UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ HELOISA MAGAGNIN BRINCAS ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ HELOISA MAGAGNIN BRINCAS ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA CURITIBA 2015

2 HELOISA MAGAGNIN BRINCAS ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA Monografia apresentada à Coordenação de Ciências Biológicas, Setor de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de bacharel em Ciências Biológicas. Orientadora: Profª Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli CURITIBA 2015

3 Aos meus pais que sempre zelaram por mim, muito obrigada por tudo, vocês são parte fundamental dessa conquista.

4 AGRADECIMENTOS Aos meus orientadores, Profª. Drª. Enilze Ribeiro e ao Profº. Dr. Iglenir João Cavalli, que me orientaram de forma brilhante e estiveram muito presentes desde o início, estimulando meu desenvolvimento. Obrigada por mostrarem uma dedicação tão grande para a formação de pesquisadores. Aos meus amigos e colegas do Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética, por todo o companheirismo e bons momentos que passamos juntos nestes anos. Em especial ao Leandro Serino, que desde o início foi meu tutor e amigo e me ensinou muito. E à Tayana Schultz, parceira de tantos experimentos e técnicas, sempre disposta a me ajudar. Aos grandes amigos que me acompanham desde o começo do curso e me apoiaram em momentos decisórios de minha vida, por todas as risadas, palavras de incentivo e momentos juntos. À ECOS - Empresa Júnior de Biologia UFPR pelos importantes aprendizados que me ajudaram a realizar meus projetos com excelência. Às amigas da genética que ajudaram a descontrair e levar os momentos mais difíceis do trabalho com mais leveza. À Carol Mathias que me ajudou no começo quando tudo e todos no laboratório ainda eram novos e desde então tem sido uma grande amiga. Em especial aos meus pais Cida e Mauricio e meu irmão Heitor, que sempre me apoiaram em todos os meus projetos e sonhos, são eles os responsáveis por eu estar aqui. Ao CNPq pelo apoio financeiro. À Deus, pois é Ele quem molda nossos caminhos.

5 Se não sai de ti a explodir apesar de tudo, não o faças Charles Bukowski

6 RESUMO O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais incidente na população feminina mundial, menos frequente somente que o câncer de pele não melanoma e representa a primeira causa de morte por câncer na população feminina brasileira. A mortalidade por esta doença poderia ser muito menor se o diagnóstico fosse realizado precocemente e se tratamentos mais específicos fossem empregados já nos estágios iniciais da doença. Os tumores costumam ser divididos em subtipos de acordo com suas características histológicas e expressão gênica. Para classificação dos tumores costuma-se fazer a análise imuno-histoquímica para se avaliar o status dos receptores hormonais e da proteína HER2, subdividindo-os em Luminal A, Luminal B, HER2+, e Triplo- Negativos. O gene alvo deste estudo, o FADD, se encontra na região cromossômica 11q13, conhecida por estar amplificada em tumores, e codifica uma proteína adaptadora essencial na transdução de sinais apoptóticos dos receptores de morte e que tem também efeito sobre a progressão do ciclo celular. Com o objetivo de avaliar a presença ou ausência de alteração do número de cópias de FADD, de acordo com os subtipos e parâmetros clínicos e histopatológicos de carcinomas primários de mama, 45 amostras foram analisadas, sendo seis triplo-negativas, 13 luminais A, 17 luminais B e nove HER2+. Como alterações no nível genômico são mais estáveis do que no nível de mrna, diferenças no número de cópias podem auxiliar na correta classificação, na escolha do tratamento e assim ajudar a reduzir a mortalidade. Foi observado um ganho de número de cópias em 53% das amostras analisadas. Utilizando-se o teste t de Student e o teste de Kruskal-Wallis não se detectou diferença significativa do número de cópias entre os parâmetros nem entre os subtipos. O número de cópias de FADD não demonstrou potencial de discriminação entre os parâmetros analisados, porém era aumentado nas amostras, o que pode ser sugestivo do seu envolvimento na tumorigênese, conferindo vantagem proliferativa e de sobrevivência a estas células cancerosas. Palavras-Chave: FADD. Número de cópias de DNA. Câncer de mama.

7 Abstract Breast cancer is the second most frequent cancer among women worldwide, only not as frequent as skin cancer non-melanoma. In Brazil it is the biggest death cause in recurrence of cancer between women. Death rates could be minimized in response to earlier diagnosis and administration of more specific treatments at initial stages of the disease. Tumors are divided in subtypes according to their genomic expression and histological characteristics. To classify these tumors it is usual to perform immuno-histochemical analyses to evaluate the status of the hormonal receptors and of the HER2 protein, subdividing them in four classes: triple-negative, Luminal A, Luminal B and HER2+. This study focuses on the FADD gene, localized at the chromosomic region 11q13, which is known to be amplified in cancer cells. The FADD protein encoded by this gene is an adaptor protein essential to the transduction of apoptotic signs from the death receptors, and it is also involved in cell cycle progression. To evaluate whether alterations in FADD copy number could differentiate between subtypes and clinical histological parameters, 45 breast cancer samples were analyzed: six triple-negative, 13 luminal A, 17 luminal B and nine HER2+. Since alterations at genomic level as copy number alterations are more stable then mrna differences, studies of the copy number could be helpful in order to assure a correct classification and determining the right treatment, reducing mortality rates. In our study, 53% of the breast cancer patients had an increase in the copy number of FADD. Analyzing our data by using t Student test and Kruskal-Wallis test, no differences of copy number where found between subtypes, neither between different histological parameters. FADD has not shown potential to discriminate between analyzed parameters, but its increase in cancer comparing to normal tissue, could be an indicative of its involvement in tumorigenesis. FADD may confer to these cancer cells proliferative and survival advantage. Keywords: FADD. DNA Copy Number. Breast Cancer.

