UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS ISOLADAS DE PROCESSOS INFECCIOSOS DE PACIENTES COM DOENÇAS HEMATOLÓGICAS DA FUNDAÇÃO HEMOAM. CRISTINA MOTTA FERREIRA MANAUS 2011

2 i CRISTINA MOTTA FERREIRA CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS ISOLADAS DE PROCESSOS INFECCIOSOS DE PACIENTES COM DOENÇAS HEMATOLÓGICAS DA FUNDAÇÃO HEMOAM Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador (a): Profª Dra. Maria das Graças do Vale Barbosa Co-orientador: Dr. Felipe Gomes Naveca MANAUS 2011

3 Ficha Catalográfica F383c Ferreira, Cristina Motta. Caracterização genética e sensibilidade microbiana das bactérias aeróbicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM / Cristina Motta Ferreira. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, f. : il. Tese de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em parceria com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas UEA/FMT, Orientadora: Profª. Dra. Maria das Graças do Vale Barbosa. 1. Bactérias aeróbicas. 2. ESBL. 3. Beta-lactamase. 4. MRSA. 5. SCCmec. I. Título. CDU:

4 ii FOLHA DE JULGAMENTO CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E SENSIBILIDADE MICROBIANA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS ISOLADAS DE PROCESSOS INFECCIOSOS DE PACIENTES COM DOENÇAS HEMATOLÓGICAS DA FUNDAÇÃO HEMOAM. CRISTINA MOTTA FERREIRA Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Profª. Maria das Graças Vale Barbosa, Dra. Presidente Prof. Marcelo Cordeiro dos Santos, Dr. Membro Prof. Henrique Manuel Condinho da Silveira, Dr. Membro Profª. Ivete de Araújo Rolland, Dra. Membro Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr. Membro

5 iii DEDICATÓRIA Dedico esta grande conquista primeiramente a DEUS Pai, por seu amor incondicional por mim. A Minha família: William, Guilherme e Gabriel. Aos meus pais: Cauby Braga Motta e Ana Leite Motta que sempre me incentivaram.

6 iv AGRADECIMENTOS Universidade do Estado do Amazonas e Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. A SUFRAMA pelo suporte financeiro para custear as despesas do Programa de Pós- Graduação. A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas- FAPEAM. A todos os pacientes que participaram desta pesquisa. Aos servidores da Fundação HEMOAM. Aos meus orientadores Maria das Graças Vale Barbosa e Felipe Gomes Naveca. A Dra. Cíntia Mara Costa de Oliveira e equipe. As minhas alunas do PAIC Mirela Andrade Neves e Andrea Laureano de Carvalho. A minha equipe de plantão da Maternidade Moura Tapajós, por sua compreensão. Aos servidores da Fundação de Dermatologia e Venereologia Alfredo da Matta. A Dra. Leny Nascimento da Motta Passos, Dra. Nazaré Saunier, Dr. Rodrigo Leitão, Fundação Sangue Nativo e todos os seus funcionários. Aos meus coordenadores da Universidade Nilton Lins Maria das Graças da Costa Alecrim e Raphael Borges. A Conceição Tufic, Secretária do PPGMT, pelo seu carinho e paciência nesta longa jornada. A todos os professores e funcionários do curso de Doutorado em Doenças Tropicais e Infecciosas. Obrigada pela paciência e esforço dedicado.

7 v EPÍGRAFE O grande barato da vida é olhar para trás e sentir orgulho da sua própria história. Carlos Drummond de Andrade

8 vi RESUMO Introdução: Espécies de estafilococos resistentes a meticilina, mundialmente disseminados tanto pelos hospitais como nas comunidades, e de bactérias gramnegativas resistentes aos beta-lactâmicos, ainda permanecem como um severo problema de saúde pública. Objetivo: Descrever a freqüência, sensibilidade a antibióticos e caracterização genética de bactérias patogênicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM. Metodologia: Estudo transversal, descritivo, incluindo-se pacientes de ambos os sexos, qualquer faixa etária, admitidos na Fundação, dos quais foram coletadas amostras biológicas (urina, sangue, escarro, fezes, sangue de cateter, aspirado de medula, abscesso ocular, perianal, secreção de orofaringe, de nasofaringe, feridas e lesão de pele) no período de julho/2007 a agosto/2008. As espécies bacterianas foram identificadas através de testes bioquímicos padronizados de rotina, confirmadas pelo 16S rrna e seqüenciamento. Nas bactérias gram-positivas a resistência a meticilina foi determinada pelos testes PBP2a e epsilométrico com cefoxitina e oxacilina. A detecção da presença do gene de resistência (MecA, SCCmec), origem dos isolados (comunitários ou hospitalares) e clones estafilocócicos foi realizada através de PCR e genotipagem. Nas bactérias gram-negativas, a determinação do fenótipo ESBL foi realizada através do teste epsilométrico. Os genes envolvidos na produção das ESBLs (TEM-, OXA-, SHV-, CTX-M-) foram identificados através de PCR. Resultados: De 146 amostras biológicas coletadas, foram isoladas 44 espécies bacterianas, sendo 17 gramnegativas e 27 gram-positivas. A doença hematológica mais freqüente foi leucemia linfocítica aguda e leucemia mielóide aguda. O protocolo molecular do 16S rrna identificou como espécies bacterianas mais freqüentes Staphylococcus epidermidis, S. intermedius, S. aureus, Staphylococcus sp., E. coli, Serratia sp., Serratia liquefaciens e B. cepacia. Das 17 bactérias gram-negativas 12 foram produtoras da enzima ESBL e carrearam os genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA. Das 27 bactérias gram-positivas, dez apresentaram perfil de resistência a meticilina, sendo nove estafilococos coagulase negativos e 01 S. aureus. Os cassetes cromossômicos mec (SCCmec) mais freqüentes foram os dos tipos I, III, e V. O MLST revelou a presença dos seguintes clones: S. aureus ST243 carreando o SCCmec tipo I, III, V; S. epidermidis ST2 carreando o SCCmec tipo II, III, V e de um novo clone de S. epidermidis ST365 carreando o SCCmec tipo I, III, V. Conclusão: A identificação dos clones de S.aureus ST243, S. epidermidis ST2 e ST365, nas espécies de estafilococos meticilina resistentes, e dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla OXA nos plasmídeos de cepas produtoras de ESBL, comprovam a presença de espécies bacterianas implicadas em processos infecciosos hospitalares. Estes achados servem como alerta para que sejam introduzidas ações para a redução da disseminação dessas linhagens clonais patogênicas, a fim de se evitar surtos de infecções hospitalares e óbitos, principalmente em pacientes imunodebilitados. Palavras-chave: ESBL, meca, beta-lactamase, MRSA, SCCmec, ST365, ST243,S. epidermidis, S. aureus, infecção hospitalar.

9 vii ABSTRACT Introduction: Methicillin-resistant Staphylococci and Gram-negative bacteria, being spread worldwide, by both hospitals and in communities still remain as a severe public health problem. Objective: To describe the frequency, sensitivity to antibiotics and genetic characterization of pathogenic bacteria isolated from hematologic patients with infectious processes at the HEMOAM Foundation. Methods: We conducted a descriptive cross-sectional study including patients of both sexes at any age who had been admitted to the HEMOAM Foundation. A total of 146 biological samples such as of urine, blood, sputum, feces, catheter tip, bone marrow aspirate, and abscess fluid along with oropharyngeal, ocular, perianal, nasopharynx, open wound, and skin lesion secretions were collected in the period from July 2007 to August Bacterial strains identified by standard biochemical tests of laboratorial routine had their species confirmed by 16S rrna protocols and sequencing. Resistance to methicillin for gram-positive strains was determined by PBP2a and epsolometric tests with cefoxitin/oxacillin. The presence of the resistance gene (meca and SCCmec), origin of isolates (community/ hospital) and staphylococci clones was performed by molecular tests such as PCR and genotyping. The identification of the ESBL phenotype in gram-negative bacteria was performed by epsolometric test. The identification of the genes involved in the production of ESBLs (TEM-, OXA-, SHV-, and CTX-M-) was performed by molecular tests such as PCR. Bacterial resistance to antimicrobials used in routine therapy was performed using the E-test. Results: We isolated 44 bacterial strains from 146 biological samples of which, 17 were gram-negative and 27 gram-positive. The most frequent hematologic disease was acute lymphocytic leukemia and acute myeloid leukemia. Biochemical tests and 16S rrna sequencing detected S. epidermidis, S. intermedius, S. aureus, Staphylococcus spp., E. coli, Serratia sp., Serratia liquefaciens and B. cepacia as the most frequent bacteria. 12 of the 17gram-negative bacteria were ESBL-producing and carried bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA genes. 10 of the 27 gram-positive bacteria were methicillin-resistant of which, nine were coagulase-negative staphylococci and one S. aureus. The most frequent cromossomal cassettes were SCCmec types I, III, V. MLST revealed the presence of the clones: S. aureus ST243 (SCCmec type I, III, V), S. epidermidis ST2 (SCCmec tipo II, III, V) and new clone of the S. epidermidis ST365(SCCmec type I, III, V). Conclusion: The identification of S. aureus ST243 (SCCmec type I, III, V) clone, S. epidermidis ST2 (SCCmec type II, III, V), ST365 (SCCmec type I, III, V) clones and bla TEM, bla SHV, bla CTX-M, bla OXA genes in Gram-negative bacteria plasmids, proving the presence of pathogenic species implied in hospital infectious processes. These findings appear as an alert to introduce actions to reduce the spread of those pathogenic lineages of S. aureus and S. epidermidis to prevent hospital infection outbreaks as well as mortality risks, mainly for immune compromised patients. Keywords: ESBL, meca, beta-lactamase, MRSA, SCCmec, ST365, ST243,S. epidermidis, S. aureus, nosocomial infection.

10 viii LISTA DE FIGURAS- TESE Figura 1 Árvore filogenética da vida de organismos com destaque em azul para o grupo das bactérias... 1 Figura 2 Desenho esquemático da parede celular de Bactéria Gram-positiva... 3 Figura 3 Desenho esquemático da parede celular de Bactéria Gram-negativa... 3 Figura 4 Desenho esquemático de gene meca Figura 5 Classificação dos principais tipos de cassetes Figura 6 Fluxograma dos procedimentos executados na realização do estudo Figura 7 Imagem das fitas de cefinase plus utilizadas na realização do teste da betalactamase Desenho esquemático das fitas utilizadas na realização do Etest ESBL com Figura 8 os gradientes de concentrações dos antibióticos CT e TZ e em associação com o inibidor, o ácido clavulânico Imagem de detecção do fenótipo ESBL pelo método E-teste Fita com os Figura 9 gradientes de concentrações dos antibióticos TZ e em associação com o inibidor, o ácido clavulânico Figura 10 Imagem do resultado do teste de suscetibilidade método E-teste para a detecção da MIC (concentração inibitória mínima) Figura 11 Protocolos laboratoriais- Figura1 e 2- Imagem da fita de E-teste para ESBL com a escala em MIC aplicadas no meio de cultura Figura 12 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 4 corte ESBL positiva Figura 13 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 5 zona fantasma Figura 14 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 6 de formação da inibição da elipse Figura 15 Protocolos laboratoriais- Padrões de inibição do crescimento- Fig 7 resultado não determinado

11 ix LISTA DE TABELAS-TESE Tabela 1 Meios de culturas de triagem para semeadura primária Tabela 2 Divisão dos cocos Gram positivos pela prova da catalase Provas bioquímicas para identificação dos gêneros de Cocos Grampositivos... Tabela Tabela 4 Identificação das espécies de cocos Gram-positivos catalase positivos Tabela 5 Esquema para diferenciação de espécies de Cocos Gram-positivos Tabela 6 Identificação de gênero e espécie bacteriana Tabela 7 Diferenciação das enterobactérias pelo Enterokit C Tabela 8 Características dos enteropatógenos da família Enterobacteriaceae nos meios EPM-MILi Tabela 9 Glicose O/F Tabela 10 Valores das provas de oxidase e motilidade Tabela 11 Valores das provas de OF/MC e morfologia Tabela 12 Valores dos testes Tabela 13 Identificação de isolados Não fermentadores Tabela 14 Valores das provas bioquímicas Tabela 15 Leitura e interpretação dos resultados da PBP 2a Tabela 16 Tipos de reação de aglutinação Tabela 17 Resultados do teste com 201 isolados clínicos frescos de S aureus de quatro laboratórios Tabela 18 Guia para interpretação do Eteste ESBL

12 x LISTA DE TABELAS- ARTIGO 1 Tabela 1 Frequency of hematologic diseases diagnosed in this study. 58 Tabela 2 Primer sequence and PCR conditions 57 Tabela 3 Gram-negative strains, ESBL phenotypes and genes detected from patients with infections. 60 Tabela 4 Tabela 5 Antimicrobial Susceptibility test (E-test) for 17Gram-negative bacteria isolated from patients with bacterial infection 61 Strains isolated from different specimen type detected from patients with infections. 58

13 xi LISTA DE TABELAS- ARTIGO 2 Tabela 1 Strains isolated from patients with hematologic disease 74 Phenotypes and genotypes profiles of the Staphylococcal strains isolated Tabela 2 from patients with hematologic diseases 75

14 xii LISTA DE QUADROS Quadro 1 Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas Quadro 2 Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA Quadro 3 Protocolo de interpretação do Etest ESBL Quadro 4 Iniciadores meca e SCCmec utilizados na reação Quadro 5 Iniciadores das toxinas bacterianas utilizados na reação Quadro 6 Iniciadores das ESBLs... 46

15 xiii ABREVIATURAS ATCC American Type Culture Collection CA-MRSA Community acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus CLSI Clinical and Laboratorial Standard Institute CVI Complexo violeta-iodo ET-A Esfoliatin Toxin A ET-B Esfoliatin Toxin B ESBL Extended spectrum beta lactamase HA- MRSA Hospital acquired methicillin resistant Staphylococcus aureus HA- MR-SCoN Hospital acquired methicillin resistant Staphylococcus sp. LOS Lipooligossacarídeo LUKPV ou PVL Panton Valentine Leucocidin MHC II Complexo de histocompatibilidade tipo II MIC Minimal inhibitory concentration Meio de cultura MIO Motilidade, Indol, Ornitina MRSA Methicillin- or oxacillin-resistant S. aureus MR-SCoN Methicillin- or oxacillin-resistant Staphylococcus sp. MSSA Methicillin- or oxacillin-sensitive S. aureus PBP 2a ou PBP 2' Penicillin-binding protein 2a or 2 PCR Polymerase Chain reaction PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Phantom zone Zona fantasma SCCmec Staphylococcal chromosomal cassette mec SCoN Coagulase negative Staphylococci TSI Tríplice Açúcar Ferro

