Caracterização molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em amostras clínicas, ambientes aquáticos e alimentos

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA ÁREA DE ANÁLISES CLÍNICAS Caracterização molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em amostras clínicas, ambientes aquáticos e alimentos Andrey Guimarães Sacramento Tese para obtenção do Título de DOUTOR Orientadora: Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka São Paulo 2015

2 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA ÁREA DE ANÁLISES CLÍNICAS Caracterização molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em amostras clínicas, ambientes aquáticos e alimentos Andrey Guimarães Sacramento Versão corrigida da Tese conforme resolução CoPGr O original encontra-se disponível no Serviço de Pós Graduação da FCF/USP. Tese para obtenção do Título de DOUTOR Orientadora: Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka São Paulo 2015

3 Andrey Guimarães Sacramento Caracterização molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em amostras clínicas, ambientes aquáticos e alimentos Comissão Julgadora da Tese para obtenção do grau de Doutor Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka orientadora/presidenta Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino 1o. examinador Profa. Dra. Doroti de Oliveira Garcia 2o. examinador Profa. Dra. Carla Taddei de Castro Neves 3o. examinador Prof. Dr. Nilton Erbet Lincopan Huenuman 4o. examinador São Paulo, 11 de setembro de 2015.

4

5 Agradecimentos Em especial à minha família Emanuela... Raul... Iraci... e Igor... À Profa. Elsa Mamizuka pelo voto de confiança e por ceder o espaço para a realização deste trabalho. Ao Prof. Nilton Lincopan pelos grandes ensinamentos fundamentais que me foram passados nos últimos meses. À Dra. Louise Cerdeira por me auxiliar nas análises de bioinformática e por ter me recebido tão bem no Laboratório Fleury e no Centro de Facilidades para Pesquisa (CEFAP-ICB-USP). À Dra. Rosemeire Zanella por estar sempre à disposição para me esclarecer dúvidas. A Lara de Ameida, Carlos Pires e Artemir Brito pelo grande apoio e incentivo. Às alunas Natasha Piola Roberto e Cecília Popazoglo pelo auxílio na execução deste trabalho. À banca de qualificação e defesa composta pelo Prof. Jorge Sampaio, Dra. Ana Gales, Dra. Marinês Martino, Dra. Doroti Garcia e Dra. Carla Neves pelas sugestões dadas. Aos colegas do Laboratório de Microbiologia e aos funcionários do Programa de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, principalmente, ao Jorge de Lima, Sueli Duarte e Irineu de Oliveira. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro concedido.

6 RESUMO SACRAMENTO, A. G. Caracterização molecular de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina em amostras clínicas, ambientes aquáticos e alimentos f. Tese (Doutorado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, Enterococos são ubíquos no ambiente e fazem parte da microbiota do trato gastrintestinal de humanos e animais. A importância dessas bactérias tem sido associada com infecções hospitalares e resistência a múltiplas drogas, principalmente à vancomicina. O objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização molecular de cepas de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE) isoladas a partir de amostras coletadas de pacientes hospitalizados, água superficial de rios urbanos e carne de frango comercializada no Brasil. A presença do gene vana foi confirmada em 20 cepas multirresitentes isoladas durante Dentre os isolados VRE, 12 cepas foram identificadas como E. faecium e oito como E. faecalis. Cepas de E. faecium isoladas de amostras clínicas e águas foram classificadas como clonalmente relacionadas pelo PFGE, com perfil virulência predominante (acm +, esp + ). Adicionalmente, enquanto cepas de E. faecium isoladas dos rios pertenceram aos ST203, ST412 e ST478 (previamente caracterizados como endêmicos em hospitais brasileiros), novos STs foram identificados entre as cepas de E. faecalis (ST614, ST615 e ST616) e E. faecium (ST953 e ST954) isoladas de alimentos. Sequências completas do transposon Tn1546 das cepas clínicas VREfm 320/07 (ST478) e ambiental VREfm 11 (ST412) mostraram Tn1546-like element de ~12800 pb, com um ponto de mutação no gene vana na posição (substituição do nucleotídeo T pelo C) e uma no gene vanx na posição (G pelo T). Além disso, uma deleção na extremidade esquerda do Tn1546, e as sequências IS1251 e IS1216E na região intergênica vanhs e vanyx, respectivamente, também foram detectados. A este respeito, a IS1216E na região intergênica vanxy constitui um conjunto de genes previamente relatado em cepas clínicas de VREfm no Brasil, denotando uma característica regional. IS1216E tem sido associada com os genes tcrb e aade que conferem resistência ao cobre e aminoglicosídeos, em E. faecium e Streptococcus agalactiae, respectivamente. Portanto, essa IS pode contribuir para a rápida aquisição de resistência antimicrobiana entre as espécies de cocos Gram-positivos clinicamente importantes. Os tipos de Tn1546 indistiguíveis que foram identificados no atual estudo isolados de humano e ambientes aquáticos sugerem uma comum partilha de um pool de genes de resistência à vancomicina. Palavras-chaves: Enterococcus, multirresitentes, MLST, vana, IS1216E.

7 ABSTRACT SACRAMENTO, A. G. Molecular characterization of vancomycin-resistant Enterococcus spp. in clinical samples, aquatic environments and foods f. Tese (Doutorado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, Enterococci are ubiquitous in the environment and in the intestinal tract of humans and animals. The importance of these bacteria has been associated with nosocomial infection and multiple resistance to antimicrobial agents, mainly vancomycin. The aim of the present study was to perform molecular characterization of vancomycin-resistant Enterococcus spp. strains (VRE) isolated from hospitalized patients, surface water of urban rivers and retail chicken meat in Brazil. The presence of the vana gene was confirmed in 20 multidrug-resistant strains isolated in Among these VRE isolates, (n = 12) were identified as E. faecium and (n = 8) as E. faecalis. E. faecium strains isolated from water and clinical samples were classified as clonally related by PFGE, the predominant virulence profile being (acm +, esp + ). Additionally, while E. faecium strains isolated from rivers belonging to ST203, ST412 and ST478 (previously characterized as endemic in Brazilian hospitals), new STs were identified among strains of E. faecalis (ST614, ST615 and ST616) and E. faecium (ST953 and ST954) isolated from food. Complete sequences of transposon Tn1546 from VREfm clinical strain 320/07 (ST478) and environmental strain VREfm 11 (ST412) showed a Tn1546-like element of ~12800 bp, with T7698C vana and G8234T vanx mutations. Moreover, deletion of the Tn1546 left extremity, and the IS1251 and IS1216E sequence inside the vanhs and vanyx intergenic region, respectively, were also detected. In this regard, the IS1216E sequence inside the vanxy intergenic region constitutes a gene array previously reported for Brazilian VREfm clinical strains alone, denoting a regional characteristic. IS1216E has been associated with tcrb and aade genes, which confer resistance to copper and aminoglycosides, in E. faecium and Streptococcus agalactiae, respectively. Therefore, IS1216E should contribute to rapid acquisition of antimicrobial resistance among species of the clinically important Gram-positive cocci. On the other hand, Tn1546-like elements were identical among clinical and environmental VREfm isolates, suggesting sharing of a common vancomycin resistance gene pool. Keywords: Enterococcus, multidrug-resistant, MLST, vana, IS1216E

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Mecanismo de ação de glicopeptídeos Figura 2 - Cluster do gene vana conferindo resistência à vancomicina Figura 3 - Representação esquemática do protótipo Tn1546, mostrando o conjunto de genes vana que conferem resistência aos glicopeptídeos Figura 4 - Localização dos rios Tietê e Pinheiros no Estado de São Paulo e distribuição de pontos de coleta de amostras de água Figura 5 - Dendrogramas mostrando a similaridade genética dos pulsotipos dos 20 VRE Figura 6 - Diagrama e-burst mostrando todos os STs de E. faecium do banco de dados do MLST Figura 7 - Diagrama e-burst mostrando todos os STs de E. faecalis do banco de dados do MLST Figura 8 - Representação esquemática do protótipo Tn1546 (acima), as deleções, mutações pontuais e as sequencias de inserções identificadas no Tn1546 de E. faecium isoladas da clínica e do rio em comparação com o protótipo (abaixo)... 61

9 LISTA DE QUADROS E TABELAS Quadro 1 - Tipos de resistência aos glicopeptídeos em enterococos Quadro 2 - Descrição dos pontos de coleta de águas que constituem a amostragem Quadro 3 - Conjuntos de iniciadores utilizados nos ensaios de PCR convencional para a detecção de genes ddl de Enterococcus spp Quadro 4 - Conjuntos de iniciadores utilizados nos ensaios de PCR convencional para a detecção de genes de resistência de Enterococcus spp Quadro 5 - Conjuntos de iniciadores e condições de ciclagem utilizados nos ensaios de PCR convencional para a detecção de genes de virulência de Enterococcus spp Quadro 6 - Conjuntos de iniciadores utilizados no ensaio de tipagem por sequenciamento de multilocus de Enterococcus faecalis Quadro 7 - Conjuntos de iniciadores utilizados no ensaio de tipagem por sequenciamento de multilocus de Enterococcus faecium Tabela 1 - Identificação e fonte de isolamento das 20 cepas de enterococos estudadas Tabela 2 - Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de E. faecalis e E. faecium vana isolados da clínica, ambiente e alimento Tabela 3 - Distribuição dos principais genes de virulência entre as cepas estudadas Tabela 4 - Perfis de MLST de E. faecium vana isolados de humanos, ambientes e alimentos Tabela 5 - Perfis de MLST de E. faecalis vana isolados de humanos, ambientes e alimentos Tabela 6 - Distribuição dos tipos de PFGE e MLST, e genes de virulência em isolados de E. faecalis de diferentes fontes no Brasil ( ) Tabela 7 - Distribuição dos tipos de PFGE e MLST e genes de virulência em isolados de E. faecium de diferentes fontes no Brasil ( )... 60

10 LISTA DE ABREVIATURAS BHI CETESB CIM Cyl CC DLV D-ala-D-ala D-Lac D-Ser Esp EPA GelE GI HLAR hylefm IS IAL ITU MHII MLST OMS ORF PFGE PREBAF SLV ST SNP UE VRE Heart Infusion Broth Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental Concentração inibitória mínima citolisina-hemolisina Complexos clonais double-locus variant D-alanina-D-alanina D-lactato D-serina Proteínas de superfície de enterococos Environmental Protection Agency gelatinase protease gastrointestinal Alto nível de resistência aos aminoglicosídeos hialuronidase Sequências de inserção Instituto Adolfo Lutz Infecções do trato urinário Mueller-Hinton II Sequenciamento de múltiplos locus Organização Mundial de Saúde Open reading frame Eletroforese em gel de campo pulsado Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frangos Single-locus variant Sequence type Single nucleotide polymorphism União Europeia Enterococcus spp resistentes à vancomicina

11 ÍNDICE 1. INTRODUÇÃO Gênero Enterococcus spp Origem da resistência à vancomicina Início da resistência dos enterococos à vancomicina Mecanismo de resistência aos glicopeptídeos Tranposon Tn Fatores de virulência de Enterococcus spp Genética da população dos enterococos Enterococos em ambientes aquáticos VRE em isolados de carne de frango JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Isolamento e identificação de VRE em amostras clínicas Isolamento e identificação de VRE em amostras ambientais Isolamento e identificação de VRE em amostras de alimentos Identificação bioquímica Teste para determinação do alto nível de resistência (HLR) aos aminoglicosídeos Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)... 36

12 4.7 Identificação genotípicas das espécies E. faecalis e E. faecium Detecção dos genes de resistência à vancomicina (vana, vanb, vanc-1 e vanc-2/3) Extração de DNA genômico Detecção de genes de virulência Tipagem molecular por PFGE Caracterização molecular pelo MLST Sequenciamento do DNA genômico utilizando sequenciamento de nova geração Montagem, anotação e depósito do Tn1546 utilizando sequências de DNA genômico RESULTADOS..., Identificação das espécies de Enterococcus spp. e do gene van Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos Detecção dos genes de virulência Determinação da similaridade genômica por PFGE Linhagens clonais identificadas por MLST Análise do ambiente genético dos Transposons Tn DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS

13 13 1. INTRODUÇÃO 1.1 Gênero Enterococcus spp Os enterococos são bactérias Gram-positivas, cocos ovais anaeróbios facultativos que formam cadeias de vários comprimentos. Resistentes e versáteis, com uma habilidade especial para resistir a condições adversas, incluindo altas concentrações de sal e a uma vasta gama de temperaturas (10 C a > 45 C). Dessa forma, estão amplamente distribuídos na natureza com capacidade para sobreviver e se desenvolver em vários ambientes, principalmente no solo e na água (MURRAY, 1990). Essas bactérias foram frequentemente relatadas por causar uma série de infecções pélvicas, neonatais, do trato urinário, bem como endocardites infecciosas. No entanto, apesar do seu potencial patogênico, os enterococos geralmente apresentam moderados níveis de virulência, devido à sua presença como colonizadores naturais do trato gastrointestinal (GI) da maior parte dos seres humanos e animais, e ainda, pelo fato de terem sido utilizados com segurança por décadas como probióticos em seres humanos e animais de fazenda (AGUIRRE & COLLINS, 1993; MURRAY et al., 2007). Algumas características dos enterococos têm contribuído para torná-los importantes patógenos humanos, tais como: i) a capacidade inerente de resistir aos antimicrobianos (clindamicina, cefalosporinas e aminoglicosídeos), ii) de adquirir e disseminar determinantes de resistência a antibióticos (clusters de genes de resistência vancomicina), e por fim, iii) ao seu genoma maleável, que pode contribuir a sua adaptação ao ambiente hospitalar e para a capacidade de certas linhagens de colonizar o trato GI e/ou disseminar fora do intestino (MURRAY et al., 2000). Atualmente, 54 espécies e duas subespécies estão descritas no gênero Enterococcus

14 14 (EUZÉBY, 2015), sendo que, o Enterococcus faecium, seguido do Enterococcus faecalis são as espécies mais frequentemente isoladas de casos de infecção humana (CATTOIR & LECLERCQ, 2013). Outras espécies, tais como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium, e E.raffinosis são isoladas com muito menos frequência e representam menos do que 5% dos isolados clínicos (PATTERSON et al., 1995; CETINKAYA et al., 2000). 1.2 Origem da resistência à vancomicina Com a descoberta dos antibióticos a mais de 70 anos atrás iniciou-se um período de inovação e implementação de drogas na saúde de humanos e animais e na agricultura. Contudo, após essa descoberta, o surgimento de microrganismos resistentes também passou a ser relatado (WRIGHT, 2007; LIVERMORE, 2009). Essas evidências têm justificado a ocorrência de resistência aos antibióticos em bactérias patogênicas nas últimas décadas, reforçadas pelo fato de que as coleções de microrganismos anteriores à era antibiótica foram altamente suscetíveis aos antimicrobianos (HUGHES & DATTA, 1983). A origem da resistência à vancomicina, antibiótico da classe dos glicopeptídeos, ainda não está elucidado. Estudos sugerem que possa ter surgido de microrganismos que produzem vancomicina, tais como Streptomyces toyocaensis e Amycolatopsis orientalis, os quais possuem os genes vanh, vana e vanx (vanhax), cassete de resistência à vancomicina relacionado com o dos enterococos (MARSHALL et al., 1997; MARSHALL et al., 1998). Tanto os microrganismos produtores de glicopeptídeos quanto as bactérias ácido lático intrinsecamente resistentes à vancomicina, tais como dos gêneros Leuconostoc, Pediococcus e Lactobacillus, provavelmente são potenciais reservatórios (DARTOIS et al., 1995; ELISHA et al., 1995; PARK et al., 1997; MARSHALL et al., 1998). Assim, os genes de resistência à vancomicina podem ter surgido em decorrência de mutações em genes homólogos dos enterococos ou de outros microrganismos (MARSHALL et al., 1998).

15 15 O Paenibacillus popilliae (anteriormente denominado Bacillus popilliae) é uma bactéria utilizada como biopesticida em práticas agrícolas. O P. popilliae é resistente à vancomicina [concentração inibitória mínima (CIM) de 800 ug/ml] e sensível teicoplanina (CIM <1 ug/ml) e apresenta o gene ligase com 77% de identidade com o gene vana (RIPPERE et al., 1998). Esses biopesticidas foram usados nos Estados Unidos há mais de 50 anos para a supressão de populações de besouros. Um outro estudo mostrou que o P. popilliae tem os genes vany, vanz, vanh, vana e vanx do operon van com alta homologia com a sequência do operon van enterocócico (PATEL et al., 2000). A origem de resistência à vancomicina é, sem dúvida, antiga. Sequências relacionadas ao vanhax foram recuperados a partir de amostras de anos atrás obtidos de solo formado por terra, rochas e gelo, recolhidos em Yukon, um dos três territórios do Canadá (D COSTA et al., 2011). Esse trabalho estabeleceu que os genes de resistência surgiram antes do uso de antibióticos e ainda, oferecendo evidências de que essa resistência é um fenômeno antigo, que ocorre naturalmente no ambiente genético dos microrganismos. Isto é consistente com a rápida emergência de resistência na clínica que prevê que os novos antibióticos selecionam determinantes de resistência pré-existentes que circulam dentro do pangenoma microbiano por milênios. Essa realidade serve como base para a conduta clínica na administração de antibióticos novos e existentes (D COSTA et al., 2011). 1.3 Início da resistência dos enterococos à vancomicina Os primeiros isolados VRE relatados em 1988 no Reino Unido e na França pertenciam à espécie E. faecium (VREfm) (UTTLEY et al., 1988; LECLERCQ et al., 1988). A princípio, verificou-se uma elevada prevalência de VREfm na comunidade em alguns países da Europa, como o observado na Bélgica (30%), em contraste com os raros casos ocorridos em hospitais

16 16 (VAN DER AUWERA et al., 1996). A avoparcina, antibiótico da classe dos glicopeptídeos utilizado como promotor de crescimento em animais de produção, foi apontado como agente seletivo de cepas resistentes, que pode ter favorecido a transmissão de VRE para os humanos através da cadeia alimentar (BATES et al., 1993). Embora ainda não comprovada, essa transmissão parece muito provável. A proibição do uso da avoparcina pela União Europeia (UE) em 1997, seguida de todos os outros agentes antimicrobianos utilizados como promotores de crescimento, foi a precursora de muitas controvérsias geradas pela ausência de análises mais detalhadas sobre os riscos do uso desses promotores (ACAR et al., 2000; HAMMERUM et al., 2010). Como resultado, houve um declínio de isolados de VRE a partir de frangos na Dinamarca e França (BAGER et al., 1999; KEMPF et al., 2008). No entanto, apesar dessa redução, os determinantes de resistência ainda persistem anos após a cessação completa do consumo de glicopeptídeos por animais de criação (JOHNSEN et al., 2011). Portanto, um reservatório animal de genes de resistência ainda pode estar presente, e potencialmente, persistir pelos próximos anos. Durante a década de 2000 na Europa, enquanto a disseminação de VRE por animais diminuía, alguns países da UE registravam aumento de VRE e grandes surtos hospitalares, semelhante ao observado nos EUA (EARSS, 2012). Além disso, as cepas isoladas de hospitais diferiram daquelas isoladas de animais, principalmente por serem altamente resistentes à ampicilina. Nos EUA, onde a avoparcina nunca foi legalmente disponível para uso em animais e onde a vancomicina oral e intravenosa foi maciçamente utilizada contra doenças humanas, a identificação de VREfm em hospitais foi relatada pela primeira vez em 1989 na cidade de Nova York (FRIEDEN et al., 1993). Desde então, a proporção de VRE em hospitais dos EUA aumentou rapidamente, tanto dentro como fora de unidades de terapia intensiva (UTIs), atingindo cerca de 28% dos isolados de enterococos em 1993 (CDC, 1993). De fato, o número de infecções por VRE em hospitais norte-americanos aumentou de em 2000 para em 2006 (RAMSEY et al., 2009). Nos anos seguintes, o E. faecium tornou-se a causa mais

17 17 comum de infecções hospitalares quando comparado ao E. faecalis (HIDRON et al., 2008). Essa mudança na espécie é de grande importância clínica, uma vez que infecções por E. faecium tem sido mais difícil de tratar por apresentarem alto nível de resistência à ampicilina e aminoglicosídeos (ARIAS & MURRAY, 2008; HIDRON et al., 2008; ARIAS & MURRAY, 2011). Diferentemente, nos EUA, cepas de VRE não foram identificadas em indivíduos da comunidade e em animais destinados à produção de alimentos, embora apenas alguns levantamentos epidemiológicos têm sido conduzidos (COQUE et al., 2006). No Brasil, a utilização da avoparcina na alimentação animal foi proibida desde No entanto, outros antimicrobianos, tais como a avilamicina, bacitracina de zinco, enramicina, flavomicina, lincomicina, colistina, tilosina e virginiamicina ainda são permitidos como aditivos na alimentação animal (BRASIL, 2015). No país, poucos estudos com o objetivo de avaliar a presença de enterococos em frangos foram conduzidos, sem relatos de Enterococcus spp. tipos vana (LEME et al., 2000; BATISTA XAVIER et al., 2006; FRACALANZZA et al., 2007). Seguindo a tendência dos EUA, no Brasil, a grande fonte de VRE tem sido proveniente do ambiente hospitalar. Após o primeiro relato de identificação de VRE em 1996, no Estado do Paraná (COSTA et al, 1998), vários estudos confirmando a disseminação de clones de VRE multirresistentes em hospitais brasileiros (ZANELLA et al., 1999; ZANELLA et al., 2003; PALAZZO et al., 2011; BATISTÃO et al., 2012; RESENDE et al., 2014; DA SILVA et al., 2014; CAMPOS et al., 2014; CORREA et al., 2015). Segundo dados do Programa de Vigilância Antimicrobiana SENTRY no Brasil, a resistência à vancomicina entre os enterococos aumentou de 4,4% em 2003 para 12,2% em 2008 (GALES et al, 2009). Em 2011, um relatório de um programa de vigilância da resistência em países da América Latina mostrou que a taxa de VRE no Brasil foi a maior entre esses países (27%) (JONES et al., 2013).

18 Mecanismo de resistência aos glicopeptídeos A síntese do peptidoglicano, principal componente da parede das células bacterianas, é composta por diversas etapas conforme o descrito por REYNOLDS, 1989 e MAINARDI et al., Os antimicrobianos da classe dos glicopeptídeos não atravessam para o citoplasma bacteriano, uma vez que atuam na superfície externa da membrana citoplasmática, inibindo a síntese do peptidoglicano. Esses antimicrobianos se ligam com elevada afinidade na região C terminal D-alanina-D-alanina (D-ala-D-ala) do pentapeptídeo (precursor do peptidoglicano) por meio de cinco pontes de hidrogênio, e devido ao seu alto peso molecular (cerca de Da), bloqueiam a ação das enzimas envolvidas nas reações de transglicosilação e transpeptidação na síntese da parede celular (Figura 1) (COURVALIN, 2006). Figura 1 - Mecanismo de ação de glicopeptídeos. Legenda: PC: Parede celular; MC: Membrana citoplasmática; C: Citoplasma Fonte: Adaptado de CATTOIR & LECLERCQ (2013).