8 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS SUBTIPOS DE TUMORES DE MAMA. CLASSIFICAÇÃO DOS TUMORES DE MAMA DE ACORDO COM O STATUS DOS RECEPTORES HORMONAIS E DE RECEPTOR HER FIGURA 2 - APRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO CROMOSSOMO FIGURA 3 - ESTRUTURA DO GENE FADD FIGURA 4 - MODELO DE SINALIZAÇÃO DE APOPTOSE VIA Fas... 22

9 LISTA DE IMAGENS IMAGEM 1 - FADD SENDO EXPRESSO NO NÚCLEO E NO CITOPLASMA... 24

10 LISTA DE QUADROS QUADRO 1 - CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DOS SUBTIPOS MOLECULARES DE CÂNCER DE MAMA QUADRO 2 - CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CARCINOMA MAMÁRIO... 30

11 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - DISTRIBUIÇÃO PROPORCIONAL DOS DEZ TIPOS DE CÂNCER MAIS INCIDENTES ESTIMADOS PARA 2014 POR SEXO, EXCETO PELE NÃO MELANOMA* TABELA 2 INFORMAÇÕES CLINÍCAS E HISTOPATOLÓGICAS DAS PACIENTES PORTADORAS DE CARCINOMA MAMÁRIO DE ACORDO COM OS SUBGRUPOS TABELA 3: COMPONENTES DA REAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL PARA ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE EM ESTUDO

12 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 - ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA GRÁFICO 2 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA TRIPLO-NEGATIVOS GRÁFICO 3 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA DO SUBTIPO LUMINAL A GRÁFICO 4 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA DO SUBTIPO LUMINAL B GRÁFICO 5 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA DO SUBTIPO HER GRÁFICO 6 - ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD DE ACORDO COM OS SUBTIPOS GRÁFICO 7 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM PACIENTES COM PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE METÁSTASE EM LINFONODOS GRÁFICO 8 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM PACIENTES COM TUMORES GRAUS I E II EM RELAÇÃO AOS DE GRAU III GRÁFICO 9 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM PACIENTES EM PRÉ-MENOPAUSA E PÓS-MENOPAUSA

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA A PROBLEMÁTICA DO CÂNCER DE MAMA CLASSIFICAÇÃO DO CÂNCER DE MAMA O GENE FADD ESTUDO DE NÚMERO DE CÓPIAS OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA PROCESSAMENTO DO MATERIAL PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS NÚMERO DE CÓPIAS DE ACORDO COM O SUBTIPO DE CARCINOMA MAMÁRIO PARÂMETROS CLÍNICOS E HISTOPATOLÓGICOS Presença e Ausência de Metástase em Linfonodos Axilares Grau Histológico do Tumor Idade da Paciente DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 47

14 14 1 INTRODUÇÃO O câncer de mama é um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por diferentes alterações moleculares. Geralmente é originado nas células epiteliais que revestem os ductos e lóbulos mamários. A utilização de uma classificação molecular é de grande relevância na prática clínica sendo muito importante como fator de prognóstico e de previsão de resposta à tratamentos (REIS-FILHO; PUSZTAI, 2011). A classificação utilizada neste estudo é baseada na classificação molecular em subtipos realizada por Perou et al. (2000) posteriormente validada por Sorlie et al. (2001 e 2003), e subdivide as neoplasias mamárias em cinco grupos principais: luminal A, luminal B, basal, HER2 positivo (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), e normal like. Utilizamos aqui uma classificação simplificada baseada na imuno-histoquímica, segundo Goldhirsch et al. (2011). Neste estudo tivemos o objetivo de contribuir para a classificação de carcinomas primários de mama estimando o número de cópias do gene FADD, desde que trabalhos anteriores do nosso grupo com CGH-array demonstraram alterações do número de cópias da região cromossômica onde está mapeado este gene. O gene FADD se encontra no cromossomo 11, região q13 que se apresenta frequentemente amplificada em células de diversos tipos de câncer (KIM et al., 1996). FADD é a principal proteína transdutora dos sinais apoptóticos a partir dos receptores de morte. A presença de FADD intranuclear está relacionada também com a progressão no ciclo celular (CHEN et al., 2005; SHEIKH; HUANG, 2003). FADD também atua na maturação de linfócitos T e B, em processos inflamatórios e de autofagia (BELL et al., 2008; TOURNEUR; CHIOCCHIA, 2010). Alguns tratamentos contra o câncer utilizam as vias apoptóticas dependentes de FADD como os tratamentos que usam a via TRAIL para levar as células de câncer a apoptose (CHINNAIYAN et al., 2000). Estas características tornam este gene e seu produto importantes candidatos na gênese e progressão dos carcinomas mamários.

15 15 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 A PROBLEMÁTICA DO CÂNCER DE MAMA O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais incidente na população feminina mundial, menos frequente somente que o câncer de pele não melanoma. Corresponde a 23% (1,38 milhões) dos novos casos de câncer diagnosticados na população mundial e 14% ( ) do número de mortes por câncer (JEMAL; BRAY; FERLAY, 2011). TABELA 1 - DISTRIBUIÇÃO PROPORCIONAL DOS DEZ TIPOS DE CÂNCER MAIS INCIDENTES ESTIMADOS PARA 2014 POR SEXO, EXCETO PELE NÃO MELANOMA* FONTE: Instituto Nacional de Câncer - INCA (2014) NOTA: *Números arredondados para 10 ou múltiplos de 10. Na população brasileira foram estimados novos casos de câncer de mama para 2014, estimativa válida também para 2015, com um risco estimado de 56,09 casos a cada 100 mil mulheres (INCA 2014) (TABELA 01). 2.2 CLASSIFICAÇÃO DO CÂNCER DE MAMA O câncer de mama é uma doença heterogênea em relação às alterações moleculares, à composição celular e aos aspectos clínicos. Os cânceres de mama apresentam em sua maioria origem epitelial (mais de 95%) (TOMASKOVIC- CROOK; THOMPSON; THIERY, 2009). As células que originam as neoplasias mamárias são em sua maioria células que revestem os ductos e os lóbulos

16 16 mamários (estes carcinomas são denominados carcinomas ductais e carcinomas lobulares respectivamente). Há também tumores de mama menos frequentes, cuja proliferação celular se inicia de outras células como é o caso dos tumores mucinosos, medulares, tubulares e papilares (GUIMARÃES, 2008). A primeira lesão que ocorre no processo de formação de carcinoma é a hiperplasia das células epiteliais (sem atipia citológica) e com poucas alterações genéticas. Nesta fase o aumento do número de células é autolimitado. As lesões pré-cancerosas passam então a apresentar uma elevada taxa de divisões celulares e as células começam a apresentar certo grau de atipia citológica. Estas lesões podem progredir para a forma de carcinoma in situ (CIS) onde as atipias das células se apresentam bem evidentes e há alto índice de taxa mitótica e alterações genéticas. Os carcinomas in situ são considerados carcinomas em que as células neoplásicas não rompem a membrana basal proliferando-se em seu local de origem. Os carcinomas invasivos por sua vez são caracterizados pelo rompimento da membrana basal das células e invasão de tecidos adjacentes iniciando assim o processo de metástase. O carcinoma ductal invasivo é o tipo mais comum de câncer de mama representando cerca de 65% a 80% de todos os casos diagnosticados (EHEMAN et al., 2009; THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY, 2015). Entre os carcinomas não invasivos, o carcinoma ductal in situ é o que apresenta maior incidência. Uma das classificações dos tumores é pelo grau de diferenciação histológica como pleomorfismo nuclear, formação do túbulo/glândula, e atividades mitóticas para os carcinomas invasivos que classificam os tumores em: grau I (bem diferenciado), grau II (moderadamente diferenciado) e grau III (pouco diferenciado) (OLDENBURG et al., 2007). A classificação do câncer de mama pode ser feita também com base no sistema TNM, proposto pela UICC (International Union Against Cancer 2013), que classifica o câncer conforme sua extensão anatômica, determinada clínica e histopatologicamente. Este sistema avalia três parâmetros principais: T que corresponde à extensão do tumor, N que se refere à ausência ou presença e a extensão de metástases em linfonodos regionais e M que se refere à ausência ou presença de metástase à distância. Adiciona-se então um número a estes