16 xiv SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Histórico Morfologia bacteriana Parede celular de bactéria gram-positiva Parede celular de bactéria Gram-negativa Relações microbiota normal/parasita/hospedeiro Patogenicidade e virulência bacteriana Patogenicidade de cocos Gram-positivos Patogenicidade de bastonetes Gram-negativos Drogas antimicrobianas Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas Resistência bacteriana aos antimicrobianos Resistência dos S aureus e Staphylococcus spp aos ß-lactâmicos Gene meca Complexo genético mec Complexo genético ccr e principais tipos de SCCmec Staphylococcus spp hospitalares e comunitários Prevalência dos estafilococos resistentes a meticilina Processos infecciosos ocasionados por estafilococos resistentes a meticilina Cassetes cromossômicos e clones estafilocócicos Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA Prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de ESBLs Enzima Beta-Lactamase Classificação das Enzimas Beta-Lactamases Beta-Lactamase de espectro estendido (ESBL) Subtipos de enzimas (ESBL) Importância Clínica das ESBL Preocupações relativas às infecções bacterianas OBJETIVOS Geral Específicos MATERIAL E MÉTODOS Delineamentos População de estudo Amostragem Critérios de inclusão Critérios de exclusão Solicitação de exame bacteriológico Pacientes hematológicos imunodeprimidos Fatores de baixo risco para complicação Coleta de amostra biológica Cultura, isolamento e identificação de bactérias isoladas Teste da beta-lactamase Teste da beta-lactamase de espectro estendido (ESBL)... 36

17 xv Teste de suscetibilidade antimicrobiana Teste da PBP 2a Caracterizações moleculares Extração do DNA Total Bacteriano e Quantificação Extração do DNA plasmidial Reação em cadeia da polimerase (PCR) Para o gene 16S rrna PCR em tempo real (q-pcr) para o gene meca Gene meca Tipos de SCCmec Genes seh, etd, arca e LUKPV das toxinas bacterianas Genes das Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) Genotipagem para identificação dos clones bacterianos Purificação pré-sequenciamento Precipitação do DNA com Isopropanol/etanol Sequenciamento Controle de Qualidade Armazenamentos de amostras Análise de Dados Fontes de financiamento (Nacionais e/ou Internacionais) RESULTADOS Artigo Artigo DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXOS Anexo 1-TCLE Anexo 2- Protocolo médico/laboratorial Anexo 3- Protocolos laboratoriais

18 1 1 INTRODUÇÃO 1.1 Histórico As bactérias são os organismos mais antigos, procariontes, constituídos por uma célula, sem organelas e núcleo celular, encontradas na forma isolada ou em colônias, pertencentes ao Domínio homônimo Bactéria. Foram descobertas por Antoni van Leeuwenhoek em 1683 após observar resíduos de seus próprios dentes e de outros materiais ao microscópio (3,5,59, 122). No final do século XIX, as bactérias passaram a despertar o interesse de muitos cientistas após Louis Pasteur e Robert Koch descreverem o seu papel como vetores de várias doenças e a demonstração da origem bacteriana de diversas doenças como o tifo, lepra e gonorréia (3,5,98, 122). Atualmente as bactérias compõem um dos três domínios do sistema de classificação cladístico. Inicialmente foram classificadas entre as plantas por Lineu e agrupadas como fungos. Em 1866, Ernst Haeckel as inseriu no reino Protista (Figura 1). Em 1969 foram incluídas entre os procariotas no reino Monera por Whittaker. Em 1977, Carl Woese dividiu os procariotas em dois grupos, com base nas seqüências 16S do rrna, que denominou de Eubacteria e Archaebacteria, e mais tarde, renomeados pelo mesmo para Bacteria e Archaea devido as mesmas formarem domínios separados com origem e evolução separadas a partir de um organismo primordial (3,5,59, 122, 132,143). Fonte: Figura 1 Árvore filogenética da vida de organismos, com destaque em azul para o grupo das bactérias

19 2 1.2 Morfologia Bacteriana Morfologicamente as bactérias estão classificadas de acordo com a forma da célula em cocos, bacilos, vibriões, espirilos, espiroquetas e, quanto ao grau de agregação, os cocos podem se apresentar de forma isolada, aos pares (diplococos), ligados em cadeias (colar), forma de cachos, cúbica (sarcina), bacilos aos pares e alinhados em cadeia. Já os bacilos podem se dividr ao longo de seu eixo curto; assim, existem menos grupamento de bacilos que de cocos. A maioria deles se apresenta isolados. Os diplobacilos aparecem após a divisão e os estreptobacilos ocorrem em cadeias (127,142). 1.3 Parede celular de Bactéria Gram-positiva Na maioria das bactérias Gram-positivas a parede celular é constituída por uma espessa camada de peptideoglicano, ácido teicóico que se divide em ácido lipoteicóico, atravessa a camada de peptideoglicano e se liga a membrana plasmática, e o ácido teicóico da parede celular, ligado à camada de peptideoglicano (Figura 2) (18, 129,142). O principal componente da parede é o peptideoglicano, um polímero de longas cadeias de glicídio com ligações cruzadas flexíveis de peptídeos formando uma estrutura forte, em forma de rede ao redor da bactéria. Esta rede é formada por dissacarídeo denominado de N-acetilglucosamina e ácido N-acetil murâmico, ligado ao peptídeo L-lisina,D-alanina, L-alanina, D-glutamina, que permite a ligação cruzada com um grupamento de pentaciclinas. Reação de transpeptidação une os peptídeos enquanto que os dissacarídeos são polimerizados ao longo da cadeia de glicano por meio de reação de transglicolização. O processo da ligação cruzada é catalisado pelas enzimas transpeptidases, as proteínas ligadoras de penicilina PBPs (18, 129, 142).

20 3 Fonte: Figura 2 Desenho esquemático da parede celular de Bactéria Gram-positiva Parede celular de Bactéria Gram-negativa Consiste de uma fina camada de peptideoglicano e membrana externa. O peptideoglicano está ligado a lipoproteínas e fosfolipídeos na membrana externa e localiza-se no periplasma, um espaço fluido entre a membrana externa e membrana plasmática (Figura 3) (129, 142). A membrana externa possui o lipopolissacarídeo (LPS) formado por uma porção lipídica denominada de lipídeo A (endotoxina) e pelo açúcar polissacarídeo 0 que atua como antígeno (121,142). Algumas bactérias Gram-negativas possuem lipooligossacarídeos (LOS) e não LPS em suas paredes celulares (46, 147). O LOS contêm lipídeo A e um oligossacarídeo central sem antígeno O, polissacarídeo de cadeia longa como o encontrado no LPS de bactérias entéricas (22). Figura 3 Desenho esquemático da parede celular de bactéria Gram-negativa

21 4 A técnica de coloração do Gram desenvolvida por Hans Christian Joacquin Gram em 1884, beneficiou a microbiologia, pois classificou as bactérias em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas (78,142). Esta técnica baseia-se na composição química e integridade da parede celular das duas bactérias e, dependendo da cor que adquirirem, são classificadas em Gram-positivas (coradas em roxo) e Gram-negativas (vermelho) (78,142). As características estruturais da parede bacteriana compõem a base da técnica que funciona da seguinte forma: Ao se adicionar o corante primário cristal violeta e o mordente lugol, ambos se combinam no citoplasma de cada bactéria e as coram de violeta escura ou púrpura, formando um complexo grande denominado de complexo violeta-iodo (CV-I) ou iodopararrosanilina (78, 127, 142). Ao se proceder a descoloração com álcool-acetona, devido ao fato de a parede celular das Gram-positivas possuírem uma espessa camada de peptideoglicano, o complexo CV-I não é arrastado e permanece intacto na mesma. Já nas Gramnegativas, devido o peptideoglicano ser constituído por apenas uma fina camada, o complexo CV-I é arrastado tornando a bactéria incolor (78,127,142). Procede-se então a coloração de fundo com o contracorante safranina para que possa tingir as estruturas incolores, permanecendo as já coradas da mesma cor. As bactérias descoradas absorvem a safranina tornando-se assim vermelhas. Por isso, as bactérias Gram-negativas coram-se em vermelho e as Gram-positivas em azuis (78,127,142). 1.4 Relações microbiota normal/parasita/hospedeiro Os agentes etiológicos de doenças infecciosas humanas pertencem a cinco grupos principais de organismos: bactérias, fungos, protozoários, helmintos e vírus, os quais possuem características fenotípicas e genotípicas essenciais que facilitam sua identificação (21, 36, 110, 127, 132). Esses agentes podem co-existir em conjunto com o hospedeiro (127) beneficiando-o, impedindo assim o crescimento de microrganismos nocivos. Tal relação é denominada de antagonismo microbiano, pois envolve uma

22 5 competição entre as bactérias da microbiota normal do corpo humano e os microrganismos nocivos (138, 142). A microbiota normal, cuja função é a manutenção da saúde corporal do hospedeiro, compete com tais microrganismos por nutrientes, produzindo substâncias nocivas aos mesmos, afetando o ph da pele, produzindo bacteriocinas e alterando, até mesmo o oxigênio disponível, objetivando assim evitar a colonização por agentes patogênicos. A microbiota normal do hospedeiro coloniza os olhos, pele, trato gastrointestinal, trato genito-urinário e nariz de ambos os sexos. Isto pode ocorrer de forma saprofítica, comensal, mutualística ou parasitária, podendo haver uma relação de cooperação entre os microrganismos ( 78, 127, 142). Em algumas situações esta cooperação pode ocasionar doenças ao hospedeiro. Certas espécies de estreptococos patogênicos utilizam os seus receptores de adesão não para se fixar aos dentes, mas sim em outros estreptococos orais, ocasionado assim processos infecciosos como gengivites e doenças periodônticas ao hospedeiro (78, 142). 1.5 Patogenicidade e virulência bacteriana A virulência dos microrganismos não é atribuída somente a um fator único, mas sim a vários fatores que estão relacionados ao organismo, hospedeiro e interação entre os mesmos. A virulência envolve a infectividade do microrganismo e a gravidade da condição produzida. A capacidade de virulência entre as cepas pode ocorrer numa mesma espécie ou em um determinado grupo de microrganismos considerados patogênicos. A capacidade de um microrganismo de causar doença envolve tanto fatores microbianos como do hospedeiro. Os microrganismos desenvolvem respostas adaptativas geneticamente modificadas a fim de lhes proporcionar versatilidade, sobrevivência e desenvolvimento em ambientes hostis (127). As bactérias desenvolveram métodos que as auxiliaram a captar alterações no ambiente externo e a expressar seus genes envolvidos nas respostas adaptativas. Quando a população atinge um determinado limiar, há um auto-indutor

23 6 suficiente que ativa os fatores de transcrição na célula e expressam os genes de fatores de virulência, mecanismo este denominado de sensores em quórum (47, 127, 100). Os fatores de virulência possibilitam as bactérias causar danos ao hospedeiro. Alguns deles estão associados a células ou podem ser extracelulares, ou então, fazerem parte da composição anatômica ou fisiológica da célula. Dentre os diversos fatores de virulência das bactérias podem-se citar as adesinas (auxiliam na adesão às células do hospedeiro como as proteínas ligadoras de colágeno, de aderência extracelular, de ligação a fibronectina e fator de aglutinação), agressinas (incluem cápsulas, substâncias viscosas extracelulares, proteínas, carboidratos de superfície e outras pequenas moléculas) (78,127,142), toxinas (síndrome do choque tóxico estafilocócico-tsst-1 (19,20), enterotoxina, toxina da síndrome da pele escaldada (125), endotoxinas, exotoxinas (78,127,142) e enzimas (hialuronidase, estafiloquinase, estreptoquinase (109), coagulase (54,133), lipase, hemolisinas (40), proteases, leucocidinas como a Panton Valentine (71), determinantes de superfícies e de resistência, responsáveis pela patologia ocasionada pelas mesmas Patogenicidade de Cocos Gram-positivos O gênero Staphylococcus é composto por diversas espécies, muitas das quais podem ser encontradas em amostras biológicas humanas. Dentre elas a mais importante é o Staphylococcus aureus. Apesar de fazerem parte da microbiota normal humana, as espécies de estafilococos podem produzir infecções oportunistas significativas em condições apropriadas (78,127,142). Estas espécies possuem vários fatores de virulência como polissacarídeos capsulares, peptideoglicano, ácidos teicóicos, proteína A, hemolisinas como a Panton Valentine (71), toxinas (esfoliatina (ET-A e ET-B) (136), enterotoxinas (A, até E, H e I) (69) e superantígenos bacterianos (enterotoxinas estafilocócicas, TSST-1,exotoxinas pirogênicas estafilocócicas (SPE A, B, C, F, G, H e J) e principalmente biofilmes (19, 78,142). A superantigenicidade se refere à capacidade das toxinas de estimularem a proliferação maciça de células T, sem relação com a especificidade antigênica das mesmas. Ocorre uma indução da proliferação de células T policlonais após a ligação

24 7 do MHC II de uma célula apresentadora de antígeno com os receptores de células T e a porção variável da cadeia ß (beta) do receptor de antígenos das células T. Ocorre então uma liberação maciça de citocinas produzindo os sintomas da TSST-1 que incluem febre, exantema, descamação, hipotensão, comprometimento gastrintestinal, muscular, das mucosas, renal, hepático, hematológico e sistema nervoso central. Algumas toxinas como a Panton-Valentine e a TSST-1 também podem ser produzidas pelos estafilococos coagulase negativos (127,142). A ação da Panton-Valentine, leucotoxina formadora de poro de membrana, inicialmente conhecida como substância leucocidina por Van develde em 1894, por sua capacidade de lisar leucócitos, ocorre através da liberação de dois componentes pertencentes as classes proteína S (LukS-PV) e proteína F (LukF-PV); antes de se tornarem um heptâmero formador de poros de membrana nos leucócitos polimorfonucleares (PMNs). Quando o LukS-PV se liga aos PMNs sofre fosforilação pela proteína quinase do hospedeiro (A ou C) através da indução dos canais de íons cálcio. Ocorre a indução do sinal de eventos de transdução que levam a liberação de interleucinas e mediadores inflamatórios. Dependendo da concentração da PVL, pode ocorrer lise dos PMNs ou apoptose, sendo que esta última pode envolver a formação de poros na membrana mitocondrial (21). Tanto os Staphylococcus aureus quanto os Staphylococcus spp. podem ocasionar uma variedade de processos patogênicos como furúnculos, carbúnculos, impetigo, mastite, hidradenite supurativa, infecções de feridas, meningite, pericardite, osteomielite, piomiosite, intoxicação alimentar, síndrome da pele escaldada, síndrome do choque tóxico, bacteremia, endocardite, infecções pulmonares e artrite séptica (127,142) Patogenicidade de Bastonetes Gram-negativos As bactérias Gram-negativas pertencentes às Enterobacteriaceae estão amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas no solo, na água, em vegetais e no trato intestinal humano. Os membros da família Enterobacteriaceae podem ser agentes patológicos de qualquer tipo de doença infecciosa e isolados de

