUÇÃO Justificativa e relevância do tema Objetivo DESENVOLVIMENTO Materiais Utilizados Sujeitos Soluções Utilizadas Formalina Alprazolam Teste da Formalina Aparato Experimental Equipamentos auxiliares Metodologia Grupos Experimentais Procedimento experimental Dia 1 (Confinamento) Dia 2 (Expressão) Cronograma Esquemático... 23

6 Resultados Número total de animais em cada grupo experimental Tempo médio de resposta(s) Tempo médio dos animais em cada ambiente experimental Tempo de permanência nos ambientes de confinamento DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 34

7 6 RESUMO Medo e ansiedade são emoções que se originam nas reações de defesa de caráter adaptativo que animais exibem perante ameaças que podem comprometer sua integridade física ou sua própria sobrevivência. Tais situações resultam em um repertório de comportamentos defensivos espécie-específicos, alterações autonômicas e inibição da dor. A dor é descrita por uma variedade de sensações e experiências emocionais associadas e constituída de dois principais componentes: o perceptivodiscriminativo, que permite ao indivíduo reconhecer o estímulo como doloroso e localizá-lo numa região do corpo, e o aversivo-cognitivo-motivacional, que compreende uma série de respostas defensivas, objetivando a autopreservação imediata. O modelo de condicionamento por lugar, para medir efeitos não discriminativos da estimulação nociceptiva, vem sendo utilizado em abordagens recentes para o estudo do componente emocional relacionado à dor. Existem paradigmas baseados na aprendizagem associativa entre o estado afetivo e de dicas ambientais que precedem a aplicação de um estímulo, o qual pode ter propriedade aversiva ou prazerosa, dependendo da resposta que se quer estudar. O presente estudo investigou a ação do fármaco triazolobenzodiazepínico, Alprazolam, sobre o fenômeno da ACL em camundongos, que foram separados em grupos experimentais. No primeiro dia, parte dos animais sofreu estimulação nociceptiva, através da injeção de formalina a 2,5% na pata traseira direita, e foi confinado nos ambientes diferenciados de uma Plataforma Elevada fechada (um lado com grade no assoalho e outro sem grade). No segundo dia, parte dos animais

8 7 (de acordo com o grupo de estudo) recebeu tratamento farmacológico (Alprazolam ou salina) 30 minutos antes de ser reexposto à plataforma, registrando-se o tempo gasto nos dois ambientes da plataforma elevada fechada. De acordo com os resultados obtidos, pode-se verificar que a ACL foi induzida em animais que receberam estímulo doloroso, uma vez que estes evitavam o ambiente que foram pareados com a dor. Os animais confinados nos ambientes com ou sem grade, mas que não receberam o estímulo nociceptivo (i.e., injeção de formalina), não exibiram preferência por nenhum compartimento. O tratamento com Alprazolam atenuou a esquiva inibitória induzida pelo confinamento no ambiente pareado com a dor, sugerindo uma reversão da ACL pelo benzodiazepínico. Esses resultados demonstraram que a dor, que tem característica de alerta para o organismo, é por si só capaz de provocar reações comportamentais semelhantes àquelas que os animais exibem frente a estímulos aversivos, e, por isso, pode também ser considerada um estímulo aversivo que conferiu a um ambiente neutro a conotação aversiva. Além disso, este trabalho sugere ser a ACL induzida pela injeção de formalina, um teste útil para o estudo da mediação das reações de defesa em roedores.

9 8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Plataforma Elevada visão superior 18 Figura 2: Plataforma Elevada Fechada (PEf) visão lateral 18 Figura 3: Dia 1 Ilustração do confinamento do animal 22 Figura 4: Dia 2 Ilustração da exploração livre do animal 23 Figura 5: Cronograma esquemático dos passos realizados 24 Figura 6: Gráfico de confinamento em compartimento A 29 Figura 7: Gráfico de confinamento em compartimento B 29 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Divisão dos grupos experimentais 21 Tabela 2: Número de animais em cada grupo experimental 24 Tabela 3: Tempo médio de resposta nas fases de reação dolorosa 25 Tabela 4: Tempo nos ambientes dos Animais Salina 27 Tabela 5: Tempo nos ambientes dos Animais Alprazolam 27

10 9 LISTA DE ABREVIATURAS ACL - Aversão Condicionada por Lugar i.pl. - injeção intraplantar i.p. - intraperitoneal LCE - Labirinto em Cruz Elevado PEf - Plataforma Elevada Fechada PCL - Preferência Condicionada por Lugar

