UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA COORDENADORIA DE PROGRAMAS INSTITUCIONAIS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA COORDENADORIA DE PROGRAMAS INSTITUCIONAIS PROPOSTA DE PLANO DE ATIVIDADES PARA BOLSISTAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA Plano de Trabalho Título do Projeto de Pesquisa: A base genética de variação fenotípica e inovação evolutiva no peixe de quatro olhos Anableps anableps. Resumo do Projeto de Pesquisa: O gênero Anableps pertencente à ordem Cyprinodontiformes, compreende três espécies, sendo duas do Atlântico ocidental (A. anableps e A. microlepis) e uma no Pacífico oriental (A. dowei). Estes peixes não migram grandes distâncias e vivem em bandos numerosos, se reproduzindo através de fecundação interna ao longo de todo o ano. A. microlepis é mais restrita ao ambiente salobro, enquanto A. anableps é mais é encontrada em água doce e estuários. No nordeste do Estado do Pará, no estuário do Rio Caeté localizado no município de Bragança, o A. microlepis habita a costa do atlântico e A. anableps ocorre ao longo do rio Caeté e seus tributários. Morfologicamente, a principal diferença entre as espécies A. anableps e A. microlepis diz respeito à pigmentação: A. microlepis não apresenta pigmentação nas nadadeiras e possui pouca pigmentação ao longo do corpo. A. anableps possui nadadeiras e dorso pigmentados, com uma listra branca bifurcada ao longo do eixo ântero-posterior. Em vertebrados, padrões de pigmentação e coloração de pelagem têm ampla variação onde espécies próximas podem ter padrões totalmente divergentes enquanto espécies filogeneticamente distantes podem ter padrões semelhantes de coloração (Mills and Patterson, 2009). O entendimento dos mecanismos genéticos e a base molecular da variação em coloração e pigmentação é uma questão de extrema importância para a evo-devo. Os

2 melanócitos em mamíferos produzem dois tipos de pigmento: a eumelanina e a feomelanina. A relação entre a quantidade de feomelanina e eumelanina produzidas por um melanócito é responsável pela variação na cor da pelagem (Jackson et al., 1994). A via de sinalização responsável pela produção destes tipos de melanina é controlada pela interação de dois genes: o receptor de melanocortina-1 (mc1r) e o seu ligante, conhecido como agouti. Nesta via, a atividade basal do Mc1r ativa a síntese de eumelanina. Esta atividade basal pode ser inibida quando a proteína Agouti se liga ao receptor Mc1r. Neste caso, o melanócito passa a produzir feomelanina. Portanto, a interação entre estas duas proteínas define o tipo de pigmento depositado em cada pelo (Voisey and van Daal, 2002). Título do Plano de Trabalho: Análise quantitativa do gene MC1R PCR em tempo realclonagem e sequenciamento do gene MC1R e OCA2 de Anableps anableps e Anableps microleps Resumo do Plano de Trabalho: Estudos recentes tem revelado o papel central desta via de sinalização na produção de pigmentação em peixes. Por exemplo, espécies do gênero Astyanax, adaptadas a ambiente de caverna, possuem mutações no gene mc1r associadas à perda de pigmentação (Jeffery, 2009). Outro gene, chamado oca2, é de função desconhecida, é o principal alvo de mutações resultantes em albinismo em humanos (Oetting et al., 2005). Curiosamente, o oca2 também é responsável pela evolução paralela do fenótipo de albinismo em duas populações distintas de peixes do gênero Astyanax (Protas et al., 2007). Portanto, os genes mc1r e oca2 são potenciais candidatos para a perda de pigmentação em outros peixes, como A. microlepis. Neste trabalho, fazer a análise quantitativa dos transcritos presentes na pele das espécies Anableps anableps e Anableps microleps. Objetivo geral Os objetivos gerais deste trabalho visam a identificação da base molecular da perda de pigmentação (A. microlepis) a partir de sequencias obtidas do trasncriptoma de A. anableps.

3 Objetivos Específicos Extração de RNA total Confecção de CDNA PCR em tempo real para a quantificação dos transcritos dos genes MC1R e OCA2 Justificativa: A biologia evolutiva do desenvolvimento (evo-devo) tem como objetivo essencial explicar variação fenotípica, de valor adaptativo ou não, através de mudanças em programas do desenvolvimento embrionário. Para tanto, o utilização de organismos-modelo foi e tem sido fundamental para elucidar as bases embriológicas e genéticas dos conceitos de modularidade e homologia, os mecanismos por trás surgimento independente de morfologias similares em múltiplos taxa (homoplasia) ou de inovações evolutivas. Entretanto, cada organismo-modelo representa um ponto amostral no espectro de morfologias ocorrentes em um dado táxon. Portanto, é necessário expandir para além dos modelos clássicos, de forma que novas espécies ofereçam oportunidade para o estudo de características diferentes daquelas observadas em organismos-modelo já estabelecidos. Neste contexto, o peixe de quatro olhos do gênero Anableps proporciona oportunidade singular para o estudo de variação e inovação fenotípica. Materiais e Métodos: Coleta Serão realizadas coletas da espécie Anableps microleps nas praias de Bragança- Pará e biopsias de pele serão obtidas e armazenadas em RNA later para preservação do tecido. Extração de RNA e síntese de cdna