25 8 qualquer tipo de amostra recebida no laboratório. Os pacientes debilitados ou imunocomprometidos são altamente suscetíveis às infecções hospitalares após serem colonizados por cepas ambientais, ou por processos invasivos como cateterismo ou biópsias cirúrgicas após as mucosas serem traumatizadas (128,142). Quando os mecanismos de defesa do hospedeiro são anulados devido a causas não-infecciosas subjacentes ou então devido a intervenções diversas como neoplasisas, terapia imunossupressora ou diabetes, os microrganismos da própria flora (endógenos) podem ocasionar processos patológicos como uma nova resposta adaptativa ao seu hospedeiro (127,142). Estas espécies podem produzir vários fatores de virulência como as endotoxinas (lipopolissacarídeo-lps e lipooligossacarídeos-los), exotoxinas (exotoxina A), toxinas (enterotoxinas termolábel ou termoestável), viscosidade extracelular, leucocidina, proteases (IgA), fosfolipases, enzimas, fímbrias (Pili) (1), PorI-PorA/PorB, proteínas Opa (proteína II) (53), proteína Rmp, cápsulas, plasmídeos (6), hemaglutininas (127, 94). As bactérias Gram-negativas podem ocasionar uma série de doenças dependendo do tipo de tecido que podem infectar como feridas, infecções urinárias, infecções de garganta, meninigite, infecções de ouvido, septicemias, disenterias, gastrenterites, síndrome similar ao choque tóxico estafilocócico e bacteremias (127,142). 1.6 Drogas antimicrobianas Os antimicrobianos conhecidos como antibióticos, são produtos químicos produzidos por microrganismos ou sinteticamente, podendo ter diferentes espectros de ação. Os antibióticos de estreito espectro, são aqueles que agem somente contra determinados tipos de bactérias (penicilina G, glicopeptídeos, macrolídeos, nitrofurantoína, metronidazol, aztreonam, ácido nalidíxico e fosfomicina), enquanto que os de largo espectro, afetam amplo número de bactérias como as Grampositivas e Gram-negativas (carbapenêmicos,cefalosporinas,ß-lactâmicos e

26 9 combinações de inibidores de ß-lactâmicos e fluoroquinolonas). Estes antibióticos geralmente são utilizados num processo infeccioso no qual o patógeno não é imediatamente conhecido. Os antibióticos também podem se classificar como bactericidas (destroem os patógenos) ou bacteriostáticos (inibem o crescimento do patógeno) (95, 109, 127,142) Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas As drogas antimicrobianas agem através de diferentes mecanismos de ação: inibição da síntese da parede celular, inibição das β-lactamases bacterianas, dano a membrana citoplasmática, inibição da síntese protéica, inibição da síntese de ácido nucléico e inibição da síntese de metabólitos essenciais (quadro 1) 142). (95, 96, 126, 1.7 Resistência Bacteriana aos Antimicrobianos As bactérias existem há milhões de anos e os mecanismos de defesa desenvolvidos pelas mesmas, contra o ataque de outras bactérias, também são utilizados para os antibióticos. Os mecanismos de resistência microbiana são complexos, variados, não completamente conhecidos, que existem antes mesmo da introdução dos antibióticos. Surgiram devido a mutações dos genes microbianos e pela aquisição de genes oriundos de fontes externas. O surgimento de múltiplas espécies bacterianas resistentes aos agentes antimicrobianos ainda constitui um sério problema para os clínicos. Muitos fatores contribuíram para o aparecimento de isolados multiresistentes, dentre eles o uso indiscriminado de antibióticos, elevação da população de risco, pacientes imunodebilitados, tempo de internação prolongado de pacientes portadores de doenças crônicas debilitantes nos hospitais, enfermarias, Unidade de Terapia Intensiva (UTI), falhas nas práticas de controle de infecção e creches (34, 44).

27 10 Quadro1. Mecanismo de ação das drogas antimicrobianas Agente antimicrobiano Mecanismo de ação β-lactâmicos (penicilinas) e β-lactâmicos Inibição da síntese da parede celular semi-sintéticos (meticilina,nafcilina, Inibe na parede celular a síntese oxacilina), cefalosporinas, imipenem, do peptideoglicano e mureína. aztreonam, vancomicina,bacitracina. Ácido clavulânico (adicionado ao β- lactâmico amoxacilina) cloranfenicol, clindamicina, eritromicina aminoglicosídeos e tetraciclinas Quinolona, ciprofloxacina, rifampicina Análogo ao fator de crescimento (sulfanilamida, acetil sulfisoxazol, trimetoprima Polimixina Fonte: (Tenover 2006 (126), Winn et al (142) ) Inibição das β-lactamases (penicilinases) Inibe as enzimas β-lactamases bacterianas Inibição da síntese protéica Age na subunidade ribosomal 50S Age na subunidade ribosomal 30S Inibição da síntese de ácidos nucléicos Inibe a síntese de DNA Inibe a síntese de mrna Inibição da síntese de metabólitos essenciais Inibe o metabolismo do ácido fólico (antifolato) Dano a membrana citoplasmática A resistência bacteriana pode se expressar de forma constitutiva, quando é produzida pela bactéria independentemente da presença da droga, ou ser induzida, quando é produzida após a exposição da bactéria a droga, como por exemplo, a enzima beta-lactamase que hidrolisa o antibiótico. A resistência também pode ser adquirida. Neste caso podem ocorrer alterações mutacionais no genoma bacteriano ou serem adquiridos materiais genéticos codificados transferidos por conjugação como plasmídeo, transposon ou seqüências de inserção (31, 44, 127). Os plasmídeos contêm genes de resistência a uma ampla variedade de antibióticos, portanto, a sua transferência horizontal (ou lateral) entre bactérias não importando a espécie, pode acarretar na aquisição de vários determinantes de

28 11 resistência tornando a espécie resistente a vários tipos de antimicrobianos. A transferência horizontal é responsável pela disseminação de numerosos determinantes de resistência antimicrobiana entre as bactérias, o que justifica a rápida disseminação dos genes de resistência (31, 44). Ela pode ocorrer por: a) conjugação- requer contato entre as células, sendo um processo no qual os plasmídeos ou transposons são trasnferidos do doador para o receptor. b) Transformação- envolve a captura e incorporação do DNA nú. c) Transdução- quando o DNA do hospedeiro é transferido via bacteriófago, que age como vetor para sua injeção na célula receptora. A transdução é um mecanismo extremamente importante de transferência genética entre as bactérias resistentes aos antibióticos (142). Os mecanismos de resistência residem em três categorias: a) inativação enzimática (beta-lactamases); b) receptores alterados (alterações nos ribossomas, na DNA girase ou enzimas bacterianas alteradas); c) alteração do transporte de antibióticos (diminuição da força motriz da proteína, alterações nas proteínas da membrana externa (porinas) e o transporte ativo por células bacterianas) (31,143). Dentre os citados, o mecanismo de modificação do alvo é utilizado por um grande número de espécies bacterianas contra uma ampla variedade de antibióticos, sendo o de indução ou inativação enzimática o mais predominante (31). Como as drogas β-lactâmicas são amplamente utilizadas devido a sua elevada efetividade, baixo custo e mínimo efeito colateral, o alvo dos antibióticos β- lactâmicos nas espécies de estafilococos reside nas quatro proteínas nativas PBP, envolvidas na síntese da parede celular bacteriana. As bactérias resistentes inativam os β-lactâmicos por três mecanismos primários (16, 126, 141) : 1 Pelas β-lactamases, que são enzimas produzidas por um largo grupo de bactérias Gram-positivas e negativas, que inativam os β-lactâmicos pela hidrólise do anel β-lactâmico. 2 Pela aquisição da proteína ligadora de penicilina 2a (PBP2a) de baixa afinidade ou alteração do alvo do antibiótico. 3 Evitando o acesso do antibiótico ao seu alvo pela alteração da permeabilidade da parede ou por efluxo.

29 12 Os mecanismos 1 e 2 estão relacionados entre si e podem co-existir na mesma célula (16, 80) Resistência dos S. aureus e Staphylococcus spp. aos ß-lactâmicos A resistência bacteriana dos estafilococos aos antibióticos ainda continua sendo um desafio para a terapia, tanto em infecções nosocomiais quanto as adquiridas na comunidade. Nos Estados Unidos, dois milhões de pessoas são acometidas por infecções e 60% delas, são ocasionadas por bactérias resistentes a antibióticos. A resistência dos estafilococos a oxacilina, antibiótico atualmente utilizado como representante da classe PPR (oxacilina, meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina), deve-se a expressão da proteína PBP 2a ou PBP 2, ausente nos Staphylococcus spp. sensíveis a oxacilina. O outro mecanismo de resistência é pela produção da enzima beta-lactamase (β-lactamase) que hidrolisa o antibiótico (108, 115). Os Staphylococcus spp. sensíveis a meticilina, possuem cinco PBPs, que são enzimas que se localizam na parede celular bacteriana e catalisam a etapa final de formação da mesma. As proteínas ligadoras de penicilina 1, 2, 3, 3,4 tem afinidade por antibióticos β-lactâmicos. A resistência a meticilina é derivada da produção de uma PBP adicional denominada de PBP 2a ou PBP 2, que possui baixa afinidade por drogas β-lactâmicas, sendo codificada pelo gene meca (115). Além da alteração na PBP 2a, os Staphylococcus spp podem apresentar mais dois mecanismos interagindo entre si, como a hiperprodução de β-lactamases (BORSA) e modificações na capacidade de ligação das PBPs (MODSA). Entretanto, o fato de portar o gene não significa que a bactéria seja resistente, pois ele pode ter um baixo nível de expressão e assim, o desenvolvimento da resistência bacteriana, fica dependente do modo e do nível de expressão desse gene (42, 81, 105, 108, 115). As β-lactamases dos estafilococos são enzimas codificadas por plasmídeos extracelulares, que podem ser dividas em quatro tipos, de A até D. Diferem das β- lactamases das bactérias Gram-negativas por serem expressas em altos níveis na

30 13 presença dos indutores, exceto o tipo D, como penicilina ou seus análogos. A expressão do gene blaz das β-lactamases está sob o controle de dois genes regulatórios adjacentes, o indutor blari e o gene repressor blai. A inibição ocorre quando o produto do gene blai liga-se ao operador do gene estrutural blaz, ocorrendo então o bloqueio da transcrição do gene. A transcrição ocorre quando o produto de clivagem do BLAR1 cliva a proteína blai permitindo que o gene seja transcrito (112, 113). Alguns genes independentes do lócus mec, denominados de fem (fatores essenciais para a expressão de resistência) contribuem para a resistência aos β- lactâmicos. Estão presentes no cromossomo dos Staphylococcus spp. resistentes a meticilina. Dois genes, fema e femb, estão envolvidos na formação da ligação cruzada dos precursores da cadeia de petideoglicano. A disfunção de um dos dois diminui o conteúdo de glicina nos precursores do peptideoglicano e confere suscetibilidade a é necessária para elevar a atividade autolítica nos isolados que possuem o gene meca (57, 67, 130). meticilina. A presença do fema Os Staphylococcus spp muitas vezes expressam resistência heterogênea, significando que seu crescimento em presença dos antibióticos β-lactâmicos, seleciona subclones altamente resistentes em uma população com MICs baixos para meticilina. A causa da heteroresistência são fatores cromossômicos cuja atividade afeta o nível da resistência. Isto pode ocasionar erros laboratoriais nos testes convencionais de cultura, podendo as mesmas serem diagnosticadas como isolados MSSA e assim, tornarem-se um reservatório nos ambientes hospitalares (39, 42, 107, 115, 117). Nos S. aureus e Staphylococus coagulase negativa (SCoN), o gene de resistência a meticilina denominado de meca, localiza-se em um elemento genético móvel denominado de cassete cromossômico estafilocócico mec (SCCmec) (42, 91, 93, 99, 106, 111), e nos S. aureus, está integrado em seu cromossomo em um único sítio (attbscc) próximo a origem de replicação (55), possuindo baixa afinidade por β- lactâmicos e sem relação com as β-lactamases (81).