11 10 1. INTRODUÇÃO A ansiedade e o medo são emoções que se originam nas reações de defesa que os animais exibem perante estímulos aversivos que promovam perigo à integridade ou ameaça à sobrevivência, e que, do ponto de vista evolucionário, apresentam valor adaptativo. Pesquisas relacionadas a tais emoções tomam como base os estudos originais de Charles Darwin, publicados em seu livro The Expression of Emotions in Man and Animals (1872, apud ZANGROSSI; GRAEFF, 2004). Pela abordagem evolucionária proposta por Darwin, tem-se permeado teorias sobre a função e a importância que as emoções desempenham às diferentes espécies. Por esta abordagem, o ser humano possui certas respostas em comum com seus ancestrais, no que diz respeito à expressão de determinadas emoções, sendo possível adotar comparações entre o seu comportamento e de outros animais (ZANGROSSI; GRAEFF, 2004). Há uma ampla gama de estímulos desencadeadores de reações aversivas, como por exemplo, confrontos com um predador ou com animais da mesma espécie por meio de competições por alimento, fêmea ou dominância territorial (BLANCHARD; BLANCHARD, 1988). A exposição de animais a essas situações ameaçadoras, de natureza inata ou aprendida, resulta em reações de defesa evidenciadas por um repertório de comportamentos espécie-específicos, como fuga, luta, imobilização, e alterações autonômicas (taquicardia, elevação da pressão arterial, defecação) e em inibição da nocicepção (ou antinocicepção), tendo esse conjunto alta relevância para a sobrevivência de uma espécie (DEAKIN; GRAEFF, 1991).

12 11 Segundo os pesquisadores Bolles e Fanselow (1980), comportamentos defensivos e respostas nociceptivas são considerados reações incompatíveis, uma vez que os cuidados dispensados na recuperação de uma injúria sofrida poderiam prejudicar a exibição de respostas defensivas apropriadas. Assim sendo, a antinocicepção pode ser considerada parte das reações do sistema defensivo do organismo frente a estímulos ameaçadores (BOLLES; FANSELOW, 1980; FANSELOW, 1991). Uma série de estudos tem mostrado que o sistema antinociceptivo pode ser ativado por diversos estímulos externos ou mesmo nociceptivos, que neste caso seria o próprio estímulo aversivo, já que o organismo reconhece a dor como algo potencialmente lesivo e perigoso à integridade corporal, desencadeando respostas defensivas. Assim, tais fenômenos exercem importante função no controle da expressão de comportamentos defensivos ou afetivos nos animais (FANSELOW, 1991; FARDIN et al., 1984; TERMAN et al., 1984; WATKINS et al., 1982). Particularmente, o fenômeno da dor é constituído de dois componentes principais: o sensorial-discriminativo, que permite ao indivíduo reconhecer um estímulo como doloroso e localizá-lo em determinada região de seu corpo; e o aversivo-cognitivomotivacional, que compreende uma série de respostas defensivas, que acontecem num espectro comportamental que abrange desde o movimento reflexo de retirada de um membro até respostas emocionais mais complexas, como comportamento de luta e fuga, visando a autopreservacão e sobrevivência (BASBAUM; FIELDS, 1984). A dor pode ser vista como uma manifestação não unitária do organismo, ou seja, existe uma soma de fatores que podem interferir na sua expressão. Neste sentido, pesquisas relacionadas a observações clínicas de pacientes indicam que os indivíduos que apresentam dor crônica podem expressar sofrimento intensificado

13 12 mais em razão de transtornos emocionais do que pela estimulação nociceptiva em si (ARNTZ et al., 1990; CROMBEZ et al., 1999; VLAEYEN; LINTON, 2000). Assim, torna-se relevante a investigação dos aspectos afetivos-emocionais associados a tal manifestação. Em consequência disso, os mecanismos subjacentes à dimensão afetiva/aversiva da dor voltados à intensificação dolorosa ou à analgesia, têm recebido maior atenção por pesquisadores da área (FIELDS, 1999; PRICE, 2000). O interesse por estudos relacionados às reações de defesa tem levado ao desenvolvimento de modelos animais voltados à investigação de estados emocionais potencialmente associados a desordens psiquiátricas. Assim, a contribuição proveniente de testes utilizando animais destaca-se quanto ao entendimento do funcionamento cerebral em diversos distúrbios mentais/emocionais (ZANGROSSI; GRAEFF, 2004) e considera-se o modelo do Labirinto em cruz elevado (LCE), como importante ferramenta para o estudo comportamental de expressão emocional, principalmente a ansiedade (HANDLEY; MITHANI, 1984; LISTER, 1987; PELLOW et al., 1985). A interação entre respostas de medo/ansiedade e analgesia tem sido estudada e os resultados têm demonstrado que o confinamento de roedores no braço aberto do LCE produz analgesia de alta magnitude quando comparações são feitas com o confinamento no braço fechado (NUNES-DE-SOUZA et al., 2000; GOMES et al., 2005). Em recentes experimentos também foi demonstrado que a exposição de camundongos a um LCE derivado do padrão, com os quatro braços abertos, promoveu antinocicepção quando os animais foram submetidos aos testes das contorções abdominais e teste da formalina (MENDES-GOMES; NUNES-DE- SOUZA, 2005), demonstrando ser este um aparato capaz de proporcionar aversão e conseqüentemente a antinocicepção.