17 17 componentes que se refere à extensão maligna da doença tendo-se na classificação T0, T1, T2, T3, T4; N0, N1, N2, N3; e M0 ou M1. O desenvolvimento da técnica de microarranjos de DNA possibilitou a avaliação de diversas variáveis genéticas simultaneamente, a partir desta técnica foi criada uma melhor classificação das neoplasias mamárias, com o auxílio de recursos de bioinformática (RAKHA et al., 2008). As técnicas moleculares possibilitaram a definição de uma correlação mais detalhada dos tumores no nível genômico. O primeiro trabalho a analisar expressão gênica e diversidade fenotípica no câncer de mama para determinar uma classificação molecular para as neoplasias mamárias foi realizado por Perou et al. (2000). Este trabalho posteriormente validado e ampliado por Sorlie et al. (2001 e 2003), subdividiu os tumores de mama em cinco grupos principais: luminal A, luminal B, basal, HER2 positivo (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2), e normal like (QUADRO 1) (FIGURA 1). QUADRO 1 - CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DOS SUBTIPOS MOLECULARES DE CÂNCER DE MAMA LEGENDA: Receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR), human epidermal growth factor receptor 2 - HER2 (ERBB2), citoqueratinas 5 e 6 (CK5/6), epidermal growth factor receptor gene (EGFR), tumor protein p53 gene (TP53), positivo (+), negativo (-). FONTE: Adaptado de EROLES et al. (2012)

18 18 FIGURA 1 - ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DOS SUBTIPOS DE TUMORES DE MAMA. CLASSIFICAÇÃO DOS TUMORES DE MAMA DE ACORDO COM O STATUS DOS RECEPTORES HORMONAIS E DE RECEPTOR HER2 LEGENDA: Receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR), Receptor de HER2 (HER2), (+) indica presença, (-) indica ausência. FONTE: Adaptado de SANDHU et al. (2010) O subtipo Luminal A representa 50-60% dos casos de câncer, sendo assim o subtipo mais frequentemente observado (EROLES et al., 2012). Este grupo apresenta positividade para os receptores de estrogênio e progesterona e negatividade para o receptor HER2, além de baixa expressão de genes de proliferação celular, o prognóstico para esse subtipo é favorável e normalmente é utilizada terapia hormonal, sendo a quimioterapia restrita a alguns casos específicos. O subtipo Luminal B representa 10 a 20% de todos os casos de câncer de mama, apresenta positividade para os receptores de estrogênio e progesterona e na maioria das vezes HER2 apresenta-se positivo. Em comparação com o luminal A apresentam um fenótipo mais agressivo, um maior grau histológico e um pior prognóstico, resultantes da maior expressão de genes de proliferação como o MKI67 e a ciclina-b1 (EROLES et al., 2012). Os tratamentos comumente

19 19 utilizados são a terapia hormonal, como o Tamoxifeno (um modulador seletivo do receptor de estrogênio) e a quimioterapia. Quinze a vinte por cento de todos os cânceres de mama são do subtipo HER2 + (EROLES et al., 2012). Este subtipo apresenta negatividade para os receptores hormonais e alta expressão do receptor HER2 e genes associados. Com um alto potencial proliferativo e alto grau histológico seu prognóstico não é favorável e normalmente é utilizado Trastuzumab (um anticorpo monoclonal direcionado ao receptor HER2) e quimioterapia como forma de tratamento. Na maioria dos casos apresentam melhor resposta a quimioterapia do que os subtipos luminais. Os tumores do subtipo basal representam entre 10 a 20% dos tumores mamários, e apresentam negatividade para os três receptores (estrogênio, progesterona e HER2) e expressam EGFR e CK5/6. Tendem a ser carcinomas ductais infiltrantes com alto índice mitótico, necrose tumoral e margens em expansão. Mesmo apresentando uma boa resposta à quimioterapia a reincidência do subtipo basal costuma ser agressiva atingindo principalmente os órgãos viscerais (principalmente o pulmão), o sistema nervoso central e linfonodos. Costuma apresentar alta taxa de mutação no gene TP53 o que ajuda a explicar sua agressividade (SØRLIE et al., 2001). O subtipo normal-like representa entre 5 a 10% dos carcinomas mamários. Expressa genes característicos de tecido adiposo e o prognóstico é intermediário entre os subtipos luminal e o basal. Geralmente não expressam os três receptores (estrogênio, progesterona e HER2) podendo ser considerados triplo negativo (TN) sem serem considerados basais por não terem expressão de EGFR e CK5 (EROLES et al., 2012). É provável que não representem verdadeiramente um subgrupo, acredita-se que sejam artefatos da contaminação dos microarranjos por tecido normal. Ainda existe um sexto subtipo o claudin-low identificado por Herschkowitz et al. (2007), e caracterizado por uma baixa expressão de genes de junções celulares ocludentes e glicoproteínas de adesão célula-célula incluindo as claudinas -3, -4, -7, as ocludinas e a E-caderina. Exibe baixa expressão de HER2 e de genes luminais e superexpressa 40 genes relacionados à resposta imune. Apesar de terem baixa expressão de genes relacionados à proliferação celular