31 Gene meca O gene meca é altamente preservado entre as espécies de estafilococos. O mecanismo responsável pela sua transferência horizontal do S. epidermidis para o S. aureus ou entre as espécies Gram-positivas ainda é desconhecido (55). O mesmo pode ter se originado do Staphylococcus sciuri, possivelmente uma espécie ancestral, e posteriormente ter sido transferido para as outras espécies (S. epidermidis e S. aureus). O gene meca pode ser um gene nativo no S.sciuri que possivelmente originou o meca no S. aureus. Evidências genéticas demonstram que a pbpd do S.sciuri foi o precursor evolucionário do gene meca do S.aureus. A proteína codificada pela pbpd tornou-se conhecida como PBP4, uma das seis PBP s detectadas no S.sciuri. Esta proteína possui algumas propriedades bioquímicas semelhantes a PBP2a do S. aureus relacionada com a resistência aos antibióticos ß- lactâmicos (7, 33,146). A expressão gênica do meca pode ter dois fenótipos: induzível ou constitutivo. O fenótipo induzível possui um lócus regulatório com os genes meci e mecri, homólogos aos genes reguladores blai e blari que regula a produção das β- lactamases. Os genes reguladores bla ou mec regulam a produção da PBP 2a e β- lactamase devido ao alto grau de homologia dos dois sistemas (28,85). Os isolados com disfunção na região regulatória dos genes meci e mecri, expressam o meca constitutivamente, pois o BlaR1 é um forte indutor do meca e BlaI fraco repressor. Entretanto, nos isolados clínicos a regulação é feita pelo gene bla devido a deleções e mutações que ocorrem no gene meci responsável pela repressão. Cepas com estas características são muito importantes porque são desreprimidas lentamente dificultando a detecção da resistência, necessitando até de 48hs para se expressar totalmente. O BlaR1 e o BlaI são capazes de controlar a expressão da PBP2a quando os genes mecr1 e o meci estão desativados. As classes mec são definidas pelo rearranjo dos genes adjacentes ao meca (16,59, 78). Igualmente ao S. aureus, a resistência a oxacilina no S.epidermidis é derivada da produção de uma PBP 2a alternativa, codificada pelo gene meca (120), que possui

32 15 homologia entre os MRSA e MR-SCoN, indicando que o mesmo pode ser proveniente dos Staphylococcus sp. (28, 65). O gene meci reprime o meca e autoreprime a transcrição do mecr1 e meci, através da ligação do promotor-operador (OP). A repressão da transcrição do meca pelo meci, faz com que a cepa torne-se suscetível a drogas ß-lactâmicas, devido a ausência da produção de PBP 2a. A inativação por deleção, faz com que a mesma expresse altos níveis de resistência (65, 140) Complexo genético mec Três classes principais do complexo genético mec foram identificadas. O protótipo mec (classe A) é composto pelo meca, seus genes reguladores mecr1(gene do sinal transdutor), meci (gene repressor) (120) intactos e a seqüência de inserção IS431: classe A- IS431- meci- mecr1- meca- IS431. No complexo classe B o domínio PB do mecr1 e o gene completo meci estão truncados por uma cópia parcial de IS272: classe B- IS272- ΔmecR1- meca- IS431. Já o complexo C possui duas variantes, C1 e C2. Na classe C1 o domínio PB do mecr1 e todo o meci estão truncados pelo IS431, e na classe C2, os domínios MS e PB do mecr1 e do meci estão truncados por IS431: classe C- IS431- ΔmecR1- meca-is431. Na classe D o meci está deletado e o domínio PB do mecr1 truncado:classe D- ΔmecR1- meca- IS431 (65, 78). O complexo mec mais prevalente e disseminado possui a estrutura meci-mecr1-meca-is431r (IS431mec) (68, 140) Complexo genético ccr e principais tipos de SCCmec O complexo genético ccr é composto por um ou dois genes recombinases sítios-específicos, responsáveis pela mobilidade do SCCmec. O SCCmec é integrado no sítio genômico attb scc localizado na sequência aberta de leitura orfx (open reading frame) com função desconhecida (17). O gene ccr catalisa a excisão e integração do elemento SCCmec. Atualmente três foram identificados: ccra, ccrb, ccrc (Figura 4) (17, 64).

33 16 Fonte: Hussain et al Figura 4 Desenho esquemático de gene meca As enzimas ccra, ccrb estão classificadas em quatro alótipos: ccra1 e ccrb1 (carreados pelo SCCmec tipo-i), ccra2 e ccrb2 (carreado pelo SCCmec tipo-ii e SCCmec tipo-iv), ccra3 e ccrb3 (carreados pelo SCCmec tipo-iii), ccra4 e ccrb4 (carreado pelo SCCmec tipo-vi). O gene ccrc foi identificado pelo SCCmec tipo-v ou elemento SCC (17, 64). O cassete estafilocócico cromossômico (SCCmec) classifica-se conforme a combinação do complexo genético meca e as recombinases do cassete cromossômico ccr (17, 29, 83). O complexo genético ccr codifica as recombinases responsáveis pela mobilidade do SCCmec (17, 98). As partes remanescentes do SCCmec são denominadas de região J (região J1, J2, J3), componentes não essenciais do cassete que podem carrear determinantes de resistência aos antibióticos. Variações nessas cadeias são utilizadas para definir os subtipos de SCCmec (17, 87). A estrutura do SCCmec pode ser resumida em: J1-ccr-J2-mec-J3 (87). Até o presente momento seis tipos de SCCmec foram descritos (Figura 5). Isolados sensíveis a meticilina (MSSA) tornam-se resistentes (MRSA ou MR- SCoN) através da aquisição do SCCmec, elemento genético móvel que carreia o gene meca encontrado nas espécies de estafilococos (23, 29, 64). O mesmo é um veículo de troca de genes de resistência a meticilina e está amplamente distribuído entre os S.aureus e Staphylococcus sp. (83).

34 17 Figura 5. Classificação dos principais tipos de Cassetes 1.9 Staphylococcus spp. hospitalares e comunitários Com o advento da penicilina na década de quarenta, houve redução na taxa de mortalidade dos pacientes portadores de infecções ocasionadas por tais espécies. Porém, surgiram isolados produtores de enzima beta-lactamase que se disseminaram pelos hospitais. Nos anos 50, surgiu uma nova droga β-lactâmica antiestafilocócica (meticilina), resistente a ação de β-lactamases produzidas pelas bactérias, para fins de tratamento de infecções ocasionadas por espécies de estafilococos resistentes à penicilina (21,132). Novamente os estafilococos desenvolveram resistência cromossômica a meticilina, a partir de um mecanismo que altera as proteínas ligadoras de penicilina (PBP) e confere resistência cruzada a todos os β-lactâmicos (21,132).

35 Prevalência de estafilococos resistentes a meticilina A prevalência de isolados MRSA varia em diferentes regiões do planeta. Na Suíça, o percentual é de 85,7% de HA-MRSA e 14,3% de CA-MRSA (124). Na Finlândia, 80% de HA-MRSA (63) e nos EUA 55% de HA-MRSA (73). No Japão 67% e na Austrália 23% (26). Na Argentina a prevalência de HA-MRSA é de 51%, enquanto que na Bolívia é de 55%, no Paraguai 30%, Uruguai 24% e Venezuela 27% (13). Para o Brasil, em 2006, a Associação Pan-Americana de Doenças Infecciosas registrou que 54% das infecções comunitárias e hospitalares eram ocasionadas por isolados MRSA (13). Especificamente no Rio de Janeiro, a taxa foi de 56% (27), em Porto Alegre 100% de estafilococos coagulase negativos (83) e 40,5% de S.aureus resistentes a meticilina (104), enquanto que na cidade de Manaus, no ano de 2003, Egido et al. detectaram 90% de S. aureus sensíveis a meticilina (MSSA). No de 2009, na mesma cidade, Ferreira et al. detectaram 15% de MRSA em um estudo realizado na Fundação Afredo da Matta sem identificar a origem dos isolados (44) Processos infecciosos ocasionados por estafilococos resistentes a meticilina Devido a sua ampla disseminação nos hospitais em todo o mundo, o S.aureus (HA-MRSA) continua sendo o agente responsável por inúmeros processos infecciosos nosocomiais (138), como infecções de pele e tecido mole (123), pneumonia, artrite séptica, endocardite, osteomielite, septicemias e infecções intravasculares (138). Com o surgimento de casos na comunidade (CA-MRSA), passou a afetar também indivíduos saudáveis (atletas, presidiários, soldados em treinamento nas bases) sem fatores de risco associados (contato direto, compartilhamento de itens pessoais sem higiene freqüente, colonização nasal) (124,138). Assim como os S.aureus, os coagulase negativos podem também causar diferentes processos patológicos, principalmente em pacientes imunodebilitados, como bacteremia, endocardite, infecções urinárias e relacionadas com cateteres e próteses. Portanto, a importância deles, baseia-se no fato de estarem se tornando prevalentes e associados a processos infecciosos de elevada morbidade e taxas de mortalidade que podem atingir até 14% das infecções hospitalares (41, 135).

36 Cassetes cromossômicos e Clones estafilocócicos Apesar dos estafilococos resistentes a meticilina possuirem o gene meca (63, 124) localizado no SCCmec apresentarem resistência aos antibióticos betalactâmicos, possuem outros determinantes comuns de resistência que contribuem para caracterizar os diferentes tipos de SCCmec, além dos complexos essenciais mec e ccr (54, 63, 97, 104), resultando assim na identificação de diferentes tipos de cassetes cromossômicos (tipo I até V) (63, 85, 97) relatados em vários países (80), cada qual possuindo tamanho e características diferentes, dispersos em vários continentes, constituindo clones de estafilococos responsáveis por infecção comunitárias (CA-MRSA) e hospitalares (HA-MRSA), como o ST8 (spa tipo t008, USA 300),ST1 (spa tipo t127, USA400) (110) e tipo 80 (ST80; spa tipo t044, clone europeu) (110), sendo altamente virulentos para os pacientes internados em hospitais, e se tornando um veículo de troca de genes de resistência entre os estafilococos (63). Esses clones estafilocócicos diferem entre si devido a organização genômica e estrutural, sendo esta refletida pela distribuição no SCCmec, nos determinantes de toxinas estafilocócicas como a enterotoxina, exfoliatina D, e leucocidina Panton Valentine (LuKPV), que ocorrem também em isolados de estafilococos coagulase negativa, demonstrando que podem ser passíveis de transferência horizontal, apesar do mecanismo ainda não ser bem conhecido (54, 82, 110). Sabe-se atualmente, que cepas identificadas como sensíveis (MSSA) LuKPV negativas, podem ser reservatórios comunitários aguardando apenas a aquisição do SCCmec, LuKPV e outros determinantes de virulência e resistência para se tornarem clones CA-MRSA virulentos (63, 82, 110). Portanto, a LuKPV é utilizada mundialmente nos testes laboratoriais como marcador para determinação de isolados comunitários (CA- MRSA), por estar envolvida em infecções invasivas como pneumonia necrotizante (24, 38, 82), pois geralmente os estafilococos pvl-positivos, estão associados com infecções cutâneas piogênicas necrotizantes (abcessos e furúnculos) e menos frequentemente com celulite e necrose tecidual (103), apesar de já existirem relatos de S. aureus pvl-positivos isolados de pacientes portadores de artrite, bacteremia (71) e pneumonia necrotizante (49, 74).

37 20 Atualmente a nomenclatura dos estafilococos meticilina resistentes baseia-se na sequência de tipagem multilocus (ST) dos fragmentos de sete genes denominados housekeeping, que referem a linhagem da bactéria, no caso S. aureus e S. epidermidis, resultando em um perfil alélico designado de ST e o tipo do elemento SCCmec. A detecção de linhagens divergentes através de técnicas moleculares como o MLST, sugere que o estafilococo resistente a meticilina surgiu pela introdução do SCCmec em uma linhagem de cepa sensível a essa droga (26). Atualmente existe uma diversidade de clones de S. aureus e de S. epidermidis dispersos pelo mundo. Na China os clones mais prevalentes são o ST239 e ST1018 (138). Na Oceania, o ST30 (11). No continente europeu, a Romênia apresenta os clones ST239,ST5,ST80,ST1,ST254 (75) como os mais prevalentes, enquanto que nos demais países prevalece o ST80 (11). No Kuwait prevalece o ST80 (131a,131b). Nos Estados Unidos os clones prevalentes são USA300 (ST8) e USA 400 (ST1) (11,131a,131b), enquanto que no Brasil, especificamente nas cidades de Porto Alegre e Rio de Janeiro, foram identificados três complexos clonais de S. aureus como ST8,ST30 e ST1, correspondendo aos clones USA300, clone do Oceano Pacífico Sul e USA400 (26, 116). Em relação ao S. epidermidis, dados publicados demonstram a prevalência dos clones ST2 e ST22 na Grécia (76), ST2 na Suiça, Finlândia e China (61, 77, 139), e nos Estados Unidos, os clones ST2, ST5,ST6, ST22, ST23, ST87, ST185,ST186 (88,145). No Brasil os clones conhecidos são os ST2,ST231 e o ST263 ( Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA Vários fatores de risco dentre eles hospitalização, antibióticoterapia, internação em enfermarias, contato direto com o corpo clínico, contribuem para infecção ou colonização dos pacientes por isolados de estafilococos coagulase negativos e S.aureus resistentes a meticilina. Entretanto, deve-se ressaltar que os CA-MRSA e HA-MRSA são tanto genética como fenotipicamente distintos (110). Isolados HA-MRSA apresentam resistência a múltiplos antibióticos betalactâmicos (penicilinas lábeis, estáveis, penicilina G, amoxacilina, carbapenêmicos,

38 21 cefalosporinas de 1º, 2º, 3º e 4º geração) e, em especial, a fluoroquinolona. Não estão associados ao gene codificador da Leucocidina Panton-Valentine (PVL) e carreiam um cassete SCCmec largo do tipo I, II, III, raramente o IV (21, 24, 45, 47, 63). Os CA-MRSA carreiam um cassete SCCmec menor tipo IV, V ou VI, que os torna suscetíveis a antibióticos não beta-lactâmicos como clindamicina, tetraciclina, e também a quinolona, sulfametoxazol/trimetoprima e doxiciclina. Freqüentemente estão associados com a presença da toxina Leucocidina Panton Valentine (PVL), localizada no interior do bacteriófago phislt, e apresentam múltiplas características no pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (21, 24, 45, 47, 63). São também mais virulentos e ocasionam doenças altamente invasivas e progressivas (pneumonia necrotizante), geralmente em indivíduos saudáveis, jovens, e sem exposição a fatores de risco hospitalar (124), devendo-se verificar se o tipo do SCCmec possui ou não importância nessas infecções (Quadro 2) (21, 49, 124) Prevalência de bactérias Gram-negativas produtoras de ESBLs Os processos patológicos que acometem pacientes infectados por bactérias Gram-positivas, também podem ocorrer em bactérias Gram-negativas, e a grande preocupação clínica está relacionada com sua capacidade de adquirir resistência aos antibióticos, que as torna capazes de produzir a enzima beta-lactamase de espectro estendido (ESBL), que hidrolisa as oxiamino-cefalosporinas e aztreonam dificultando assim a escolha terapêutica, o que afeta os pacientes, principalmente idosos, imunocomprometidos e debilitados, já que esses antibióticos são utilizados diariamente na rotina hospitalar e comunitária (48, 109, 130, 134). Dentre as bactérias não-fermentadoras, a Pseudomonas aeruginosa é a que apresenta índice de mortalidade mais elevado (5%) (32), tendo sido isolada de 10,7% (32) das amostras biológicas coletadas de pacientes sob antibióticoterapia profilática, seguida posteriormente por outras espécies bacterianas como E. coli e Salmonella sp. (46, 48). Já nos pacientes internados portadores de doenças hematológicas, como lúpus, anemia hemolítica, aplasia de medula, linfoma, doença maligna dentre outras, a imunodeficiência ocasionada pela doença de base os torna muito mais vulneráveis a infecções bacterianas por espécies Gram-negativas (32), principalmente se

39 22 estiverem utilizando acesso venoso central como cateteres (136). Relatos de bacteremia nesses pacientes assim como infecções hospitalares ocasionadas por E.coli, principalmente em pacientes imunocomprometidos, já foram registrados na literatura (79, 136). Quadro 2. Características diferenciais entre HA-MRSA e CA-MRSA Aquisição Infecções clínicas Fatores de risco Fenótipo Marcadores genéticos HA-MRSA Hospitalar Pacientes imunodebilitados, contato direto e. Internação prolongada, uso prolongado de antibióticos, enfermarias, diabetes, dispositivos intravasculares, doença pulmonar crônica b. Resistência a múltiplos antibióticos betalactâmicos e em especial a fluoroquinolona a, f. Negativo para o gene codificador da Leucocidina Panton-Valentine (PVL). Carreiam um cassete SCCmec largo, do tipo I,II, III, e raramente o IV d, f. CA-MRSA Comunitário Indivíduos jovens, saudáveis, sem fatores de risco associados e. Contato físico, compartilhamento de itens pessoais, lesões de pele, uso de drogas, prisão, atletas b Suscetíveis a antibióticos não betalactâmicos como clindamicina, tetraciclina,quinolona,sulfametoxazol /trimetoprima e doxiciclina (multidroga) a, f. Gene codificador da (PVL) c Carreiam um cassete SCCmec menor, tipo IV ou V. Múltiplas características no PFGE d, f. Fonte: Fey et al a (45) ; Huang et al b (60) ; Ma et al c (82), Bouchami et al d (23), Strandén et al e (124), Boyle-Vavra et al f (21). A prevalência de bactérias produtoras de ESBLs oscila entre as instituições de saúde e países. Na Suíça é de 8%, Portugal 34%, Ásia 20% (92), Turquia 58% (105) e África do Sul 20% (93). Nos EUA a média anual é de 3% (14), e nas regiões da América Latina 60%. No Brasil, a prevalência registrada para espécies como a Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) é de 45,4% enquanto que para a Escherichia coli (E. coli) 6% (10). Na região Norte, e especificamente no Amazonas, ainda não há registros publicados sobre infecções ocasionadas por bactérias produtoras de ESBL.