14 13 Entretanto, a maioria dos estudos tem como foco um componente sensorialdiscriminativo da dor, utilizando-se de técnicas neurofisiológicas e comportamentais (por exemplo, latência de retirada de cauda). Vale ressaltar que a palavra dor é utilizada para descrever uma variedade muito ampla de sensações e experiências emocionais associadas, desde uma injúria sofrida em decorrência de uma pequena queimadura ou corte, até as sensações anormais de síndromes neuropáticas (CERVERÓ, 2000). Pela dificuldade na determinação de um conceito único do fenômeno da dor, a Associação Internacional para o estudo da Dor (IASP) (apud PRADO, 1999) padronizou uma definição, que pode ser citada da seguinte forma: A dor é a experiência sensorial e emocional desagradável, associada com dano potencial ou de fato ou, ainda, descrita em termos que sugerem tal dano. Com base nessas evidências, a dor não deve ser entendida como um fenômeno sensitivo simples. Baseando-se na propriedade que estímulos nociceptivos são capazes de induzir reações de defesa (GRAEFF, 1994), levanta-se a hipótese de que o estímulo nociceptivo pode induzir condicionamento aversivo por lugar. Tal modelo, que pode ser utilizado para medir os efeitos não-discriminativos da estimulação nociceptiva, vem sendo utilizado em abordagens recentes para o estudo do componente emocional relacionado à dor. Este deriva do procedimento geral de condicionamento por lugar, utilizado para avaliar propriedades motivacionais variadas, como efeitos aversivos ou reforçadores de drogas (CARR et al., 1989; TZSCHENKTE, 1998; TANIMOTO et al., 2003). O paradigma geral do condicionamento por lugar é baseado na aprendizagem associativa entre o estado afetivo e dicas ambientais que precedem a aplicação do estímulo prazeroso ou aversivo. Neste sentido, emergem duas grandes ferramentas para o estudo comportamental: a preferência

15 14 condicionada por lugar (PCL) e a aversão condicionada por lugar (ACL). Dessa forma, já foi estabelecido que a aversão condicionada por lugar (ACL) induzida pela estimulação dolorosa nesse paradigma reflete o aspecto aversivo-motivacional da dor (LABUDA; FUCHS, 2000; JOHANSEN, et al., 2001). Corroborando essa hipótese, alguns autores demonstraram que a dor induzida pela injeção intraplantar (i.pl.) de formalina ou pela administração intraperitoneal (i.p.) de ácido acético é capaz de promover esquiva dos animais aos ambientes nos quais ocorreram as aplicações (GAO et al., 2004; TANIMOTO et al., 2003; LEI et al., 2004b). Em tais ambientes os animais expressariam a esquiva devido à emoção negativa que os mesmos sentem, associando o local ao estímulo aversivo, no caso doloroso, recebido anteriormente. Assim, o ambiente primeiramente neutro, adquire contexto aversivo, provocando a esquiva do animal a este local gerando a ACL. Neste sentido, a dor, além de ter propriedade de informar o organismo que existe algo anormal em algum órgão/tecido, pode, por si só, comportar-se como um estímulo aversivo e produzir aversão a um ambiente previamente neutro. Assim, torna-se relevante pesquisar se a dor, induzida pela injeção de formalina na pata em camundongos, provocaria a ACL e se os benzodiazepínicos poderiam reverter ou atenuar a ACL Justificativa e relevância do tema O presente estudo pertence a uma série de investigações sobre o tema Neurobiologia da Antinocicepção Induzida pelo Medo, que estão em andamento no laboratório de Neuropsicofarmacologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Unesp de Araraquara, sob a coordenação do Prof. Dr. Ricardo Luiz Nunes de Souza.

16 15 Conforme a proposta de Charles Darwin (1872, apud GRAEFF, 1990) em sua abordagem evolutiva, as raízes filogenéticas dos estados emocionais de medo e ansiedade estariam nos comportamentos defensivos que os animais exibem diante de estímulos que representam perigo ou ameaça à sua sobrevivência. Assim, a utilização de modelos animais tem o potencial de auxiliar na compreensão das bases neurobiológicas de psicopatologias em humanos Objetivo Investigar o efeito do alprazolam (fármaco ansiolítico benzodiazepínico) sobre a aversão condicionada por lugar (ACL) induzida por estímulo nociceptivo em camundongos expostos a uma plataforma elevada. 2. DESENVOLVIMENTO 2.1. Materiais Utilizados Sujeitos Foram utilizados 54 camundongos Suíços albinos machos com aproximadamente 7 a 8 semanas de vida e peso médio 34,06 gramas, com variação de ±2,07 gramas, provenientes do biotério central da Universidade Estadual Paulista UNESP / campus Botucatu. Os animais foram alojados em gaiolas de polipropileno (28 x 17 x 12 cm, com capacidade para até 5 animais) e mantidos em condições