19 19 A resistência aos glicopeptídeos ocorre devido a produção de precursores pentapeptídicos de baixa afinidade que terminam em D-lactato (D-Lac) ou D-serina (D-Ser) e pela eliminação dos precursores de afinidade elevada (D-Ala-D-Ala). Essa modificação do alvo resulta na cooperação de várias enzimas codificadas por genes organizados em um operon, as quais são necessárias para a reprogramação da síntese do peptidoglicano. A mudança do D-Ala para o D-Lac na região terminal do precursor, leva à quebra de uma ligação essencial de hidrogênio, que resulta, por sua vez, em uma diminuição de 1000 vezes na afinidade da vancomicina com os precursores que terminam em D-Ala-D-Ala, resultando em alto nível resistência à vancomicina. Em contrapartida, a mudança do D-Ala para o D-Ser leva apenas a redução de sete vezes na afinidade, e assim, a um nível mais baixo de resistência à vancomicina (COURVALIN, 2009). Até o presente momento, oito tipos de resistência adquirida aos glicopeptídeos foram relatados com base em critérios fenotípicos e genotípicos (VanA, VanB, VanD, VanE, VanG, VanL, VanM e VanN) e um outro tipo de resistência (VanC), sendo uma característica intrínseca do Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus (Quadro 1) (Lebreton et al., 2011). Os tipos VanA e VanB são os mais frequentemente detectados nos enterococos, sendo ocasionalmente, identificados em bactérias corineformes e estreptocócicas (KRCMÉRY, 2000), e raramente, o operon vana também tem sido detectado em S. aureus (SIEVERT et al., 2008). Isolados VanA positivos apresentam altos níveis resistentes indutíveis à vancomicina e à teicoplanina (CIM > 64 mg/l), enquanto que os isolados VanB exibem vários níveis de resistência indutíveis à vancomicina (CIM geralmente igual a mg/l), mas permanecem sensíveis à teicoplanina.

20 20 Quadro 1 - Tipos de resistência aos glicopeptídeos em enterococos. Resistência adquirida Resistência intrínseca Suscetibilidade Alto nível Variável Moderado Baixo nível Baixo nível VanA VanM VanB VanD VanE VanG VanL VanN VanC1/C2/C3 Vancomicina R R r-r R r r r r r Teicoplanina R R S r-r S S S S S Transferibilidade Espécies A/B* A A/B A/B B B B A G/D Expressão I? I C I/C I I C C/I Localização Plasmídeo (Cromossomo) Plasmídeo (Cromossomo) Cromossomo (Plasmídeo) Cromossomo (Plasmídeo) Cromossomo Cromossomo? Cromossomo Cromossomo Precursores finais D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser D-Ala-D-Ser Legenda: R, elevado nível de resistência (MIC > 16 mg/l); r, baixo nível de resistência (MIC=8-16 mg/l); S, suscetível; A, E. faecium; B, E. faecalis; G, E. gallinarum; D, E. casseliflavus; I, indutível; C, constitutiva. * também outras espécies de Enterococcus. Fonte: Adaptado de CATTOIR & LECLERCQ (2013).

21 21 O operon vana é normalmente carreado por um transposon denominado Tn1546, que é composto por cinco genes envolvidos na resistência aos glicopeptídeos (vanhaxyz) e dois genes reguladores (vanrs). O gene vana codifica uma ligase que catalisa a formação de um depsipeptídeo D-Ala-D-Lac. Por si só, esse gene não confere resistência, uma vez que o substrato de D-Lac é raro na natureza e tem que ser sintetizado. É esse o papel da desidrogenase codificada por vanh que reduz piruvato, comumente encontrado na natureza, à D-Lac, proporcionando assim, o substrato para a ligase. Nas etapas seguintes, esse depsipeptídeo é finalmente incorporado como uma forma de pentadepsipeptídeo para a síntese do peptidoglicano. No entanto, a resistência ainda não é expressa, visto que a síntese de precursores do tipo selvagem persiste e permite que a ligação de vancomicina ocorra, e subsequentemente, a ruptura da parede celular. A eliminação desses precursores sensíveis é tarefa do gene vanx, que codifica uma D, D-dipeptidase capaz de hidrolisar o dipeptídeo D-Ala-D-Ala formado pela ligase natural (Ddl). Além disso, os genes vany codificam uma D, D-carboxipeptidase que elimina o terminal D-Ala de precursores, caso haja eliminação incompleta do dipeptídeo pelo vanx (COURVALIN, 2006) (Figura 2). Figura 2 - Cluster do gene vana conferindo resistência à vancomicina. Fonte: Adaptado de HUGHES, 2003.

22 Tranposon Tn1546 Os primeiros estudos conduzidos na França com isolados de VRE mostraram que o cluster de genes van reside em um transposon da família Tn3 de pb denominado Tn1546 (ARTHUR et al., 1993). Esse transposon possui duas open reading frame (ORF) upstream dos genes vanrshaxyz, denominadas ORF1 e ORF2, mostrando homologia para transposase e resolvase, respectivamente (Figura 3). Essas ORFs são transcritas em direções opostas e ambas estão associadas à função de transposição. O Tn1546 é flanqueado por repetições invertidas imperfeitas que variam de pb. Apresenta-se estruturalmente relacionado a transposons da família Tn3, não conjugativo e in vitro, transpõe em baixa frequência (10-8 por doador), conforme o observado em experimentos realizados com plasmídeos (HANDWERGER et al., 1995). A maioria dos estudos tem identificado cluster de genes van em vários plasmídeos diferentes (CLARK et al., 1993; MATO et al., 1996; THAL et al., 1998; WERNER et al., 1999; MERLO et al., 2015) e mais raramente, no cromossomo (HANDWERGER & SKOBLE, 1995). Figura 3 - Representação esquemática do protótipo Tn1546, mostrando o conjunto de genes vana que conferem resistência aos glicopeptídeos. A heterogeneidade genética de elementos relacionados ao Tn1546 tem sido bem documentada (HANDWERGER et al., 1995; ARTHUR et al., 1997; MACKINNON et al., 1997; WERNER et al., 1997; WOODFORD et al., 1998; JENSEN et al., 1998; VAN DEN BRAAK et al., 1998; MERLO et al., 2015). Os polimorfismos descritos até o presente

23 23 momento, incluem a detecção de sequências de inserções (IS) IS1216V, IS1251, IS1542, IS1476, IS1478, IS1485, IS1297, IS3, ISEf1, ISEfa4, ISEfa5 e de deleções, tanto na extremidade esquerda (sentido da ORF1) e direita (sentido do vanz), onde termina o transposon. Mutações pontuais na ORF1, vanr, vans, vana, vanx e vany têm sido descritas (WILLEMS et al., 1999; LAUDERDALE et al., 2002; CAMARGO et al., 2004; HARADA et al., 2012). Dentre esses elementos, a IS1216V é a mais descrita e disseminada, seguida pelas IS1251 e IS1542, podendo estar presente em diversas regiões do transposon (PALEPOU et al., 1998; LEE et al., 2004; TALEBI et al., 2008; ZHU et al., 2009; PARK et al., 2011; CHA et al., 2013; MERLO et al., 2015). A presença da ISEfa5 na região intergênica vanx-vany pode resultar na expressão de suscetibilidade à teicoplanina, alterando o fenótipo VanA (HENRIQUE et al., 2008). Da mesma maneira, a supressão dos genes vanx-vany pela inserção da IS1216V nessa região intergênica está diretamente associada com a incongruência do fenótipo-vanb e genótipo-vana (OH et al., 2007). Discrepâncias do tipo vana/vand também foram observadas em amostras com transposons que apresentavam alterações nos genes vans, vany e/ou vanz (HASHIMOTO et al., 2000; CHA et al., 2013). Outros elementos de inserção também podem interromper a porção inicial de Tn1546, tais como, a IS1297 (inserida na IS1542) e a IS1485 (SONG et al., 2006; KHAN et al., 2008). Os vários locais de inserção indicam que esses elementos são ativamente móveis, alterando o rearranjo do Tn1546, modificando sua transmissibilidade e o fenótipo VanA em isolados de humanos, animais e ambientais (PARK et al., 2007; NOVAIS et al., 2008). 1.6 Fatores de virulência de Enterococcus spp A ascensão dos enterococos como patógenos nosocomiais foi inicialmente o resultado da seletiva vantagem proporcionada pela sua resistência aos antibióticos. No entanto, é provável que outros determinantes de virulência também estejam envolvidos no sucesso desses

24 24 microrganismos em ambiente hospitalar. Grandes plasmídeos transmissíveis com de tamanho kb são comuns entre os E. faecium isolados da clínica e têm um importante papel na sua virulência (ARIAS et al., 2009). O gene da hialuronidase (hylefm) (que codifica uma família 84 da Glicosiltransferase) tem sido frequentemente referido como um dos mediadores do aumento da virulência que lhe é conferida por esses megaplasmídeos (FREITAS et al., 2010). Em relação aos determinantes da superfície celular, as proteínas de superfície de enterococos (Esp) são codificadas por genes que parecem ter sido adquiridos dentro de uma ilha de patogenicidade, são comumente encontradas em isolados clínicos, apresentando-se ancoradas à parede celular, favorecem a formação de biofilme e possuem um papel nas infecções do trato urinário (ITU) e/ou endocardite em modelos experimentais (SHANKAR et al., 2001; HEIKENS et al., 2007; HEIKENS et al., 2011). Outro fator de virulência importante é a adesina (Acm) de E. faecium, que tem a função de se ligar ao colágeno. Essa proteína tem um papel no aumento da capacidade dos membros do clado de E. faecium associado ao hospital para causar doença, principalmente em endocardite experimental (NALLAPAREDDY et al., 2008). Ao contrário dos estreptococos e estafilococos, a maioria dos enterococos não produzem um conjunto de toxinas pró-inflamatórias, mas, no entanto, são constituídos por diversos genes que codificam proteínas de adesão que podem mediar a sua ligação aos tecidos do hospedeiro, o que é coerente com a seu papel patogênico na endocardite infecciosa (ARIAS & MURRAY, 2012). Várias proteínas que são secretadas para o meio extracelular têm sido implicadas na virulência enterocócicas. A citolisina-hemolisina (Cyl) é uma toxina que é codificada em plasmídeos ou ilhas de patogenicidade de E. faecalis. É secretada no meio extracelular e possui atividade proteolítica em células sanguíneas (SEGARRA et al., 1991; BOOTH et al., 1996). Outro importante fator secretado é a gelatinase protease (GelE), que participa da ativação de autolisina, uma enzima que degrada o peptidoglicano, levando à liberação de DNA extracelular e a formação de biofilme (THOMAS et al., 2009). Em modelos

25 25 animais, cepas que não possuem GelE têm mostrado diminuição na translocação através células intestinais T84, virulência atenuada em peritonite, endocardite, endoftalmite e reduzida aderência às raízes dentárias (SINGH et al., 1998; HUBBLE et al., 2003; ENGELBERT et al., 2004; ZENG et al., 2005). 1.7 Genética da população dos enterococos Os primeiros estudos sobre a epidemiologia molecular de VRE no Brasil utilizando eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) mostraram uma disseminação clonal intra e interhospitalar (REIS et al., 2001; CEREDA et al., 2002). Em São Paulo, desde 1997 quando pesquisadores da Instituto Adolfo Lutz (IAL) relataram o primeiro isolado de E. faecium tipo vana (ZANELLA et al, 1999) e documentaram o primeiro surto nosocomial no país (ZANELLA et al, 2003), outros estudos sobre a tipagem por PFGE de E. faecalis e E. faecium resistentes à vancomicina vêm mostrando a propagação de novos clones em diferentes hospitais das regiões sul e sudeste (D'AZEVEDO et al., 2008; PALAZZO et al., 2011). A tipagem por sequenciamento de múltiplos locus (MLST) é baseada em diferenças alélicas de sete genes conservados e tem sido bastante utilizada para análises de relações de ancestralidades. Essa técnica tem permitido identificar que isolados de enterococos recuperados de pacientes hospitalizados, muitas vezes, se agrupam em cluters específicos (complexos clonais - CC), os quais são diferentes dos grupos dos isolados comensais ou dos recuperados de animais (GETACHEW et al., 2013). Estudos no Brasil e no mundo tem demonstrado que a maioria dos isolados de E. faecalis derivados de hospitais pertence a dois complexos clonais: CC2 e CC9 (RUIZ-GARBAJOSA et al., 2006; PENAS et al., 2013; CONCEIÇÃO et al., 2014). O aumento da frequência de isolamento de E. faecium deve-se à presença de uma subpopulação policlonal, como os Sequence types 17 (ST17), ST18, ST78, ST192, ST412 e ST478, todos

26 26 pertencentes ao (CC17) (WILLEMS & VAN SCHAIK et al., 2009; PALAZZO et al., 2011; DA SILVA et al., 2012). Análises de sequenciamento de nova geração dos enterococos, têm comparado várias sequências dos seus genomas [ex. single nucleotide polymorphism (SNP), 16S rrna, IS16] e demonstrado que o clado associado ao hospital é geneticamente diferente da maioria dos isolados comensais de humanos e animais (VAN SCHAIK et al., 2010; WERNER et al., 2011; GALLOWAY-PENA et al., 2012). 1.8 Enterococos em ambientes aquáticos Os enterococos estão amplamente distribuídos em diversos habitats ambientais, mesmo quando há pouca ou nenhuma entrada de humano e/ou fontes de fezes de animais. Esses habitats extra entéricos incluem solo e sedimentos, areia da praia, vegetação aquática (ex. algas) e terrestre, e ambiente aquáticos (rios, córregos e água do mar), podendo também serem considerados habitats heterotérmicos, uma vez que apresentam temperaturas variáveis, diferentemente da do trato GI de animais de sangue quente, onde a temperatura é relativamente constante (BYAPPANAHALLI et al., 2012). A sua abundância nas fezes de humano e animais, a facilidade com que são cultivados, e a sua correlação com os resultados da saúde humana em água doce e marinha, levaram os enterococos a serem utilizados como ferramentas para avaliar qualidade da água recreacional em todo o mundo. Dada a sua distribuição ubíqua nas fezes de animais e humanos, são usados como bactérias indicadoras de contaminação fecal ou associados a outros para patógenos, em análises de qualidade da água (WOLF, 1972; SADOWSKY & WHITMAN, 2010). A capacidade dos enterococos em crescer na presença de sal (6,5% de NaCl) é uma das características que distinguem o gênero. A maior tolerância ao sal dos enterococos quando

27 27 comparados a outros coliformes fecais (ex. Escherichia coli), provavelmente contribui para o seu melhor desempenho como indicadores de risco para a saúde humana em águas recreacionais marinhas (OSTROLENK et al., 1947; CABELLI et al., 1979). Atualmente, os enterococos são as únicas bactérias indicadoras de contaminação fecal recomendada pela Environmental Protection Agency (EPA) dos EUA para águas salobras e marinhas, uma vez que se correlacionam melhor com os resultados da saúde humana do que os de outras bactérias indicadoras de contaminação fecal (WADE et al., 2010). Outros estudos também têm observado a sobrevivência prolongada de enterococos em água doce (ANDERSON et al., 2005; HALLER et al., 2009) e estuários (JENG et al., 2005). A vegetação aquática e terrestre, areia da praia, sedimentos de água doce e marinha, e do solo foram identificadas como algumas das principais fontes ambientais de enterococos e de outras bactérias indicadoras de contaminação fecal. Essas bactérias derivadas dessas fontes podem, potencialmente, impactar a qualidade da água das praias e bacias hidrográficas associados, e assim, existe a necessidade de uma melhor compreensão do seu destino nesses ecossistemas (BYAPPANAHALLI et al., 2012). Vários estudos têm mostrado uma correlação entre a elevada concentrações de enterococos e os riscos de doença GI, respiratória e de pele em humanos durante o uso recreacional da água (KAY, et al., 1994; PRÜSS, 1998; SINCLAIR et al., 2012). As características associadas à bactéria "ideal" indicadora de contaminação incluem: baixa virulência; a existência de uma metodologia simples e rápida para contagem; características de sobrevivência que são semelhantes às de patógenos de ambientes extra entérico; e uma grande associação com a presença de agentes patogênicos (CABELLI et al., 1979). A concentração de enterococos por método de filtração por membrana e cultivo em meios seletivos (mei ou M-Enterococcus) são atualmente considerados "padrão ouro" para a avaliação da qualidade da água (EPA, 2002). Estudos epidemiológicos adicionais de águas impactadas pela poluição incluem a

28 28 identificação de enterococos ao nível de espécie e a quantificação de outros patógenos necessários para compreender melhor os riscos à saúde humana. Quando analisados em conjunto com resultados do emprego de tecnologias de sequenciamento de última geração, podem elucidar a compreensão da ecologia de enterococos multirresistentes e a sua continuada utilidade como bactérias indicadoras de contaminação fecal em águas para consumo e recreacionais em todo o mundo (BYAPPANAHALLI et al., 2012). 1.9 VRE em isolados de carne de frango Vários estudos têm identificado a presença de Enterococcus tipo vana em animais de corte, carne e produtos de carne no mundo (ROBREDO et al., 2000; JUNG et al., 2007; HARADA et al., 2012; TALEBI et al., 2015). A disseminação dessas bactérias multirresistentes fora do ambiente hospitalar tem acarretado sérios problemas ao longo dos últimos anos, e com o uso extensivo de antibióticos em animais de produção, essa se tornou uma provável fonte para a seleção de bactérias. Como consequência, foi estabelecida uma possível rota de transmissão dessas bactérias multirresistentes do animal para o homem através do alimento, especialmente carnes e derivados (GHIDAN et al., 2008; CARATTOLI et al., 2008). Baixas doses de agentes antimicrobianos em animais utilizados na alimentação podem em certas condições aumentar a sua produtividade, melhorando a sua alimentação e diminuindo a morbidade e mortalidade causadas por infecções clínicas e subclínicas (BUTAYE & DEVRIESE, 2003). O efeito dos antimicrobianos na promoção do crescimento foi descoberto pela primeira vez quando frangos foram alimentados com produtos de fermentação do Streptomyces aureofaciens após a produção de antimicrobianos (STOKSTAD & JUKES, 1950). A avoparcina, um glicopeptídeos, foi introduzido pela primeira vez como promotor de crescimento em 1975 (HAMMERUM et al., 2010), sendo usado em frangos e suínos, como

29 29 também em perus, bezerros e outros animais (MCDONALD et al., 1997; WEGENER, 1998). A Organização Mundial de Saúde (OMS) define que zoonose é qualquer doença ou infecção naturalmente transmissível de animais vertebrados para o homem e vice-versa (WHO, 2012). A transmissão dessas infecções dos animais para os seres humanos pode ser de forma direta ou indireta. A via de transmissão indireta ocorre por meio de produtos de alimentos animais ou vegetais contaminados (GIRAFFA, 2002; SCHJORRING et al., 2011). Os produtos à base de carne podem ser contaminados por matéria fecal nos frigoríficos, enquanto que vegetais podem ser contaminados no campo por estrume ou água de esgoto utilizada para fertilização e irrigação. Em relação às bactérias resistentes aos antimicrobianos, sabe-se que não são apenas os agentes patogênicos que possuem um potencial zoonótico, uma vez que os genes que codificam a resistência antimicrobiana em comensais, tais como Escherichia coli e Enterococcus spp., podem ser transferidos para outros microrganismos patogênicos (EFSA, 2008; SCHJORRING & KROGFELT, 2011). No intestino humano, essas bactérias podem colonizar de forma persistente ou transitória, podendo ser suficiente para os genes de resistência serem transferidos para outras cepas mais adaptadas a colonizar os humanos (BERCHIERI, 1999; LESTER et al., 2006; TROBOS et al., 2009). O potencial zoonótico de alguns genes de resistência antimicrobiana significa a presença de algumas bactérias resistentes em animais de produção, podendo ser um reservatório e uma fonte de propagação de resistência, afetando a medicina humana e veterinária (WITTE, 2000).

30 30 2. JUSTIFICATIVA Até o momento, não existem dados sobre a relação epidemiológica de Enterococcus spp. tipo vana isolados de humanos, ambientes aquáticos e alimentos no Brasil. Como é de conhecimento que os VRE são predominantes em hospitais brasileiros, torna-se oportuno um estudo que vise identificar as principais espécies, perfil de suscetibilidade aos antibacterianos, genes de resistência e virulência dessas bactérias isoladas de outras fontes. Além disso, a tipagem molecular de cepas de VRE permite a identificação de clones e suas possíveis formas de disseminação, podendo auxiliar no monitoramento de novos clones e possibilitar a comparação destes com os identificados no Brasil e em outros países. Por fim, a análise do ambiente genético do cluster do gene vana, faz-se importante para a identificação e caracterização das funções dos elementos que medeiam a resistência à vancomicina em isolados de diferentes ambientes ecológicos.

31 31 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Caracterizar isolados de Enterococcus spp., com perfil de resistência aos glicopeptídeos isoladas de amostras clínicas, ambientes aquáticos e alimentos no Brasil, quanto ao perfil de suscetibilidade aos antibacterianos, elemento genético móvel, virulência e a sua relação clonal Objetivos específicos 1. Identificar espécies de Enterococcus resistentes aos glicopeptídeos em amostras clínicas, alimentos e amostras de água superficial coletada de rios urbanos. 2. Avaliar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana aos demais antimicrobianos das cepas resistentes aos glicopeptídeos. 3. Identificar o gene de resistência aos glicopeptídeos relacionado à presença do gene vana, vanb e/ou vanc. 4. Identificar os principais genes de virulência das cepas de Enterococcus resistentes aos glicopeptídeos. 5. Avaliar a similaridade genética e presença de clones endêmicos das cepas estudadas. 6. Investigar o ambiente genético do transposon contendo o gene vana em cepas de Enterococcus faecium isoladas de diferentes origens.

32 32 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Isolamento e identificação de VRE em amostras clínicas Para o presente estudo, foram identificadas oito cepas clínicas de VRE, as quais foram isoladas durante o período de 1997 a As cepas de VRE foram selecionadas a partir de um total de 239 isolados de Enterococcus spp resistentes à vancomicina recuperados de casos clínicos durante surtos de infecção hospitalar diagnosticados em 26 centros médicos distribuídos na cidade de São Paulo (SACRAMENTO, 2010). As amostras clínicas (sangue, líquor, urina e swab retal) foram processadas e semeadas em ágar sangue à 5% para o isolamento e posterior identificação de Enterococcus spp, seguindo o Manual de Microbiologia Clínica para o controle de infecção relacionada à assistência à saúde (BRASIL, 2013). 4.2 Isolamento e identificação de VRE em amostras ambientais Foram analisadas 42 amostras de águas superficiais coletadas de oito pontos dos Rios Tietê e Pinheiros próximos de Hospitais de São Paulo nos anos de 2010 a 2011, com colaboração da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB) (Figura 4 e Quadro 2). Destas, 31 (75%) foram positivas para enterococos, sendo que foram isoladas seis cepas de VRE em cinco dos oito pontos dos rios que foram coletados (SACRAMENTO et al., 2015a). As alíquotas de água utilizadas no presente estudo foram oriundas de projeto temático que investigou a biodiversidade microbiana nas águas dos Rios Tietê e Pinheiros (LINCOPAN, 2010).