40 Enzima Beta-Lactamase As ß-lactamases são enzimas que se localizam no espaço periplasmático nas bactérias Gram-negativas ou extracelularmente nas Gram-positivas. A informação genética para sua síntese pode estar contida no plasmídeo ou cromossomo bacteriano (25). No caso do plasmídeo, o mesmo também pode ser incorporado no cromossomo bacteriano (25) desenvolvendo-se assim a resistência cromossômica. Esta resistência muitas vezes não é detectada em condições normais de crescimento do isolado, surgindo apenas quando na presença de antibióticos indutores como os ß-lactâmicos (25). Os plasmídeos ou transposons contém os genes da ß-lactamase que são transferíveis entre as bactérias não importando a espécie (109), e que atualmente estão disseminados no mundo inteiro, sendo encontrados em diferentes espécies das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae (14, 103). A beta-lactamase SHV-1 (variável sulfidril), codificada cromossomicamente na maioria dos isolados de K. pneumoniae, é freqüentemente mediada por plasmídeo em E. coli. Assim, devido a essa forma de disseminação dos genes, nos últimos 20 anos, novos antibióticos surgiram e com eles também novas beta-lactamases, que induziram o surgimento de cepas resistentes (14). As ß-lactamases destroem os antibióticos ß-lactâmicos como penicilinas e cefalosporinas através da hidrólise do anel beta-lactâmico (25), mas podem ser inibidas por inibidores de beta-lactamases como o clavulanato, sulbactam e tazobactam, ineficazes contra a classe C destas enzimas (36). Mais de 340 ß-lactamases já foram identificadas estando classificadas em quatro classes de A à D conforme sua estrutura primária e características funcionais e bioquímicas (grupo I à IV) (37, 43). As ESBLs clássicas são comumente transmitidas/codificadas por plasmídeo como o da família TEM-, SHV- e OXA-. No decorrer dos anos, dentro de cada família, ocorreram mutações e novas variantes

41 24 surgiram como por exemplo, TEM-6, CTX-M-8, CTX-M-2, PER, VEB, GES, e TLA (36, 89, 102, 108, 134). A complexidade das ß-lactamases é acentuada por vários fatores dentre eles o fato de uma mesma cepa de bactéria expressar múltiplas ß-lactamases de tipos variados, podendo ocasionar diferentes implicações clínicas e dificultar a análise laboratorial de seu perfil enzimático. Outro fator relacionado é o efeito do inóculo que dificulta a detecção de resistência clinicamente relevante. As bactérias produtoras de ESBLs, demonstram resistência cada vez mais elevada as cefalosporinas de terceira geração com o aumento do inóculo bacteriano (efeito do inóculo), fenômeno ocasionado pela incapacidade dos antibióticos de destruírem ou inbirem as bactérias (142). Outro exemplo importante relacionado a essa complexidade, é o fato dessas enzimas apresentarem afinidade por diferentes antibióticos ß-lactâmicos. Porém, sua hiperprodução pode inativar a eficácia desses antibióticos, apesar de terem sido classificadas como ativas contra todo o antibiótico ß-lactâmico. Não é raro também, a presença de mecanismos redundantes de resistência na mesma cepa bacteriana, a qual pode albergar uma ß-lactamase combinada com uma mutação na porina, tornando-a multiressitente, ou então portar transposons contendo genes de resistência a múltiplos antibióticos além dos ß-lactâmicos, como fluoroquinolonas, aminoglicosídeos, trimetoprim-sulfametoxazol (142) Classificação das Enzimas Beta-Lactamases (110) As enzimas da classe A ou grupo II incluem as famílias bla TEM e bla SHV que hidrolisam as penicilinas e cefalosporinas; classe B ou grupo III, carbapenêmicos; classe C ou grupo I, cefalosporinas; classe D, penicilinas e cloxacilina; e grupo IV (peniclinases) penicilina (36). As enzimas pertencentes à classe A, geralmente são encontradas em plasmídeo ou transposon sendo consideradas as mais importantes. A SHV, por exemplo, é freqüentemente encontrada em isolados clínicos (36, 43).

42 25 Posteriormente Ambler classificou as ESBLs em 4 classes evolucionárias (A, B, C, D). As enzimas SHV- e TEM- pertencem à classe A e possuem a serina como seu principal resíduo catalítico, enquanto que as OXA- pertencem à classe D (oxacilinases). O esquema de Bush classifica as ESBLs de acordo com o perfil do substrato e características físicas como ponto isoelétrico e peso molecular. Neste esquema as ESBLs estão divididas em dois subgrupos: 2be (TEM- e SHV-) e 2d (OXA-) inibidos pelo clavulanato. Em 1995 Bush-Jacoby-Medeiros apresentaram um novo esquema no qual as enzimas foram divididas em quatro grupos (1-4) e subgrupos (a-f) (36). O grupo 1 é formado por cefalosporinases que não são inibidas pelo ácido clavulânico e pertencem a classe molecular C. O grupo 2 são penicilinases, cefalosporinases ou ambas, que são inibidas pelo ácido clavulânico e pertencem a classe molecular A e D. Devido ao surgimento de vários mutantes ESBLs foi criada duas subclasses 2a (penicilinases) e 2b (ESBLs de amplo espectro). Posteriormente foram criados subgrupos 2be (inativam cefalosporinas de terceira geração), 2br (ESBLs resistentes aos inibidores de beta-lactamases), 2c (inativam a carbenicilina), 2d (inativam a cloxacilina e são fracamente inibidas pelos inibidores de ß-lactamases) e 2f (serina-beta-lactamases). O grupo 3 possuem enzimas que necessitam de zinco para para exercerem seu efeito sendo denominadas de zincobeta-lactamases ou metallo-beta-lactamases e correspondem a classe molecular B. No grupo 4 estão as penicilinases não inibidas pelo ácido clavulânico (36) Beta-Lactamase de espectro estendido (ESBL) A primeira descrição de ESBL mediada por plasmídeo denominado TEM-1, foi feita em Esta enzima foi encontrada em cepa de E. coli isolada da hemocultura de uma paciente denominada Temoniera, na Grécia, daí a origem do nome (14, 35, 43). Em 1983 foi identificado um novo grupo de enzima beta-lactamase em isolados clínicos de Serratia marcescens e Klebsiella pneumoniae. Esta enzima passou a denominar-se de Beta-lactamase de espectro estendido ou ampliado (ESBLs) (2, 35).

43 26 Posteriormente, as ESBLs foram classificadas em dois grandes grupos sem relação entre si, apesar de algumas enzimas agirem sobre o mesmo substrato (ßlactâmicos) ligando-se a sítios diferentes (35). Assim sua ação ampliou-se também sobre as oxiamino-cefalosporinas e monobactans, reduzindo as opções terapêuticas da classe dos ß-lactâmicos para os carbapenêmicos, elevando os custos do tratamento e risco para os pacientes devido a longos períodos de hospitalização e antibióticoterapia (2, 35, 102). No caso dos pacientes portadores de doenças hematológicas, os mesmos são frequentemente submetidos à quimioterapia, o que ocasiona imunodeficiência deixando-os susceptíveis a uma ampla variedade de infecções, principalmente as hospitalares, e especialmente aquelas ocasionadas por bactérias produtoras de ESBL, contribuindo assim para a elevação do risco de morbi-mortalidade (113, 117). As ESBLs são produtos derivados de mutações pontuais no sítio ativo da enzima TEM e SHV (104), codificadas por plasmídeos conjugativos transferíveis entre as bactérias Gram-negativas (9, 128), que freqüentemente produzem determinantes de resistência a outras classes de antibióticos (65). As bactérias que comumente produzem esse tipo de enzima são E. coli e K. pneumoniae (2, 10, 65, 69, 102, 108), podendo também ser elaboradas por outras espécies como Enterobacter, Salmonella, Proteus, Citrobacter, Morganella morganii, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia (4, 10, 69) Subtipos das enzimas Beta-Lactamases de espectro estendido (ESBLs) Vários são os subtipos de ESBL. Em E. coli a maioria das ß-lactamases pertencem a classe A de Ambler e podem ser divididas em ß-lactamases de pequeno espectro como a TEM-1,TEM-2 e SHV, e as de amplo espectro, como TEM-3, SHV-5 e CTX-M-like. As do tipo CTX-M são de largo espectro e derivadas das ß-lactamases codificadas cromossomicamente pelo gênero Kluyvera. Foram isolados mais de 70 tipos, divididos em cinco clones, que possuem similaridades em sua sequência de aminoácidos conhecidos como CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, e CTX-M-25 (89,109). Estudos realizados nos genes codificadores de ESBL

44 27 revelaram que a maioria dos isolados produtores carreiam os genes TEM-1 (88%), CTX-M (20%), SHV (8%), e OXA (5%), sendo o CTX-M o mais prevalente e disperso pelo mundo (79, 110). Nas espécies de E. coli, os subtipos SHV, TEM e CTX-M-15 são os mais prevalentes (108), já em Pseudomonas aeruginosa, é o GES- 1 e GES-5 (86). Bactérias produtoras de enzimas mediadoras de resistência aos carbapenêmicos estão descritas mundialmente. As carbapenamases são representadas por 3 classes moleculares de ß-lactamases: A,B e D. A mais conhecida é a K. pneumoniae (KPC); enterobactéria produtora de carbapenamase, responsável por vários surtos hospitalares. A classe B são as metalobetalactamases (MBL) que apresentam um amplo espectro de substrato. As carbapenamases da classe D tipo OXA, são mais frequentemente detectadas nas bactérias não fermentadoras, exceto a OXA-48, detectada somente em enterobactérias e que possui uma notável atividade de hidrolisar os carbapenêmicos (35, 90) Importância Clínica das ESBL As mutações genéticas pontuais que ocorrem nos isolados produtores de ESBL, torna-os capazes de sintetizar as ESBLs que atuam hidrolisando antibióticos de amplo espectro como as cefalosporinas (ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima), monobactans (aztreonam) (4, 36, 43, 66, 105), e, como os plasmídeos muitas vezes albergam genes codificam as ESBLs e outros que codificam resistência aos antibióticos não beta-lactâmicos, quando a bactéria é estimulada para um gene de determinado antibiótico, pode-se tornar concomitantemente, resistente aos outros antibióticos também, podendo ampliar assim sua resistência contra outros antimicrobianos não ß-lactâmicos como aminoglicosídeos, fluoroquinolonas, tetraciclina, cloranfenicol e sulfonamidas (36, 93). Outro aspecto importante é que esses genes, localizados no mesmo plasmídeo conjugativo, podem ser transmitidos conjuntamente de um isolado para outro não importando o gênero bacteriano, ou então serem estimulados separadamente por pressão seletiva, tornando assim mais difícil a escolha

45 28 terapêutica nesses casos, principalmente, quando da ausência do diagnóstico (84, 102) laboratorial desse fenótipo Portanto, torna-se importante a realização dos testes de suscetibilidade de acordo com os critérios determinados pelo CLSI 2010, pois até 2009 a recomendação era de se realizar a detecção de cepas produtoras de ESBL em duas etapas, screening e testes confirmatórios. Entretanto, em 2010 (manual M100-S20) esta orientação deixou de existir como condição única, sendo incluídas as orientações posológicas mínimas além dos pontos de corte modificados para interpretar os resultados obtidos (halo de inibição e concentração inibitória mínima) (30) Preocupações relativas às infecções bacterianas Isolados resistentes a antimicrobianos como os HA-MRSA, CA-MRSA e ESBLs, ocasionam quadros graves de infecções muitas vezes difíceis de tratar devido à limitada opção terapêutica, elevando assim o percentual de morbimortalidade e os custos do tratamento decorrentes da internação prolongada nos hospitais. (85, 93). Outro fator importante é a dificuldade para detecção desses isolados nos testes laboratoriais de suscetibilidade a antimicrobianos que, apesar das normas do CLSI 2010 (manual M100-S20), para algumas espécies ainda é necessário teste confirmatório para este tipo de fenótipo, devido ao surgimento de novos mutantes bacterianos produtores de ESBL e novas espécies de estafilococos coagulase negativos resistentes a meticilina, para as quais o CLSI ainda não possui padronização da concentração inibitória mínima (MIC) aos antimicrobianos utilizados na rotina hospitalar (85). A importância desses patógenos é tão relevante para a saúde pública, que relatos de doenças causadas por bactérias Gram-positivas resistentes a meticilina (MRSA), Gram-negativas produtoras de beta lactamase de espectro estendido (ESBL) incluindo aquelas que ampliaram seu espectro de resistência aos carbapenêmicos (ampc), estão amplamente descritos e discutidos na literatura científica nacional e internacional (115,117,138,139). Portanto, a resistência microbiana

46 29 aos antimicrobianios utilizados no tratamento, ainda é um grande desafio tanto nas infecções comprovadamente hospitalares, quanto nas adquiridas na comunidade, em todo o mundo. Em razão dos pacientes internados nos hospitais estarem mais expostos aos antimicrobianos de largo espectro (que muitas vezes debilitam a barreira química natural do organismo ou ocasionam alteração da resposta imune), ao contato freqüente entre profissional da saúde-paciente (possibilitando a transmissão cruzada de patógenos), a ruptura da barreira tecidual por processos invasivos, como cirurgia, inserção de sondas, cateteres, e ao déficit nutricional devido à dificuldade de ingestão, a probabilidade de ocorrerem processos infecciosos graves e até mesmo fatais nos mesmos, ocasionados por bactérias resistentes presentes no ambiente hospitalar, é elevadíssima (114,115,117). Atualmente observa-se que os fatores de risco para que um paciente desenvolva algum processo infeccioso bacteriano, de origem hospitalar ou comunitária, tanto em hospitais como em ambulatórios já é uma realidade, e a Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (FHEMOAM), como um centro que promove assistência ambulatorial e internações a pacientes com doenças hematológicas (hemofilia, talassemia, anemia hemolítica, leucemia,etc) muitas vezes graves, não é uma exceção no processo. Muitos dos usuários assistidos requerem tratamentos que incluem seções de quimioterapia que, às vezes, causam efeitos colaterais como imunodeficiência, deixando-os mais suscetíveis a infecções bacterianas graves que, quando tratadas de modo ineficaz, podem levar a estado de morbidez prolongado podendo ocasionar a morte. Nestes casos, a resistência microbiana aos antibióticos utilizados no tratamento, ainda é um desafio tanto nas infecções comprovadamente hospitalares, quanto nas adquiridas na comunidade. Pesquisas científicas nesse campo são fundamentais para a saúde pública e bem estar dos indivíduos e das comunidades, pois as questões que envolvem a saúde pública são complexas e seus problemas devem ser confrontados em todos os aspectos, dos mais abrangentes aos mais localizados, e o estudo científico pode contribuir sobremaneira para o equacionamento e solução dos mesmos.