17 16 controladas de temperatura (22±1 C) e luz (ciclo 12/12 horas), com livre acesso ao alimento e a água, exceto durante os curtos períodos de teste Soluções Utilizadas Formalina: utilizado na concentração de 2,5% como indutor nociceptivo durante o Teste da Formalina Alprazolam: derivado do grupo farmacológico das triazolobenzodiazepinas. Tem como principais efeitos característicos: ansiólise, relaxamento muscular, amnésia e em altas doses pode causar hipnose. É uma droga indicada para o tratamento sintomático a curto prazo de situações clínicas relacionadas a transtornos de ansiedade e pânico (LINNOILA et al., 1990). No procedimento experimental foram utilizadas a dose de 0,3 mg/kg isenta, na maioria dos animais, de efeito colateral como hipnose e sedação. O veículo da solubilização em ambos os compostos foi salina 0,9%, sendo que para o Alprazolam acrescentou-se Tween a 2%, com o objetivo de facilitar o processo. A salina também foi utilizada na injeção para avaliação experimental dos animais controle Teste da Formalina O teste de formalina é um modelo amplamente utilizado na avaliação de comportamentos nociceptivos em cobaias (ABBOTT; FRANKLIN; WESTBROOK, 1994). A injeção de solução de formalina a 2,5% na região dorsal da pata traseira direita provoca uma resposta nociceptiva bifásica (DUBBUISSON; DENNIS, 1977). A

18 17 primeira fase, denominada de fásica, é detectada dentro dos primeiros 5 minutos após a aplicação, enquanto a segunda fase, denominada tônica, inicia-se depois de 20 minutos da injeção de formalina e tem duração até minutos. A primeira fase é ocasionada predominantemente pela estimulação direta de nociceptores (LE BARS; GAZARIU; CADDEN, 2001) enquanto a segunda parece ser dependente da combinação de uma reação inflamatória no tecido periférico injuriado, com mudanças funcionais no corno dorsal da medula espinal (TJOLSEN et al., 1992; MCCALL; TANNER; LEVINE, 1996). O volume utilizado no procedimento experimental foi de 0,05 ml (em conformidade com os princípios éticos da CONCEA - Parecer 09/12 CEUA FCF/CAr) Aparato Experimental Para a avaliação das respostas comportamentais, o modelo animal de escolha foi a Plataforma Elevada, uma estrutura de madeira com dimensões 60,0 x 5,0 x 18,0 cm, elevados 35 cm do solo. Neste equipamento, o assoalho em madeira foi dividido em dois braços de dimensões iguais (30,0 x 5,0 x 18,0 cm), com assoalhos diferenciados por uma grade metálica de aço inox, nomeado de A, e um assoalho liso na cor branca, nomeado de B (Figura 1). Além disso, paredes de vidro transparente, com altura de 18,0 cm a partir do assoalho da plataforma, foram utilizadas para caracterizá-la como Plataforma Elevada Fechada (PEf) (Figura 2).

19 18 Figura 1: Plataforma Elevada visão superior. Dimensões 60,0 x 5,0 x 15cm. Diferenciação dos assoalhos dos braços entre A: grade metálica e B: liso. Figura 2: Plataforma Elevada Fechada (PEf) - vista lateral. Dimensões: parede de vidro de 18,0 cm de altura, elevação de 35,0 cm. Diferenciação dos assoalhos dos braços entre A: grade metálica e B: liso.

20 Equipamentos auxiliares O experimento foi filmado e gravado por um circuito câmera, TV e DVD para a posterior análise comportamental e de medidas espaço-temporais. O acompanhamento quanto ao tempo de permanência do animal em cada ambiente foi determinado através da utilização do software X-Plo-Rat Versão 1.1.0, desenvolvido e disponibilizado pelo Laboratório de Comportamento Exploratório da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, sob responsabilidade do Prof. Dr. Silvio Morato Metodologia Grupos Experimentais Os animais foram alocados em 8 grupos experimentais, diferenciados pela aplicação ou não do estímulo nociceptivo no Dia 1 e pelo tipo de tratamento (Alprazolam ou salina) no Dia 2. Tais grupos foram caracterizados abaixo e ilustrados na Tabela 1: Grupo 1: animais não submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente A no Dia 1, e tratados com solução salina 0,9% no Dia 2 (Controle A, sem dor); Grupo 2: animais não submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente A no Dia 1, e tratados com solução de Alprazolam 0,3mg/Kg (Alprazolam A, sem dor)