33 33 Figura 4 - Localização dos rios Tietê e Pinheiros no Estado de São Paulo e distribuição de pontos de coleta de amostras de água. Fonte: Modificado de LINCOPAN (2010) e SUARES ROCHA et al. (2010). Quadro 2 - Descrição dos pontos de coleta de águas que constituem a amostragem. UGRHI Corpo Hídrico Código CETESB Local de Amostragem Latitude S Longitude W Município Rio Tietê TIET2050 Ponte na Rodovia que liga Mogi das Cruzes a Salesópolis (SP-88) Biritiba Mirim Rio Tietê TIET3120 À jusante da ETE de Suzano Suzano Rio Tietê Rio Tietê TIET4180 TIET4200 Ponte das Bandeiras, na Avenida Santos Dumont Ponte dos Remédios, na Avenida Marginal (Rodovia Presidente Castelo Branco) São Paulo São Paulo 6 Reservatório Edgard de Souza TIES4900 Próximo às comportas da barragem do reservatório, após a Rede de Retenção de Aguapés Santana do Parnaíba Rio Pinheiros PINH4250 Na Ponte do Socorro São Paulo Rio Pinheiros PINH4900 Próximo à sua Foz no Rio Tietê, na estrutura de Retiro São Paulo 10 Reservatório de Barra Bonita TIBB2700 No meio do Corpo Central, na direção do Córrego Araquazinho São Manuel UGRHI: Unidade de Gerenciamento de Recursos Hídricos. Fonte: LICOPAN (2010)

34 34 Seguindo métodos padronizados para o exame de água e de águas residuais, alíquotas de 500 ml de água de superfície foram coletadas em frascos de vidro esterilizados (http: // methods.org). As alíquotas foram armazenadas em frascos de vidro esterilizados, etiquetadas e transportadas em gelo para o laboratório. A partir de cada amostra de água, 100 ml, foi concentrada por filtração através de filtros de membrana esterilizados (tamanho de poro de 0,45 μm). Os filtros foram colocados em placas de ágar base M- Enterococcus e incubada a 37 C por 24 h. Os filtros de membrana foram removidos assepticamente e colocados separadamente em caldos Brain Heart Infusion (BHI). Após o tratamento de vórtice, uma alíquota de 100 ul de cada cultura foi semeada em ágar M- Enterococcus com e sem vancomicina (6 ug/ml). 4.3 Isolamento e identificação de VRE em amostras de alimentos Seis isolados de VRE foram recuperados de amostras de frango congeladas, destinados à venda em mercados em quatro estados brasileiros. Essas amostras foram isoladas nos anos de 2004 a 2006, durante o Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frangos (PREBAF) (ANVISA, 2008, SACRAMENTO et al., 2015b). As amostras de frango de varejo foram descongeladas a 5 C, por até 24 horas, em seguida, as vísceras de frango foram removidas e cada carcaça foi lavado em água peptonada a 1%, tamponada. Para cada 1 g de amostra, 1 ml de água peptonada foi adicionado (1:1). Depois de enxaguar a superfície inteira das carcaças de frangos, duas alíquotas de 25 ml foram removidas assepticamente e colocadas separadamente em frascos estéreis que tinham anteriormente sido cheio com 225 ml de caldo de Enterococcosel estéril com e sem vancomicina (6ug/ml), respectivamente. Os frascos foram incubados a 35 C durante 48 horas, e as culturas de caldos Enterococcosel que transformaram para preto foram semeadas em ágar Enterococcosel com e sem vancomicina, respectivamente (ANDREWS & HAMMACK, 2003).

35 Identificação bioquímica A identificação das amostras em gênero e espécie segue as provas bioquímicas padronizadas internacionalmente por FACKLAM & TEIXEIRA (2003). Primeiramente, foi observada a morfologia celular por meio da coloração de Gram. Posteriormente, provas presuntivas para identificação do gênero foram realizadas, como a capacidade de crescimento em meio de cultura líquido acrescido de 6,5% de NaCl, capacidade de crescimento na presença da bile e de hidrolisar a esculina e a hidrólise enzimática da L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide (Teste PYR). A fermentação dos carboidratos manitol, sorbitol, sorbose, arabinose e rafinose foi avaliada em meio de cultura líquido, tendo como base o caldo de infusão de coração (Heart Infusion Broth - BHI), esterilizado por autoclavação a 121ºC por 15 minutos. Ao caldo acrescentou-se o carboidrato e o indicador azul de bromocresol para uma concentração final de 1%. Para o teste da hidrólise da arginina, o meio utilizado foi o caldo descarboxilase de Moeller acrescido de 1% de (L)-arginina. O meio esterilizado por autoclavação foi distribuído em tubos e uma camada de um centímetro de óleo mineral estéril foi adicionada ao meio. (HLAR) 4.5 Teste para determinação do alto nível de resistência aos aminoglicosídeos A determinação do HLAR foi realizada pelo método de difusão em ágar, conforme técnica descrita pelo manual CLSI (2014). Com o auxílio de uma micropipeta automática o volume de 10 µl de uma suspensão bacteriana com 10 8 UFC/ml, preparada com o auxílio da escala 0,5 de McFaland foi semeado em duas placas de ágar BHI contendo 500 μg/ml de gentamicina ou μg/ml de estreptomicina. Após incubação da placa por 24h a 37ºC em

36 36 aerobiose procedeu-se a leitura. O crescimento de mais do que uma colônia foi considerada teste positivo para resistência ao antimicrobiano, com exceção da placa com gentamicina, que quando o resultado foi negativo, esta foi incubada por mais 24h. Para aferição das concentrações dos antibióticos nas placas de ágar BHI, utilizaramse as cepas padrão de E. faecalis ATCC e ATCC 51299, como controle de suscetibilidade e resistência, respectivamente. 4.6 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) Para os ensaios de determinação da CIM, utilizou-se a técnica de microdiluição em caldo, conforme recomendações do CLSI (2014) e EUCAST (2014). As cepas foram avaliadas frente aos antimicrobianos: vancomicina (VAN), teicoplanina (TEI), ampicilina (AMP), ciprofloxacina (CIP), tetraciclina (TET), clorofenicol (CLO), eritromicina (ERI), linezolida (LNZ), quinupristina/dalfopristina (Q/D), tigeciclina (TIG) e daptomicina (DAP). Os sais dos antimicrobianos foram estocados a - 20ºC. As soluções concentradas dos antimicrobianos foram feitas em água destilada esterilizada ou em outro solvente adequado ao antimicrobiano, levando-se em consideração a potência de cada antimicrobiano fornecida pelo fabricante. Como meio de cultura, utilizou-se o caldo Mueller-Hinton II (MHII) cátions ajustados. Neste caldo, prepararam-se as diluições de uso dos antimicrobianos seguidas de diluições seriadas de 1:2. Após a dispensa de 50 μl das diferentes diluições dos antimicrobianos nas placas de microdiluição estéreis com 96 poços, estas foram mantidas a - 20ºC devidamente lacradas e acondicionadas até a realização dos testes de determinação da CIM. Para a determinação da CIM, o inóculo bacteriano foi preparado em solução fisiológica esterilizada, a partir de um crescimento de 18h em placas de ágar sangue. Com auxílio de um swab e de um espectrofotômetro (A625nm = 0,8 1,3), preparou-se uma suspensão bacteriana

37 37 ajustada para uma concentração de 10 8 UFC/mL. Desta suspensão, preparou-se o inóculo em caldo MHII para uma concentração final de 10 6 UFC/mL. Um volume de 50 μl foi adicionado por poço das placas de microdiluição e foram incubadas a 37ºC por 24h em condições de aerobiose. A cepa padrão de E. faecalis ATCC foi utilizada como controle de qualidade do teste para todos os antimicrobianos. O controle de pureza do inóculo bacteriano foi observado pela coluna, na qual se tinha somente meio de cultura sem antimicrobiano e com inóculo bacteriano. O controle de esterilidade do meio de cultura foi realizado observando-se a coluna, na qual continha somente o meio de cultura sem inóculo bacteriano. A leitura da CIM foi a menor concentração de antibiótico na qual não se observou visualmente o crescimento bacteriano. Os critérios de suscetibilidade e resistência adotados para cada antimicrobiano foram os recomendados pelo CLSI (2014). 4.7 Identificação genotípicas das espécies E. faecalis e E. faecium Para confirmação das espécies, foi utilizada a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação dos genes ddl que codificam as ligases D-alanina, espécieespecíficos para E. faecalis e E. faecium (DUTKA-MALEN et al., 1995). O conjunto de iniciadores que foram utilizados encontra-se descrito no Quadro 3.

38 38 Quadro 3 - Conjuntos de iniciadores utilizados nos ensaios de PCR convencional para a detecção de genes ddl de Enterococcus spp. Genes e nomes dos primers Sequência de primers Tamanhos do amplificados ddl E. faecalis E1 5 ATC AAG TAC AGT TAG TCT 3 E2 3 ACG ATT CAA AGC TAA CTG pb ddl E. faecium F1 5 TAG AGA CAT TGA ATA TGC C 3 F2 3 TCG AAT GTG CTA CAA TC pb pb: pares de bases Para cada 25 µl de reação foram utilizados: tampão da PCR 10X [TRIS-HCl 20 mm, ph8,4; KCl 50 mm (Gibco, BRL) na concentração final de 1X; 3mM de solução de MgCl2 (Gibco, BRL); desoxinucleotídeos trifosfatos (dntps) 100 mm (Gibco, BRL) na concentração final de 200 µm; iniciadores ddl E. faecalis em sentido sense e antisense e ddl E. faecium em sentido sense e antisense na concentração final de 50 ng (cada), conforme sequências publicadas por DUTKA-MALEN et al. (1995). A enzima Taq DNA Polimerase (Gibco, BRL) foi adicionada na concentração final de 1U para cada reação e água destilada, esterilizada, para um volume final de 25 µl. Duas a quatro colônias isoladas, a partir de uma cultura pura em ágar sangue, foram adicionadas em cada tubo de reação (FREE & SHAM, 1996). Os controles positivos E. faecalis ATCC e E. faecium 228, e o controle negativo (tubo contendo somente a mistura de reagentes sem DNA bacteriano), foram incubados no termociclador (Mastercycler Personal Eppendorf) e submetidos aos seguintes ciclos (DUTKA- MALEN et al., 1995): 1 ciclo a 94ºC / 2 min. 30 ciclos a 94ºC / 1 min., 54ºC / 1 min., 72ºC / 1 min. 1 ciclo a 72ºC / 10 min.

39 39 Após o término da reação, o produto de amplificação foi mantido a 4ºC, para posterior análise pela eletroforese em gel de agarose (Sigma) a 1,5% em TBE 1X. A corrida eletroforética foi feita durante 90 minutos a 100 volts. Utilizou-se um marcador de peso molecular para os fragmentos de DNA, 100 pb DNA Ladder (Gibco BRL). A coloração do gel foi realizada com GelRed por 30 minutos e fotografado pelo sistema de fotodocumentação do equipamento Gel Doc EQ (Bio-Rad). 4.8 Detecção dos genes de resistência à vancomicina (vana, vanb, vanc-1 e vanc-2/3) Para confirmação dos genes de resistência vana, vanb, vanc-1 e vanc-2/3 foram utilizadas as mesmas sequências de nucleotídeos publicados por ZANELLA et al., 2003 (Quadro 4). Quadro 4 - Conjuntos de iniciadores utilizados nos ensaios de PCR convencional para a detecção de genes de resistência de Enterococcus spp. Genes e nomes dos primers Sequências de primers Tamanhos do amplificados vana A1 5 AAA TGT GCG AAA AAC CT 3 A2 3 TCC TGA TGA ATA CGA AAG AT pb vanb B1 5 ACC TAC CCT GTC TTT GTG AA 3 B2 3 AAT GTC TGC TGG AAC GAT A pb vanc-1 C GGT ATC AAG GAA ACC TC 3 C CTT CCG CCA TCA TAG CT pb vanc-2/3 C CTC CTA CGA TTC TCT TG 3 C CGA GCA AGA CCT TTA AG pb pb: pares de bases

40 40 O preparo das amostras para a reação da PCR foi o mesmo utilizado no item Cepas de E. faecium - vana 228, E. faecalis - vanb ATCC 51299, E. gallinarum NCTC e E. casseliflavus NCTC 1261 foram usadas como controles positivos, e a cepa E. faecalis ATCC como controle negativo. As amostras e os controles foram incubados no termociclador e submetidos aos seguintes ciclos, conforme protocolo de WOODFORD et al. (1995): 1 ciclo a 94ºC / 5 min., 30 ciclos a 94ºC / 25 seg., 54ºC / 40 seg., 72ºC / 40 seg., 1 ciclo a 72ºC / 5 min. 4.9 Extração de DNA genômico O DNA genômico das bactérias foi extraído pelo método previamente descrito por BOLANO et al (2001). Para a extração do DNA, as amostras de VRE foram cultivadas em ágar sangue a 37ºC por 18-24h. Uma colônia do crescimento bacteriano foi semeada em 5mL de caldo BHI e incubada a 37ºC por 18h. Após incubação, o caldo BHI com bactérias foi centrifugado por 5 minutos a 2.655g a 4 C. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento bacteriano foi lavado com 5mL de solução fisiológica (0,85g NaCl em 100mL de água destilada) e centrifugados sob as mesmas condições citadas acima e o sobrenadante foi desprezado. Em seguida, foi adicionada, ao sedimento bacteriano, a mesma quantidade de pérolas de vidro (proporção 1:1), previamente tratadas com ácido nítrico. Este ácido tem a função de remover metais pesados que atuam como co-fatores para nucleases (DNAses e RNAses). Então, foi adicionada solução tamponante de extração (Tris HCl ph 8,5-0,5M; NaCl; EDTA ph 8-0,5M; SDS e água deionizada) na proporção 2:1, sendo assim, para 300μL do sedimento bacteriano foram adicionados 600μL da solução tamponante e logo após, foram agitados

41 41 vigorosamente por 10 minutos. Foram transferidos 500μL da mistura (mistura do sedimento bacteriano e da solução tamponante) para tubo de 1,5mL. A seguir, foram adicionados ao tubo, 500μL de fenolclorofórmio (1:1), homogeneizando cuidadosamente por 15 segundos. Posteriormente, o tubo foi centrifugado por 20 minutos a g a 4 C. O sobrenadante (400μL) foi transferido para um novo tubo, ao qual foi adicionado isopropanol absoluto (armazenado a -20 C) na proporção 1:1 e o tubo foi mantido a -20 C por horas. Após incubação, o tubo foi centrifugado a g por 10 minutos a 4 C, o sobrenadante foi desprezado e foi adicionado 1 ml de etanol 70% (armazenado a -20 C), procedimento seguido por homogeneização por inversão. Em seguida, o tubo foi submetido a uma nova centrifugação sob as mesmas condições descritas anteriormente. Finalmente, após o sobrenadante ter sido desprezado, todo o líquido remanescente foi desprezado em papel absorvente e o tubo contendo o DNA permaneceu aberto no fluxo até a evaporação total do etanol. Em seguida, foi suspenso em 100μL água ultra-pura e armazenado a -20 C Detecção de genes de virulência A PCR para detecção dos genes de virulência foi realizado com base no mesmo utilizados por (CAMARGO et al., 2006; CAMARGO et al., 2008). Para cada 25 µl de reação foram utilizados: solução tamponante de reação 10X diluída para a concentração final 1X (Tris 20mM e KCl 50mM), 2mM de cloreto de magnésio (MgCl2), 0,625 U de Taq DNA polimerase, 0,2mM de cada um dos quatro nucleotídeos (dntp), 21 pmol dos primers para amplificação dos genes de virulência, 2µL de DNA na concentração de 30 ng/µl e água ultra pura q.s.p. Foram utilizadas as mesmas sequências de nucleotídeos publicados por (CAMARGO et al., 2006; CAMARGO et al., 2008) (Quadro 5).

42 42 Quadro 5 - Conjuntos de iniciadores e condições de ciclagem utilizados nos ensaios de PCR convencional para a detecção de genes de virulência de Enterococcus spp. Genes Primers Sequências de primers acm acm F GGCCAGAAACGTAACCGATA acm R CGCTGGGGAAATCTTGTAAA cyll L F AACTAAGTGTTGAGGAAATG cyll L R AAAGACACAACTACAGTTAC cyl CylLs F AGAACTTGTTGGTCCTTC CylLs R GCTGAAAATAATGCACCTAC CylA F ACAGGTTATGCATCAGATCT CylA R AATTCACTCTTGGAGCAATC esp esp F AGATTTCATCTTTGATTCTTGG esp R AATTGATTCTTTAGCATCTGG gele gele F AATTGCTTTACACGGAACGG gele R GAGCCATGGTTTCTGGTTGT hyl hyl F CGATGCGCAAGAATTAGACA hyl R CATGATTGGACAACCGAGTG pb: pares de bases Tamanhos do amplificados Temperatura de hibridização 353 pb 58 o C 159 pb 48,5 o C 134 pb 50 o C 507 pb 52 o C 500 pb 56 o C 548 pb 60 o C 308 pb 54,4 o C As condições para a PCR foram: 94 C por 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 C por 45 segundos, temperatura de hibridação para cada par de primer por 1 minuto, 72 C por 1 minutos e extensão final a 72 C por minutos. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 1%. Após o término da eletroforese, o gel foi corado no GelRed e observado sob luz ultravioleta com o auxílio do fotodocumentador. As cepas controle para as reações foram: E. faecalis MMH594 (asc10 +, cyllilsabm +, esp +, IPA + ), E. faecalis OG1RF (gele + ), E. faecium TX0016 (hylefm +, acm + ) e E. faecalis JH2-2 (controle negativo de todos os genes de virulência) (CAMARGO et al., 2006; CAMARGO et al., 2008).

43 Tipagem molecular por PFGE A caracterização genética das cepas de VRE foi realizada pela metodologia de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), segundo o protocolo utilizado por Zanella e colaboradores (2003). Uma colônia do crescimento bacteriano em ágar BHI foi semeada em 5mL de caldo Toddy Hewitt e incubada a 37ºC por 18h. Um volume de 1,5mL do crescimento foi centrifugado por 2 minutos a rpm a 11ºC. O sedimento foi lavado com 500 μl de tampão PIV (TRIS 10mM, NaCl 1M, ph 8,0) e centrifugado, descartando o sobrenadante para obter o sedimento. A partir desse sedimento foi preparada uma suspensão bacteriana em 200μL de PIV. Um volume de 150μL desta suspensão foi diluído em 150μL de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5%. Gotas de 20μL foram dispensadas sobre uma placa de vidro recoberta com parafilme, formando discos de agarose contendo as células bacterianas foram formados. Após este período os discos foram, removidos cuidadosamente para um tubo estéril e cônico, utilizando uma alça descartável, contendo 1mL de tampão EC (Tris 6mM, NaCl 1M, EDTA 100mM, Desoxicolato de Sódio 0,2%, N-laurilsarcosina, ph 8). Adicionou-se ao tampão EC, RNAse para uma concentração final de 50 μg/ml e Lisozima para uma concentração final de 100 μg/ml e os discos foram incubados a 37ºC por 4-6h. Após este período de incubação retirou-se o tampão EC e adicionou-se 1mL da solução ES (EDTA, N-laurilsarcosina, ph 9,0) acrescida de Proteinase K para uma concentração final de 1 mg/ml e os discos foram incubados a 50ºC por 18-24h. Após este período, os discos foram lavados três vezes por 30 minutos (cada), com tampão TE (TRIS 10mM, ph 7,5, EDTA 1Mm, ph 8,0) e mantidos em solução tampão TE sob refrigeração. Os discos de agarose contendo DNA bacteriano foram equilibrados com 50 μl de tampão de enzima de restrição (TRIS 6mM, ph 8, KCl 20mM, MgCl2 6mM) por no mínimo 30 minutos a temperatura ambiente. Após a retirada deste tampão, adicionou-se 45 μl do

44 44 mesmo tampão acrescido de 2-mercaptoetanol a 6mM, 10 μl/ml de BSA e enzima de restrição SmaI na concentração final de 0,6 U/μL. Esta reação foi mantida a 25ºC por 4-18h para a digestão do DNA. A separação dos fragmentos de DNA foi realizada pela eletroforese em gel de agarose para PFGE a 1% em tampão TBE 0,5X. O padrão de peso molecular Lambda S340 (New England, Biolabs) foi utilizado para comparação das bandas. A corrida eletroforética foi realizada no sistema CHEF-DR II (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA) e nas seguintes condições: tensão de 200 volts, temperatura de 11ºC, tempo inicial de 5 segundos, tempo final de 35 segundos e tempo de corrida de 24h. Após a corrida, o gel foi corado com GelRel por 30 minutos e fotografado pelo sistema de fotodocumentação do equipamento Gel Doc EQ (Bio- Rad). A análise dos perfis genéticos foi realizada por meio do programa BioNumerics (Version 5.0; Applied Maths NV, Keistraat 120, 9830 Sint-Martens-Latem, Belgium). Para esta análise, foi aplicado o coeficiente de Dice e o método de pareamento das bandas (UPGMA) para gerar os dendrogamas de relações genéticas entre os perfis, comparando-os entre si. Foi utilizada tolerância de 1% e otimização de 0,5% e os tipos de PFGE foram atribuídos com base nos padrões similaridade > 90% conforme WERNER et al. (2007) Caracterização molecular pelo MLST A tipagem por sequenciamento de múltiplos locus (MLST - Multilocus Sequence Typing) em amostras de E. faecium e E. faecalis foi realizada segundo o esquema proposto por HOMAN et al. (2002) e GARBAJOSA et al. (2006). Para a amplificação de cada um desses genes foi preparada uma mistura contendo: 4 L de DNA a uma concentração de 10 ng/ L; 0,5 L de Taq polimerase (Fermentas 0,5U); 5 L do tampão concentrado; 5 L de MgCl2 a 2,5mM; 5 L de dntp (cada um a 200 M); 2 L de

45 45 cada iniciador a 250nM e água deionizada para completar o volume final de 50 L. As reações foram amplificadas no termociclador Veriti Thermal Cycler 6.5 (Applied Biosystems) com as seguintes condições: um ciclo de 5 minutos a 94 C seguido de trinta ciclos de amplificação, cada uma consistindo de 30 segundos a 95 C, 1 minuto a 55 C e 1 minuto a 72 C. A reação foi concluída com um ciclo de 5 minutos a 72 C. O conjunto de iniciadores que foram utilizados encontra-se descrito no Quadros 6 e 7. Quadro 6 - Conjuntos de iniciadores utilizados no ensaio de tipagem por sequenciamento de multilocus de Enterococcus faecalis. Genes Funções Sequências de primers Tamanhos dos produtos gyd-1 gyd-2 Desidrogenase gliceraldeido- 3-fosfato CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC CATTTCGTTGTCATACCAAGC 395 pb psts-1 psts-2 Transportador cassete ligado a ATP fosfato CGGAACAGGACTTTCGC ATTTACATCACGTTCTACTTGC 583 pb gki-1 gki-2 Glicocinase GATTTTGTGGGAATTGGTATGG ACCATTAAAGCAAAATGATCGC 438 pb aroe-1 aroe-2 Chiquimato 5-desidrogenase TGGAAAACTTTACGGAGACAGC GTCCTGTCCATTGTTCAAAAGC 459 pb xpt-1 xpt-2 Xantina fosforibosiltransferase AAAATGATGGCCGTGTATTAGG AACGTCACCGTTCCTTCACTTA 456 pb yiql-1 yiql-2 Acetil-CoA acetiltransferase CAGCTTAAGTCAAGTAAGTGCCG GAATATCCCTTCTGCTTGTGCT 436 pb gdh-1 gdh-2 Glucose-6-phosphate dehydrogenase GGCGCACTAAAAGATATGGT CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA 530 pb

46 46 Quadro 7 - Conjuntos de iniciadores utilizados no ensaio de tipagem por sequenciamento de multilocus de Enterococcus faecium. Genes Funções Sequências de primers adk1 adk2 atpa1 atpa2 ddl1 ddl2 gdh1 gdh2 Adenilato quinase Subunidade alfa ATP sintetase D-alanina-D-alanina Desidrogenase glicose-6- fosfato TATGAACCTCATTTTAATGGG GTTGACTGCCAAACGATTTT CGGTTCATACGGAATGGCACA AAGTTCACGATAAGCCACGG GAGACATTGAATATGCCTTATG AAAAAGAAATCGCACCG GGCGCACTAAAAGATATGGT CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA Tamanhos dos produtos 437 pb 556 pb 465 pb 530 pb gyd1 gyd2 Desidrogenase gliceraldeido- 3-fosfato CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC CATTTCGTTGTCATACCAAGC 395 pb purk1 purk2 Fosforibosil aminoimidazol carboxilase GCAGATTGGCACATTGAAAGT TACATAAATCCCGCCTGTTTC/T 492 pb psts1 psts2 Transportador cassete ligado a ATP fosfato TTGAGCCAAGTCGAAGCTGGAG CGTGATCACGTTCTACTTCC 583 pb Os produtos da PCR foram purificados com a utilização do kit de purificação GE Healthcare, segundo as recomendações do fabricante, e enviados ao Centro de Estudos do Genoma Humano para sequenciamento. Foi utilizado um sistema de análise de DNA de 48 capilares, no ABI 3730 DNA Analyser (Applied Biosystems). As reações de sequenciamento foram feitas usando o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (código ). As sequências genéticas foram analisadas e comparadas com as sequências publicadas na base de dados por meio do programa Bioedit. Para cada cepa foi obtido um conjunto de sete números, um para cada gene estudado, e este conjunto de números, foi representado por um outro número denominado Tipo de Sequência (Sequence Type, ST). Utilizando os programas eburstv3, um diagrama foi construído com base no ST de cada cepa e do banco de dados, para demonstrar a relação entre as cepas e também para separálas em grupos representando complexos clonais, quando existentes.