47 30 Pesquisas direcionadas para os mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos, utilizando-se protocolos moleculares (110,130) que possibilitem visualizar se os genes específicos e suas possíveis mutações são comuns ou exclusivas, como as descritas por pesquisadores em outras regiões (132,135), auxiliarão diretamente no desenvolvimento de novos projetos envolvendo outras instituições de saúde ligadas ao SUS, de diferentes níveis de complexidade, o que ampliará a visão epidemiológica sobre a fisiopatogenia das doenças ocasionadas por esses agentes, o monitoramento dos mecanismos de resistência dos mesmos, a importância da pressão seletiva relacionada ao uso de antimicrobianos, os mecanismos de infecção cruzada bem como os de disseminação, auxiliando sobremaneira no controle das infecções, das decisões sobre a terapia antimicrobiana e das políticas de saúde a serem adotadas para a prevenção de surtos hospitalares ou comunitários.

48 31 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Descrever a freqüência, sensibilidade aos antimicrobianos e caracterizar as alterações genético-moleculares das bactérias patogênicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM 2.2 Específicos Identificar a freqüência dos gêneros e espécies bacterianas. Identificar os fenótipos de sensibilidade, sensibilidade reduzida e a resistência dessas bactérias aos antibióticos indicados no tratamento. Identificar as alterações genético-moleculares de resistência envolvidas.

49 32 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Delineamento Estudo transversal, descritivo, com componentes analíticos, realizado a a partir da demanda espontânea de pacientes atendidos na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas/FHEMOAM, autarquia do governo do Estado do Amazonas, localizada na zona centro oeste de Manaus, onde são atendidos anualmente pacientes com doações de sangue entre Capital e Interior do Estado. 3.2 População de estudo Pacientes de ambos os sexos, de qualquer faixa etária, portadores de doenças hematológicas, com suspeita clínica de processo infeccioso bacteriano, internados na FHEMOAM. 3.3 Amostragem Foram incluídos todos os casos de pacientes com doença hematológica apresentando quadro de infecção bacteriana durante o período de julho/2007 a agosto/2008. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da FHEMOAM sob número 170 CAAE versão 003/06. A abordagem do paciente foi realizada após consulta médica na qual foi detectada provável infecção. Foram realizados esclarecimentos quanto aos objetivos e métodos a serem utilizados, apresentando ao sujeito da pesquisa o Termo de Consentimento Livre Esclarecido adequado para adultos e crianças (anexo 1). Aqueles que não concordaram em participar do estudo não tiveram nenhum tipo de prejuízo no atendimento e receberam o mesmo tratamento oferecido pela FHEMOAM aos demais pacientes. Após esclarecimento e aceite dos pacientes, as amostras foram coletadas, as informações referentes ao cadastro e resultado dos testes foram incluídas no anexo 2, e os testes foram realizados conforme protocolos

50 33 do estudo (Anexo 3). Todos os resultados dos exames de cultura e antibiograma foram enviados para os médicos dos pacientes internados a fim de orientar a escolha terapêutica. Os procedimentos realizados na pesquisa encontram-se descritos no fluxograma da figura 6 e os protocolos laboratoriais no anexo 3. Figura 6 Fluxograma dos procedimentos executados na realização do estudo

51 Critérios de inclusão a) Pacientes com diagnóstico prévio de doença hematológica b) Pacientes atendidos no ambulatório ou internado na FHEMOAM c) Pacientes apresentando sinais e sintomas clínicos de processo infeccioso bacteriano d) Pacientes utilizando ou não antibióticos de amplo espectro a partir de qualquer via de administração e) Pacientes neutropênicos (número de neutrófilos inferior a 1000 mm 3 de sangue) ou que apresentarem quadro febril durante o período de internação. 3.5 Critérios de exclusão a) Pacientes cujas culturas apresentaram contaminação por outras bactérias durante o processo de manipulação b) Pacientes portadores de outras doenças que não as hematológicas. c) Culturas que apresentaram crescimento microbiano de Micrococcus sp. 3.6 Solicitações do Exame Bacteriológico O exame laboratorial foi realizado após solicitação médica seguindo o protocolo interno padronizado da FHEMOAM, conforme normas técnicas padronizadas (Pop/HEMOAM/Goldin 2001), adequadas para diferentes tipos de infecções bacterianas. O protocolo clínico (Pop/FHEMOAM) interno específico para pacientes hematológicos imunodeprimidos define como critério de infecção: Pacientes Hematológicos Imunodeprimidos: Foram considerados pacientes portadores de doenças hematológicas imunodeprimidos aqueles que apresentaram: 1- Neutropenia- quando a contagem de neutrófilo está abaixo de 500/células por mm 3 ou quando inferior a 1000/células por mm 3 após quimioterapia. 2- Quebra de barreiras naturais: lesão de pele, mucosa, quimioterapia

52 35 3- Febre durante neutropenia (temperatura acima de 38,3 C ou acima de 38 C mais de uma hora) Fatores de baixo risco para complicação: Os pacientes hematológicos que apresentaram um dos sintomas abaixo relacionados foram considerados como de baixo risco para complicação, mas com probabilidade de desenvolver infecção bacteriana. 1- Contagem absoluta de neutrófilos acima de 100 células, monócitos acima de 100 células raios X de tórax e função renal normal. 2- Leucopenia com menos de sete dias. 3- Ausência de infecção na corrente sanguínea e no cateter. 4- Recuperação precoce de produção celular pela medula óssea. 5- Remissão de malignidade. 6- Pico de temperatura abaixo de 39 C, ausência de rebaixamento de alteração neurológica (ausência de dor abdominal e co-morbidade, choque, pneumonia, vômito, diarréia). 3.7 Coleta de amostra biológica A coleta de material biológico foi realizada seguindo as recomendações de Winn et al., 2008 (142) e Manual Anvisa Módulo III (8,9), sendo transportados imediatamente para o laboratório. Material de ponta de cateter foi coletado por médico especializado e enviado imediatamente para o laboratório (frasco estéril sem conservante) (8,9,142). 3.8 Cultura, Isolamento e Identificação das bactérias isoladas Para o isolamento primário de bactérias aeróbicas, foram utilizados meios de cultura como ágar sangue de carneiro a 5% (Himedia Hexasystens-Mumbai, India), ágar manitol salgado (Himedia), ágar eosina azul de metileno (EMB) (Himedia), ágar Mac Conkey (Himedia), Mueller Hinton (Himedia).

53 36 Após coleta, as amostras foram semeadas e incubadas em estufa bacteriológica à temperatura de 35,6ºC, por um período de 24/48 horas. Culturas que apresentaram crescimento foram submetidas à reação de Gram (Newprov). As colônias Gram-positivas foram submetidas aos testes de identificação de gênero e espécie como, catalase, coagulase (Newprov), fermentação do manitol (Himedia), teste do L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide-PYR-Test (Probac do Brasil), testes com monodiscos de antibióticos como novobiocina 5µg (Laborclin), bacitracina 0,04UI (Newprov), polimixina B-Pol 300 (Newprov), furazolidona-100mcg (Cefar). As bactérias identificadas como Gram-negativas, foram submetidas a testes de identificação de gênero e espécie como oxidase, Kit EPM-MILi-Citrato (Probac do Brasil), Enterokit B (Probac do Brasil), Enterokit C (Probac do Brasil), Kit NFII (Probac do Brasil), testes bioquímicos adicionais com os meios de Mac Conkey (Himedia), ágar uréia (Himedia), meio de MIO (Himedia), caldo Lisina (Himedia), meio de TSI (Himedia), açúcares como glicose (Himedia), maltose (Himedia), lactose (Himedia), sacarose (Himedia), realizados conforme protocolos padronizados (142). Os protcolos laboratoriais encontram-se descritos no anexo Teste da Beta-Lactamase (cefinase) Foi realizado o teste da beta-lactamase tanto nas bactérias Gram-positivas quanto Gram negativas, a partir de fita impregnada com reagente contendo cefalosporina cromogênica (Cefinase plus), segundo recomendações do fabricante Beckton-Dickson (BD Diagnostic System, Sparks, MD). A detecção da enzima sugere que a espécie bacteriana produz a enzima beta-lactamase sendo resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos (12) Teste da Beta-Lactamase de espectro estendido (ESBL) O teste aplicado para detecção do fenótipo ESBL foi o epsilométrico (Eteste ) utilizando-se os antibióticos cefotaxima ( μg/ml)/cefotaxime ( μg/ml) mais 4 μg/ml de ácido clavulânico; ceftazidima ( μg/ml) /ceftazidima ( μg/ml) mais 4 μg/ml de ácido clavulânico, segundo recomendações do

54 37 fabricante (AB-Biodisk-Sweden ). Fonte: William Antunes Ferreira Figura 7: Imagem das fitas de cefinase plus utilizadas na realização do teste da betalactamase. Os organismos testes foram suspensos em solução salina a 0.8%, padrão de turbidez número 0.5 da escala de McFarland e inoculados no meio de ágar Mueller- Hinton (Himedia), seguidas por uma incubação a 37 C por 18 24h. A interpretação do testes foi realizada segundo o manual técnico do Clinical and Laboratory Standards (CLSI; Wayne, Pennsylvania, USA) (29), o qual fornece o ponto de corte (break point) correspondente ao diâmetro da zona de inibição. Cepas de E. coli ATCC e K. pneumoniae ATCC foram utilizadas como controle de qualidade para os meios de cultura e testes de suscetibilidade. O teste epsilométrico E-teste consiste na aplicação de fitas plásticas, nãoporosas com cinco milímetros (mm) de altura e 60 mm de comprimento contendo em um dos lados o MIC (Concentração Inibitória Mínima) num gradiente de µg/ml para os antibióticos cefotaxime (CT) e ceftazidime (TZ) com escalas de 0,25-16 µg/ml e 0,50-32µg/mL, respectivamente. No outro apresenta dois gradientes predefinidos de CTL (cefotaxime/ácido clavulânico) e TZL (ceftazidime/ácido clavulânico) com escalas de 0,016-1 µg/ml mais 4 µg/ml de ácido clavulânico, e 0,064-4 g/ml mais 4 µg/ml de ácido clavulânico (Figura 7). Após o cultivo e isolamento, a cultura pura foi armazenada em freezer a -70ºC segundo CLSI, 2005 (29). Posteriormente, as cepas resistentes foram submetidas a estudos moleculares para determinação genética de sua resistência e os resultados armazenados em banco de dados apropriado.

55 38 Fonte: AB BIODISK. Figura 8: Desenho esquemático das fitas utilizadas na realização do Etest ESBL com os gradientes de concentrações dos antibióticos CT e TZ e em associação com o inibidor, o ácido clavulânico. A produção de ESBL (figura 8) foi determinada a partir do aparecimento de uma zona fantasma (phantom zone), deformação da elipse do lado contendo o CT ou TZ, ou quando o MIC de CT ou TZ se apresentassem reduzidos a 3 log 2 de diluições na presença do ácido clavulânico (Quadro 3). Quadro 3. Protocolo de interpretação do Etest ESBL, conforme recomendações do fabricante AB BIODISK Descrição ESBL MIC CT > 0,5 e CT/CTL > 8 ou TZ > 1 e TZ/TZL > 8 Positivo ou Zona fantasma ou deformação da elipse no CT ou TZ CT < 0,5 ou CT/CTL < 8 Negativo e TZ < 1 ou TZ/TZL < 8 CT > 16 e CTL > 1 e Não determinada Quando uma fita é negativa para ESBL e a outra não determinada Fonte: (Etest ESBL, AB BIODISK) Produção de ESBL e resistência a todos as penicilinas, cefalosporinas e aztreonam (CLSI) Não produtora de ESBL ESBL não determinada. Se a ESBL é suscetível, confirmar o resultado com a genotipagem.