21 20 Grupo 3: animais não submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente B no Dia 1, e tratados com solução salina 0,9% no Dia 2 (Controle B, sem dor); Grupo 4: animais não submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente B no Dia 1, e tratados com solução de Alprazolam 0,3mg/Kg (Alprazolam B, sem dor); Grupo 5: animais submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente A no Dia 1, e tratados com solução salina 0,9% no Dia 2 (Controle A, com dor); Grupo 6: animais submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente A no Dia 1, e tratados com solução de Alprazolam 0,3mg/Kg (Alprazolam A, com dor); Grupo 7: animais submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente B no Dia 1, e tratados com solução salina 0,9% no Dia 2 (Controle B, com dor); Grupo 8: animais submetidos a estimulação nociceptiva e confinados em ambiente B no Dia 1, e tratados com solução de Alprazolam 0,3mg/Kg (Alprazolam B, com dor);

22 21 GRUPO ESTIMULAÇÃO NOCICEPTIVA CONFINAMENTO (AMBIENTE) TRATAMENTO 1 NÃO A SALINA 2 NÃO A ANSIOLÍTICO 3 NÃO B SALINA 4 NÃO B ANSIOLÍTICO 5 SIM A SALINA 6 SIM A ANSIOLÍTICO 7 SIM B SALINA 8 SIM B ANSIOLÍTICO Tabela 1: Divisão dos grupos experimentais segundo estimulação nociceptiva, confinamento e tratamento Procedimento experimental Ao chegarem ao Biotério do Laboratório de Farmacologia do Departamento de Princípios Ativos Naturais e Toxicologia FCFar/UNESP, os animais passaram por um período de adaptação às condições locais, por aproximadamente uma semana. A avaliação do comportamento dos sujeitos nos diferentes grupos experimentais se divide em dois passos, com intervalo de 24 horas entre eles e nomeados de Dia 1 (Confinamento) e Dia 2 (Expressão): Dia 1 (Confinamento): metade dos grupos de animais recebeu injeção de solução de formalina a 2,5% (estímulo nociceptivo) na região dorsal da pata traseira direita (padronização para facilitar quantificação do efeito nociceptivo).

23 22 Imediatamente após o estímulo nociceptivo, os animais foram individualmente confinados, com o auxílio de uma barreira opaca (Figura 3), por um tempo padrão de 35 minutos em um dos ambientes da Plataforma Elevada fechada (A ou B), quando foi cronometrado o tempo total da resposta ao estímulo nociceptivo (definida como o tempo total de lambidas na região na pata injuriada) em dois momentos: entre 0-5 minutos (fase fásica) e entre minutos (fase tônica). Para a outra metade dos animais, o confinamento também foi de 35 minutos, porém sem aplicação do estímulo nociceptivo. Figura 3: Dia 1 Ilustração do confinamento do animal em ambiente A (assoalho de grade) através da utilização de barreira opaca. Acompanhamento através de filmagem durante 35 minutos Dia 2 (Expressão): após um intervalo de 24 horas do confinamento, de acordo com tratamento estabelecido pelo grupo experimental, alguns animais receberam injeção intraperitoneal de solução Alprazolam 0,3mg/Kg, enquanto outros

24 23 receberam injeção de solução salina (veículo) e, em seguida, permaneceram durante 30 minutos na gaiola de armazenamento e depois foram submetidos à exploração livre na Plataforma Elevada fechada por 15 minutos. Neste período, registrou-se o tempo gasto em cada um dos ambientes (A e B) (Figura 4), para posterior avaliação do efeito no tratamento sobre a aversão condicionada por lugar (ACL). Figura 4: Dia 2 Ilustração da exploração livre do animal pelos 2 ambientes da Plataforma Elevada fechada. Acompanhamento por filmagem durante 15 minutos Cronograma Esquemático Os passos de cada etapa experimental estão descritos no cronograma esquemático (Figura 5):

25 24 Dia 1 Dia 2 24h CONFINAMENTO (35 min) * Injeção subcutânea com formalina 2,5% (Vol 0,05 ml) na região dorsal da pata traseira DIREITA do animal. EXPRESSÃO (15 min) Injeção intraperitoneal de salina ou Alprazolam (de acordo com grupo experimental) Avaliação da ACL *50% dos grupos Figura 5: Cronograma esquemático dos passos realizados nos Dias 1 e 2 para avaliação do efeito do tratamento farmacológico ou não sobre a ACL Resultados Número total de animais em cada grupo experimental O número total (n) utilizado no experimento foi de 54 animais, divididos nos grupos conforme Tabela 2, abaixo: GRUPO N Tabela 2: Número de animais em cada um dos 8 grupos experimentais Tempo médio de resposta(s) Os animais que sofreram estimulação nociceptiva no Dia 1 obtiveram os seguintes tempos médios de resposta (lambida na pata traseira direita) nas fases de reação dolorosa (Tabela 3):