47 Sequenciamento do DNA genômico utilizando sequenciamento de nova geração O DNA genômico de duas cepas de E. faecium isolados de diferentes fontes pertencentes aos clones (ST412 e ST478) endêmicos no Brasil (PALAZZO et al., 2006; SILVA et al., 2012; MERLO et al., 2015), foram extraídos conforme o item 3.9 e sequenciados na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Para a preparação da biblioteca foi o utilizado um kit para fragmentação enzimática e em seguida para preparação do template foi utilizado o kit OT2 400 bp e este fora submetido no one touch 2. Por fim foi utilizado o Ion PGM 400 Sequencing Kit para o sequenciamento juntamente com um Ion 318 Chip v2. genômico 4.14 Montagem, anotação e depósito do Tn1546 utilizando sequências de DNA Após o sequenciamento, as sequências com qualidade PHRED 20 foram submetidas a uma montagem de novo ou ab initio, utilizando dois montadores SPAdes 3.5 (BANKEVICH et al., 2012) e Mira v4 (CHEVREUX et al., 1999), respectivamente. Os contigs obtidos das duas montagens foram alinhados utilizando o programa Blast (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990) contra o banco de dados de nucleotídeos do NCBI ( Para identificar em quais sequências o transposon Tn1546 estava contido, os resultados do Blast foram filtrados, ou seja, contigs que apresentaram melhor hit contra plasmídeos foram separados e alinhados par a par (pairwise), uns contra os outros, gerando supercontigs.

48 48 Para a montagem das sequências completas dos transposons Tn1546 das duas cepas, foi realizada uma montagem por referência, alinhando os transposons pesquisados com sequência referência do Tn1546 de número de acesso M As sequências finais dos transposons foram anotadas pela ferramenta RAST (Rapid Annotations Subsystem Technology) (AZIZ et al., 2008) e feita uma curadoria manual utilizando o programa Artemis (RUTHERFORD et al., 2000). As regiões contendo repetições invertidas, repetições diretas e duplicações de sítio alvo e sequência de inserção foram identificadas usando o programa ISFinder (SIGUIER et al., 2006). Por fim, as sequências dos transposons foram depositadas no NCBI com os números de acesso KR e KR

49 49 5. RESULTADOS 5.1 Identificação das espécies de Enterococcus spp. e do gene van Das 20 cepas de Enterococcus spp. isoladas de amostras clínicas, de carne de frango e água superficial coletada de rios urbanos em São Paulo, foram identificadas 12 cepas de E. faecium e oito cepas de E. faecalis, todas contendo o gene de resistência aos glicopeptídeos vana (Tabela 1). Tabela 1 Identificação e fonte de isolamento das 20 cepas de enterococos estudadas. N da cepa Ano Origem Estado Amostra Identificação 98A 1997 Hospital 1 SP Líquor E. faecium Hospital 1 SP Sangue E. faecium Hospital 1 SP Swab retal E. faecalis Hospital 1 SP Sangue E. faecalis Frango SC Carne E. faecium Frango RS Carne E. faecalis Frango RS Carne E. faecalis Frango ES Carne E. faecalis Frango SP Carne E. faecium Frango SP Carne E. faecalis Hospital 2 SP Sangue E. faecium Hospital 3 SP Urina E. faecium Hospital 3 SP Swab retal E. faecalis Hospital 3 SP Swab retal E. faecium Rio Tietê (TIET 4180) SP Água E. faecium Rio Tietê (TIET 4200) SP Água E. faecalis Rio Tietê (TIES 4900) SP Água E. faecium Rio Tietê (TIES 4900) SP Água E. faecium Rio Pinheiro (PINH 4250) SP Água E. faecium Rio Pinheiro (PINH 4900) SP Água E. faecium Legenda: Número (N ); Rio Tietê localizado na Ponte dos Remédios, na Avenida Marginal, São Paulo (TIET 4200); Rio Tietê no Reservatório Edgard de Souza, Santana do Parnaíba (TIES 4900); Rio Pinheiro na Ponte do Socorro, São Paulo (PINH 4250); Rio Pinheiro próximo à sua Foz no Rio Tietê, na estrutura de Retiro, São

50 50 Paulo (PINH 4900); Rio Tietê na Ponte das Bandeiras, na Avenida Santos Dumont, São Paulo (TIET 4180); Rio Grande do Sul (RS); Espírito Santo (ES); São Paulo (SP) e Santa Catarina (SC). As figuras dos géis de agarose demonstrando a amplificação dos genes que codificam a ligase D-alanina D-alanina (ddl) utilizada na confirmação das espécies E. faecalis e E. faecium e do gene vana de algumas amostras representativas encontra-se nos Anexos 1 e 2, respectivamente. 5.2 Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos A Tabela 2 mostra a concentração inibitória mínima das cepas de VRE testadas com 13 antimicrobianos utilizados no seu monitoramento. As cepas de E. faecalis e E. faecium resistentes aos glicopeptídeos mostraram um perfil de multirresistência. As cepas clínicas apresentaram resistência aos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), quinolonas (ciprofloxacina), macrolídeos (eritromicina); as isoladas dos rios foram resistentes aos glicopeptídeos, penicilinas (ampicilina), quinolonas (ciprofloxacina), macrolídeos (eritromicina) e as de alimentos, além dos glicopeptídeos foram resistentes a tetraciclina e as estreptograminas (quinupristina/dalfopristina). Os isolados foram resistentes a no mínimo cinco e no máximo nove antimicrobianos diferentes. As drogas mais eficazes contra o E. faecalis e E. faecium foram linezolida, daptomicina e tigeciclina. Foi detectada resistência intermediária a linezolida na cepa E. faecium 28 isolada do rio Tietê.

51 51 Tabela 2 - Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de E. faecalis e E. faecium vana isolados da clínica, ambiente e alimento. HLAR b Perfil de resistência CIM (ug/ml) c Cepa N a Origem GEN EST VAC TEI AMP TET CIP ERI CLO LIN Q/D DAP TIG E. faecium 98A Clínica R S >64 >32 >32 >64 >64 > ,5 0, R S >64 >32 >32 1 >64 > ,5 0,12 57 S R >64 >32 >32 1 >64 > , S R >64 >32 >32 1 >64 > ,01 09 S S >64 >32 >32 >64 32 > ,06 E. faecalis 470 R S >64 > >64 >64 > ,5 0,06 82 R S >64 >32 2 >64 >64 >256 > , R R >64 > > ,5 0,25 E. faecium 38 Rios urbanos S R >64 >32 >32 1 >32 >256 > ,03 9 S R >64 >32 >32 0,5 >32 > ,03 11 S R >64 >32 >32 0,5 >32 > ,06 28 S R >64 32 >32 1 >32 > ,03 21 S S >64 32 >32 >64 4 > ,03 E. faecalis 29 S R >64 >32 >32 1 >32 > ,06 E. faecium 55 Alimento S R > ,25 >64 4 0, >32 2 0, S S 64 >64 1 >64 0, ,06 E. faecalis 96 R R 64 > >64 > , R R , S R ,5 0, ,5 0,12 92 R R 64 >32 2 >64 >64 > >32 2 0,03 Legenda: a Número da cepa. b Alto nível de resistência aos aminoglicosídeos (HLAR) foi determinada pelo método de diluição em ágar. Gentamicina (GEN) e estreptomicina (EST). c A concentração inibitória mínima (CIM) foram determinadas pela técnica de microdiluição em caldo. O negrito

52 52 indica a resistência e o sombreamento cinza, o intermediário. Vancomicina (VAN), teicoplanina (TEI), ampicilina (AMP), tetraciclina (TET), ciprofloxacina (CIP), eritromicina (ERI), cloranfenicol (CLO), linezolida (LIN), quinopristina/dalfopristina (Q/D), daptomicina (DAP) e tigeciclina (TIG). O CLSI (2013) foi usado para interpretar os resultados de CIM, exceto para a tigeciclina, que foi utilizado o EUCAST (2014) 5.3 Detecção dos genes de virulência A Tabela 3 mostra a presença dos principais genes de virulência de E. faecalis e E. faecium entre as diferentes fontes de isolamento. Todas as espécies de E. faecium apresentaram o gene acm (adesina de colágeno) (Anexo 3). Os genes de virulência entre E. faecium isolados da clínica e do ambiente foram mais frequentemente detectados do que nos do alimento com destaque para acm, esp (proteína de superfície enterocócica). Todas as cepas de E. faecalis apresentaram o gene que codifica a gelatinase (gele). Os genes codificadores da citolisinahemolisina (cylll, cylls e cyla) foram detectados apenas na cepa E. faecalis 29 isolada do Rio Tietê.

53 53 Tabela 3 Distribuição dos principais genes de virulência entre as cepas estudadas. Cepa N a Origem Genes de virulência b E. faecium 98A Clínica acm, esp 378 acm, esp 57 acm, esp 320 acm, esp, hylefm 09 acm, esp, hylefm E. faecium 38 Rios urbanos acm, esp, hylefm 9 acm, esp, hylefm 11 acm, esp, hylefm 28 acm, esp, 21 acm, esp, E. faecium 55 Alimento acm 402 acm, esp E. faecalis 470 Clínica gele, esp 82 gele, esp 106 gele E. faecalis 29 Rios urbanos gele, esp, cylll, cylls, cyla E. faecalis 96 Alimento gele 154 gele 438 gele 92 gele Legenda: a Número da cepa. b Genes de virulência: acm (adesina de colágeno), esp (proteína de superfície enterocócica), hylefm (hialuronidase), gele (gelatinase) e citolisina-hemolisina (cylll, cylls, cyla). 5.4 Determinação da similaridade genômica por PFGE Os dados obtidos pelo PFGE foram analisados utilizando dendrogramas, que incluíram pulsotipos obtidos a partir de cepas de E. faecalis e E. faecium (Figuras 5A e B). As cepas de E. faecalis 470 e 82 foram pertencentes ao mesmo cluster A com similaridade maior do que 90%, enquanto que as demais isoladas de diferentes fontes apresentaram não relacionadas clonalmente. As cepas de E. faecium 11, 28 e 320 isoladas dos Rios Tietê e Pinheiros e do Hospital 2, respectivamente, foram indistinguíveis pelo PFGE e classificados como pertencentes ao cluster H. Além disso, três E. faecium isolados de dois pontos distintos do Rio Tietê e do Hospital 1 (38, 9 e 378, respectivamente) apresentaram o mesmo pulsotipo K.

54 54 A) E. faecalis % de similaridade/clusters Perfil de PFGE Cepas Origem Pulsotipo A 470 Hospital 1 A 82 Hospital 1 A 92 Frango B 29 Rio Tietê C 106 Hospital 3 D 96 Frango (RS) E 154 Frango (ES) F 438 Frango (SP) G B) E. faecium % de similaridade/clusters Perfil de PFGE Cepas Origem Pulsotipo H K 11 Rio Tietê H 28 Rio Pinheiros H 320 Hospital 2 H 57 Hospital 3 I 21 Rio Pinheiros J 38 Rio Tietê K 9 Rio Tietê K 378 Hospital 1 K 09 Hospital 3 L 402 Frango (SP) M 55 Frango (SC) N 98A Hospital 1 O Figura 5 - Dendrogramas mostrando a similaridade genética dos pulsotipos dos 20 VRE.

55 Linhagens clonais identificadas por MLST Os Anexos 4 e 5 mostram a amplificação dos fragmentos internos de sete genes housekeeping do E. faecalis 470 e E. faecium 11, respectivamente, que foram purificados e sequenciados. As linhagens clonais dos 12 E. faecium apresentaram oito STs diferentes (ST114, ST203, ST412, ST478, ST858, ST896, ST953 e ST954) e oito E. faecalis foram distribuídos em sete STs diferentes (ST4, ST6, ST9, ST59, ST614, ST615 e ST616) (Tabelas 4 e 5). Dentre as cepas caracterizadas, cinco novos STs foram identificados nos isolados de frango (E. faecium ST953 e ST954, e E. faecalis ST614, ST615 e ST616) e um novo ST858 isolado da clínica, sendo registrados no banco de dados do MLST ( Os ST953 e ST954 foram detectados devido à presença de alelos novos para os genes atpa, gdh e gyd, identificados como 77, 67 e 44, respectivamente. Os demais STs apresentaram os seguintes alelos: ST614 psts = 75; ST615 xpt = 67; ST616 gki = 78 e aroe = 81, reportados pela primeira vez neste estudo. O ST858 apresentou uma nova combinação de alelos (atpa = 45, ddl = 43, gdh = 22, purk = 44, gyd = 16, psts = 20, adk = 18) (Tabelas 4 e 5). Entre as cepas de E. faecium, o ST478 foi o mais frequente (quatro isolados - um da clínica e três do ambiente) e apresentou-se estreitamente relacionado com os ST412 e ST896, compartilhando todos os alelos, com exceção do gene ddl. Além disso, ST478 partilhou com todos os genes alelos do ST203, exceto para os genes ddl e purk (Tabela 4). O ST478 é SLV (do inglês, single-locus variant) do ST412 e DLV (do inglês, double-locus variant) dos ST896 e ST203, todos pertencentes ao CC17. As cepas de E. faecium também apresentaram os ST953 e ST954, que não possuem complexo clonal atribuído, e os ST114 e ST858, que foram denominados singletons (Figura 6). O clustering dos oitos STs de E. faecalis pelo eburst revelou a presença do CC9 (ST9), CC2 (ST6), CC4 (ST4), CC21 (ST615), CC59 (ST59), ST614 (sem complexo clonal atribuído) e o ST616 (singleton) (Figura 7).

56 56 Tabela 4 Perfis de MLST de E. faecium vana isolados de humanos, ambientes e alimentos. Cepa Ano Origem Perfil alélico MLST atpa ddl gdh purk gyd psts adk ST CC E. faecium 98A 1997 Clínica S S S Rios urbanos Alimento N N Legenda: CC: complexo clonal; ST: Sequence type; S: singleton Tabela 5 Perfis de MLST de E. faecalis vana isolados de humanos, ambientes e alimentos. Perfil alélico MLST Cepa Ano Origem gdh gyd psts gki aroe xpt yqil ST CC E. faecalis Hospitalar Rios urbanos Alimento S N Legenda: CC: Complexo clonal; ST: Sequence type; S: singleton

57 CC Figura 6 - Diagrama e-burst mostrando todos os STs de E. faecium do banco de dados do MLST. Fundador Subgrupo fundador Todos os outros STs Todos os STs de E. faecium identificados

58 CC2 615 CC21 CC CC4 CC Figura 7 - Diagrama e-burst mostrando todos os STs de E. faecalis do banco de dados do MLST. Fundador Subgrupo fundador Todos os outros STs Todos os STs de E. faecalis identificados

59 59 As Tabelas 6 e 7 mostram a distribuição dos tipos de PFGE e MLST e os principais genes de virulência em cepas de E. faecalis e E. faecium de diferentes fontes de isolamento no Brasil durante os anos de 1997 a Os padrões de PFGE foram concordantes com os resultados de MLST para os oitos isolados de E. faecalis. A maioria dos E. faecalis isolados das três diferentes fontes apresentou diferentes pulsotipos e STs, com exceção dos E. faecalis 470 e 82 isolados da clínica que foram identificados com o mesmo pulsotipo (A), tipo de sequência (ST9), complexo clonal (CC9) e perfil de virulência (gele +, esp + ). Dentre as cepas de E. faecium isolados da clínica e dos rios, a maioria apresentou clones geneticamente relacionados, pertencentes ao CC17 e perfil de virulência (acm +, esp + ).

60 Tabela 6 Distribuição dos tipos de PFGE e MLST, e genes de virulência em isolados de E. faecalis de diferentes fontes no Brasil ( ). 60 Epidemiologia Nº cepa Fonte Amostra Ano Estado Pulsotipos ST CC Virulência Clínica 470 Hospital Swab retal 1998 SP A 9 9 gele +, esp + 82 Sangue 2000 SP A 9 9 gele +, esp Swab retal 2010 SP D 6 2 gele + Rio 29 Tietê Água 2011 SP C 4 4 gele +, esp +, cyll + Alimento 92 Frango Carne 2004 RS B 614 N gele + 96 Carne 2004 RS E gele Carne 2005 ES F gele Carne 2005 SP G 616 S gele + Tabela 7 - Distribuição dos tipos de PFGE e MLST e genes de virulência em isolados de E. faecium de diferentes fontes no Brasil ( ). Epidemiologia Nº cepa Fonte Amostra Ano Estado Pulsotipos ST CC Virulência Clínica 98A Hospital Líquor 1997 SP O 114 S acm +, esp Sangue 1998 SP K 114 S acm +, esp Sangue 2007 SP H acm +, esp +, hylefm + 57 Urina 2008 SP I 858 S acm +, esp + 09 Swab retal 2011 SP L acm +, esp +, hylefm + Rios 38 Tietê Água 2011 SP K acm +, esp +, hylefm + 9 Água 2011 SP K acm +, esp +, hylefm + 11 Água 2011 SP H acm +, esp +, hylefm + 28 Pinheiros Água 2011 SP H acm +, esp + 21 Água 2011 SP J acm +, esp + Alimento 55 Frango Carne 2004 SC N 953 N acm Carne 2005 SP M 954 N acm +, esp +

61 Análise do ambiente genético dos Transposons Tn1546 As sequências completas dos dois transposons Tn1546 de: (E. faecium 320, ST478 isolados da clínica) e (E. faecium 11, ST412 isolado do rio) foram depositados no DDBJ/ENA/GenBank com os números de acesso KR e KR047792, respectivamente. A análise das sequencias dos dois Tn1546 mostrou que eles têm cerca de pb, com dois pontos de mutação: a) gene vana na posição (substituição do nucleotídeo T pelo C); e b) gene vanx na posição (G pelo T). Foi detectada uma deleção de 868 pares de bases na extremidade esquerda do transposon, uma IS1251 inserida entre os genes vans e vanh e uma IS1216E entre os genes vanx e vany. Os transposons foram comparados com o protótipo Tn1546, um transposon de pb (GenBank número de acesso M97297) do Enterococcus faecium BM4147 (Figura 8). Figura 8 - Representação esquemática do protótipo Tn1546 (acima), as deleções, mutações pontuais e as sequencias de inserções identificadas no Tn1546 de E. faecium isoladas da clínica e do rio em comparação com o protótipo (abaixo).

62 62 6. DISCUSSÃO Devido à resistência dos enterococos aos antibióticos da classe dos aminoglicosídeos e β-lactâmicos, a vancomicina foi considerada como um dos últimos recursos terapêuticos para tratar infecções enterocócicas. No entanto, no final da década de 1980 na Europa e de 90 no Brasil foram identificadas as primeiras cepas de VRE (LECLERCQ et al., 1988; ZANELLA et al., 1999). Desde então, os VRE tornaram-se endêmicos em vários hospitais brasileiros e no mundo, principalmente pelos E. faecium (PALAZZO et al., 2011; CATTOIR & LECLERCQ, 2013), embora essas bactérias também possam causar infecções humanas na comunidade (TEIXEIRA et al., 2007). Dada a sua característica ubíqua, os enterococos podem sobreviver em vários ambientes, principalmente na água. Nos humanos e aves, essas bactérias são encontradas principalmente no trato gastrointestinal como comensais, mas podem se tornar sérios patógenos oportunistas. A sua transmissão em humanos pode ocorrer de forma endógena ou exógena, sendo que esta última, pode se dá, principalmente, por meio do consumo de alimentos e água contaminada, podendo se tornar uma via comum de transmissão, especialmente nos países em desenvolvimento (DEVRIESE et al., 1987; IVERSEN et al., 2004; CASTILLO-ROJAS et al., 2013) A região metropolitana da cidade de São Paulo é uma área crítica do ponto de vista ambiental, bem como devido à disponibilidade de água limpa nessa região. Os Rios Tietê e Pinheiros cruzam o Estado de São Paulo e apresentam diversos reservatórios ao longo de seus cursos (Figura 4). Esses reservatórios são intensamente utilizados para o fornecimento de água potável, como fonte para irrigação agrícola e como locais de recreação da população (ROCHA et al., 2009; SUARES ROCHA et al., 2010). Com isso, o isolamento e identificação de cepas de VRE em cinco dos oito pontos de coleta desses rios urbanos no atual estudo, coloca-os como

63 63 potenciais fontes de colonização e/ou infecção humana, assim como para outros animais pertencentes a esse ecossistema. Outros estudos também têm identificados Enterococcus spp. multirresistentes em águas superficiais de rios e baías na Europa, América do Norte e Central, sugerindo grande risco à população (GRAMMENOU et al., 2006; ZDRAGAS et al., 2008; VARELA et al., 2013; CASTILLO-ROJAS et al., 2013; BESSA et al., 2014). Os animais, especialmente o frango de corte, têm sido consistentemente relatados como um dos reservatórios de VRE, uma vez que o isolamento de bactérias que têm características genéticas de resistência semelhantes às cepas encontradas em humanos tem sido reportado (STOBBERINGH et al., 1999; TEUBER, 2001; VAN DEN BOGAARD et al., 2002; LEAVIS et al., 2006; VIGNAROLI et al., 2011). Esses estudos têm aumentado a hipótese de que os animais, de fato, desempenham um papel fundamental na transmissão e dispersão de VRE para a comunidade. Diante disso, este estudo identificou e caracterizou, fenotipicamente e genotipicamente, seis cepas de VRE isolados de carnes de frangos comercializados em mercados brasileiros (SACRAMENTO et al., 2015a), objetivando estabelecer sua relação com isolados clínicos e ambientais no Brasil. Haja vista, a capacidade dos enterococos de se adaptar a vários ambientes e de adquirir vários determinantes de resistência a antibióticos, e aliada ao aumento da sua prevalência e de sua disseminação de multirresistência em todo o mundo, resultou na redução de drogas efetivas contra essas bactérias (ARIAS et al., 2010). No presente estudo, a avaliação do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos mostrou resistência a três ou mais classes de antimicrobianos e a detecção do gene de resistência à vancomicina das cepas de E. faecium e E. faecalis confirmou a presença do gene vana. Além dos altos níveis resistência aos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), as cepas isoladas de carne de frango foram resistentes a tetraciclina e as estreptograminas (quinupristina/dalfopristina). A origem de Enterococcus spp. contendo vana pode ser justificada pelo uso maciço de macrolídeos (tilosina e espiramicina) em frangos de corte, que são utilizados para o controle de doenças respiratórias crônicas