4 Amostras de tecido de pele e nadadeiras serão armazenada em RNAlater (Qiagen) em freezer -80 o C. e RNA total será obtido através do uso de TRizol, e em seguida purificado através do kit de purificação RNease, de acordo com protocolo do fabricante (Qiagen). PCR em tempo real O desenho dos iniciadores para PCR em tempo real serão confeccionados através do programa do próprio equipamento (Life Technologies). O cdna será analisado utilizando um ensaio de quantificação relativa por PCR em tempo real (7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems). Serão feitas três réplicas experimentais, sendo que cada transcrito será amplificado individualmente em triplicada, utilizando-se o kit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), em um volume final de reação de 10µL. As condições de termociclagem foram: 95 C por 10 minutos e, 45 ciclos de 95 C por 15 s e 60 C por 1minuto. min. Após cada corrida de PCR, a análise da curva de desnaturação será realizada para cada amostra, para detectar dímeros de oligonucletídeos e produtos inespecíficos. A eficiência de amplificação de cada transcrito será estimada em triplicada utilizando-se uma curva-padrão construída por diluição serial do cdna (1:4, 1:8, 1:16, 1:32; 1:64), sendo analisados através do software 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems. A quantificação relativa em cada amostra do transcrito de interesse (FASN) será corrigida pela quantidade de controle endógeno da mesma amostra utilizando-se o método da curva padrão conforme sugestão do fabricante do equipamento (Applied Biosystems). Resultados e Discussão Expressão de opn4a nos olhos de Anableps anableps Hibridização in situ de RNA revelou que a expressão do gene opn4a durante o desenvolvimento larval é distribuída de forma simétrica na retina, não havendo portanto diferenças entre as porção ventral (Fig. 10). Estes resultados hibridização in situ utilizando sondas de opn4a indica expressão desse gene em

5 regiões da retina que coincidem com a região onde está localizada a camada nuclear interna (INL), nesse estágio de desenvolvimento (Fig. 13). Esses resultados corroboram com dados de outras análises sobre a caracterização da expressão de Opn4 em larvas de peixes (Danio rerio) onde foi encontrado o mesmo padrão de expressão para esse gene 7. Figura 1 Resultado para o procedimento de hibridização in situ realizado em olho de larvas de A. anableps no estágio 5 de desenvolvimento, utilizando sondas de RNA para o gene opn4a. Houve marcação pela sonda de opn4a nas porções dorsal e ventral da retina. A técnica foi realizada sob uma temperatura de hibridização de 62ºC. (a) Visão panorâmica do olho capturado com objetiva 4x. (b) e (c) fotos aproximadas das porções dorsal (RD) e ventral (RV) da retina, respectivamente, foram capturadas com objetiva 9x em microscópio óptico.

6 Expressão do gene opn4b nos olhos de Anableps anableps Hibridização in situ para o gene opn4b não detectou expressão deste gene durante o estágio larval estudado, porém, análise de transcriptoma das larvas desta espécie detectou opn4b sendo expressa durante o desenvolvimento larval. Os resultados obtidos neste experimento podem ter sido negativos pela ausência deste gene neste estágio especificamente ou pode estar relacionado às condições experimentais utilizadas. Figura 2 Resultado para o procedimento de hibridização in situ realizado em olho de larvas de A. anableps no estágio 5 de desenvolvimento, utilizando sondas de RNA para o gene opn4b. Não houve marcação pela sonda de opn4b nas porções dorsal e ventral da retina. A técnica foi realizada sob uma temperatura de hibridização de 62ºC. (a) Visão panorâmica do olho capturado

7 com objetiva 4x. (b) e (c) fotos aproximadas das porções dorsal (RD) e ventral (RV) da retina, respectivamente, foram capturadas com objetiva 9x em microscópio óptico Resultados e discussão (dados complementares) Imunofluorescência Como um dado complementar a esse trabalho, foi realizada a técnica de imunofluorescência nos olhos de larvas de A. anableps utilizando anticorpo antihistona H3, e DAPI (marcação de núcleos). Figura 3 Imunofluorescência realizada no olho de larvas no estágio 5 de desenvolvimento de A. anableps. Foram utilizados como marcadores o anticorpo Anti-Histona H3 (verde) e DAPI (azul). (a) Visão panorâmica do olho. (b) e (c) aproximações das regiões onde houve marcação (regiões periféricas das porções dorsal e ventral da retina) pelo anticorpo Anti-H3.

8 A marcaçãoo com o anticorpo HH3 (anti-histona H3) indica onde está havendo proliferação celular. Nos olhos de larvas de A. anableps, proliferação celular é observado nas regiões periféricas da retina. 7. Conclusão Neste trabalho é possível concluir que o gene opn4a é expresso na camada nuclear interna da retina de larvas de A. anableps no 5º estágio larval, padrão semelhante ao encontrado em larvas de D. rerio. Não foi detectada de expressão de opn4b no estágio de desenvolvimento analisado. A análise do padrão de proliferação celular na retina de A. anableps demosntra que a proliferação nesta camada acontece nas extremidades dorsal e ventral da retina, padrão selehante ao de crescimento da retina em zebrafish (D. rerio). Área: Genética Palavras Chave: Microleps, pigemenatção, MC1R, OCA2 Cronograma: ATIVIDADES Coletas Confecção de iniciadores Extração de RNA total Confecção de primers Amplificação dos genes meses X X X X X X X X X X X X X X X X

9 PCR tempo real X X X Produção e entrega de relatório final X X