56 39 Fonte: Cristina Motta Ferreira Figura 9: Imagem de detecção do fenótipo ESBL pelo método epsilométrico E-teste. Fita com os gradientes de concentrações dos antibióticos TZ e em associação com o inibidor, o ácido clavulânico Teste de Suscetibilidade Antimicrobiana O teste antimicrobiano epsilométrico E-teste (figura 9), para a detecção da MIC (concentração inibitótria mínima), foi realizado utilizando-se o meio de cultura ágar Mueller Hinton (Himedia), conforme recomendações do fabricante AB Biodisk (Solna, Sweden). Os critérios de interpretação utilizados seguiram as recomendações do Institute for Clinical and Laboratory Standards CLSI (CDC- Atlanta, USA, 2005) (29). Os antibióticos amicacina, oxacilina, cefoxitina, penicilina G, ciprofloxacina, cefepime, vancomicina, ceftazidime, cloranfenicol, imipenem e tetraciclina foram escolhidos em comum acordo com o corpo clínico do HEMOAM. As fitas de E-test contendo os antibióticos utilizados para tratamento de infecções bacterianas Gram-positivas foram: oxacilina, cefoxitina, vancomicina, tetraciclina, ceftazidima, cloranfenicol, amicacina, cefepime ( µg/ml), benzilpenicillina, ciprofloxacina, imipenem ( µg/ml). Para as bactérias Gram-negativas foram: tetraciclina, ceftazidima, cefoxitina, cloranfenicol, cefepime, amicacina ( µg/ml), ciprofloxacina e imipenem ( µg/ml). Os organismos testes foram suspensos em solução salina a 0.8%, padrão número 0.5 da escala de McFarland e inoculadas no meio de ágar Mueller-Hinton, seguidas por uma incubação a 37 C por 18 24h. A interpretação do teste foi realizada segundo o manual técnico do Clinical and Laboratory Standards (CLSI;

57 40 Wayne, Pennsylvania, USA) (29), o qual fornece o ponto de corte (break point), correspondente ao diâmetro da zona de inibição. Cepa de S. aureus ATCC e E. coli ATCC foram utilizadas com controle de qualidade para os meios de cultura e testes de suscetibilidade. Fonte: William Antunes Ferreira Figura 10: Imagem do resultado do teste de suscetibilidade método epsilométrico E-teste para a detecção da MIC (concentração inibitótria mínima) Teste da PBP 2a Os S. aureus com resistência no MIC/E-test maior ou igual a quatro (>/=4µg/mL) para oxacilina e cefoxitina, e os SCoN com resistência no MIC/E-teste maior ou igual a cinco (>/=0,5µg/mL) (CLSI) para oxacilina e cefoxitina, foram submetidos ao teste da proteína ligadora de penicilina (PBP 2a ou PBP2 ) conforme protocolo do kit PBP 2 Test Kit (Oxoid,Japan). Este kit detecta os (MRSA) e MR- SCoN, pois a PBP2 é uma proteína presente na parede celular bacteriana responsável pela resistência cromossômica a meticilina (oxacilina) nesta espécie Caracterizações Moleculares Extração do DNA Total Bacteriano e Quantificação Todas as espécies bacterianas identificadas através de metodologia padronizada foram semeadas em meio sólido de Luria Bertani (LB) (Promega, Madison, WI, USA) e incubadas a 37 C por 24hs. Após 24hs, retirou-se 01 colônia

58 41 pura para inoculação em 5ml de meio líquido de cultura LB com nova incubação a 37 C por uma noite, sob agitação, sendo a extração realizada conforme protocolo do kit Easy DNA for genomic DNA isolation (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) com adaptações em relação ao tempo, temperatura de incubação das amostras e concentração enzimática, utilizando-se previamente tratamento com lisozima 50µl (10mg/mL) para permitir a lise bacteriana. O princípio do kit baseou-se na adição da solução A (solução de lise) ao pellet bacteriano resuspenso em solução tampão PBS seguida de incubação a 65 C. As proteínas e os lipídios das células foram precipitados e extraídos pela adição da solução B (solução de precipitação) e clorofórmio. A fase de centrifugação teve por objetivo separar a solução em duas fases com uma interface sólida entre as mesmas. O DNA ficou na fase aquosa clara de cima e as proteínas e os lipídios na interface sólida. O clorofórmio forma a fase abaixo da nterface sólida. O DNA foi então removido, precipitado com etanol e ressuspenso com tampão TE (Invitrogen). Após a extração o DNA foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8% com SYBR safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) por uma hora e comparado com padrão de peso molecular 100bp DNA Ladder (2-2,072bp) (Invitrogen). O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. O DNA foi quantificado em aparelho UV Spectrophotometer 50 Conc Varian e diluído para uma concentração final de 5ng/µl sendo as amostras armazenadas a -70ºC Extração do DNA plasmidial As bactérias Gram-negativas produtoras de ESBL, foram semeadas em meio sólido de Luria Bertani (LB) com ampicilina (50mg/ml) (Promega) e incubadas a 37 C por 16hs. Após 16hs, retirou-se 01 colônia pura para inoculação em 5ml de meio líquido de cultura LB com nova incubação a 37 C 16-18hs sob agitação sendo a extração realizada conforme protocolo do kit Wizard Plus SV Minipreps-DNA purification System (Promega, Madison, WI, USA).

59 42 A técnica baseou-se no rompimento da parede celular para se obter um lisado, separando o DNA solúvel dos restos celulares e outros materiais insolúveis, purificando-o de proteínas solúveis e outros ácidos nucléicos. O rompimento da célula foi feito utilizando-se detergentes ou desnaturação alcalina. O lisado foi clareado por centrifugação, filtração ou clareamento magnético. O DNA foi então purificado da parte solúvel do lisado. Quando as matrizes de sílica foram utilizadas, o DNA foi eluído em água livre de nuclease. Obteve-se então um material de alta qualidade e pronto para ser utilizado em várias aplicações moleculares (Promega ). Após a extração, o DNA plasmidial foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, com SYBR safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) por uma hora e vinte minutos, e comparado com padrão de peso molecular 2-16Kb DNA Ladder (Promega). O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. A avaliação e classificação do plasmídio foi realizada a partir da análise comparativa dos padrões de peso molecular do DNA plasmidial das cepas isoladas resistentes aos antibióticos Reação em cadeia da polimerase (PCR) Para o gene 16S rrna Realizou-se o PCR para amplificação do DNA genômico das bactérias Grampositivas e Gram-negativas. O protocolo para o 16S rrna utilizando o primer bacteriano universal (Invitrogen) com um produto de PCR de aproximadamente 900 bp, foram realizados para confirmar o gênero e espécie, conforme protocolo de Miyoshi et al.(2005) (91). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 35 ciclos de 95ºC por 2 minutos (min.), 94ºC por 1 min., 58ºC por 1 min., 72ºC por 1 min., 72ºC por 5 min., e 4ºC forever totalizando um tempo de 2,5hs. A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 1%, corado com Sybr safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) em 80v, por 50 minutos. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em

60 43 transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. A sequência de similaridade da região 16S rrna foi comparada com os dados do Genbank utilizando-se a ferramenta BLAST com o algoritmo MegaBLAST. Os Primers universais utilizados na reação foram 27F-5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3 ; 149 R -5 -GGTTA CCTTGTTACGACTT-3 (91) PCR em tempo real (q-pcr) para o gene meca Para a amplificação do gene meca e Nuc utilizou-se 17µl de mix para reação (330µl de Power sybr, 66µl de primers mix, 165µl de água mili-q) e 3µl da amostra. A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 95º C por 10 minutos, 45 ciclos de 95ºC por 10 segundos, 50ºC e 60ºC por 15 segundos, e a curva de desnaturação (melt) padrão Gene meca Os primers meca (meca1 e meca2), tipos de SCCmec (CIF2, ccrc, RIF5, SCCmecV, SCCmecIII, dcs, ccrb2, kdp, mecip2, mecip3, mecap4 e mecap7), toxinas bacterianas (seh, arca, etd, LUKPV) foram obtidos de acordo com o protocolo descrito por Jonas et al. (2002) (66), Thomas et al. (2007) (130), Milheiriço et al. (2007) (87), e Strommenger et al., (2008) (110). Cepas S. aureus ATCC (33591) e S. epidermidis (ATCC12228) foram utilizadas como controle positivo e negativo (quadro 4). Para uma reação com volume final de 25µl, utilizou-se 20µl de mix para a reação (14,45µl de água ultrapura, 2,5µl de tampão 10X (Invitrogen), 1,25µl de MgCl 2 (50µm) (Invitrogen), 0,5µl dntp (10µm) (Invitrogen), 1,0µl do total de primers (forward e reverse), 0,3µl de DNA Taq polimerase (5U/ml) (Invitrogen) e 5µl de DNA cromossomal (5ng). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30 ciclos de 94º C por 4 minutos (min.), 94ºC por 45seg., 50ºC por 45seg., 72ºC por 60 seg., 72ºC por 2min., e temperatura final de 4ºC, totalizando um tempo de 2,25hs.

61 44 A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 2%, corado com Sybr safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. Quadro 4. Iniciadores meca e SCCmec utilizados na reação Tipos de Primers meca1 meca2 CIF2 F2 CIF2 R2 ccrc F2 ccrc R2 RIF5 F10 RIF5 R13 SCCmecVJ1 F SCCmecVJ1 R dcs F2 dcs R1 ccrb2 F2 ccrb2 R2 Kdp F1 Kdp R1 SCCmecIIIJ1 F SCCmecIIIJ1 R mecip2 mecip3 mecap4 mecap7 Sequência de nucleotídeos 5 -GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3 5 -CCAATTCCACATTGTTCGGTCAA-3 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG ATTTACCACAAGGACTACCAGC GTACTCGTTACAATGTTTGG ATAATGGCTTCATGCTTACC TTCTTAAGTACACGCTGAATCG ATGGAGATGAATTACAAGGG TCTCCATTCTTGTTCATCC AGAGACTACTGACTTAAGTGG CATCCTATGATAGCTTGGTC CTAAATCATAGCCATGACCG AGTTTCTCAGAATTCGAACG CCGATATAGAAWGGGTTAGC AATCATCTGCCATTGGTGATGC CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG CATTTGTGAAACACAGTACG GTTATTGAGACTCCTAAAGC ATCAAGACTTGCATTCAGGC GCGGTTTCAATTCACTTGTC TCCAGATTACAACTTCACCAGG CCACTTCATATCT TGTAACG

62 Tipos de SCCmec Para uma reação com volume final de 25µl, utilizou-se 20µl de mix para a reação (13,5µl de água ultrapura, 2,5µl de tampão 10X (Invitrogen), 0,75µl de MgCl 2 (50µm) (Invitrogen), 0,5µl dntp (10µm) (Invitrogen), 1,25µl do total de primers (forward e reverse), 0,25µl de DNA Taq polimerase (5U/ml) (Invitrogen) e 5µl de DNA cromossomal (5ng). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30 ciclos de 94º C por 4 minutos (min.), 94ºC por 30seg., 53ºC por 30seg., 72ºC por 1 min., 72ºC por 4 min., e temperatura final de 4ºC, totalizando um tempo de 2,25hs. Cepas S. aureus ATCC (33591) e S. epidermidis (ATCC12228) foram utilizadas como controle positivo e negativo A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 3%, corado com Sybr safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação Genes seh, etd, arca e lukpv das toxinas bacterianas Para a reação com volume final de 25µl, utilizou 20µl de mix para a reação (12,95µl de água ultrapura, 2,5µl de tampão 10X (Invitrogen), 1,25µl de MgCl 2 (50µm), 0,5µl de dntps (10µm) (Invitrogen), 2,5 µl do mix de todos os primers (forward e reverse), 0,3µl de DNA Taq polimerase (Invitrogen) e 5µl de DNA cromossomal (5ng). A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30 ciclos de 94ºC a 4 min., 94ºC por 45seg., 50ºC 45 seg., 72 ºC 60seg., 72 ºC 2min., e temperatura final de 4ºC, perfazendo um total de 2,25horas. Os primers seh, etd, arca, lukpv foram obtidos de acordo com o protocolo descrito por Strommenger et al. (2008) (110). Cepas S. aureus ATCC (29213) S. epidermidis (ATCC 12228) foram utilizadas como controle positivo (quadro 5).

63 46 A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 2%, corado com SYBR safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. Quadro 5. Iniciadores das toxinas bacterianas utilizados na reação Tipos de primers Seh f Seh r arca f arca r Setd f Setd r lukpv f lukpv r Sequência de nucleotídeos CAACTGCT GATTTAGCTCAG GTCGAATGAGTAATCTCTAGG TTGCTCAAACTTTGAGAGATGAA TTACGTACGCCAGCCATGAT CCCGTTGATTAGTCATGCAG CCAGAATTTCCCGACTCAG ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA GCATCAAGTGTATTGGATAGCAA AAGC Genes das Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) A detecção dos genes bla (beta-lactamase) foi realizada através da amplificação por PCR com os iniciadores para os genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla OXA, respectivamente (quadro 6). Quadro 6. Iniciadores das ESBLs Genes Tipos de primers Sequência de nucleotídeos bla TEM bla SHV bla CTX-M bla OXA Legenda: Y = C ou T; R = A ou G; S = G ou C. TEM-F 5 ATGAGTATTCAACATTTCCG 3 TEM-R 5 CTGACAGTTACCAATGCTTA 3 SHV-F 5 GGTTATGCGTTATATTCGCC 3 SHV-R 5 TTAGCGTTGCCAGTGCTC 3 CTX-F 5 ATGTGCAGYACCAGTAARGT 3 CTX-R 5 TGGGTRAARTARGTSACCAGA 3 OXA-F 5 ACACAATACATATCAACTTCGC 3 OXA-R 5 AGTGTGTTTAGAATGGTGATC 3

64 47 Para uma reação com volume final de 25µl, utilizou-se 5µL de tampão 5X; 2,5µL de MgCl 2 (25mM); 0,5µL de dntp (10µM); 1µL de cada iniciador (10µM); 0,2µL de GoTaq DNA Polymerase, 5µL de DNA cromossomal (5ng) e 1µL para DNA plasmidial (1:10). A seqüência do ciclo de amplificação foi de 96ºC por 5 min; 35 ciclos de 96ºC por 1 min, 58ºC(TEM) / 60ºC (SHV) por 1 min e 72ºC por 1 min. Após a finalização dos ciclos, houve uma extensão final de 72ºC por 10 min. Para o gene bla CTX-M : desnaturação inicial a 94ºC por 7 min; seguida de 35 ciclos de 50 seg a 94ºC, 40 seg a 50ºC, 1 min a 72ºC; e extensão final de 5 min a 72ºC. Para bla OXA : desnaturação inicial de 5 min a 96ºC; seguido de 35 ciclos de 1 min a 96ºC, 1 min a 60ºC, 2 min a 72ºC; e extensão final de 10 min a 72ºC. A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 1%, corado com Sybr safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. Foi utilizado como controle positivo para o gene bla SHV cepa de K. pneumoniae ATCC tanto para o plasmídeo como para o cromossomo Genotipagem para identificação dos clones bacterianos Os primers referentes aos sete loci dos genes housekeeping e os protocolos para realização das PCRs para o clone do S. aureus: arc (Carbamato quinase), aro (Siquimato deidrogenase), glp (Glicerol quinase), gmk (Guanilato quinase), pta (Fosfato acetiltransferase), tpi (Triosefosfato isomerase), yqi (Acetil coenzima A acetiltransferase) e dos clones dos S. epidermidis: arcc (Carbamato quinase), aroe (Siquimato deidrogenase), gtr (Transportador ABC), muts (Proteína de reparo do DNA), pyrr (Proteína operon reguladora da pirimidina), tpia (Triosefosfato isomerase), yqil (Acetil coenzima A acetiltransferase), foram obtidos de acordo com os protocolos descritos no site ( com adequações nas concentrações dos reagentes e na temperatura do ciclo da reação (anexo 3).