64 64 causadas por micoplasmas e como agentes não terapêuticos para melhorar as taxas de crescimento e eficiência alimentar. Sugere-se que, o uso desses antimicrobianos poderia coselecionar a resistência à vancomicina entre os enterococos, uma vez que os genes que codificam resistência a essas drogas têm sido localizados no mesmo plasmídeo (AARESTRUP, 2000; NILSSON, 2012). No Brasil, o uso indiscriminado de antibióticos tem atingido áreas além da clínica humana e veterinária, tais como agronegócio e aquicultura (TEOPHILO et al., 2002; PAVEZ et al., 2009; CASELLA et al., 2015), culminando na emergência de bactérias resistentes amplamente disseminadas na comunidade e nos hospitais brasileiros, assim como, no estabelecimento de novos mecanismos de resistência, tendo o ambiente como uma possível fonte de disseminação (LINCOPAN et al., 2009; PAVEZ et al., 2009; DE ALMEIDA et al., 2014). Os Rios Tietê e Pinheiros representam um dos principais recursos hídricos para as atividades humanas no Estado de São Paulo e constituem o habitat de diversos ecossistemas. Dessa forma, fica evidente que a principal via pela qual os antimicrobianos de uso humano e veterinário atingem as águas superficiais é mediante o esgoto proveniente das descargas de efluentes (ALEXY et al., 2006; KÜMMERER, 2009) ou diretamente pelos resíduos de produção (HIRSCH et al., 1999). De fato, um estudo conduzido por LOCATELLI e colaboradores 2010 sobre a presença de antibióticos no rio Atibaia localizado no estado de São Paulo detectou uma frequência maior do que 50% de ciprofloxacina, cefalexina, norfloxacina, trimetoprim, amoxicilina, ampicilina e sulfametoxazol em suas águas superficiais. Sendo então, os Rios Tietê e Pinheiros suscetíveis a receber grandes cargas de antimicrobianos e compostos análogos, o atual estudo isolou e identificou cepas de E. faecalis e E. faecium com altos níveis de resistência aos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), quinolonas (ciprofloxacina), macrolídeos (eritromicina) e penicilinas (ampicilina) em ambos os rios (SACRAMENTO et al., 2015a). Algumas cepas também apresentaram altos níveis de

65 65 resistência aos aminoglicosídeos (estreptomicina), tetraciclina, fenicóis (cloranfenicol), oxazolidinonas (linezolida) e estreptograminas (quinupristina/dalfopristina), semelhantes aos encontrados em alguns isolados da clínica. Neste estudo, sugere-se que ambos os rios são um hotspot de disseminação de genes e bactérias resistentes a antibióticos no ambiente. Antibióticos mais recentes, como a linezolida, daptomicina e tigeciclina tiveram uma boa atividade in vitro contra isolados de enterococos da clínica, ambiente e alimentos, embora outros estudos reportem que a sua utilização pode ser limitada em determinados cenários clínicos e também, pelo aparecimento de resistência (ARIAS et al., 2007; ARIAS et al., 2010; DE ALMEIDA et al., 2014). O agente experimental oritavancina vem emergindo como uma nova alternativa para o tratamento de VRE, mas ainda carecem de ensaios clínicos. Assim, as terapias mais adequadas para o tratamento de infecções por enterococos multirresistentes continuam a se basear em observações empíricas e em resultados de estudos in vitro e em animais. Estudos clínicos avaliando novas estratégias, incluindo a combinação de terapias para tratar grave infecções por E. faecium resistente à vancomicina se fazem necessários (ARIAS et al., 2010). Além da notoriedade de que os membros desse gênero têm em relação à resistência aos antibióticos, os enterococos possuem fatores de virulência que estão associados com a gravidade e duração de infecções causadas em humanos. Muitos fatores de virulência são responsáveis, por exemplo: i) pela capacidade de colonizar o trato gastrointestinal, que é o habitat normal; ii) capacidade de aderir a diversas proteínas da matriz extracelular; e iii) capacidade de aderir aos epitélios do trato urinário e da cavidade oral, e às células de rim de embrião humano (FISHER & PHILLIPS, 2009). No entanto, é provável que essas características estejam envolvidas na disseminação desses microrganismos em ambiente hospitalar, causando principalmente infecções urinárias e bacteremias. A ocorrência de marcadores moleculares de virulência foi extensivamente estudada entre enterococos da clínica (ARIAS & MURRAY, 2012), quando comparados com enterococos recuperados de alimentos

66 66 e ambientes aquáticos (SANTIAGO-RODRIGUEZ, 2013; CAMARGO et al., 2014). No presente estudo, os genes acm e esp estiveram presentes em todas as cepas de E. faecium isolados da clínica e dos rios. Estes genes são conhecidos por contribuir para a colonização do tecido do hospedeiro e para a formação de biofilme, respectivamente (ARIAS & MURRAY, 2012). Estudos sobre VRE no Brasil têm detectado o predomínio dos genes acm e esp em espécies de E. faecium (CAMARGO et al., 2006; MERLO et al., 2015). Em estudos conduzidos no Brasil e nos EUA, o gene hylefm foi raro entre isolados de E. faecium vana, sendo encontrado em apenas 17% (CAMARGO et al., 2006) e em 33% (RICE et al., 2003), respectivamente. Estudos reportam a relação desse gene como um dos mediadores do aumento da virulência de megaplasmídeos de cepas de E. faecium com maior capacidade de colonizar o trato gastrointestinal de camundongos (RICE et al., 2009; FREITAS et al., 2010). No atual estudo, o gene gele (protease gelatinase) foi detectado apenas nas cepas de E. faecalis, corroborando com achados de outros estudos (DUPRE et al., 2003; CAMARGO et al., 2006). Sugere-se que o gele media virulência por meio de mecanismos, tais como, a degradação de tecidos do hospedeiro, modulação da resposta imune do hospedeiro e formação de biofilme (PARK et al., 2008; THOMAS et al., 2009). A citolisina-hemolisina (cyl) é uma toxina produzida por aproximadamente 30% das cepas de E. faecalis, que pode lisar as células vermelhas e brancas do sangue de humanos (ARIAS & MURRAY, 2012). Isolados de E. faecalis que expressam cyl são mais virulentas em vários modelos animais do que cepas sem este gene (IKE et al., 1984). Esse gene foi detectado em apenas uma cepa E. faecalis isolada do Rio Tietê. Um estudo realizado na Malásia detectou predominantemente o gene cyl em enterococos isolados de rios (AHMAD et al., 2014). O atual estudo identificou importantes genes de virulência de cepas de enterococos isolados de diferentes fontes. No entanto, novos estudos pesquisando outros genes de virulência e suas expressões se fazem necessários para melhor compreensão da virulência destes patógenos em ambientes ecológicos distintos.

67 67 A tipagem eficaz de microrganismos é um pré-requisito para se estabelecer vínculos epidemiológicos ou filogenéticos entre isolados correspondentes. Diversos métodos têm sido aplicados com sucesso para tipar e diferenciar cepas bacterianas e grupos clonais (WITTE et al., 2006). No presente estudo, as cepas de E. faecalis foram clonalmente não relacionadas pelo PFGE quando comparadas com as diferentes fontes de isolamento, enquanto que cepas de E. faecium isoladas da clínica e do ambiente apresentaram clones idênticos. Um estudo realizado na Grécia identificou cepas de E. faecium isoladas de água potável e para fins recreativos que apresentaram-se clonalmente relacionadas pelo PFGE com Enterococcus spp de origem hospitalar, sugerindo uma possível origem comum (GRAMMENOU et al., 2006). A análise de MLST do presente estudo confirmou a disseminação ambiental do clone multirresistente de alto risco de E. faecium vana CC17 (ST478, ST412 e ST203), que em estudos prévios foram predominantes em amostras clínicas do Sudeste do Brasil (PALAZZO et al., 2011; SILVA et al., 2012; MERLO et al, 2015). De acordo com a análise do eburst, os ST478, ST412 e ST203 mostraram-se TLV (triple-locus variants), DLV (double-locus variants) e SLV (single-locus variant) do ST78, respectivamente. Estes STs podem ser descendentes diretos ou ter evoluído de um ancestral comum que está intimamente ligado ao ST78. De acordo com a literatura e informações depositadas no banco de dados do MLST de E. faecium, vários países da Europa, Ásia e América já identificaram enterococos com ST78 em pacientes hospitalizados (KO et al., 2005; QU et al., 2007; WERNER et al., 2008, 2011; HSIEH et al., 2010; KHAN et al., 2010; FALLICO et al., 2011; SILVA et al, 2012). A detecção de cepas de E. faecium vana pertencentes ao CC17 em rios urbanos é uma evidência epidemiológica que demonstra que a disseminação ambiental de bactérias multirresistentes de alto risco está em curso no Brasil. Digno de nota, o isolamento de Pseudomonas aeruginosa co-produção de metalo-β-lactamase SPM-1 e 16S rrna metilase RmtD1 e KPC-2 produtoras de Klebsiella pneumoniae em ambos os rios Tietê e Pinheiros também foi reportado (FONTES et al., 2011, OLIVEIRA et al., 2013). Com isso, há que se

68 68 considerar, que os rios urbanos do Brasil podem representar uma potencial fonte de colonização e/ou infecção humana. Por fim, considerando que o E. faecium CC17 vana é comum em hospitalares do estado de São Paulo (CAMARGO et al., 2006; PALAZZO et al., 2011; SILVA et al., 2012), especulações sobre uma possível ligação entre infecções nosocomiais e ambientais poderiam ser levantadas, o que demonstra o potencial de VRE vana de se espalhar para outros sítios, além do hospitalar. A vigilância da resistência em amostras ambientais de regiões urbanas precisa ser estabelecida como uma prioridade, e as estratégias para o tratamento de águas residuais precisam ser adotadas, a fim de inibir a liberação de bactérias multirresistentes de alto risco para o meio ambiente. As cepas isoladas de carne frango revelou a presença de E. faecalis vana ST59 (CC59) e de cinco novos STs (E. faecalis vana ST614, ST615 e ST616 e E. faecium vana ST953 e ST954). A este respeito, de particular interesse é a descrição de E. faecalis pertencentes ao ST59, que tem sido previamente isoladas de carne de frango e amostras humanas (QUIÑONES et al., FREITAS et al., 2009; OLSEN et al., 2012). Ainda, a análise eburst revelou o ST615 como pertencente ao CC21, um complexo clonal bastante documentado em isolados clínicos, de animais e alimentos (JAMET et al., 2012; NOVAIS et al., 2013 CHOWDHURY et al., 2014), o que denota o potencial dos VRE ou dos genes vana de enterococos para alcançar os seres humanos através da cadeia alimentar (CETINKAYA et al., 2000; GOUSIA et al., 2015). Por outro lado, a identificação de novos STs, neste estudo, sugere que o frango comercial pode ser uma fonte para a transferência de resistência mediada por vana entre enterococos comensais, o que é uma perspectiva preocupante, uma vez que VRE de origem comensais podem desempenhar um importante papel como patógenos oportunistas em humanos e em outros animais, que podem atuar como hospedeiros (SACRAMENTO et al., 2015b). Em um estudo realizado por LEBRETON e colaboradores (2013) foram sequenciados os genomas de 51 enterococos isolados de diferentes ambientes ecológicos localizados em cinco continentes ao longo dos últimos 60 anos, a fim de compreender como os E. faecium emergiram

69 69 como um importante patógeno hospitalar. Por meio de reconstrução filogenômica, os pesquisadores desse estudo sugerem que a linhagem epidêmica adaptada ao hospital está evoluindo rapidamente, e que surgiu há aproximadamente 75 anos, concomitantemente com a introdução de antibióticos, a partir de uma população que incluiu a maioria das cepas de origem animal, e não de comensais humanos. Além disso, foi observado que a linhagem que incluiu a maioria das cepas de origem animal divergiu da principal linhagem comensal humana de cerca de anos atrás, possivelmente devido à crescente urbanização dos seres humanos, desenvolvimento práticas de higiene e domesticação de animais. Cada bifurcação foi acompanhada da aquisição de novas capacidades metabólicas, traços de colonização em elementos móveis, e perda de função e remodelação do genoma associada à inserção de elemento móvel (LEBRETON et al., 2013). No atual estudo, entre os isolados de E. faecium da clínica foi identificado um novo ST denominado ST858, além do ST114, previamente reportado por Camargo e colaboradores (2006) em surto ocorrido em hospital de São Paulo. Além do ST114, os ST478 e ST896 já reportados no Brasil e nos EUA, respectivamente, também foram identificados (PALAZZO et al., 2011; SILVA et al., 2012; WANG et al., 2014). A capacidade de distinguir com precisão diferentes cepas dentro de uma espécie bacteriana é um requisito fundamental para estudos de vigilância epidemiológica e microevolutivo. A grande diversidade genética presente em muitas espécies bacterianas tem originado vários métodos de tipagem que variam em sua reprodutibilidade e poder discriminatório (COOPER & FEIL, 2004). No presente estudo, a comparação das duas técnicas de tipagem molecular mostrou que os padrões de PFGE foram concordantes com os resultados de MLST nos isolados de E. faecalis, enquanto que algumas cepas de E. faecium apresentaram perfis de PFGE diferentes com MLST iguais ou virce e versa (Tabela 6). Comparações são frequentemente feitas entre os resultados de MLST e PFGE. Muitos estudos revelam níveis semelhantes de discriminação entre essas técnicas (PEACOCK et al., 2002;

70 70 NALLAPAREDDY et al., 2002; JOHNSON et al., 2003; GODOY et al., 2003). No entanto, em outros estudos, verificou-se que o MLST foi mais discriminatório (KOTETISHVILI et al., 2002, 2003; REVAZISHVILI et al., 2004), enquanto NOLLER e colaboradores (2003) demonstrou que o MLST não fez distinção entre cepas de Escherichia coli O157: H7, as quais foram diferenciadas pelo PFGE. Embora tais comparações possam proporcionar um indicador útil para epidemiologistas que monitoram a propagação de clones específicos, o poder desses métodos, em geral, dependerá dos detalhes dos protocolos (por exemplo, enzimas de restrição utilizadas no PFGE ou local do gene pesquisado no MLST). Além disso, ao passo que o MLST examina diretamente a diversidade de sequências de nucleotídeos, não detecta rearranjos genômicos em larga escala, enquanto que o PFGE é mais sensível a este último tipo de variação e assim, será, por conseguinte, mais discriminatório em espécies com muitas ilhas genômicas, sequências de inserção ou outros elementos móveis. Uma segunda vantagem do PFGE, referese à possibilidade de ser prontamente realizado na ausência de informação detalhada sobre o genoma bacteriano (COOPER et al., 2004). O valor do MLST, como originalmente concebido, está na criação de uma estrutura abrangente de populações bacterianas com base em múltiplos genes estáveis. Para as espécies contendo uma considerável diversidade, esse método tem grande valia, tanto para a tipagem de rotina quanto para análises evolutivas. Uma vez que os custos das reações de sequenciamento vêm diminuindo nos últimos anos, estudos incluindo mais locus altamente variável tendem a serem conduzidos, facilitando assim, a subtipagem de alta resolução de clones específicos e a reconstrução de vias da evolutivas mais robusta (COOPER et al., 2004). Um ponto crítico para ambos os métodos citados é a sua aplicabilidade para responder questões distintas que variam desde a investigação de surtos estabelecendo amplo parentesco genético, até a organização de cepas dentro dos principais complexos clonais. Cada método tem seus respectivos pontos fortes e fracos de acordo com a pergunta abordada e a metodologia por

71 71 trás (MAIDEN et al., 1998; ENRIGHT & SPRATT, 1999; URWIN & MAIDEN, 2003; BENNETT & CAFFERKEY, 2003). O Tn1546, um transposon do cluster vana presente no plasmídeo pip816 do E. faecium BM4147, foi primeiramente reportado em 1993 (ARTHUR et al., 1993). Desde então, esse transposon tornou-se cada vez mais diversificado devido a mutações pontuais, a introdução de sequências de inserção (IS) e a deleções de genes nas extremidades esquerda e/ou direita do Tn1546 (HANDWERGER et al., 1995; WILLEMS et al., 1999; KO et al., 2005; NAAS et al., 2005; GU et al., 2009; CHA et al., 2012; MERLO et al., 2015). No presente estudo, tipos idênticos de Tn1546 foram encontrados em isolados de humano (ST478) e de ambiente aquático (ST412), caracterizados como clones endêmicos no Brasil (SACRAMENTO et al., 2015a). Foi identificado um ponto de mutação no gene vana na posição (substituição do nucleotídeo T pelo C) e um outro no gene vanx na posição (G pelo T). A presença dessas mutações já foram reportadas no Brasil, EUA e Espanha (WILLEMS et al., 1999; CAMARGO et al., 2004; LÓPEZ et al., 2010). Ainda, nos dois transposons sequenciados no presente estudo, foram detectadas uma IS1251 inserida entre os genes vans e vanh, uma IS1216E entre os vanx e vany e uma deleção na sua extremidade esquerda, sem apresentar alteração no fenótipo de resistência aos glicopeptídeos. A IS1251 foi detectada na mesma região intergênica, especialmente nos elementos VanA de cepas isoladas nos Estados Unidos (HANDWERGER et al., 1995; DE LENCASTRE et al., 1999), como também em raros isolados da Irlanda, Noruega, Grécia e Costa Rica (SIMONSEN et al., 2000; DEMERTZI et al., 2001; BUSTAMANTE et al., 2003). No Brasil, essa IS foi reportada pela primeira vez em 2004 em um elemento VanA de VRE, isolado de um paciente previamente tratado nos EUA, sugerindo que este VRE foi introduzido a partir do estrangeiro, provavelmente através da disseminação inter-hospitalar (CAMARGO et al., 2004). Essa IS também foi detectada durante um surto ocorrido em 2007 em um hospital universitário de Campinas, seguido por detecções em hospitais de Ribeirão Preto e Belo Horizonte

72 72 (PALAZZO et al., 2011; SILVA et al., 2012; MERLO et al., 2015). Diferentemente, a IS1216E, recentemente identificada por Merlo e colaboradores (2015) na maioria dos seus isolados de E. faecium vana na mesma região intergênica (vans e vanh), assim como no presente estudo. Essa IS até então não havia sido reportada nesta posição em cluster van de E. faecium em todo o mundo. O Tn1546 pode conter vários tipos de ISs, incluindo IS1542, IS1251, ISEfa5, IS1476 e IS19, que são diversificadas regionalmente e têm sido caracterizadas a partir de isolados da Europa, Coréia, EUA e Brasil (HANDWERGER et al., 1995; WILLEMS et al., 1999; CAMARGO et al., 2005; CHA et al., 2012). Por outro lado, a IS1216V tem sido identificada em isolados de VRE em todo o mundo (HANDWERGER et al., 1995; WILLEMS et al., 1999; CAMARGO et al., 2005; CHA et al., 2012). Múltiplos locais de inserção apontam que esses elementos são ativamente móveis, cruciais para a evolução do ambiente genético do gene vana. Infelizmente, o papel das ISs na diversificação do ambiente genético do vana diminui o seu valor como marcador epidemiológico, uma vez que o movimento dessas ISs resulta em alteração estrutural do transposon, acarrentando uma baixa reprodutibilidade na tipagem. Embora isso possa não afetar estudos evolutivos ou epidemiológicos instantâneos, os estudos de longo prazo devem ser interpretados com considerável cautela. A este respeito, no atual estudo foi identificado o mesmo tipo de transposon encontrado por Merlo e colaboradores (2015) em 46 dos 47 E. faecium vana em Belo Horizonte, Minas Gerais. Uma vez que é provável que a inserção da IS1216E no Tn1546 foi um evento único, com padrão distinto do cluster van de outros isolados de VRE já estudados, pode-se constituir uma oportunidade para o estudo epidemiológico da propagação deste tipo de transposon de resistência em nosso país. Com relação ao ambiente genético do cluster van, este estudo confirma a presença dessa sequência de inserção, que até o presente momento, foi identificada em cepas brasileiras de E. faecium. De fato, a sequência IS1216E foi previamente reportada por Merlo e colaboradores em 2015 e curiosamente, neste contexto genético, não tem sido reportado

73 73 em outros países. Assim, muito provavelmente isolados brasileiros incorporaram recentemente esta IS. A IS1216E tem sido associada com os genes tcrb e aade que conferem resistência ao cobre e aminoglicosídeos, em E. faecium e Streptococcus agalactiae, respectivamente (HASMAN, 2005; MONTILLA et al., 2014). Portanto, essa IS deve contribuir para a rápida aquisição de resistência antimicrobiana entre as espécies de cocos Gram-positivos clinicamente importante (PAULSEN et al., 2003). Os tipos de Tn1546 indistiguíveis que foram identificados no atual estudo isolados de humano e ambientes aquáticos sugerem uma comum partilha de um pool de genes de resistência à vancomicina entre enterococos isolados de diferentes ecossistemas (SACRAMENTO et al., 2015a). Além disso, esses transposons apresentaram uma deleção na região de repetição, importante para a sua mobilidade, e portanto, é provável, que para a sua transposição seja necessário um plasmídeo para se deslocar de uma linhagem para outra. Um recente estudo realizado no Brasil com 47 E. faecium, todas as cepas possuiam plasmídeos de 35, 60 ou 75 Kb contendo o gene vana, com exceção de uma cepa que não hibridizou com a sonda vana, sugerindo que o transposon contendo vana possa estar no cromossomo (MERLO et al., 2015). Em resumo, no atual estudo foi documentada pela primeira vez, a identificação de VRE tipo vana com novos STs em carne de frango comercializada no Brasil. A detecção precoce de VRE em amostras de frango pode ajudar na implementação de medidas preventivas que visem reduzir a contaminação, sendo muito útil para o país, que é o terceiro maior produtor de carne de frango e o maior exportador deste produto no mundo (ALVES et al., 2012). Além disso, a detecção de cepas de E. faecium contendo vana pertencentes ao CC17 em amostras de águas superficiais em rios urbanos indica a disseminação ambiental de bactérias multirresistentes e virulentas, assim como seus elementos que compõe o ambiente genético do gene vana. Infecções por VRE na comunidade ainda são raras no Brasil, e com o conhecimento

74 74 de que existem VRE em hospitais e nesses rios, medidas devem ser tomada para evitar a sua propagação para a esfera da comunidade.

75 75 7. CONCLUSÕES Nas amostras clínicas, de alimentos e de água superficial coletada de rios urbanos em São Paulo foram identificadas cepas de E. faecium (n= 12) e de E. faecalis (n= 8) resistentes à vancomicina. As cepas de E. faecium e E. faecalis resistentes à vancomicina apresentaram um perfil de multirresistência. As cepas clínicas mostraram resistência aos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), quinolonas (ciprofloxacina) e macrolídeos (eritromicina). Os isolados ambientais, além das resistências acima citadas, foram resistentes às penicilinas (ampicilina), enquanto que as cepas de alimentos foram resistentes aos glicopeptídeos, tetraciclina e as estreptograminas (quinupristina/dalfopristina). A presença do gene vana foi identificada em todas as cepas de E. faecium e E. faecalis, resistentes aos glicopeptídeos, estudadas. Cepas de E. faecium isoladas da clínica e do ambiente apresentaram os fatores de virulência em comum acm + e esp +. O gene gele foi identificado em todas as cepas de E. faecalis, mostrando que esse gene pode estar intimamente ligado a esta espécie. A maioria das cepas de E. faecium isoladas de hospitais e rios urbanos de São Paulo apresentaram clones indistinguíveis pelo PFGE. Foram isolados E. faecium vana pertencentes ao complexo clonal 17 (ST203, ST412 e ST478) em rios de São Paulo idênticos a clones endêmicos de hospitais.