20 20 apresentam um prognóstico ruim, pois expressam genes envolvidos na transição epitelial-mesenquimal (EROLES et al., 2012). Atualmente ainda não estão completamente estabelecidas as diferenças entre os tumores do subtipo basal e os triplos negativos. Ambos negativos para os receptores de estrogênio, progesterona e HER2, apresentam prognóstico não favorável, pois não respondem a terapias hormonais ou ao Trastuzumab, sendo a quimioterapia a melhor opção nesses casos. 2.3 O GENE FADD O FADD, gene alvo do presente estudo, foi escolhido a partir de estudo anterior de nosso grupo de pesquisa realizado por Torresan (2011) em colaboração com a Georgetown University, Washington, DC, USA. O estudo de Torresan aplicou a metodologia de CGH-array para investigar alterações do número de cópias do DNA de amostras de tumores primários e metástases axilares. Os resultados dos ensaios apontaram que 90% das alterações mais frequentes eram comuns aos dois grupos estudados e se localizavam preferencialmente nas regiões cromossômicas 8q24.3, 11p15.5-p15.4, 11q13.1- q13.4, 16p11.2, 17q12-q21, 17q25.1-q25.3, 20q13.33, 21q22.3 e Xq13.1. Foram identificados então os genes presentes nestas regiões selecionadas, dentre eles estavam muitos genes que já haviam sido associados ao câncer de mama, como o FADD (TORRESAN, 2011). O gene FADD contém dois éxons, extensão de aproximadamente 3,6kb e foi mapeado pelo estudo de KIM et al. (1996) no cromossomo 11, região q13.3 (FIGURA 2). Esta é uma região descrita como amplificada em vários tipos de câncer e estes autores verificaram amplificação do FADD em uma linhagem celular de câncer de mama a MDA-MB-134-VI. Os dois éxons do gene FADD são separados por um íntron de aproximadamente 2.0 kb, e as regiões codificadoras do éxon 1 e 2 apresentam um comprimento de 286 e 341 bp respectivamente (FIGURA 3) (KIM et al., 1996). Este gene é responsável pela codificação da proteína FADD (Fasassociated protein with death domain), também chamada MORT1, que em

21 21 humanos, foi por muito tempo considerada uma proteína estritamente citoplasmática. Atualmente sabe-se que está presente também no núcleo celular (GÓMEZ-ANGELATS; CIDLOWSKI, 2003). FADD é a principal molécula adaptadora a fazer a transmissão dos sinais apoptóticos a partir dos receptores de morte e desempenha um importante papel no desenvolvimento embrionário (TOURNEUR; CHIOCCHIA, 2010). FIGURA 2 - APRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO CROMOSSOMO 11 LEGENDA: Em vermelho está a localização do gene FADD. FONTE: (2015) FIGURA 3 - ESTRUTURA DO GENE FADD LEGENDA: A, Representação do cdna do FADD. B, representação do gene e da organização de seus éxons/íntrons. As caixas azuis representam os éxons, sendo a região sem preenchimento a região não codificadora e a região preenchida a região codificadora, as linhas representam os íntrons. O domínio de morte está representado pela região hachurada. As bases estão numeradas de acordo com o sítio correspondente ao início de tradução. FONTE: Adaptado de KIM et al. (1996) Conhecida por sua interação com Fas (FIGURA 4) e com o TNFR1 (receptor do fator de necrose tumoral) a FADD faz o recrutamento e ativação das

22 22 procaspases 8 e 10 levando a célula à apoptose. FADD é uma molécula adaptadora que pode transduzir os sinais apoptóticos também pelas vias do DR3 (death receptor 3), e do TRAIL-R1 (TNF-related apoptosis inducing ligandreceptor) também conhecido como DR4 (death receptor 4) e do TRAIL-R2 também conhecido como DR5 (death receptor 5) (SCHNEIDER et al., 1997; SHERIDAN et al., 1997). A proteína de 23-kDa é constituída por 208 aminoácidos e possui dois domínios principais, o domínio de morte (DD) na extremidade C-terminal e o domínio efetor de morte (DED) na extremidade N-terminal. O domínio de morte (DD) é responsável pela ancoragem da mesma nos receptores de morte e a partir daí recruta e ativa o complexo DISC (do inglês death-inducing signaling complex) que por sua vez ativará as procaspases 8 e 10 recrutadas pelo domínio efetor de morte (DED) (SCAFFIDI et al., 1998; SPRICK et al., 2002). FIGURA 4 - MODELO DE SINALIZAÇÃO DE APOPTOSE VIA Fas LEGENDA: A ativação do Fas a partir da ligação de FasL recruta FADD/MORT1, que possui seu domínio de morte (DD) e o domínio efetor de morte (DED). FADD se liga ao Fas (através de interações DD-DD) e recruta caspase-8 (através de uma interação DED-DED). Este agregado de Fas, FADD e caspase-8 foi denominado DISC (Death-Inducing Signaling Complex) e permite a autoativação proteolítica da caspase-8 que gera caspase-8 ativa (constituída por p18 e p10). Esta caspase ativa ativará outras caspases efetoras levando à morte celular. FONTE: Adaptado de ZHANG; ZHANG; HUA (2004)

23 23 Para exemplificar uma via apoptótica em que FADD é necessária pode-se observar a morte por apoptose induzida pelo receptor TRAIL-R1, R2. A molécula indutora de apoptose TRAIL se liga aos receptores DR4 e/ou DR5 na superfície da célula, isto desencadeia o recrutamento dos elementos do complexo DISC através da proteína ativadora FADD, a qual recruta e possibilita a ativação das proteases iniciadoras de apoptose, caspase 8 e/ou 10. Após estarem ativadas estas caspases fazem a clivagem proteolítica das caspases efetoras (caspases 3, -6, e 7-) que por sua vez induzirão as respostas que levam à morte celular (BHOJANI; ROSSÚ; REHEMTULLA, 2003). Estudos mostram que a forma dominante negativa da FADD (que apresenta a região DD conservada, porém não tem a região DED), é capaz de interagir com os receptores Fas e TNFR-1, mas não permite a ativação das vias apoptóticas através dos mesmos (CHINNAIYAN et al., 1996). No estudo de Chinnaiyan et al. (1996) foi testado também se a forma dominante negativa do FADD apresentava efeito sobre uma via alternativa regulada pelo TNFR-1 (a via de ativação de NF-kB). As células que apresentavam a forma dominante negativa de FADD não apresentaram diferença no nível de ativação de NF-kB, confirmando que a FADD atua exclusivamente na via apoptótica de Fas e TNFR- 1, sendo que na ausência da proteína funcionalmente normal, ocorre uma redução significativa da apoptose. Gómez-Angelats e Cidlowski (2003) em seus estudos descobriram evidências da presença nuclear de FADD e comprovaram a existência de domínios de sinalização de localização nuclear (NLSs) na sequência de aminoácidos de FADD. Foi detectada a expressão constitutiva de FADD tanto no citoplasma quanto no núcleo de diferentes linhagens celulares por microscopia confocal. Foram estudadas as linhagens de células HeLa, HEK 293, Jurkat, HTC, COS-1, and A549 que foram marcadas com anticorpo monoclonal do domínio DD de FADD ou com anticorpo monoclonal que reconhece a forma fosforilada de FADD. As células que apresentaram FADD concentrada em seus núcleos foram as da IMAGEM 1, painéis a,b,d,f. Enquanto que as células Jurkat apresentaram em 50% da população de células FADD no núcleo e outro 50% apresentou FADD concentrada no citoplasma (IMAGEM 1c) (GÓMEZ-ANGELATS; CIDLOWSKI, 2003).