26 25 Fase Fásica (0-5 min) Tônica (25-35 min) Tempo médio de resposta(s) 32,18 91,34 Tabela 3: Tempo médio de resposta do animal durante as fases fásica e tônica Tempo médio dos animais em cada ambiente experimental O tempo médio dos animais dos diferentes grupos em cada ambiente experimental após avaliação de 15 minutos (900 segundos) no Dia 2 e a variação correspondente, foram determinados e separados entre animais que receberam tratamento com salina, chamados de Animais Controle (Tabela 4) e animais que receberam tratamento com a solução do fármaco Alprazolam (Tabela 5). A variação correspondente nas Tabelas 4 e 5 para cada grupo de estudo foi determinada pela diferença entre os tempos médios de permanência no ambiente A, confrontando com os tempos médios de permanência no ambiente B, tomando-se como variação positiva os valores correspondentes à maior permanência em A. Tal variação tem relevância no estudo pois permite a visualização da preferência por determinado ambiente pelo animal após a indução da aversão condicionada através do estímulo nociceptivo. A análise estatística mostrou que no grupo 1 (Tabela 4) que trata de animais confinados na grade (compartimento A) no primeiro dia com ausência de estímulo doloroso e tratados com salina, não houve diferenças significantes entre o tempo de permanência nos compartimentos A e B [t(12) = 1.1, p = 0.2], o que demonstra que os animais não têm preferência por nenhum dos compartimentos. Entretanto, o mesmo teste realizado no grupo 5, com animais confinados no mesmo ambiente A, tratados com salina, mas submetidos à injeção de formalina, indicou diferença significativa entre o tempo de permanência nos dois compartimentos A e B [t(12) = - 2,53, p < 0,05], demonstrando que o animal preferiu o ambiente B (contrário ao que

27 26 foi confinado) ao A, sugerindo aversão induzida pela associação da injeção de formalina e o confinamento no compartimento A. A injeção de alprazolam, no entanto, fez com que os animais que receberam a injeção de formalina e foram confinados no compartimento A, escolhessem esse ambiente no dia seguinte, a despeito do pareamento com o estímulo doloroso [t(12) = 5.36, p < 0.05]. Tais resultados sugerem que o alprazolam inibiu a aversão condicionada por lugar induzida pela dor, uma vez que mesmo com a dor pareada ao compartimento A, os animais sob ação do benzodiazepínico mantém sua preferência pelo ambiente A (Tabela 5). Com relação aos animais confinados no compartimento B (piso liso) tratados com salina (grupo 3, Tabela 4), a análise estatística também não revelou preferência por nenhum dos compartimentos no dia seguinte ao confinamento para os animais que não receberam formalina [t(12) = 0.85, p = 0.4]. Entretanto, com animais confinados no ambiente B, tratados com salina, porém submetidos à injeção de formalina, a análise estatística indicou diferença significativa entre o tempo de permanência nos dois compartimentos A e B [t(10) = -12,5, p < 0,05], demonstrando que os animais preferiram o ambiente A (contrário ao que foi confinado) ao B, sugerindo aversão induzida pela associação da injeção de formalina e o confinamento no compartimento B. A injeção de alprazolam, no entanto, fez com que, mesmo tendo recebido formalina e confinamento no compartimento B, os animais não escolhessem o ambiente oposto, quando reexpostos a plataforma [t(12) = -0.4, p > 0.05]. Estes resultados sugerem que o alprazolam inibe a aversão condicionada por lugar induzida pela dor, uma vez que mesmo com a dor pareada ao compartimento B, os

28 27 animais tratados como este benzodiazepínico não ficaram mais tempo no ambiente oposto, como os controles o fizeram (Tabela 5). GRUPO 1 Confinamento em A sem Dor GRUPO 3 Confinamento em B sem Dor A B Variação A B Variação Tempo: 512, , ,185 Tempo: 491, ,351 83,298 GRUPO 5 Confinamento em A com Dor GRUPO 7 Confinamento em A com Dor A B Variação A B Variação Tempo: 325, , ,360 * Tempo: 680, , ,054 * * p< 0.05 ambiente A vs B. Tabela 4: Tempo (s) nos ambientes (Animais controle - Salina). GRUPO 2 Confinamento em A sem Dor GRUPO 4 Confinamento em B sem Dor A B Variação A B Variação Tempo: 627, , ,56 * Tempo: 333, , ,407 GRUPO 6 Confinamento em A com Dor GRUPO 8 Confinamento em B com Dor A B Variação A B Variação Tempo: 666, , ,968 * Tempo: 416, ,501-67,002 * p< 0.05 ambiente A vs B Tabela 5: Tempo (s) nos ambientes (Animais tratados com Alprazolam).

29 Tempo de permanência nos ambientes de confinamento As figuras abaixo demonstram o tempo (em segundos) de permanência dos animais no mesmo compartimento em que foram confinados 24 horas antes com ou sem estimulação nociceptiva. A figura 6 demonstra que entre os animais tratados com salina e confinados em A (grade), aqueles que receberam injeção de formalina na pata tenderam a permanecer menos tempo (p= 0.08) no mesmo compartimento no dia seguinte. Entretanto, aqueles que foram tratados com alprazolam não exibiram tal tendência, o que significa tempos semelhantes independente da aplicação da formalina. Comportamento semelhante pode ser observado nos grupos de animais confinados no compartimento B (piso liso), demonstrado na figura 7, onde os animais tratados com salina e formalina tenderam a permanecer menos tempo no compartimento B, comportamento abolido pelo tratamento com o alprazolam.