76 76 Foram detectados novos STs de E. faecalis (ST614, ST615, ST616) e de E. faecium (ST953, ST954) em carne de frango comercializada no Brasil. A análise do ambiente genético do cluster do gene vana (transposon Tn1546) dos dois isolados de E. faecium da clínica e do rio mostrou que ambas as cepas foram indistinguíveis, que apresentaram dois pontos de mutação nos genes vana e vanx, uma deleção na extremidade esquerda do transposon, uma IS1251 inserida entre os genes vans e vanh e uma IS1216E entre os genes vanx e vany. A IS1216E na região intergênica vanxy constitui um conjunto de genes previamente relatado em cepas clínicas de VREfm no Brasil, denotando uma característica regional. A presença da IS1216E, sugere uma propensão do E. faecium em incorporar elementos que podem contribuir para a rápida aquisição de resistência a compostos antimicrobianos, determinantes os quais podem chegar a ser disseminados para outras linhagens e/ou gêneros.

77 77 8. REFERÊNCIAS AARESTRUP, F.M. Characterization of glycopeptide-resistant Enterococcus faecium (GRE) from broilers and pigs in Denmark: genetic evidence that persistence of GRE in pig herds is associated with coselection by resistance to macrolides. Journal of Clinical Microbiology, v.38, p , ACAR, J.; CASEWELL, M.; FREEMAN, J.; FRIIS, C.; GOOSSENS, H. Avoparcin and virginiamycin as animal growth promoters: a plea for science in decision-making. Clinical Microbiology and Infection, v.6, p , AGUIRRE, M.; COLLINS, M.D. Lactic acid bacteria and human clinical infection. Journal of Applied Bacteriology, v.75, p , AHMAD, A.; DADA, A.C.; USUP, G.; HENG, L.Y. Occurrence of Enterococcus species with virulence markers in an urban flow-influenced tropical recreational beach. Marine Pollution Bulletin, v.82, n.1-2, p.26-38, ALEXY, R.; SOMMER, A.; LANGE, F.T.; KÜMMERER, K. Local use of antibiotics and their input and fate in a small sewage treatment plant: Significance of balancing and analysis on a local scale vs. nationwide scale. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica, v.34, p , ALTSCHUL, S.F.; GISH, W., MILLER, W.; MYERS, E.W; LIPMAN, D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, v.215, p , ANDERSON, K.L.; WHITLOCK, J.E.; HARWOOD, V.J. Persistence and differential survival of fecal indicator bacteria in subtropical waters and sediments. Applied and Environmental Microbiology, v.71, p , ANDREWS, W.H.; HAMMACK, T.S. Chapter I, Food sampling and preparation of 95 sample homogenate. In: Bacteriological analytical manual online. U.S. Food and 96 Drug Administration, Silver Spring, MD. Publicado em Abr Disponível em: Acesso em: 04 abr

78 78 BANKEVICH, A.; NURK, S.; ANTIPOV, D.; GUREVICH, A.A.; DVORKIN, M.; KULIKOV, A.S.; LESIN, V.M.; NIKOLENKO, S.I.; PHAM, S.; PRJIBELSKI, A.D.; PYSHKIN, A.V.; SIROTKIN, A.V.; VYAHHI, N.; TESLER, G.; ALEKSEYEV, M.A.; PEVZNER, P.A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol, v. 19, n. 5,p , 2012 ARIAS, C.A.; CONTRERAS, G.A.; MURRAY, B.E. Management of multidrug-resistant enterococcal infections. Clinical Microbiology and Infection, v.16, n.6, p , ARIAS, C.A.; MURRAY, B.E. The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nature Reviews Microbiology, v.10, n.4, p , ARIAS, C.A.; TORRES, H.A.; SINGH, K.V.; PANESSO, D.; MOORE, J.; WANGER, A.; MURRAY, B.E. Failure of daptomycin mono-therapy for endocarditis caused by an Enterococcus faecium strain with vancomycin-resistant and vancomycin-susceptible subpopulations and evidence of in vivo loss of the vana gene cluster. Clinical Infectious Diseases, v.10, p , ARIAS, C.A.; MURRAY, B.E. Emergence and management of drug-resistant enterococcal infections. Expert Review of Anti-infective Therapy, v.6, p , ARIAS, C.A.; MURRAY, B.E. In: Harrison s Principles of Internal Medicine (eds Longo, D. L. et al.) McGraw Hill, New York, p , ARIAS, C.A.; PANESSO, D.; SINGH, K.V.; RICE, L.B.; MURRAY, B.E. Cotransfer of antibiotic resistance genes and a hylefm-containing virulence plasmid in Enterococcus faecium. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.53, p , ARTHUR, M.; DEPARDIEU, F.; GERBAUD, G.; GALIMAND, M.; LECLERCQ, R.; COURVALIN P. The VanS sensor negatively controls VanR-mediated transcriptional activation of glycopeptide resistance genes of Tn1546 and related elements in the absence of induction. Journal of Bacteriology, v.179, p , ARTHUR, M.; MOLINAS, C.; DEPARDIEU, F; COURVALIN, P. Characterization of Tn1546, a Tn3-related transposon conferring glycopeptide resistance by synthesis of depsipeptide peptidoglycan precursors in Enterococcus faecium BM4147. Journal of Bacteriology, v.175, p , AZIZ, R.K.; BARTELS, D.; BEST, A.A.; DEJONGH, M.; DISZ, T.; EDWARDS, R.A.;

79 79 FORMSMA, K.; GERDES, S.; GLASS, E.M.; KUBAL, M.; MEYER, F.; OLSEN, G.J.; OLSON, R.; OSTERMAN, A.L.; OVERBEEK, R.A.; MCNEIL, L.K.; PAARMANN, D.; PACZIAN, T.; PARRELLO, B.; PUSCH, G.D.; REICH, C.; STEVENS, R.; VASSIEVA, O.; VONSTEIN, V.; WILKE, A.; ZAGNITKO, O. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics, v.9, p.75, BAGER, F.; AARESTRUP, F.M.; MADSEN, M.; WEGENER, H.C. Glycopeptide resistance in Enterococcus faecium from broilers and pigs following discontinued use of avoparcin., Microbial Drug Resistance, v.5, p.53-6, BATES, J.; JORDENS, Z.; SELKON, J.B. Evidence for an animal origin of vancomycinresistant enterococci. Lancet, v.342, p , BATISTA XAVIER, D.; MORENO BERNAL, F.E.; TITZE-DE-ALMEIDA, R. Absence of VanA- and VanB-containing enterococci in poultry raised on nonintensive production farms in Brazil. Applied and Environmental Microbiology, v.72, n.4, p , BATISTÃO, D.W.; GONTIJO-FILHO, P.P.; CONCEIÇÃO, N.; OLIVEIRA, A.G.; RIBAS, R.M. Risk factors for vancomycin-resistant enterococci colonisation in critically ill patients. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.107, n.1, p.57-63, BENNETT, D.E.; CAFFERKEY, M.T. Multilocus restriction typing: a tool for Neisseria meningitidis strain discrimination. Journal of Medical Microbiology, v.52, p , BERCHIERI A. Intestinal colonization of a human subject by vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Clinical microbiology and infection: the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, v.5, p.97100, BESSA, L.J.; BARBOSA-VASCONCELOS, A.; MENDES, A.; VAZ-PIRES, P.; MARTINS DA COSTA, P. High prevalence of multidrug-resistant Escherichia coli and Enterococcus spp. in river water, upstream and downstream of a wastewater treatment plant. Journal of Water and Health, v.12, n.3, p , BOLANO, A.; STINCHI, S.; PREZIOSI, R.; BISTONI, F.; ALLEGRUCCI, M.; BALDELLI, F.; MARTINI, A.; CARDINALI, G. Rapid methods to extract DNA and RNA from Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research, v.1, p , BOOTH, M.C.; BOGIE, C.P.; SAHL, H.G.; SIEZEN, R.J.; HATTER, K.L.; GILMORE, M.S. Structural analysis and proteolytic activation of Enterococcus faecalis cytolysin, a novel

80 80 lantibiotic. Molecular Microbiology, v.21, p , BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Módulo 6 : Detecção e identificação de bactérias de importância médica. Brasília/DF, v.9, 150p., BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Ministério da Saúde. Relatório do monitoramento da prevalência e do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos em enterococos e salmonelas isoladas de carcaças de frangos congeladas comercializadas no Brasil. Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frango (PREBAF), 1.ed, Brasília/DF, 186p., BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MAPA. Lista de aditivos autorizados uso na alimentação animal no Brasil. Atualizada em 25 abr [acesso 2015 jun 16]. Disponível em: [ BUSTAMANTE, W.; ALPÍZAR, A.; HERNÁNDEZ, S.; PACHECO, A.; VARGAS, N.; HERRERA, M.L.; VARGAS, A.; CABALLERO, M.; GARCÍA, F. Predominance of vana genotype among vancomycin-resistant Enterococcus isolates from poultry and swine in Costa Rica. Applied and Environmental Microbiology, v.69, n.12, p , BUTAYE, P.; DEVRIESE, L.A.; HAESEBROUCK, F. Antimicrobial growth promoters used in animal feed: effects of less well known antibiotics on gram-positive bacteria. Clinical Microbiology Reviews, v.16, n.2, p , BYAPPANAHALLI, M.N.; NEVERS, M.B.; KORAJKIC, A.; STALEY, Z.R.; HARWOOD, V.J. Enterococci in the environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.76, n.4, p , CABELLI, V.J.; DUFOUR, A.P.; LEVIN, M.A.; MCCABE, L.J.; HABERMAN, P.W. Byappanahalli et al. Relationship of microbial indicators to health effects at marine bathing beaches. American Journal of Public Health, v.69, p , CAMARGO, C.H.; BRUDER-NASCIMENTO, A.; LEE, S.H.; JÚNIOR, A.F.; KANENO, R.; RALL, V.L. Prevalence and phenotypic characterization of Enterococcus spp. isolated from food in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v.45, n.1, p , CAMARGO, I.L.; DEL PELOSO, P.F.; DA COSTA LEITE, C.F.; GOLDMAN, G.H.; DARINI,

81 81 A.L. Identification of an unusual VanA element in glycopeptide-resistant Enterococcus faecium in Brazil following international transfer of a bone marrow transplant patient. Canadian Journal of Microbiology, v.50, n.9, p , CAMARGO, I.L.; GILMORE, M.S.; DARINI, A.L. Multilocus sequence typing and analysis of putative virulence factors in vancomycin-resistant and vancomycin-sensitive Enterococcus faecium isolates from Brazil. Clinical Microbiology and Infection, v.12, n.11, p , CAMARGO, I.L.; ZANELLA, R.C.; GILMORE, M.S.; DARINI, A.L. Virulence factors in vancomycin-resistant and vancomycin- susceptible Enterococcus faecalis from Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v.39, n.2, p , CAMPOS, P.A.; BATISTÃO, D.W.; GONTIJO-FILHO, P.P.; RIBAS, R.M. A sustained endemic outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus faecium: A 30-month surveillance study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases, v.46, n.8, p , CARATTOLI A. Animal reservoirs for extended spectrum beta-lactamase producers. Clinical Microbiology and Infection, v.14, p , CASELLA, T.; RODRÍGUEZ, M.M.; TAKAHASHI, J.T.; GHIGLIONE, B.; DROPA, M.; ASSUNÇÃO, E.; NOGUEIRA, M.L.; LINCOPAN, N.; GUTKIND, G.; NOGUEIRA, M.C. Detection of blactx-m-type genes in complex class 1 integrons carried by Enterobacteriaceae isolated from retail chicken meat in Brazil. International Journal of Food Microbiology, v.197, p.88-91, CASTILLO-ROJAS, G.; MAZARI-HIRÍART, M.; PONCE DE LEÓN, S.; AMIEVA- FERNÁNDEZ, R.I.; AGIS-JUÁREZ, R.A.; HUEBNER, J.; LÓPEZ-VIDAL, Y. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS One, v.8, n.4, e59491, CATTOIR, V.; LECLERCQ, R. Twenty-five years of shared life with vancomycin-resistant enterococci: is it time to divorce? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.68, p , Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Nosocomial enterococci resistant to vancomycin in the United States, Morbidity and Mortality Weekly Report, v.42,

82 82 n.30, p , CEREDA, R.F.; GALES, A.C.; SILBERT, S.; JONES, R.N.; SADER, H.S. Molecular typing and antimicrobial susceptibility of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in Brazil. Infection Control & Hospital Epidemiology, v.23, n.1, p.19-22, CETINKAYA, Y.; FALK, P.; MAYHALL, C.G. Vancomycin-resistant enterococci. Clinical Microbiology Reviews, v.13, n.4, p , CHA, J.O.; YOO, J.I.; KIM, H.K.; KIM, H.S.; YOO, J.S.; LEE, Y.S.; JUNG, Y.H. Diversity of Tn1546 in vana-positive Enterococcus faecium clinical isolates with VanA, VanB, and VanD phenotypes and susceptibility to vancomycin. Journal of Applied Microbiology. v.115, n.4, p , CHA, J.O.; JUNG, Y.H.; LEE, H.R.; YOO, J.I.; LEE, Y.S. Comparison of genetic epidemiology of vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates from human and poultry. Journal of Medical Microbiology, v.61, p , CHEVREUX, B.; WETTER, T.; SUHAI, S. Genome sequence assembly using trace signals and additional sequence information, p In Computer science and biology. Proceedings of the German Conference on Bioinformatics, GCB 99. GCB, Hannover, Germany, CHOWDHURY, S.A.; NALLAPAREDDY, S.R.; ARIAS, C.A.; MURRAY, B.E. The majority of a collection of U.S. endocarditis Enterococcus faecalis isolates obtained from 1974 to 2004 lack capsular genes and belong to diverse, non-hospital-associated lineages. Journal of Clinical Microbiology, v.52, n.2, p , CLARK, N.C.; COOKSEY, R.C.; HILL, B.C.; SWENSON, J.M.; TENOVER, F.C. Characterization of glycopeptide-resistant enterococci from U.S. hospitals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.37, p , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-fourth informational supplement. CLSI document M100-S24. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA CONCEIÇÃO, N.; DA SILVA, L.E.; DARINI, A.L.; PITONDO-SILVA, A.; DE OLIVEIRA, A.G. Penicillin-resistant, ampicillin-susceptible Enterococcus faecalis of hospital origin: pbp4 gene polymorphism and genetic diversity. Infection, Genetics and Evolution, v.28, p , 2014.

83 83 COOPER, J.E,; FEIL, E.J. Multilocus sequence typing - what is resolved? Trends in Microbiology. v.12, n.8, p , COQUE, T.M.; TOMAYKO, J.F.; RICKE, S.C.; OKHYUSEN, P.C.; MURRAY, B.E. Vancomycin-resistant enterococci from nosocomial, community and animal sources in the United States. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.40, p , CORREA, A.A.; PIGNATARI, A.C.; DA SILVEIRA, M.; MINGONE, R.C.; DE SALES OLIVEIRA, V.G.; FORTALEZA, C.M. Small hospitals matter: insights from the emergence and spread of vancomycin-resistant enterococci in 2 public hospitals in inner Brazil. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. v.82, n.3, p , COSTA, L.M.D.; SOUZA, D.C.; MARTINS, L.T.F.; ZANELLA R.C.; BRANDILEONE, M.C.C.; BOKERMANN, S.; SADER, H.S.; SOUZA, H.A. Vancomycin-resistant Enterococcus faecium: first case in Brazil. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v.2, p , D'Costa, V.M.; King, C.E.; Kalan, L.; Morar, M.; Sung, W.W.; Schwarz, C.; Froese, D.; Zazula, G.; Calmels F.; Debruyne, R.; Golding, G.B.; Poinar, H.N.; Wright, G.D. Antibiotic resistance is ancient. Nature, v.477p , DA SILVA, L.P.; PITONDO-SILVA, A.; MARTINEZ, R.; DA COSTA DARINI A.L. Genetic features and molecular epidemiology of Enterococcus faecium isolated in two university hospitals in Brazil. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v.74, n.3, p , DA SILVA, N.S.; MUNIZ, V.D.; ESTOFOLETE, C.F.; FURTADO, G.H.; RUBIO, F.G. Identification of temporal clusters and risk factors of bacteremia by nosocomial vancomycinresistant enterococci. American Journal of Infection Control. v.42, n.4, p , DARTOIS, V.; PHALIP, V.; SCHMITT, P.; DIVIES, C. Purification, properties and DNA sequence of the D-lactate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. Research in Microbiology. v.146, p , D'AZEVEDO, P.A.; FURTADO, G.H.; MEDEIROS, E.A.; SANTIAGO, K.A.; SILBERT, S.; PIGNATARI, A.C. Molecular characterization of vancomycin-resistant Enterococci strains eight years apart from its first isolation in São Paulo, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo Jul-Aug;50(4):195-8.

84 84 DE ALMEIDA, L.M.; DE ARAÚJO, M.R.; IWASAKI, M.F.; SACRAMENTO, A.G.; ROCHA, D.; DA SILVA, L.P.; PAVEZ, M.; DE BRITO, A.C.; ITO, L.C.; GALES, A.C.; LINCOPAN, N.; SAMPAIO, J.L.; MAMIZUKA, E.M. Linezolid resistance in vancomycinresistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates in a Brazilian hospital. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.58, n.5, p , DE LENCASTRE, H.; BROWN, A.E.; CHUNG, M.; ARMSTRONG, D.; TOMASZ, A. Role of transposon Tn5482 in the epidemiology of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in the paediatric on- cology unit of a New York City hospital. Microbial Drug Resistance, v.5, p , DEMERTZI, E.; PALEPOU, M.F.; KAUFMANN, M.E.; AVLAMIS, A.; WOODFORD, N. Characterisation of VanA and VanB elements from glycopeptide-resistant Enterococcus faecium from Greece. Journal of Medical Microbiology, v.50, n.8, p , DEVRIESE, L.A.; KERCKHOVE, A.V.D.; KILPPER-BÄLZ, R.; SCHLEIFER, K.H. Characterization and identification of Enterococcus species isolated from the intestines of animals. International Journal of Systematic Bacteriology, v.37, p , DUPRE, I.; ZANETTI, S.; SCHITO, A.M.; FADDA, G.; SECHI, L.A. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis isolates in Sardinia (Italy). Journal of Medical Microbiology, v.52, p , DUTKA-MALEN, S.; EVERS, S.; COURVALIN, P. Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. Journal of Clinical Microbiology, v.33, p.24-27, EFSA. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards on a request from the European Food Safety Authority on foodborne antimicrobial resistance as a biological hazard. EFSA J; v.765, p.187, ELISHA, B.G.; COURVALIN, P. Analysis of genes encoding D-alanine: D-alanine ligaserelated enzymes in Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus spp. Gene v.152, p.79-83, ENGELBERT, M.; MYLONAKIS, E.; AUSUBEL, F.M.; CALDERWOOD, S.B.; GILMORE, M.S. Contribution of gelatinase, serine protease, and fsr to the pathogenesis of Enterococcus faecalis endophthalmitis. Infection and Immunity, v.72, p , 2004.

85 85 ENRIGHT, M.C.; SPRATT, B.G. Multilocus sequence typing. Trends in Microbiology, v.7, p , EUCAST. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 4.0, Disponível em: Acessado em: 06 jan EUZÉBY, J.P. List of prokaryotic names with standing in nomenclature - genus Enterococcus. Disponível em: Acessado em 12 abr FALLICO, L.; BOLDRIN, C.; GROSSATO, A.; FRANCHIN, E.; DE CANALE, E.; TOMMASINI, T.; PARISI, S.G.; MANGANELLI, R.; PALÙ, G. Molecular epidemiology of Enterococcus faecium isolates from an Italian hospital. Infect, v.39, p , FISHER, K.; PHILLIPS, C. The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology, v.155, n.6, p , FONTES, L.C.; NEVES, P.R.; OLIVEIRA, S.; SILVA, K.C.; HACHICH, E.M.; SATO, M.I.; LINCOPAN, N. Isolation of Pseudomonas aeruginosa coproducing metallo-β-lactamase SPM- 1 and 16S rrna methylase RmtD1 in an urban river. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.55, p , FRACALANZZA, S.A.; SCHEIDEGGER, E.M.; SANTOS, P.F.; LEITE, P.C.; TEIXEIRA, L.M. Antimicrobial resistance profiles of enterococci isolated from poultry meat and pasteurized milk in Rio de Janeiro, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.102, n.7, p , FREE, L.; SAHM, D. Detection of enterococcal vancomycin resistance by multiplex PCR. In: Persing D H, editor. PCR protocols for emerging infectious diseases. Washington, D.C: ASM Press; p , FREITAS, A.R.; NOVAIS, C.; RUIZ-GARBAJOSA, P.; COQUE, T.M.; PEIXE, L. Clonal 153 expansion within clonal complex 2 and spread of vancomycin-resistant plasmids among different genetic lineages of Enterococcus faecalis from Portugal. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.63, p , FREITAS, A.R.; TEDIM, A.P.; NOVAIS, C.; RUIZ-GARBAJOSA, P.; WERNER, G.; LAVERDE-GOMEZ, J.A.; CANTÓN, R.; PEIXE, L.; BAQUERO, F.; COQUE, T.M. Global spread of the hylefm colonization-virulence gene in megaplasmids of the Enterococcus faecium CC17 polyclonal subcluster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.54, p ,

86 FRIEDEN, T.R.; MUNSIFF, S.S.; LOW, D.E.; WILLEY, B.M.; WILLIAMS, G.; FAUR, Y.; EISNER, W.; WARREN, S.; KREISWIRTH, B. Emergence of vancomycin-resistant enterococci in New York City. Lancet, v.342, p.76-79, GALES, A. C.; SADER, H. S.; RIBEIRO, J.; ZOCCOLI, C.; BARTH, A.; PIGNATARI, A. C. Antimicrobial susceptibility of gram-positive bacteria isolated in Brazilian hospitals participating in the SENTRY Program ( ). Braz. J. Infect. Dis., v.13, p.90-98, GALLOWAY-PENA, J.R.; ROH, J.H.; LATORRE, M.; QIN, X.; MURRAY, B.E. Genomic, SNP, and 16S rrna analyses demonstrate a distant separation of the hospital and communityassociated clades of Enterococcus faecium. PLoS ONE, v.7, e30187, GARBAJOSA, P.R.; BONTEN, M.J.M.; ROBINSON, D.A.; TOP, J.; NALLAPAREDDY, S. R.; TORRES, C. Multilocus sequence typing scheme for Enterococcus faecalis reveals hospitaladapted genetic complexes in a background of high rates of recombination. Journal of Clinical Microbiology, v.44, n.6, p , GETACHEW, Y.; HASSAN, L.; ZAKARIA, Z.; ABDUL AZIZ, S. Genetic variability of vancomycin-resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis isolates from humans, chickens, and pigs in Malaysia. Applied and Environmental Microbiology, v.79, n.15, p , GHIDAN, A.; DOBAY, O.; KASZANYITZKY, E.J.; SAMU, P.; AMYES, S.G.B.; NAGY, K.; ROZGONYI, F. Vancomycin resistant Enterococci (Vre) still persist in slaughtered poultry in Hungary 8 years after the ban on Avoparcin. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica Journal, v.55, p , GIRAFFA, G. Enterococci from foods. FEMS Microbiology Reviews, v.26, n.2, p , GODOY, D.; RANDLE, G.; SIMPSON, A.J.; AANENSEN, D.M.; PITT, T.L.; KINOSHITA, R.; SPRATT, B.G. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p , GOUSIA, P.; ECONOMOU, V.; BOZIDIS, P.; PAPADOPOULOU, C. Vancomycin-resistance phenotypes, vancomycin-resistance genes, and resistance to antibiotics of enterococci isolated