24 24 IMAGEM 1 - FADD SENDO EXPRESSO NO NÚCLEO E NO CITOPLASMA LEGENDA: Imagem por imunofluorescência da distribuição endógena de FADD em microscópio confocal de células HeLa (a e e), A549 (b), Jurkat (c), e HEK 293 (d e f) mostradas nos painéis a esquerda e sua respectiva marcação nuclear (Hoechst) nos painéis da direita. Células fixadas expostas a anticorpo monoclonal anti-fadd IgG mais Alexa Fluor 594 anti-rato (a-d) e anticorpo policlonal de coelho anti-fadd mais FITC-marcado anti-coelho (e e f). FONTE: GÓMEZ-ANGELATS; CIDLOWSKI (2003) Um dos níveis de regulação da FADD em mamíferos ocorre por via da fosforilação de FADD na serina-194 por uma kinase de 70-kDa ainda não identificada relacionada ao ciclo celular, mesmo com a fosforilação da FADD ambas as formas de FADD interagem normalmente com os receptores de morte (SCAFFIDI et al., 2000). O papel da FADD na indução da proliferação celular e na tumorigênese ainda não é bem entendido, o artigo de CHEN et al. (2005) elucida em partes esta questão. Neste trabalho eles comprovaram a evidência de que FADD fosforilada (p-fadd) tem papel importante na translocação de FADD para o núcleo e na progressão do ciclo celular. Já havia sido reportado que a mutação de uma serina na posição 194 para uma alanina levava a concentração de FADD restrita ao citoplasma e a problemas na progressão celular (HUA et al., 2003). Os casos de câncer de pulmão com níveis aumentados de FADD mrna e proteína estão

25 25 relacionados de forma significativa com uma reduzida taxa de sobrevivência (CHEN et al., 2005). A partir dessa constatação CHEN et al. (2005) desenvolveram ensaios de microarranjos de tecido que mostraram que a localização nuclear de FADD e o aumento de concentração de sua forma fosforilada (p-fadd) levam a um pior prognóstico. Para testar a relação entre FADD que se apresenta fosforilada no resíduo Ser194 do domínio C-terminal e a atividade apoptótica e a ativação de NF-kB os autores criaram diversos mutantes de FADD com a região Ser194 modificada para outro aminoácido. Então verificaram que as células mutadas, incapazes de sofrer fosforilação, não tiveram sua atividade de apoptose alterada, em contrapartida a forma mutada apresentou uma atividade de NF-kB reduzida mostrando que a fosforilação de FADD é importante para a ativação de NF-kB. As células expressando p-fadd normal apresentaram maior ativação de NF-kB e maior expressão de ciclinas B1 e D1 que são importantes na progressão G2/M do ciclo celular, são induzíveis pelo fator NF-kB e estão relacionadas com pior prognóstico em casos de adenocarcinomas de pulmão (CHEN et al., 2005). Em resumo, estes estudos mostram que esta indução da atividade de NF-kB e consequentemente o efeito de progressão de ciclo celular que isto causa, pode ser a chave para se explicar a maior agressividade associada a níveis elevados de p-fadd nos adenocarcinomas de pulmão e talvez também em outros tipos de câncer (CHEN et al., 2005). Além da função de apoptose FADD está envolvida na regulação do processo de doenças autoimunes, pois age na regulação do desenvolvimento de linfócitos T e B, no desenvolvimento do câncer, atuando também na proliferação e na progressão do ciclo celular, sinalização de processos inflamatórios, necrose e autofagia (KABRA et al., 2001; SCHAUB et al., 2000; TOURNEUR; CHIOCCHIA, 2010; VIRGIN; LEVINE, 2009). Desempenha um papel importante nos diferentes estágios do desenvolvimento do tumor podendo atuar também como um supressor de tumor sendo que sua ausência resulta em resistência a quimioterapia, escape do sistema imune e vantagem proliferativa (TOURNEUR; BUZYN; CHIOCCHIA, 2005). Sendo assim, o melhor conhecimento de suas características, poderá possibilitar o desenvolvimento de drogas específicas para controlar o processo de

26 26 morte celular (TOURNEUR; BUZYN; CHIOCCHIA, 2005) e possibilitará o aprimoramento das drogas em fase de desenvolvimento que atuam na modulação da morte celular em diversos tipos de câncer (CHINNAIYAN et al., 1996). Como exemplo têm-se as drogas indutoras de morte celular via receptor de morte TRAIL onde a ativação da apoptose depende da presença da proteína FADD (CHINNAIYAN et al., 2000). Sabe-se que TRAIL tem uma preferência por causar a morte de células transformadas ao invés das células saudáveis o que torna esta via interessante para o combate de tumores (ASHKENAZI et al., 1999). Moléculas capazes de impedir a fosforilação de FADD, como a NSC 47147, estão em fase de teste e mostraram efeitos positivos, foram capazes de aumentar a taxa de apoptose e reduzir o efeito de progressão no ciclo celular através da redução da ativação de NF-kB (SCHINSKE et al., 2011). Neste trabalho avaliamos o número de cópias do gene FADD para auxiliar na compreensão da atuação no processo da carcinogênese mamária e também averiguar se a variação do número de cópias pode vir a ser um auxiliar na diferenciação dos diferentes subtipos, de acordo com a classificação imunohistoquímica. 2.4 ESTUDO DE NÚMERO DE CÓPIAS Alterações no número de cópias são observadas em mais de 95% dos casos de câncer de mama e correspondem a grande parte das alterações do genoma das células de câncer de mama (NATRAJAN et al., 2010). Como o DNA genômico é mais estável do que o mrna, e uma vez que as alterações no número de cópias são um evento genético chave na tumorigênese, conhecer estas alterações genômicas é vantajoso como fator preditivo e de prognóstico (BERGAMASCHI et al., 2006). Bergamaschi et al. (2006) descreveram uma diferença significativa nas alterações de número de cópias que ocorrem entre os diferentes subtipos (basal, luminal A, luminal B e HER2+). Em subtipos basais ganhos e perdas de número de cópias são mais frequentes e o subtipo em que as alterações no número de cópias foram menos frequentes foi o subtipo HER2+. Em relação a amplificações