30 29 Confinamento Compartimento A (grade) 800 # 700 Tempo no comp A (seg) p=0.08 sem dor com dor 0 salina alprazolam Tratamento Figura 6: Tempo de permanência (seg) no compartimento que foi confinado 24 horas antes com ou sem estímulo nociceptivo. P=0.08 vs controle salina sem dor. # p< 0.05 vs salina com dor. Confinamento Compartimento B (Piso liso) 800 Tempo no comp B (seg) # sem dor com dor 0 salina alprazolam Tratamento Figura 7: Tempo de permanência (seg) no compartimento que foi confinado 24 horas antes com ou sem estímulo nociceptivo. # p< 0.05 vs salina com dor.

31 30 3. DISCUSSÃO Os resultados gerados no segundo dia (Dia 2 Expressão) do presente estudo (visualizados nas Tabelas 4 e 5) possibilitaram a observação de alguns pontos a serem destacados, dentre eles pode-se verificar que animais que não receberam a estimulação nociceptiva nem o tratamento farmacológico (Grupos 1 e 3) não demonstraram preferência por algum ambiente. Além disso, foi demonstrado que, pelos tempos obtidos nos Grupos 5 e 7, animais que receberam estimulação nociceptiva pela injeção de formalina e não receberam tratamento farmacológico, demonstraram preferência pelo ambiente oposto ao qual foram pareados com o estímulo nociceptivo, expressando a aversão condicionada por lugar (ACL) ao ambiente no qual foram confinados no primeiro dia de experimento. Tal observação corrobora estudos anteriores como os de Gray e McNaughton (2000) e McNaughton e Corr (2004), nos quais se demonstra que a aproximação da fonte de perigo gera a ansiedade traduzida nos animais pela exibição de respostas de defesa como a esquiva que foi observada ao local em que foi aplicado o estímulo aversivo, neste caso a dor. Em outras palavras, a injeção de formalina fez com que os animais evitassem o compartimento com o qual foi pareada. Assim, no dia seguinte à injeção de formalina, os animais permaneceram mais tempo no ambiente oposto ao que foi confinado, denotando ACL. Entretanto, a aplicação de alprazolam em alguns grupos de animais atenuou a ACL, já que, mesmo com a aplicação do estímulo nociceptivo, os animais continuaram preferindo o compartimento A (Tabela 5, Grupo 6). No caso daqueles que foram confinados em B, a aversão também foi atenuada, uma vez que o grupo tratado com alprazolam não se esquivou deste compartimento e deixou de exibir preferência pelo compartimento oposto (Tabela 5, Grupo 8), demonstrando ausência

32 31 de preferência. Neste sentido a conotação aversiva que o contexto (pareamento dor e compartimento) induziu nos animais submetidos à formalina, deixou de existir nos animais tratados com alprazolam, pois, mesmo tendo recebido o estímulo nociceptivo no dia anterior, os animais não evitaram o ambiente aversivo, tal como fizeram os animais não tratados com o ansiolítico. Estudos anteriores como de Donaldson e colaboradores (2003), já pontuaram que a dor é capaz de induzir respostas comportamentais que envolvem fuga e/ou esquiva, procurando defender o organismo daquele potencial dano tissular. Tais respostas são geradas provavelmente pelo fato de que o processamento da dor envolve a ativação e/ou inativação de vias neurais centrais e periféricas que vão além das vias sensoriais, como, por exemplo, os tratos ascendentes espinotalâmicos e espino-reticulares e também as vias modulatórias descendentes inibitórias e facilitatórias da dor. Tais vias transmitem ou possuem ramificações neuronais em diversas áreas do sistema límbico, um conjunto de estruturas responsáveis pelo controle e expressão das emoções. Neste sentido, as ramificações ou mesmo estações sinápticas fazem com que a informação que chega até os centros processadores da dor, como tálamo e o córtex sensorial, sofram influências de estados emocionais. Em outras palavras, a dor pode tanto interferir no controle das emoções como também sofrer influência das emoções. Assim, estruturas límbicas como locus coeruleus (LC), matéria cinzenta periaquedutal (MCP), amídala, hipotálamo e outras, conectadas com o tálamo e córtex, modulam a resposta nociceptiva e, além disso, conferem um valor emocional à dor. Por este motivo, a dor não deve ser tratada somente levando-se em consideração aspectos fisiológicos e sensoriais, mas também como uma sensação subjetiva, com um componente emocional relevante, o qual modula sua expressão.