87 87 fromm food of animal origin. Foodborne Pathogens and Disease, v.12, p , GRAMMENOU, P.; SPILIOPOULOU, I.; SAZAKLI, E.; PAPAPETROPOULOU, M. PFGE analysis of enterococci isolates from recreational and drinking water in Greece. Journal of Water and Health, v.4, n.2, p , GU, L.; CAO, B.; LIU, Y.; GUO, P.; SONG, S.; LI, R.; DAI, H.; WANG, C. A new Tn1546 type of VanB phenotypevana genotype vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates in mainland China. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v.63, p.70-75, HALLER, L.; AMEDEGNATO, E.; POTÉ, J.; WILDI, W. Influence of freshwater sediment characteristics on persistence of fecal indicator bacteria. Water, Air, & Soil Pollution, v.203, p , HAMMERUM, A.M.; LESTER, C.H.; HEUER, O.E. Antimicrobial-resistant enterococci in animals and meat: a human health hazard? Foodborne Pathogens and Disease, v.7, p , HANDWERGER, S.; SKOBLE, J. Identification of chromosomal mobile element conferring high-level vancomycin resistance in Enterococcus faecium. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.39, p , 1995 HANDWERGER, S.; SKOBLE, J.; DISCOTTO, L.F.; PUCCI, M.J. Heterogeneity of the vana gene cluster in clinical isolates of enterococci from the northeastern United States. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,v.39, p , HARADA, T.; KAWAHARA, R.; KANKI, M.; TAGUCHI, M.; KUMEDA, Y. Isolation and characterization of vana genotype vancomycin-resistant Enterococcus cecorum from retail poultry in Japan. International Journal of Food Microbiology, v.153, n.3, p , HASHIMOTO, Y.; TANIMOTO, K.; OZAWA, Y.; MURATA, T.; IKE, Y. Amino acid substitutions in the VanS sensor of the VanA-type vancomycin-resistant Enterococcus strains result in high-level vancomycin resistance and low-level teicoplanin resistance. FEMS Microbiology Letters, v.185, p , HASMAN H. The tcrb gene is part of the tcryazb operon conferring copper resistance in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis. Microbiology, v.151, p , HEIKENS, E.; SINGH, K.V.; JACQUES-PALAZ, K.D.; VAN LUIT-ASBROEK, M.;

88 88 OOSTDIJK, E.A.; BONTEN, M.J.; MURRAY, B.E.; WILLEMS, R.J. Contribution of the enterococcal surface protein Esp to pathogenesis of Enterococcus faecium endocarditis. Microbes and Infection, v.13, p , HEIKENS, E.; BONTEN, M.J.; WILLEMS, R.J. Enterococcal surface protein Esp is important for biofilm formation of Enterococcus faecium E1162. Journal of Bacteriology, v.189, p , HENRIQUE, P.M.; PALAZZO, I.C.V.; ZANELLA, R.C.; DARINI, A.L.C. Molecular characterization of enterococci harboring genotype and phenotype incongruence related to glycopeptide resistance isolated in Brazilian hospitals. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.103, p , HIDRON, A.I.; EDWARDS, J.R.; PATEL, J.; HORAN, T.C.; SIEVERT, D.M.; POLLOCK, D.A.; FRIDKIN, S.K.; National Healthcare Safety Network Team; Participating National Healthcare Safety Network Facilities. NHSN annual update: antimicrobialresistant pathogens associated with healthcareassociated infections: annual summary of data reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, Infection Control & Hospital Epidemiology, v.29, p , HIRSCH, R.; TERNES, T.; HABERER, K.; KRATZ, K.L. Occurrence of antibiotics in the aquatic environment. Science of the Total Environment, v.225, p , HOMAN, W.L.; TRIBE, D.; POZNANSKI, S.; LI, M.; HOGG, G.; SPALBURG, E.; EMBDEN, J.D.A.; WILLEMS R.J.L. Multilocus sequence typing scheme for Enterococcus faecium. Journal of Clinical Microbiology, v.40, p , HSIEH, Y.C.; LEE, W.S.; OU, T.Y.; HSUEH, P.R. Clonal spread of CC17 vancomycinresistant Enterococcus faecium with multilocus sequence type 78 (ST78) and a novel ST444 in Taiwan. European Journal of Clinical Microbiology, v.29, p.25-30, HUBBLE, T.S.; HATTON, J.F.; NALLAPAREDDY, S.R.; MURRAY, B.E.; GILLESPIE, M.J. Influence of Enterococcus faecalis proteases and the collagenbinding protein, Ace, on adhesion to dentin. Oral Microbiology and Immunology, v.18, p , HUGHES, V.M.; DATTA, N. Conjugative plasmids in bacteria of the pre-antibiotic era. Nature, v.302, p , HUGHES, D. Exploiting genomics, genetics and chemistry to combat antibiotic resistance. Nat

89 89 Rev Genet, v.4, p , IKE, Y.; HASHIMOTO, H.; CLEWELL, D.B. Hemolysin of Streptococcus faecalis subspecies zymogenes contributes to virulence in mice. Infection and Immunity, v.45, p , IVERSEN, A.; KÜHN, I.; RAHMAN, M.; FRANKLIN, A.; BURMAN, L.G.; OLSSON- LILJEQUIST, B.; TORELL, E.; MÖLLBY, R. Evidence for transmission between humans and the environment of a nosocomial strain of Enterococcus faecium. Environmental Microbiology, v.6, p.55-59, JAMET, E.; AKARY, E.; POISSON, M.A.; CHAMBA, J.F.; BERTRAND, X.; SERROR, P. Prevalence and characterization of antibiotic resistant Enterococcus faecalis in French cheeses. Food Microbiology, v.31, n.2, p , JENG, H,C.; SINCLAIR, R.; DANIELS, R.; ENGLANDE, A.J. Survival of Enterococci faecalis in estuarine sediments. International Journal of Environmental Studies, v.62, p , JENSEN, L.B.; AHRENS, P.; DONS, L.; JONES, R.N.; HAMMERUM, A.M.; AARESTRUP, F.M. Molecular analysis of Tn1546 in Enterococcus faecium isolated from animals and humans. Journal of Clinical Microbiology, v.36, p , JOHNSEN, P.J.; TOWNSEND, J.P.; BØHN, T.; SIMONSEN, G.S.; SUNDSFJORD, A.; NIELSEN, K.M. Retrospective evidence for a biological cost of vancomycin resistance determinants in the absence of glycopeptide selective pressures. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.66, p , Johnson, C.N.; Benjamin Jr, W.H. Jr.; Moser, S.A.; Hollingshead, S.K.; Zheng, X.; Crain, M.J.; Nahm, M.H.; Waites, K.B. Genetic relatedness of levofloxacinnonsusceptible Streptococcus pneumoniae isolates from North America. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p , JONES, R.N.; GUZMAN-BLANCO, M.; GALES, A.C.; GALLEGOS, B.; CASTRO, A.L.; MARTINO, M.D.; VEGA, S.; ZURITA, J.; CEPPARULO, M.; CASTANHEIRA, M. Susceptibility rates in Latin American nations: report from a regional resistance surveillance program (2011). Brazilian Journal of Infectious Diseases, v.17, n.6, p , JUNG, W.K.; LIM, J.Y.; KWON, N.H.; KIM, J.M.; HONG, S.K.; KOO, H.C.; KIM, S.H.; PARK, Y.H. Vancomycin-resistant enterococci from animal sources in Korea. International

90 90 Journal of Food Microbiology, v.113, n.1, p , KAY, D.; FLEISHER, J.M.; SALMON, R.L.; JONES, F.; WYER, M.D.; GODFREE, A.F.; ZELENAUCH-JACQUOTTE, Z.; SHORE, R. Predicting likelihood of gastroenteritis from sea bathing: results from randomised exposure. Lancet v.344, p , KEMPF, I.; HELLARD, G.; PERRIN-GUYOMARD, A.; GICQUEL-BRUNEAU, M.; SANDERS, P.; LECLERCQ, R. Prevalence of high-level vancomycin-resistant enterococci in French broilers and pigs. International Journal of Antimicrobial Agents, v.32, p , KHAN, M.A.; NORTHWOOD, J.B.; LOOR, R.G.; THOLEN, A.T.; RIERA, E.; FALCÓN, M.; Paraguayan Antimicrobial Network; van BELKUM, A.; van WESTREENEN, M.; HAYS, J.P. High prevalence of ST-78 infection associated vancomycin-resistant Enterococcus faecium from hospitals in Asunción, Paraguay. Clinical Microbiology and Infection, v.16, p , KHAN, M.A.; VAN DER WAL, M.; FARRELL, D.J.; COSSINS, L.; VAN BELKUM, A.; ALAIDAN, A.; HAYS, J.P. Analysis of VanA vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates from Saudi Arabian hospitals reveals the presence of clonal cluster 17 and two new Tn1546 lineage types. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.62, p , KO, K.S.; BAEK, J.Y.; LEE, J.Y.; OH, W.S.; PECK, K.R.; LEE, N.; LEE, W.G.; LEE, K.; SONG, J.H. Molecular characterization of vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates from Korea. Journal of Clinical Microbiology, v.43, p , KOTETISHVILI, M.; STINE, O.C.; KREGER, A.; MORRIS, J.G JR.; SULAKVELIDZE, A. Multilocus sequence typing for characterization of clinical and environmental salmonella strains. Journal of Clinical Microbiology, v.40, p , KOTETISHVILI, M.; STINE, O.C.; CHEN, Y.; KREGER, A.; SULAKVELIDZE, A.; SOZHAMANNAN, S.; MORRIS, J.G Jr. Multilocus sequence typing has better discriminatory ability for typing Vibrio cholerae than does pulsed-field gel electrophoresis and provides a measure of phylogenetic relatedness. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p , KRCMÉRY, V.; SEFTON, A. Vancomycin resistance in Gram-positive bacteria other than Enterococcus spp. International Journal of Antimicrobial Agents, v.14, p , 2000.

91 91 KÜMMERER, K Antibiotics in the aquatic environment - a review - part I. Chemosphere. v.75, n.4, p LAUDERDALE, T.L.; MCDONALD, L.C.; SHIAU, Y.R.; CHEN, P.C.; WANG, H.Y.; LAI, J.F.; HO, M. Vancomycin-resistant enterococci from humans and retail chickens in Taiwan with unique VanB phenotype-vana genotype incongruence. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.46, n.2, p , LEAVIS, H.L.; BONTEN, M.J.; WILLEMS, R.J. Identification of high-risk enterococcal clonal complexes: global dispersion and antibiotic resistance. Current Opinion in Microbiology, v.9, p , LEBRETON, F.; DEPARDIEU, F.; BOURDON, N.; FINES-GUYON, M.; BERGER, P.; CAMIADE, S.; LECLERCQ, R.; COURVALIN, P.; CATTOIR, V. D-Ala-D-Ser VanN-type transferable vancomycin resistance in Enterococcus faecium. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.55, p , LEBRETON, F.; VAN SCHAIK, W.; MCGUIRE, A.M.; GODFREY, P.; GRIGGS, A.; MAZUMDAR, V.; CORANDER, J.; CHENG, L.; SAIF, S.; YOUNG, S.; ZENG, Q.; WORTMAN, J.; BIRREN, B.; WILLEMS, R.J.L.; EARL, A.M.; GILMORE, M.S. Emergence of epidemic multidrug resistant Enterococcus faecium from animal and commensal strains. MBio, v.4, p.1-10, LECLERCQ, R.; DERLOT, E.; DUVAL, J.; COURVALIN, P. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. The New England Journal of Medicine, v.319, p , LEE, H.G.; JANG, J.; CHOI, J.E.; CHUNG, D.C.; HAN, J.W.; WOO, H.; JEON, W.; CHUN, B.C. Blood stream infections in patients in the burn intensive care unit. Infection and Chemotherapy, v.45, p , LEME, I.L.; PIANTINO, A.J.; PIGNATARI, A.C. Glycopeptides susceptibility among enterococci isolated from a poultry farm in São Paulo, Brazil (1996/1997). Brazilian Journal of Microbiology, v.31, p.53-57, LESTER, C.H.; FRIMODT-MOLLER, N.; SORENSEN, T.L.; MONNET, D.L.; HAMMERUM, A.M. In vivo transfer of the vana resistance gene from an Enterococcus faecium isolate of animal origin to an E. faecium isolate of human origin in the intestines of

92 92 human volunteers. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.50, p.5969, LINCOPAN, N.; DE ALMEIDA, L.M.; ELMOR DE ARAÚJO, M.R.; MAMIZUKA, E.M. Linezolid resistance in Staphylococcus epidermidis associated with a G2603T mutation in the 23S rrna gene. International Journal of Antimicrobial Agents, v.34, n.3, p , LINCOPAN, N. Cetesb realiza estudo bacteriológico do Rio Tietê. Agência Universitária de Notícias, AUN (on line), Ano 43, n.100, 16 nov LIVERMORE, D.M. Has the era of untreatable infections arrived? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.64, p.i29-i36, LOCATELLI, M.A.; SODRÉ, F.F.; JARDIM, W.F. Determination of antibiotics in Brazilian surface waters using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, v.60, n.3, p , LÓPEZ, M.; SÁENZ, Y.; ALVAREZ-MARTÍNEZ, M.J.; MARCO, F.; ROBREDO, B.; ROJO- BEZARES, B.; RUIZ-LARREA, F.; ZARAZAGA, M.; TORRES, C. Tn1546 structures and multilocus sequence typing of vana-containing enterococci of animal, human and food origin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.65, n.8, p , MACKINNON, M.G.; DREBOT, M.A.; TYRRELL, G.J. Identification and characterization of IS1476, an insertion sequence-like element that disrupts VanY function in a vancomycinresistant Enterococcus faecium strain. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.41, p , MAIDEN, M.C.; BYGRAVES, J.A.; FEIL, E.; MORELLI, G.; RUSSELL, J.E.; URWIN, R.; ZHANG, Q.; ZHOU, J.; ZURTH, K.; CAUGANT, D.A.; FEAVERS, I.M.; ACHTMAN, M.; SPRATT, B.G. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., v.95, p , MAINARDI, J.L.; VILLET, R.; BUGG, T.D.; MAYER, C.; ARTHUR, M. Evolution of peptidoglycan biosynthesis under the selective pressure of antibiotics in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiology Reviews, v.32, p , MARSHALL, C.G.; LESSARD, I.A.; PARK, I.; WRIGHT, G.D. Glycopeptide antibiotic resistance genes in glycopeptide-producing organisms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.42, n.9, p , 1998.

93 93 MARSHALL, C.G.; BROADHEAD, G.; LESKIW, B.; WRIGHT, G.D. D-AlaD-Ala ligases from glycopeptide antibiotic-producing organisms are highly homologous to the enterococcal vancomycin-resistance ligases VanA and VanB. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., v.94, p , MATO, R.; LENCASTRE, H.; ROBERTS, R.B.; TOMASZ, A. Multiplicity of genetic backgrounds among vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates recovered from an outbreak in a New York City hospital. Microbial Drug Resistance, v.2, p , MCDONALD, L.C.; KUEHNERT, M.J.; TENOVER, F.C.; JARVIS, W.R. Vancomycinresistant enterococci outside the health-care setting: prevalence, sources, and public health implications. Emerging Infectious Diseases, v.3, p.3117, MERLO, T.P.; DABUL, A.N.; CAMARGO, I.L. Different VanA Elements in E. faecalis and in E. faecium Suggest at Least Two Origins of Tn1546 Among VRE in a Brazilian Hospital. Microbial Drug Resistance, v.21, n.3, p , MONTILLA, A.; ZAVALA, A.; CÁCERES, CÁCERES, R.; CITTADINI, R.; VAY, C.; GUTKIND, G.; FAMIGLIETTI, A.; BONOFIGLIO, L.; MOLLERACH, M. Genetic environment of the lnu(b) gene in a Streptococcus agalactiae clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother, v.58, n.9, p , RAMSEY, A.M.; ZILBERBERG, M.D. Secular trends of hospitalization with vancomycinresistant enterococcus infection in the United States, Infection Control & Hospital Epidemiology, v.30, n.2, p , MURRAY, B.E. The life and times of the Enterococcus. Clinical Microbiology Reviews, v.3, p.46-65, MURRAY B.E. Vancomycin-resistant enterococcal infections. The New England Journal of Medicine, v.342, n.10, p , MURRAY, B. E.; BARON, E. J.; JORGENSEN, J. H.; LANDRY, M. L.; PFALLER, M. A. Manual of Clinical Microbiology. 9.ed., Washington, D.C.: ASM Press, NAAS, T.; FORTINEAU, N.; SNANOUDJ, R.; SPICQ, C.; DURRBACH, A.; NORDMANN, P. First nosocomial outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus faecium expressing a VanDlike phenotype associated with a vana genotype. Journal of Clinical Microbiology, v.43, p , 2005.

94 94 NALLAPAREDDY, S.R.; SINGH, K.V.; OKHUYSEN, P.C.; MURRAY, B.E. A functional collagen adhesin gene, acm, in clinical isolates of Enterococcus faecium correlates with the recent success of this emerging nosocomial pathogen. Infection and Immunity, v.76, p , NALLAPAREDDY, S.R.; DUH, R.W.; SINGH, K.V.; MURRAY, B.E. Molecular typing of selected Enterococcus faecalis isolates: pilot study using multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis. Journal of Clinical Microbiology, v.40, p , NILSSON O. Vancomycin resistant enterococci in farm animals occurrence and importance. Infection Ecology & Epidemiology, v.2, p.1 8, NOLLER, A.C.; MCELLISTREM M.C.; STINE O.C.; MORRIS J.G. JR.; BOXRUD, D.J.; DIXON, B.; HARRISON, L.H. Multilocus sequence typing reveals a lack of diversity among Escherichia coli O157:H7 isolates that are distinct by pulsed-field gel electrophoresis. Journal of Clinical Microbiology, v.41, p , NOVAIS, C.; FREITAS, A.R.; SILVEIRA, E.; ANTUNES, P.; SILVA, R.; COQUE, T.M.; PEIXE, L. Spread of multidrug-resistant Enterococcus to animals and humans: an underestimated role for the pig farm environment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.68, n.12, p , NOVAIS, C.; FREITAS, A.R.; SOUSA, J.C.; BAQUERO, F.; COQUE, T.M.; PEIXE, L.V. Diversity of Tn1546 and its role in the dissemination of vancomycin-resistant enterococci in Portugal. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.52, n.3, p , OH, J.Y.; AN, S.; JIN, J.S.; LEE, Y.C.; CHO, D.T.; LEE, J.C. Phenotypic and genotypic differences of the vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates from humans and poultry in Korea. TJ Microbiology. v.45, p , MOURA, R.A.; SILVA, K.C.; PAVEZ, M.; MCCULLOCH, J.A.; DROPA, M.; MATTÉ, M.H.; MAMIZUKA, E.M.; SATO, M.I.; PESTANA DE CASTRO, A.F.; LINCOPAN, N. Isolation of KPC-2-producing Klebsiella pneumonia strains belonging to the high-risk multiresistant clonal complex 11 (ST437 and ST340) in urban rivers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.69, p , OLSEN, R.H.; CHRISTENSEN, H.; BISGAARD, M. Transmission and genetic diversity of Enterococcus faecalis during hatch of broiler chicks. Veterinary Microbiology, v.60, p.214-

95 95 221, OSTROLENK, M.; KRAMER, N.; CLEVERDON, R.C. Comparative studies of enterococci and Escherichia coli as indices of pollution. Journal of Bacteriology, v.53, p , PALAZZO ICV, CAMARGO ILBC, ZANELLA RC, DARINI ALC. Evaluation of clonality in enterococci isolated in Brazil carrying Tn1546-like elements associated with vana plasmids. FEMS Microbiol Lett, v.258, p.20-36, PALAZZO, I.C.; PITONDO-SILVA, A.; LEVY, C.E.; DA COSTA DARINI, A.L.Changes in vancomycin-resistant Enterococcus faecium causing outbreaks in Brazil. Journal of Hospital Infection, 2011; 79: PALEPOU, M.F.; ADEBIYI, A.M.; TREMLETT, C.H.; JENSEN, L.B.; WOODFORD, N. Molecular analysis of diverse elements mediating VanA glycopeptide resistance in enterococci. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.42, p , PARK, I.J.; LEE, W.G.; LIM, Y.A.; CHO, S.R. Genetic rearrangements of TN1546-like elements in vancomycin-resistant Enterococcus faecium isolates collected from hospitalized patients over a seven-year period. Journal of Clinical Microbiology, v.45, n.12, p , PARK, S.H.; PARK, C.; CHOI, S.M.; LEE, D.G.; KIM, S.H.; KWON, J.C.; BYUN, J.H.; CHOI, J.H.; YOO, J.H. Molecular epidemiology of vancomycin-resistant Enterococcus faecium bloodstream infections among patients with neutropenia over a 6-year period in South Korea. Microbial Drug Resistance, v.17, n.1, p.59-65, PARK, I.S.; WALSH,. C.T. D-Alanyl-D-lactate and D-alanyl-D-alanine synthesis by D-alanyl- D-alanine ligase from vancomycin-resistant Leuconostoc mesenteroides. Effects of a phenylalanine 261 to tyrosine mutation. The Journal of Biological Chemistry, v.272, p , PARK, S.Y.; SHIN, Y.P.; KIM, C.H.; PARK, H.J.; SEONG, Y.S.; KIM, B.S.; SEO, S.J.; LEE, I.H. Immune evasion of Enterococcus faecalis by an extracellular gelatinase that cleaves C3 and ic3b. The Journal of Immunology, v.181, p , PATEL, R.; PIPER, K.; COCKERILL, F.R 3rd.; STECKELBERG, J.M.; YOUSTEN, A.A. biopesticide Paenibacillus popilliae has a vancomycin resistance gene cluster homologous to the enterococcal VanA vancomycin resistance gene cluster. Antimicrobial Agents and