27 27 no DNA o subtipo luminal B foi o subtipo que apresentou amplificações com maior frequência (BERGAMASCHI et al., 2006). No estudo de CHEN et al. (2005) o número de cópias e a sequência de FADD analisada em 24 tumores de mama independentes demonstrou a existência de FADD amplificado e/ou mutado nos cânceres de pulmão mais agressivos. As alterações de número de cópias de baixo nível são positivamente selecionadas e se mantêm na população de células. A análise dos genes que são desregulados por essas alterações mostrou que há muitos genes envolvidos no metabolismo celular e de RNA que estavam sendo mais expressos. Isso nos sugere que estas alterações menores no número de cópias foram selecionadas durante os primeiros estágios do câncer, pois elas aumentam o metabolismo basal das células providenciando a estas uma vantagem proliferativa e de sobrevivência (CHIN et al., 2006). O estudo de CHIN et al. (2006) mostrou que combinando-se a análise de expressão de genes com a análise de número de cópias, pode-se aumentar a acurácia com a qual as pacientes podem ser avaliadas quanto ao prognóstico. Ainda neste estudo foram identificadas algumas regiões de alto nível de amplificação e/ou de expressão de genes em 8p11, 11q13 (região em que o FADD está localizado), 17q12, e/ou 20q13 que demonstraram serem indicadores de baixa expectativa de sobrevivência.

28 28 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar se o número de cópias do gene FADD pode ser um auxiliar na diferenciação dos subtipos de carcinomas mamários, classificados de acordo com a imuno-histoquímica. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Analisar alterações do número de cópias dos genes FADD em carcinomas primários de mama dos subtipos: Luminal A, Luminal B, HER2 + e triplo negativo. Comparar os resultados obtidos entre os subtipos, correlacionando com parâmetros clínicos e histopatológicos. Comparar estes resultados com os já descritos na literatura.

29 29 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA As amostras de carcinomas primários utilizadas no presente estudo foram coletadas no Hospital Nossa Senhora das Graças (HNSG) durante o procedimento cirúrgico. Todo material biológico utilizado foi obtido após assinatura do consentimento livre e esclarecido pelas pacientes. O projeto foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética do HNSG (Registro CONEP 7220). As 45 amostras utilizadas, foram processadas no Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética do Departamento de Genética do Setor de Ciências Biológicas da UFPR. As amostras estão caracterizadas de acordo com: idade das pacientes, características histopatológicas e características imunohistoquímicas (QUADRO 1). Estas informações sobre os parâmetros clínicos e histopatológicos foram obtidas a partir dos laudos anatomopatológicos e o número de informações é variável entre as pacientes, conforme demonstrado na TABELA 2. As amostras utilizadas nesse trabalho foram classificadas de acordo com os resultados da análise imuno-histoquímica utilizando-se o status dos receptores hormonais (estrogênio e progesterona) e da proteína HER2 (GOLDHIRSCH et al., 2011). Desta forma foram divididas em 4 grupos: Positivas para os receptores hormonais e negativas para HER2 - Luminal A; Positivas para os 3 receptores - Luminal B; Negativas para os receptores hormonais e positivas para HER2 - HER2+. Negativas para os 3 receptores - triplo negativo;

30 30 QUADRO 2 - CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CARCINOMA MAMÁRIO Paciente Idade Diagnóstico L G ER PR HER Carcinoma Ductal Invasor, associado P II NEG NEG NEG a Carcinoma Intraductal (>5%) 2 51 Carcinoma Ductal Invasor, associado A II NEG NEG NEG a Carcinoma Intraductal (5%) 3 43 Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG NEG 4 66 Carcinoma Ductal Invasor SOE P II NEG NEG NEG 5 62 Carcinoma Ductal Invasor A II NEG NEG NEG 6 35 Carcinoma Ductal Invasor A III NEG NEG NEG 7 45 Carcinoma Ductal Invasor P III POS POS NEG 8 54 Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG 9 33 Carcinoma Ductal Invasor, associado P - POS POS NEG a Carcinoma Intraductal Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG 11 - Carcinoma Ductal Invasor P - POS POS NEG Carcinoma Ductal Invasor, associado P III POS POS NEG a Carcinoma Intraductal Carcinoma Ductal Invasor - POS POS NEG Carcinoma Ductal Invasor SOE P II POS POS NEG Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG Carcinoma Ductal Invasor associado A II POS POS NEG a carcinoma intraductal comedocarcinoma Carcinoma Ductal Invasor P II POS POS NEG Carcinoma Ductal Invasor, associado P III POS POS NEG a Carcinoma Ductal in situ sólido cibriforme Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS NEG Carcinoma Ductal Invasor, associado A I POS POS POS a Carcinoma Intraductal (>5%) Carcinoma Ductal Invasor, associado A I POS POS POS a Carcinoma Intraductal (9%) Carcinoma Ductal Invasor, associado P III POS POS POS a Carcinoma Intraductal (5%) Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS POS Carcinoma Lobular Invasor A II POS POS POS Carcinoma Ductal Invasor, associado P II POS POS POS a Carcinoma Intraductal Carcinoma Ductal Invasor, associado A I POS POS POS a Carcinoma Intraductal Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS POS Carcinoma Ductal Invasor, associado P II POS POS POS a Carcinoma Intraductal (5%) Carcinoma Ductal Invasor A III POS POS POS Carcinoma Ductal Invasor P III POS POS POS Carcinoma Ductal Invasor, associado a Carcinoma Intraductal (5%) P II POS POS POS