33 32 Neste estudo, o aspecto aversivo do estímulo nociceptivo (provocado pela formalina) foi avaliado pela sua associação com o ambiente em que a injúria foi aplicada, gerando uma emoção negativa. Neste sentido, ao ser colocado no aparato no dia seguinte, o animal identifica este ambiente, passando a se esquivar dele, aumentando seu tempo de permanência no ambiente oposto. Este comportamento também parece ser mediado pela ativação dessas áreas límbicas que reconhecem a dor como o estímulo aversivo capaz de ameaçar a integridade corporal, provocando a resposta de esquiva do animal ao compartimento no dia seguinte à injeção de formalina. De fato, Sokolov (1990) descreveu que o hipotálamo, uma área encefálica relacionada com respostas de defesa, também está envolvido no processamento da dor, e sua ativação em resposta a estímulos nociceptivos é capaz de desencadear respostas mediadas pelo próprio hipotálamo e conexões centrais, bem como através da ativação do sistema nervoso simpático em resposta à injúria o que provocaria além da esquiva, reações autonômicas como elevação da pressão arterial, taquicardia e outras respostas relacionadas. Além disso, Graeff (1994) relacionou que a ativação da MCP medeia reações de fuga e esquiva em animais submetidos a estímulos dolorosos. Além desses sítios citados, Davis (2000) identificou, através de tomografia, uma série de sítios límbicos ativados em situações em que humanos conscientes sentiam dor como pinçamento e outros testes. Sob tais condições, o escaneamento encefálico mostrou ativação do córtex pré-frontal medial, núcleos talâmicos e MCP. Neste sentido, baseados nestes e em outros estudos da literatura, é possível sugerir que a exposição do animal à dor tenha ativado uma ou mais áreas límbicas, gerando a esquiva ao compartimento e, portanto, a ACL. Além disso, é possível que o tratamento com o ansiolítico tenha atenuado o grau de ativação dessas áreas,

34 33 diminuindo a aversividade da associação dor compartimento. Uma vez que é conhecido que fármacos benzodiazepínicos atuam potencializando a neurotransmissão GABAérgica nos receptores GABA-A, e, portanto, diminuindo a excitação dessas áreas relacionadas a mediação da ansiedade, tal situação pode fazer com que o compartimento, ainda que seja o mesmo no qual o animal sofreu com a dor induzida pela formalina, tenha menor conotação aversiva. Esta hipótese fundamenta-se na conhecida propriedade ansiolítica do alprazolam bem como pelo seu efeito em diminuir a esquiva do ambiente pareado com o estímulo nociceptivo. Existem poucos trabalhos que utilizam a formalina como indutor de ACL, entre eles está o de Johansen e colaboradores (2001) no qual ratos confinados em um ambiente neutro após sofrerem injeção intraplantar de formalina, evitavam o compartimento no dia seguinte ao confinamento, da mesma forma que neste trabalho com camundongos. Nesse estudo, os autores demonstraram que a lesão do córtex pré-frontal medial, mais especificamente da porção rostral do cingulado anterior, abolia a aversão condicionada por lugar, sem alterar o efeito agudo da formalina em animais não submetidos ao condicionamento aversivo, sugerindo o envolvimento de um componente emocional à dor. Ainda com respeito ao condicionamento aversivo, outro teste baseado na esquiva de um compartimento pareado a uma situação aversiva é o teste conhecido como shuttle box ou caixa vai-e-vem. De modo sucinto, neste teste o animal é colocado em uma caixa com dois compartimentos, onde recebe um choque na pata fazendo com que ele saia do compartimento em direção ao outro. Segundo Tang e colaboradores (1991), a aplicação de diazepam diminuiu a resposta de esquiva em animais treinados na caixa de vai-e-vem, denotando efeito ansiolítico. Assim, para os animais tratados com diazepam, o choque exprimia uma menor característica

35 34 aversiva que para aqueles tratados com salina, da mesma maneira que, no presente estudo, os animais tratados com alprazolam não exibiram aversão ao ambiente que estavam com dor, como exibidos pelos animais controles. 4. CONCLUSÃO Segundo os resultados obtidos, foi demonstrado que o tratamento com o fármaco benzodiazepínico promove alteração comportamental do animal em relação a ACL induzida pela dor, e tal fato sugere ser este um teste com potencial importância no que diz respeito ao estudo da neurobiologia das reações de defesa, uma vez que, ainda que inicial e requerendo estudos adicionais, mostrou-se sensível a um fármaco ansiolítico clássico, o alprazolam, constituindo-se assim, uma ferramenta útil no estudo dos transtornos de ansiedade. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS - ARNTZ, A.; VAN ECK, M.; HEIJMANS, M. Predictions of dental pain: The fear of any expected evil is worse than the evil itself. Behav. Res. Ther., Oxford, v. 28, p ABBOTT, V.F.; FRANKLIN, K.B.J.; WESTBROOK, R.F. The formalin test: scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats. Pain, v. 60, p , BASBAUM, A. I.; FIELDS, H. L. Endogenous pain control systems Brainstem spinal pathways and endorphin circuitry. Annu. Rev. Neurosci., Palo Alto, v. 7, p

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