96 96 Chemotherapy, v.44, p , PATTERSON, J.E.; SWEENEY, A.H.; SIMMS.; CARLEY, N.; MANGI, R.; SABETTA, J.; LYONS, R.W. Analysis of 110 series enterococcal infections. Medicine, v.74, p , PAULSEN, I.T.; BANERJEI, L.; MYERS, G.S.; NELSON, K.E.; SESHADRI, R.; READ, T.D.; FOUTS, D.E.; EISEN, J.A.; GILL, S.R.; HEIDELBERG, J.F.; TETTELIN, H.; DODSON, R.J.; UMAYAM, L.; BRINKAC, L.; BEANAN, M.; DAUGHERTY, S.; DEBOY, R.T.; DURKIN, S.; KOLONAY, J.; MADUPU, R.; NELSON, W.; VAMATHEVAN, J.; TRAN, B.; UPTON, J.; HANSEN, T.; SHETTY, J.; KHOURI, H.; UTTERBACK, T.; RADUNE, D.; KETCHUM, K.A.; DOUGHERTY, B.A.; FRASER, C.M. Role of mobile DNA in the evolution of vancomycin-resistant Enterococcus faecalis. Science. v.299, n.5615, p , PAVEZ, M.; MAMIZUKA, E.M.; LINCOPAN, N. Early dissemination of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.53, n.6, p.2702, PEACOCK, S.J.; DE SILVA, G.D.; JUSTICE, A.; COWLAND, A.; MOORE, C.E.; WINEARLS, C.G.; DAY, N.P. Comparison of multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis as tools for typing Staphylococcus aureus isolates in a microepidemiological setting. Journal of Clinical Microbiology, v.40, p , PENAS, P.P.; MAYER, M.P.; GOMES, B.P.; ENDO, M.; PIGNATARI, A.C.; BAUAB, K.C.; PINHEIRO, E.T. Analysis of genetic lineages and their correlation with virulence genes in Enterococcus faecalis clinical isolates from root canal and systemic infections. Journal of Endodontics, v.39, n.7, p , PRÜSS A. Review of epidemiological studies on health effects from exposure to recreational water. International Journal of Epidemiology, v.27, p.1-9, QU, T.T.; CHEN, Y.G.; YU, Y.S.; LV, H.X.; DONG, X.Q.; XIAO, Z.; GU, H.Q.; LI, L.J. Molecular characterization of vancomycin-resistant enterococci in Hangzhou, China. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.60, n.6, p , QUIÑONES, D.; KOBAYASHI, N.; NAGASHIMA, S. Molecular epidemiologic analysis of Enterococcus faecalis isolates in Cuba by multilocus sequence typing. Microbial Drug Resistance, v.15, n.4, p , REIS, A.O.; CORDEIRO, J.C.; MACHADO, A.M.; SADER, H.S. In vitro antimicrobial

97 97 activity of linezolid tested against vancomycin-resistant enterococci isolated in Brazilian hospitals. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v.5, n.5, p , RESENDE, M.; CAIERÃO, J.; PRATES, J.G.; NARVAEZ, G.A.; DIAS, C.A.; D'AZEVEDO, P.A. Emergence of vana vancomycin-resistant Enterococcus faecium in a hospital in Porto Alegre, South Brazil. The Journal of Infection in Developing Countries. v.8, n.2, p , REVAZISHVILI, T.; KOTETISHVILI, M.; STINE, O.C.; KREGER, A.S.; MORRIS, J.G JR.; SULAKVELIDZE, A. Comparative analysis of multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis for characterizing Listeria monocytogenes strains isolated from environmental and clinical sources. Journal of Clinical Microbiology, v.42, p , REYNOLDS PE. Structure, biochemistry and mechanism of action of glycopeptides antibiotics. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, v.8, p , RICE, L.B.; CARIAS, L.; RUDIN, S.; VAEL, C.; GOOSSENS, H.; KONSTABEL, C.; KLARE, I.; NALLAPAREDDY, S.R.; HUANG, W.; MURRAY, B.E. A potential virulence factor gene, hylefm, predominates in Enterococcus faecium of clinical origin. The Journal of Infectious Diseases, v.187, p , RICE, L.B.; LAKTICOVÁ, V.; CARIAS, L.L.; RUDIN, S.; HUTTON, R.; MARSHALL, S.H. Transferable capacity for gastrointestinal colonization in Enterococcus faecium in a mouse model. The Journal of Infectious Diseases, v.199, p , RIPPERE, K.; PATEL, R.; UHL, J.R.; PIPER, K.E.; STECKELBERG, J.M.; KLINE, B.C.; COCKERILL, F.R.; YOUSTEN, A.A. DNA sequence resembling vana and vanb in the vancomycin-resistant biopesticide Bacillus popilliae. The Journal of Infectious Diseases, v.178, p; , ROBREDO, B.; SINGH, K.V.; BAQUERO, F.; MURRAY, B.E.; TORRES, C. Vancomycinresistant enterococci isolated from animals and food. International Journal of Food Microbiology, v.54, n.3, p , ROCHA, P.S.; LUVIZOTTO, G.L.; KOSMEHL, T.; BÖTTCHER, M.; STORCH, V.; BRAUNBECK, T.; HOLLERT, H. Sediment genotoxicity in the Tietê River (São Paulo, Brazil): in vitro comet assay versus in situ micronucleus assay studies. Ecotoxicology and

98 98 Environmental Safety, v.72, n.7, p , RUIZ-GARBAJOSA, P.; BONTEN, M.J.; ROBINSON, D.A.; TOP, J.; NALLAPAREDDY, S.R.; TORRES, C.; COQUE, T.M.; CANTÓN, R.; BAQUERO, F.; MURRAY, B.E.; DEL CAMPO, R.; WILLEMS, R.J. Multilocus sequence typing scheme for Enterococcus faecalis reveals hospitaladapted genetic complexes in a background of high rates of recombination. Journal of Clinical Microbiology, v.44, p , RUTHERFORD, K.; PARKHILL, J.; CROOK, J.; HORSNELL, T.; RICE, P.; RAJANDREAM, M.A.; BARRELL, B. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics, v.16, n.10, p , SACRAMENTO, A.G. Tipagem molecular de cepas de Enterococcus spp resistentes à vancomicina, isoladas em hospitais da cidade de São Paulo, no período de 1999 a São Paulo: Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde. [Dissertação] p.115, SACRAMENTO, A.G.; CERDEIRA, L.T.; DE ALMEIDA, L.M.; ZANELLA, R.C.; PIRES, C.; SATO, M.I.; COSTA, E.A.; ROBERTO, N.P.; MAMIZUKA, E.M.; LINCOPAN, N. Environmental dissemination of vana-containing Enterococcus faecium strains belonging to hospital-associated clonal lineages. J Antimicrob Chemother, p.1-2, 2015a. SACRAMENTO, A.G.; ZANELLA, R.C.; de ALMEIDA, L.M.; PIRES, C.; POPAZOGLO, C.; COSTA, E.A.S.; CERDEIRA, L.T.; MAMIZUKA, E.M.; LINCOPAN, N. Identification of New Sequence Types among Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis carrying vana gene in Retail Chicken Meat. J Glob Antimicrob Resist, 2015b. SADOWSKY, M.J.; WHITMAN, R.L. The fecal bacteria. ASM Press, Washington, DC. Wolf HW The coliform count as a measure of water quality, p In Mitchell R (ed), Water pollution microbiology. Wiley Interscience, New York, NY, SANTIAGO-RODRIGUEZ, T.M.R.J.; CORADIN, M.; TORANZOS, A. Antibiotic-resistance and virulence genes in Enterococcus isolated from tropical recreational waters. Journal of Water and Health, v.11, p , SCHJORRING, S.; KROGFELT, K.A. Assessment of bacterial antibiotic resistance transfer in the gut. International Journal of Microbiology, v.2011, p , SEGARRA, R.A.; BOOTH, M.C.; MORALES, D.A.; HUYCKE, M.M.; GILMORE, M.S.

99 99 Molecular characterization of the Enterococcus faecalis cytolysin activator. Infection and Immunity, v.59, p , SHANKAR, N.; LOCKATELL, C.V.; BAGHDAYAN, A.S.; DRACHENBERG, C.; GILMORE, M.S.; JOHNSON, D.E. Role of Enterococcus faecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection. Infection and Immunity, v.69, p , SIGUIER, P.; PEROCHON, J.; LESTRADE, L.; MAHILLON, J.; CHANDLER, M. ISfinder: the reference centre for bacterial insertion sequences. Nucleic Acids Res, v.34, p.32-36, SILVA, L.P.P.; PITONDO-SILVA, A.; MARTINEZ, R.; DARINI, A.L.C. Genetic features and molecular epidemiology of Enterococcus faecium isolated in two university hospitals in Brazil. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v.74, p , SIMONSEN, G.S.; MYHRE, M.R; DAHL, K.H.; OLSVIK, O.; SUNDSFJORD, A. Typeability of Tn1546-like elements in van- comycin-resistant enterococci using long-range PCRs and specific analysis of polymorphic regions. Microbial Drug Resistance, v.6, p.49-57, SINCLAIR, R.G.; ROSE, J.B.; HASHAM, S.A.; GERBA, C.P.; HAAS, C.N. Criteria for selection of surrogates used to study the fate and control of pathogens in the environment. Applied and Environmental Microbiology, v.78, p , SINGH, K.V.; QIN, X.; WEINSTOCK, G.M.; MURRAY, B.E. Generation and testing of mutants of Enterococcus faecalis in a mouse peritonitis model. The Journal of Infectious Diseases, v.178, p , SONG, J.H.; KO, K.S.; OH, W.S.; PARK, S.; HEO, S.T.; KWON, K.T.; RYU, S.Y.; PECK, K.R.; LEE, N.Y. High frequency of vancomycinresistant Enterococcus faecium isolates with VanB phenotype and vana genotype in Korean hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, v.56, p , STOBBERINGH, E.; VAN DEN BOGAARD, A.; LONDON, N.; DRIESSEN, C.; TOP WILLEMS, JR. Enterococci with glycopeptide resistance in turkeys, turkey farmers, turkey slaughterers, and (sub)urban residents in the south of The Netherlands: evidence for transmission of vancomycin resistance from animals to humans? Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.43, p , STOKSTAD, E.L.; JUKES, T.H. Further observations on the animal protein factor.

100 100 Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine, v.78, p.5238, SUARES ROCHA, P.; AZAB, E.; SCHMIDT, B.; STORCH, V.; HOLLERT, H.; BRAUNBECK, T. Changes in toxicity and dioxin-like activity of sediments from the Tietê River (São Paulo, Brazil). Ecotoxicology and Environmental Safety, v.73, n.4, p , TALEBI, M.; POURSHAFIE, M.R.; KATOULI, M.; MÖLLBY, R. Molecular structure and transferability of Tn1546-like elements in Enterococcus faecium isolates from clinical, sewage, and surface water samples in Iran. Applied and Environmental Microbiology, v.74, n.5, p , TALEBI, M.; SADEGHI, J.; RAHIMI, F.;POURSHAFIE, M.R. Isolation and Biochemical Fingerprinting of Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium From Meat, Chicken and Cheese. Jundishapur Journal of Microbiology, v.8, n.4, p.e15815, TEIXEIRA, L.; CARVALHO, M.; FACKLAN, R. Enterococcus. In: Murray P, Baron E, Landry M, Jorgensen J, Pfaller M, editors. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Washington, DC: ASM Press. p , TEIXEIRA, L.M.; FACKLAM, R.R. Enterococcus. In Manual of Clinical Microbiology, 8th edn, p Edited by P. R. Murray, E. J. Baron, J. H. Jorgensen, M. A. Pfaller & R. H. Yolken. Washington, DC: American Society for Microbiology, TEOPHILO, G.N.; DOS FERNANDES VIEIRA, R.H.; DOS PRAZERES RODRIGUES, D.; MENEZES, F.G. Escherichia coli isolated from seafood: toxicity and plasmid profiles. International Microbiology. v.5, n.1, p.11-4, TEUBER, M.Veterinary use and antibiotic resistance. Current Opinion in Microbiology, v.4, p , THAL, L.; DONABEDIAN, S.; ROBINSON-DUNN, B.; CHOW, J.W.; DEMBRY, L.; CLEWELL, D.B.; ALSHAB, D.; ZERVOS, M.J. Molecular analysis of glycopeptide-resistant Enterococcus faecium isolates collected from Michigan hospitals over a 6-year period. Journal of Clinical Microbiology, v.36, p , The European Antimicrobial Resistance Surveillance System. EARSS results. Disponível em: Acessado em: 13 fev

101 101 THOMAS, V.C.; HIROMASA, Y.; HARMS, N.; THURLOW, L.; TOMICH, J.; HANCOCK, L.E. A fratricidal mechanism is responsible for edna release and contributes to biofilm development of Enterococcus faecalis. Molecular Microbiology, v.72, n.4, p , TROBOS, M.; LESTER, C.H.; OLSEN, J.E.; FRIMODT-MOLLER, N.; HAMMERUM, A.M. Natural transfer of sulphonamide and ampicillin resistance between Escherichia coli residing in the human intestine. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.63, p.806, URWIN, R.; MAIDEN, M.C. Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology. Trends in Microbiology, v.11, p , US Environmental Protection Agency.Method 1600 enterococci in water by membrane filtration using membrane-enterococcus indoxyl-b-d-glucoside agar (mei). EPA-821-R US Environmental Protection Agency, Washington, DC UTTLEY, A.H.; COLLINS, C,H.; NAIDOO, J.; GEORGE, R.C. Vancomycin-resistant enterococci. Lancet, v.1, p.57-58, VAN DEN BOGAARD, A.E.; WILLEMS, R.; LONDON, N.; TOP, J.; STOBBERINGH, E.E. Antibiotic resistance of faecal enterococci in poultry, poultry farmers and poultry slaughterers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.49, p , VAN DEN BRAAK, N.; VAN BELKUM, A.; VAN KEULEN, M.; VLIEGENTHART, J.; VERBRUGH, H.A.; ENDTZ, H.P. Molecular characterization of vancomycinresistant enterococci from hospitalized patients and poultry products in The Netherlands. Journal of Clinical Microbiology, v.36, p , VAN DER AUWERA, P.; PENSART, N.; KORTEN, V.; MURRAY, B.E.; LECLERCQ, R. Influence of oral glycopeptides on the fecal flora of human volunteers: selection of highly glycopeptide-resistant enterococci. The Journal of Infectious Diseases, v.173, p , VAN SCHAIK, W.; TOP, J.; RILEY, D.R.; BOEKHORST, J.; VRIJENHOEK, J.E.; SCHAPENDONK, C.M.; HENDRICKX, A.P.; NIJMAN, I.J.; BONTEN, M.J.; TETTELIN, H.; WILLEMS, R.J. Pyrosequencing-based comparative genome analysis of the nosocomial pathogen Enterococcus faecium and identification of a large transferable pathogenicity island. BMC Genomics, v.11, p.239, VARELA, A.R.; FERRO, G.; VREDENBURG, J.; YANIK, M.; VIEIRA, L.; RIZZO, L.;

102 102 LAMEIRAS, C.; MANAIA, C.M. Vancomycin resistant enterococci: from the hospital effluent to the urban wastewater treatment plant. Science of the Total Environment, v , p , VIGNAROLI, C.; ZANDRI, G.; AQUILANTI, L.; PASQUAROLI, S.; BIAVASCO, F. Multidrug-resistant enterococci in animal meat and faeces and co-transfer of resistance from an Enterococcus durans to a human Enterococcus faecium. Current Microbiology, v.62, p , WADE, T.J.; SAMS, E.; BRENNER, K.P.; HAUGLAND, R.; CHERN, E.; BEACH, M.; WYMER, L.; RANKIN, C.C.; LOVE, D.; LI, Q.; NOBLE, R.; DUFOUR, A.P. Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study. Environmental Health, v.9, p.66, WANG, G.; KAMALAKARAN, S.; DHAND, A.; HUANG, W.; OJAIMI, C.; ZHUGE, J.; YEE, L.L.; MAYIGOWDA, P.; SURENDRAIAH, P.K.; DIMITROVA, N.; FALLON, J.T. Identification of a novel clone, ST736, among Enterococcus faecium clinical isolates and its association with daptomycin nonsusceptibility. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.58, n.8, p , WEGENER, H.C. Historical yearly usage of glycopeptides for animals and humans: the American-European paradox revisited. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.42, p.3049, WEGENER, H.C.; AARESTRUP, F.M.; JENSEN, L.B.; HAMMERUM, A.M.; BAGER, F. Use of antimicrobial growth promoters in food animals and Enterococcus faecium resistance to therapeutic antimicrobial drugs in Europe. Emerging Infectious Diseases, v.5, p , WERNER, G.; COQUE, T.M.; HAMMERUM, A.M.; HOPE, R.; HRYNIEWICZ, W.; JOHNSON, A.; KLARE, I.; KRISTINSSON, K.G.; LECLERCQ, R.; LESTER, C.H.; LILLIE, M.; NOVAIS, C.; OLSSON-LILJEQUIST, B.; PEIXE, LV.; SADOWY, E.; SIMONSEN, G.S.; TOP, J.; VUOPIO-VARKILA, J.; WILLEMS, R.J.; WITTE, W.; WOODFORD, N. Emergence and spread of vancomycin resistance among enterococci in Europe. Eurosurveillance, v.13, p.1-11, WERNER, G.; FLEIGE, C.; GERINGER, U.; VAN SCHAIK, W.; KLARE, I.; WITTE, W. IS element IS16 as a molecular screening tool to identify hospital-associated strains of

103 103 Enterococcus faecium. BMC Infectious Diseases, v.11, p.1-8, WERNER, G.; KLARE, I.; WITTE, W. Large conjugative vana plasmids in vancomycinresistant Enterococcus faecium. Journal of Clinical Microbiology, v.37, n.7, p , WERNER, G.; KLARE, I.; WITTE, W. The current MLVA typing scheme for Enterococcus faecium is less discriminatory than MLST and PFGE for epidemic-virulent, hospital-adapted clonal types. BMC Microbiology, v.7, p.28, WERNER, G.; KLARE, I.; WITTE, W. Arrangement of the vana gene cluster in enterococci of different ecological origin. FEMS Microbiology Letters, v.155, p.55-61, WHO. Programmes and projects, Zoonoses and veterinary public health. Disponível em: Aessado em: 19 dez WILLEMS, R.J.; VAN SCHAIK, W. Transition of Enterococcus faecium from comensal organism to nosocomial pathogen. Future Microbiology, v.4, n.9: , WILLEMS, R.J.; TOP, J.; VAN DEN BRAAK, N.; VAN BELKUM, A.; MEVIUS, D.J.; HENDRINKS, G., VAN SANTEN-VERHEUVEL, M.; VAN EMBDEN, J.D. Molecular diversity and evolutionary relationships of Tn1546-like elements in enterococci from humans and animals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.43, p , WITTE, W. Selective pressure by antibiotic use in livestock. International Journal of Antimicrobial Agents, v.16, p.s1924, WITTE, W.; STROMMENGER, B.; WERNER, G. Diagnostics, typing & taxonomy. In Gram positive pathogens 2nd edition. Edited by: Fischetti VA, Novick RP, Ferretti JJ, Portnoy DA, Rood JI. Washington D.C.: ASM Press; WOODFORD, N.; ADEBIYL, A.M.; PALEPOU, M.F.; COOKSON, B.D. Diversity of VanA glycopeptide resistance elements in enterococci from humans and nonhuman sources. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.42, p , WOODFORD, N.; JOHNSON, A.P.; MORRISON, D.; SPELLER, D.C.E. Current perspectives on glycopeptide resistance. Clinical Microbiology Reviews, v.8, n.4, p , WRIGHT, G.D. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity. Nature Reviews Microbiology, v.5, p , 2007.

104 104 ZANELLA, R.C.; VALDERATO, F.; LOVGREN, M.; TYRREL, G.J.; BOKERMANN, S.; ALMEIDA, S.C.G.; VIEIRA, V.S.; BRANDILEONE, M.C.C. First confirmed case of a vancomycin-resistant Enterococcus faecium with Van A phenotype from Brazil: isolation from a meningits case in São Paulo. Microbial Drug Resistance, v.5, p , ZANELLA, R.C.; BRANDILEONE, M.C.; BOKERMANN, S.; ALMEIDA, S.C.; VALDETARO, F.; VITÓRIO, F. Phenotypic and genotypic characterization of VanA Enterococcus isolated during the first nosocomial outbreak in Brazil. Microbial Drug Resistance, v.9, n.3, p , ZDRAGAS, A.; PARTHENIOU, P.; KOTZAMANIDIS, C.; PSONI, L.; KOUTITA, O.; MORAITOU, E.; TZANETAKIS, N.; NIANGOU, M. Molecular characterization of low-level vancomycin-resistant enterococci found in coastal water of Thermaikos Gulf, Northern Greece. Water Research, v.42, n.4-5, p , ZENG, J.; TENG, F.; MURRAY, B.E. Gelatinase is important for translocation of Enterococcus faecalis across polarized human enterocyte-like T84 cells. Infection and Immunity, v.73, p , ZHU, X.; ZHENG, B.; WANG, S.; WILLEMS, R.J.; XUE, F.; CAO, X.; LI, Y.; BO, S.; LIU, J. Molecular characterisation of outbreak-related strains of vancomycin-resistant Enterococcus faecium from an intensive care unit in Beijing, China. Journal of Hospital Infection, v.72, n.2, p , 2009.

105 Anexos 105

106 106 Anexo 1 Gel de agarose a 1% demonstrando a amplificação dos genes que codificam a ligase D-alanina D-alanina (ddl) utilizada na confirmação das espécies E. faecalis e E. faecium pb 550 pb Legenda - Linhas 1: marcador de peso molecular de 100pb, 2: cepa padrão E. faecium 228, 3: E. faecalis ATCC 29212, 4: E. faecium 38, 5: E. faecium 11, 6: E. faecium 57, 7: E. faecium 320, 8: E. faecalis 438 e 9: E. faecium 402.

107 107 Anexo 2 Gel de agarose a 1% demonstrando a amplificação do gene vana pb Legenda - Linhas 1: marcador de peso molecular de 100pb, 2: cepa padrão E. faecium 228 (vana), 3: E. faecium 38, 4: E. faecium 11, 5: E. faecium 57, 6: E. faecium 320, 7: E. faecalis 438 e 8: E. faecium 402.

108 108 Anexo 3 - Produtos de amplificação do gene de virulência (acm) das cepas de E. faecium após eletroforese em gel de agarose 1% pb pb Legenda - Linhas: 1, 14 e 15 marcador de peso molecular de 100pb, 2: E. faecium 98A, 3: E. faecium 378, 4: E. faecium 57, 5: E. faecium 320, 6: E. faecium 09, 7: E. faecium 38, 8: E. faecium 9, 9: E. faecium 11, 10: E. faecium 28, 11: E. faecium 21, 12: E. faecium 55, 13: E. faecium 402, 16: E. faecium TX0016 (controle positivo), 17: E. faecalis JH2-2 (controle negativo) e 18: controle negativo da reação.

109 109 Anexo 4 - Amplificação dos sete genes housekeeping de E. faecalis Legenda - Linhas 1 e 10: marcador de peso molecular de 100pb, 2: dgh (glicose-6-fosfato desidrogenase), 3: gyd (desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato), 4: psts (fosfato de transportador cassete de ligação ATP), 5: gki (glucoquinase putativo), 6: aroe (5 chiquimato desidrogenase), 7: xpt (5 chiquimato desidrogenase), 8: yiql (acetil-coenzima A acetiltransferase) 9: controle negativo.

110 110 Anexo 5 - Amplificação dos sete genes housekeeping de E. faecium Legenda - Linhas 1: marcador de peso molecular de 100pb, 2: atpa (ATP sintetase, subunidade alfa), 3: ddl (Dalanina- D-alanina), 4: gdh (Desidrogenase glicose-6-fosfato), 5: purk (fosforibosilaminoimidazol carboxilase subunidade ATPase), 6: gyd (deidrogenase gliceraldeido-3-fosfato), 7: psts (transportador cassete ligado a ATP fosfato), 8: adk (adenilato quinase) e 9: controle negativo.

111 Anexo 6 Informações para os Membros da Banca Julgadora de Mestrado/Doutorado. 111

112 Anexo 7 Ficha do aluno. 112

113 Anexo 7 Continuação 113

114 114 Anexo 8 Artigo publicado: SACRAMENTO et al., Environmental dissemination of vana-containing Enterococcus faecium strains belonging to hospital-associated clonal lineages, p.1-2, 2015a.

115 115

116 116 Anexo 9 Artigo aceito para publição: SACRAMENTO et al., Identification of New Sequence Types among Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis carrying vana gene in Retail Chicken Meat, 2015b.

117 117

118 118

119 119

120 120

121 121