31 Carcinoma Ductal Invasor, associado A II POS POS POS a Carcinoma intraductal Carcinoma Ductal Invasor A II POS POS POS Carcinoma Ductal Invasor, associado P I POS POS POS a Carcinoma Intraductal Carcinoma Ductal Invasor, associado P II POS POS POS a Carcinoma Intraductal (10%) Carcinoma Ductal Invasor multifocal P - POS POS POS Carcinoma Ductal Invasor, associado P III NEG NEG POS a Carcinoma Intraductal (20%) Carcinoma Ductal Invasor A II NEG NEG POS Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG POS Carcinoma Ductal Invasor A II NEG NEG POS Carcinoma Ductal P - NEG NEG POS Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG POS Carcinoma Ductal Invasor associado P II NEG NEG POS a CDIS e comedocarcinoma Carcinoma Ductal Invasor P III NEG NEG POS Carcinoma Ductal Invasor, comedocarcinoma P III NEG NEG POS LEGENDA: Idade, idade da paciente em anos no momento do diagnóstico; L, presença ou ausência de metástases nos linfonodos axilares; P, presença; A, ausência; G, grau histológico do tumor; ER, status do receptor de estrogênio; PR, status do receptor de progesterona; HER2, aumento de expressão da proteína HER2. FONTE: A autora (2015)

32 32 TABELA 2 INFORMAÇÕES CLINÍCAS E HISTOPATOLÓGICAS DAS PACIENTES PORTADORAS DE CARCINOMA MAMÁRIO DE ACORDO COM OS SUBGRUPOS N Idade Média Grau (%) Metástase em linfonodos ER -, PR -, HER2 - Triplo Negativo 6 50,3 ± 11,8 Grau I (0%) P (50%) Grau II (66,7%) A (50%) Grau III (33,3%) ER +, PR +, HER2 - Luminal A 13 58,9 ± 19,1 Grau I (0%) P (83,3%) Grau II (70%) A (16,7%) Grau III (30%) ER +, PR +, HER2 + Luminal B 17 58,8 ± 12,4 Grau I (25%) P (47%) Grau II (50%) A (53%) ER -, PR -, HER2 + Grau III (25%) HER ,3 ± 16,4 Grau I (0%) P (77,8%) Grau II (37,5%) A (22,2%) Grau III (62,5%) LEGENDA: (ER) receptor de estrogênio, (PR) receptor de progesterona, (HER2) Human Epidermal growth factor receptor 2, (N) número amostral, (P, A) presença, ausência de metástase em linfonodos axilares. FONTE: A autora (2015) 4.2 PROCESSAMENTO DO MATERIAL Utilizando-se tesouras e pinças esterilizadas e placas de Petri descartáveis processou-se as amostras para a remoção de tecido estromal, tecido adiposo e vasos sanguíneos. Após processado o material foi estocado em tubos do tipo Eppendorf e mantido a -80 C até o momento da extração de DNA. 4.3 EXTRAÇÃO DE DNA Para a extração de DNA utilizou-se fragmentos de amostras de tumor homogeneizados no vórtex em 130 µl de tampão de proteinase K e 70 µl de

33 33 proteinase K (10 µg/ml). A mistura permaneceu incubada em banho-maria a 55 C por 24 horas. Em seguida incubaram-se as amostras em banho seco a 95 C por 10 minutos para a inativação da proteinase K. Posteriormente foi adicionado um volume de fenol:clorofórmio:álcool-iso-amílico 25:24:1 v/v, realizada a homogeinização no vórtex por 15 segundos e centrifugação a rpm por 15 minutos (esta etapa foi realizada duas vezes). Foram adicionados dois volumes de etanol absoluto e 0,2 volumes de acetato de amônio 7,5 M, e mantido no freezer -20 C por 24 horas. Em seguida centrifugou-se a rpm por 15 minutos e descartou-se o sobrenadante, seguido da adição de 1 ml de etanol 70% e centrifugação a rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi então descartado e o DNA ressuspendido em 40 µl de água ultra pura. 4.4 PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL Com a técnica de PCR quantitativa determinamos o número de cópias do gene FADD nas 45 amostras (QUADRO 2). Para a avaliação do número de cópias foi utilizado o ensaio TaqMan Copy Number Assays da empresa Life Technologies. Este método é baseado em uma reação dupla de PCR em tempo real capaz de detectar a sequência do gene alvo do estudo e a sequência de um gene de referência (RNASE P) conhecido por apresentar duas cópias em um genoma diploide. Este método de detecção relativa é usado para determinar o número de cópias do gene de interesse em um DNA de referência. Neste trabalho, para fins de simplificação, este ensaio (TaqMan Copy Number Assays) será referido como PCR em tempo real. Em todas as placas foi inserido, além das amostras tumorais, um DNA controle com o número de cópias do gene de interesse conhecido, este DNA genômico é composto por um pool de amostras de indivíduos que não apresentam a doença. Para cada reação foram utilizados: 5 µl de Master Mix, 2 µl de DNA (na concentração de 5 ng/µl), 0,5 µl de mix do gene de estudo (contendo o par de primers e sonda TaqMan ), 0,5 µl de mix do gene RNASE P (primers e sonda TaqMan ) e 2 µl de água ultra pura, totalizando 10 µl de

34 34 volume de reação. Todas as amostras, incluindo o DNA controle foram analisadas em triplicatas na placa. Os reagentes utilizados nestas reações e as especificações do ciclo de PCR encontram-se descritos na TABELA 3. O equipamento empregado foi o Viia 7 da Applied Biosystems. As análises foram realizadas utilizando-se o software Copy Caller (Life Technologies ). Não foram consideradas amostras que apresentaram valor de CT > 33 ciclos e valor de z-score O número de cópias do DNA teste foi calculado pelo software Copy Caller que considera ganho quando o número de cópias calculado está em 2,51 ou acima, perda quando está em 1,49 ou abaixo e normal quando está entre 1,50 e 2,50. Este método é adotado devido à padronização prévia dos ensaios de primers e sondas comercializados pela empresa, que fornecem uma eficiência de reação de 100%, possibilitando que as curvas de amplificação entre os genes testados e o gene de referência possam ser comparadas com precisão. TABELA 3: COMPONENTES DA REAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL PARA ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD. Componente Volume por reação (µl) 2x TaqMan Genotyping Master Mix 5,0 TaqMan Copy Number Assay (20x) 0,5 TaqMan Copy Number Reference Assay (20x) 0,5 Água ultra pura 2,0 DNA (5ng/ µl) 2,0 Volume total 10 FONTE: A autora (2015)

35 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados de número de cópias obtidos foram agrupados de acordo com os subtipos e com os diferentes parâmetros clínicos e histopatológicos. Então foram submetidos ao teste t de Student para avaliar a diferença de número de cópias entre os parâmetros clínicos e histopatológicos. Para avaliação das diferenças entre os subtipos realizou-se o teste não paramétrico de Kruskall-Wallis, utilizando o método de Dunn para a comparação entre os grupos. Para a realização dos testes foi utilizado o software GraphPad Prism Version 6.01 para Windows (Disponível em:

36 36 5 RESULTADOS 5.1 NÚMERO DE CÓPIAS DE ACORDO COM O SUBTIPO DE CARCINOMA MAMÁRIO A análise da alteração do número de cópias do gene FADD em 45 amostras de carcinomas primários de mama revelou que o mesmo apresenta um número de cópias alterado na maior parcela da amostra. Foi detectado na maioria dos casos, em 53%, um ganho do número de cópias, 42% da amostra apresentaram um número de cópias normal e uma pequena parcela, apenas 5%, apresentou redução no número de cópias (GRÁFICO 1). GRÁFICO 1 - ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA FONTE: A autora (2015) Para cada subtipo (Triplo Negativo, Luminal A, Luminal B, HER2+) foi realizada a análise da alteração de número de cópias separadamente. O gene FADD apresentou em média 3,33 ± 2,4 cópias no subtipo Triplo Negativo, no subtipo Luminal A apresentou em média 2,71 ± 0,6, o Luminal B, 4,10 ± 4,7, e para o subtipo HER2+ a média foi 3,30 ± 1,6 de número de cópias do FADD. Estão apresentados nos GRÁFICOS 2, 3, 4 e 5 os números de cópias do gene FADD por amostra de acordo com o subtipo do carcinoma mamário. Analisandose todas as amostras sem distinção obteve-se uma média de número de cópias

37 37 aumentada nos carcinomas primários de mama em relação ao tecido normal de 3,43 ± 3,1. GRÁFICO 2 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA TRIPLO-NEGATIVOS FONTE: A autora (2015) GRÁFICO 3 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA DO SUBTIPO LUMINAL A FONTE: A autora (2015)

38 38 GRÁFICO 4 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA DO SUBTIPO LUMINAL B. FONTE: A autora (2015) GRÁFICO 5 - NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM AMOSTRAS DE CARCINOMAS PRIMÁRIOS DE MAMA DO SUBTIPO HER2+. FONTE: A autora (2015) Os dados referentes à análise do número de cópias do gene FADD encontrados nos diferentes subtipos foram submetidos ao Teste de Kruskal-Wallis (através do software GraphPad Prism Version 6.01) e não apresentaram diferenças significativas (p= 0,9758) (GRÁFICO 6).

39 N ú m e ro d e c ó p ia s 39 F A D D T N L u m in a l A L u m in a l B H E R 2 S u b tip o s GRÁFICO 6 - ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD DE ACORDO COM OS SUBTIPOS. FONTE - A autora (2015) 5.2 PARÂMETROS CLÍNICOS E HISTOPATOLÓGICOS A fim de verificar se as variações no número de cópias do gene FADD estariam relacionadas com os parâmetros clínicos e histopatológicos dos tumores foi realizado o teste t de Student no software GraphPad Prism Version 6.01 para cada parâmetro selecionado. Foram testados os seguintes parâmetros: Idade da paciente; Presença ou ausência de metástases em linfonodos axilares; Grau histológico do Tumor. Em adição a isso o teste t de Student foi realizado separadamente dentro do grupo amostral de cada subgrupo para cada parâmetro, também no software GraphPad Prism Version 6.01.

40 N ú m e ro d e c ó p ia s 40 Como para algumas das amostras não se tinha disponível as informações completas dos parâmetros clínicos e histopatológicos (QUADRO 4), o tamanho amostral (N) variou entre os parâmetros analisados Presença e Ausência de Metástase em Linfonodos Axilares Através do teste t de Student verificou-se que não há diferença estatisticamente significativa entre a alteração do número de cópias do gene FADD em pacientes com carcinomas mamários com presença ou ausência de metástases em linfonodos axilares (p= 0,2151) (GRÁFICO 7). 2 5 F A D D P r e s e n ç a A u s ê n c ia M e tá s ta s e e m lin fo n o d o a x ila r GRÁFICO 7 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM PACIENTES COM PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE METÁSTASE EM LINFONODOS AXILARES. FONTE: A autora (2015) O teste t de Student foi realizado também separadamente para as amostras dos subgrupos Triplo Negativo, Luminal A, Luminal B e HER2+ para o parâmetro presença ou ausência de metástase em linfonodos. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa dentro dos subgrupos (p= 0,4534; p= 0,2232; p= 0,4784; p= 0,8645 respectivamente).

41 N ú m e ro d e c ó p ia s Grau Histológico do Tumor Para verificar-se se o grau histológico do tumor está relacionado ao número de cópias do gene FADD nos diferentes subtipos, separou-se as pacientes em dois grupos: o primeiro englobava as pacientes que apresentaram graus histológico de I e II e o segundo as que apresentavam grau III. Aplicou-se o teste t de Student e constatou-se que a diferença no número de cópias entre esses dois parâmetros não é estatisticamente significativa (p= 0,9199) (GRÁFICO 8). 2 5 F A D D G r a u s I e II G r a u h is to ló g ic o G r a u III GRÁFICO 8 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM PACIENTES COM TUMORES GRAUS I E II EM RELAÇÃO AOS DE GRAU III. FONTE: A autora (2015) Para analisar se o número de cópias varia entre os graus histológicos do tumor dentro dos subgrupos o teste t de Student foi aplicado nas amostras dos subgrupos Triplo Negativo, Luminal A, Luminal B e HER2+. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa dentro dos subgrupos (p= 0,4049; p= 0,6731; p= 0,6290; p= 0,4352 respectivamente).

42 N ú m e ro d e c ó p ia s Idade da Paciente Considerou-se para esta análise as pacientes com informação disponível de idade inferior a 50 anos na data da cirurgia no grupo pré-menopausa e as com idade superior a 50 anos no grupo pós-menopausa. A análise da alteração do número de cópias do gene FADD de acordo com a idade das pacientes não se mostrou significativa ao realizar-se o teste t de Student (p= 0,4135) (GRÁFICO 9). 2 5 F A D D P r é -m e n o p a u s a P ó s -m e n o p a u s a Id a d e d a s P a c ie n te s GRÁFICO 9 - ANÁLISE DA ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DO GENE FADD EM PACIENTES EM PRÉ-MENOPAUSA E PÓS-MENOPAUSA. FONTE: A autora (2015) Dentro dos subgrupos Triplo Negativo, Luminal A, Luminal B e HER2+ aplicou-se o teste t de Student para averiguar se o número de cópias varia conforme a idade das pacientes. Não se encontrou diferença estatisticamente significativa (p= 0,4961; p= 0,9008; p= 0,4289; p= 0,3562 respectivamente).