65 48 A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 2%, corado com SYBR safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 75v, por uma hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação Purificação pré-sequenciamento A purificação foi realizada conforme recomendação do fabricante do kit illustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). A análise eletroforética foi realizada em gel de agarose a 1%, corado com SYBR safe DNA gel stain X concentrate in DMSO (Invitrogen) a 80 v, por uma hora. Um marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado para se estimar o tamanho das amostras. O gel foi examinado em transiluminador ultravioleta a 300nm e posteriormente fotografado em sistema apropriado de fotodocumentação. O seqüenciamento de todas as amostras foi realizado no aparelho ABI Sequence (Applied Biosystems) para se detectar a seqüência nucleotídica e posterior comparação com o banco de dados público BLAST e GenbanK databases. Para os genes pesquisados no MLST (Multi Locus Sequence Typing) a purificação foi realizada conforme protocolo do Big Dye X terminator TM purification kit (Applied Biosystems) sendo posteriormente sequenciados Precipitação do DNA com Isopropanol/etanol Para a reação com volume final de 20µl, utilizou 19µl de mix para a reação de pré-sequencimamento (12,0µl de água ultrapura, 3,0µl de tampão 5X (Invitrogen), 1,5µl de cada primer separadamente, 2,5µl de Big Dye (invitrogen) e 1,0µl de DNA amplificado (forward e reverse separadamente) com Big Dye. A seqüência do ciclo de amplificação da reação foi de 30 ciclos de 96 ºC a 1 min., 96ºC por 15seg., 50ºC 15 seg., 60ºC 4 min., 4ºC forever, perfazendo um total de 2,30horas.

66 49 Posteriormente as amostras foram precipitadas adicionando-se 80µl de isopropanol a 75% e submetidas ao vortex. A placa foi selada com papel colante e deixada a T.A. (temperatura ambiente) por 15min. protegida da luz. Em seguida a mesma foi centrifugada por 20min. a rpm descartando-se o sobrenadante por inversão sobre um papel absorvente. Aplicou-se um pulso de rotação da centrífuga com a placa invertida sobre o papel absorvente. Adicionou-se 20µl de etanol a 70% em cada amostra e selou-se a placa novamente, submetendo a mesma a uma nova centrifugação a rpm a T.A. Posteriormente, descartou-se o sobrenadante e repetiu-se a centrifugação com a placa invertida sobre o papel absorvente. O pellet preso no fundo do poço ficou a temperatura ambiente para secar, protegido da luz, e a placa foi preparada para o seqüenciamento Seqüenciamento Para a ressuspensão da amostra foi utilizada 10 µl formamida Hi-Di (applied Biosystems P/N ) em cada uma, sendo posteriormente tampadas com papel laminado. A palca foi selada, submetida ao vortex, uma rotação na centrifuga e desanturada no termociclador a 95ºC por 2 min. Posteriormente a placa foi colocada no gelo seco por 2 min. e submetida a uma nova rotação na centrífuga para remoção de bolhas de ar. Removeu-se o adesivo selante da placa. Posteriormente, ambas placa, bandeja e tampa adaptativa foram inseridas no autosampler do aparelho de seqüenciamento 3130/genetic analyser (applied Biosystems Hitachi) e procedida à reação de seqüenciamento Controle de Qualidade Dos meios de cultura e do antibiótico utilizado no teste de suscetibilidade, foram utilizados as cepas de: S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 33591, S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 25922, S. saprophyticus ATCC 15305, S. epidermidis ATCC 12228, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, S. pyogenes ATCC 19615, K. pneumoniae ATCC 13883;, K. pneumoniae ATCC ; E. aerogenes ATCC 13048; E. cloacae ATCC13047 (American Type Culture and Collection), recomendado pelo Institute for Clinical and Laboratory Standards (CLSI,

67 ) (29). Para os testes moleculares utilizou-se os padrões de peso molecular Supercoiled DNA Ladder de 2-10Kb (Promega), DNA Ladder de 100bp e 123bp (Invitrogen) Armazenamentos de amostras As amostras de bactérias isoladas foram armazenadas em meio de cistina tripticase soja com 10% de glicerol em freezer a -70ºc (CLSI, 2005) (29) Análise de Dados Os dados coletados foram armazenados em planilha do Excel e os resutados descritos e demonstrados através de tabelas de freqüência e gráficos Fontes de financiamento (Nacionais e/ou Internacionais) Projeto submetido e aprovado pelo Edital MS/CNPq/FAPEAM N. 014/2006, Programa de pesquisa para o SUS: gestão compartilhada em saúde.

68 51 4 RESULTADOS Os resultados estão apresentados na forma de artigos originais.

69 Artigo 1 Extended-spectrum beta-lactamase-producing bacteria isolated from hematologic patients in Manaus, State of Amazonas, Brazil Cristina Motta Ferreira 1*, William Antunes Ferreira 2, Nayanne Cristina Oliveira da Silva Almeida 3, Felipe Gomes Naveca 4, Maria das Graças Vale Barbosa 5 1 Universidade Estadual do Amazonas (UEA); Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM); Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM), Manaus, State of Amazonas, Brazil. 2 Fundação de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da Matta (FUAM). 3 Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Manaus, State of Amazonas, Brazil. 4 Leônidas and Maria Deane Institute/FIOCRUZ, Manaus, State of Amazonas, Brazil. 5 The Amazon Tropical Medicine Foundation FMT-AM; Universidade Estadual do Amazonas (UEA), Manaus, State of Amazonas, Brazil. *Corresponding Author Cristina Motta Ferreira Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM) Address: Avenida Constantino Nery, 2533 Apto. 704, Bloco B, Residencial. Maria da Fé. CEP: , Manaus, Amazonas, Brazil. Telephone: (55) ; cris_motta_ferr@yahoo.com.br Abstract Antibiotic therapy in hematologic patients, often weak and susceptible to a wide range of infections, particularly nosocomial infections derived from long hospitalization periods, is a challenging issue. This paper presents ESBL-producing strains isolated from such hematologic patients treated at the Amazon Hematology and Hemotherapy Foundation (HEMOAM) in the Brazilian Amazon Region to identify the ESBL genes carried by them as well as the susceptibility to 11 antimicrobial agents using the E-test method. A total of 146 clinical samples were obtained from July 2007 to August 2008, when 17 gram-negative strains were isolated in our

70 53 institution. The most frequent isolates confirmed by biochemical tests and 16S rrna sequencing were E. coli (8/17), Serratia spp. (3/17) and B.cepacia (2/17). All gram-negative strains were tested for extended-spectrum-beta-lactamases (ESBLs), where: (12/17) strains carried ESBL; among these, (8/12) isolates carried bla TEM, bla CTX-M, bla OXA, bla SHV genes, (1/12) bla TEM gene and (3/12) bla TEM, bla CTX-M, bla OXA genes. Antibiotic resistance was found in (15/17) of the isolates for tetracycline, (12/17) for ciprofloxacin, (1/17) resistance for cefoxitin and chloramphenicol, (1/17) for amikacin and (3/17) cefepime. This research showed the presence of gram-negative ESBL-producing bacteria infecting hematologic patients in HEMOAM. These strains carried the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA genes and were resistant to different antibiotics used in the treatment. This finding was based on a period of 13 months, during which clinical samples from specific populations were obtained. Therefore, caution is required when generalizing the results that must be based on posological orientations and new breakpoints for disk diffusion and microdilution published by CLSI Key words ESBL, beta-lactams, nosocomial infection, TEM, SHV, OXA, CTX-M Running Title ESBL-producing bacteria from hematologic patients Introduction Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL) are enzymes produced by gramnegative bacteria such as Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli (24) as well as by species from other genera, such as Enterobacter sp., Salmonella sp., Proteus sp., Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, and Burkholderia cepacia (2, 3, 31, 26). ESBLs originate from punctual genetic mutations in the active sites of the TEM-1, TEM-2, and SHV-1 enzymes (3, 10, 12, 31, 19, 23, 26, 34), which enable the

71 54 hydrolysis of extended-spectrum cephalosporins, monobactams, penicillins. (2, 3, 5, 9, 11, 12, 27, 30). However, these plasmid mediated enzymes have their activity inhibited by clavulanic acid, tazobactam and sulbactam. Another important epidemiological characteristic is the possibility of these enzymes being transferred to other species via plasmids or transposons (2, 3, 5, 6, 9, 11, 12, 21, 27, 28, 30, 34). The emergence of ESBL-producing bacteria, responsible for infectious processes with high levels of morbidity and mortality has complicated the therapeutic options available for elderly, immunocompromised, and debilitated individuals (4, 31). The prevalence of ESBLs among clinical isolates varies according to countries and institutions (31). In the United States, the presence of these enzymes among Enterobacteriaceae has increased from 0% to 25%, with a national average of 3%, whereas the percentage of Klebsiella sp. has demonstrated an increased resistance from 5% to 10% to ceftazidime (6). In other countries, such as Switzerland, the frequency of ESBL-producing bacteria varies from 3% to 8%, whereas it is 34% in Portugal, 4.8% in Korea, 8.5% in Taiwan, 12% in Hong Kong, and 58% in Turkey. In Latin America, studies have reported frequencies ranging from 30% to 60% (6, 21). The prevalence of ESBL resistance to antibiotics in Brazil has reached 45.4%, 65% of which stand for K. pneumoniae and E. coli, which is considered one of the highest levels in the world. For the city of Manaus, in the State of Amazonas, Brazil, no published data is found regarding the prevalence of such bacteria (3, 5). ESBL-producing bacteria are responsible for serious infectious processes, commonly associated with outbreaks of nosocomial infections. This situation is relevant as most patients with hematologic diseases undergo chemotherapy that can lead to a deficient immune response. These medical conditions can lead to prolonged hospitalization, elevation of the risks of mortality and morbidity, and increased treatment costs. This study therefore aimed to detect ESBL-producing strains isolated from such hematologic patients treated at the HEMOAM in the Brazilian Amazon region to

72 55 identify the ESBL genes carried by them and susceptibility to 11 antimicrobial agents using the E-test method. Materials and Methods The study was approved by the HEMOAM Ethics Committee (Approval number 170 CAAE Version 003/06). An informed consent was obtained from each patient before specimens were collected and the results were used for the management of each respective patient. We conducted a descriptive cross-sectional study including patients of both sexes at any age who had been admitted to the HEMOAM Foundation in the city of Manaus, State of Amazonas, with prior diagnosis of hematologic disease, presenting clinical signs and symptoms suggestive of acute gram-negative bacterial infection, whether feverish or not, or having developed fever during hospital stay in the period from July 2007 to August Gram-negative bacteria strains were identified using colonial morphology on blood, MacConkey, Eosin Methylene Blue (EMB), and Mueller-Hinton agar plates (Himedia- Hexasystems, Mumbai, India), followed by biochemical panels like NF II Kit, enterokit C, and enterokit B (Probac, São Paulo, Brazil). Other tests, such as urease, oxidase, glucose, mannose, lactose, and maltose fermentation, were also performed. The 16S rrna protocol with the bacterial primers 27F (5 - GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) and 1492R (5 -GGTTACCTTGTTAC GACTT-3 ) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with a product size around 900 bp, were performed to confirm genus and species (17). The sequence analysis of the 16S rrna region was compared with GenBank data using BLAST search with the MegaBLAST algorithm for identifying highsimilarity sequences. The sequences with the highest levels of similarity were considered as being consistent for species identified by the biochemical tests. The antibiotics E-test strips representing common drugs used in the

73 56 treatment of suspected gram-negative bacterial infections in our hospital were chosen for antimicrobial testing. Strips included tetracycline, ceftazidime, cefoxitin, chloramphenicol, cefepime, and amikacin ( µg/ml), and ciprofloxacin and imipenem ( µg/ml). Test organisms were suspended in 0.8% saline to 0.5 McFarland standards and then inoculated on Mueller-Hinton agar plates, followed by overnight incubation at 37 C for hours. Interpretation was performed using guidelines laid down in the Clinical and Laboratory Standards (CLSI; Wayne, Pennsylvania, USA) manual, which provides break points corresponding to the diameter of the zone of inhibition. The isolates were screened for the production of ESBL by the E-test method with the antibiotics cefotaxime ( μg/ml)/cefotaxime ( μg/ml) plus 4 μg/ml clavulanic acid, ceftazidime ( μg/ml) /ceftazidime ( μg/ml) plus 4 μg/ml clavulanic acid, following manufacturer s recommendations (7). Strains of E. coli ATCC and K. pneumoniae ATCC were used as quality controls for culture media, susceptibility tests, PCR and the ESBL-production E-test. The bacteria deemed as positive for ESBL-production were inoculated in 5 ml of Luria-Bertani (LB) broth with ampicillin (50 µg/ml) and incubated at 37 C for 16 hours for plasmid extraction following the protocol described in the Kit Wizard Plus SV Minipreps-DNA purification System (Promega ; São Paulo, Brazil). Electrophoresis was performed in 0.8% agarose gel stained with SYBR Safe (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for the identification of plasmid sizes. The Supercoiled Loading Dye Ladder 2-16 Kb (Invitrogen) was used as a standard molecular weight. Data were filed by using Excel programs. ESBL isolates were preserved for future molecular analysis. PCR amplification for the detection of chromosomal beta-lactamase resistance AmpC type in Pseudomonas spp. isolates was not included in our study. The Polimerase Chain Reaction (PCR) assay to amplification and detection of the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA was carried out in a final volume reaction of

74 57 25µl using 10X buffer, MgCl 2 (50mµ), dntp (10mµ), DNA Taq polimerase (5U/mL) (Invitrogen), 1,25µl of each primer TEM-F, TEM-R, SHV-F, SHV-R, bla CTX-M -F, bla CTX-M -R, bla OXA -F, bla OXA -R and 5µl of plasmidial DNA. Cycling parameters were previously described (Table 2). The amplified products obtained have not been sequenced up to the present moment. Table 2. Primer sequence and PCR conditions Primers Oligonucleotide sequence (5 to 3 ) PCR conditions TEM-F ATGAGTATTCAACATTTCCG 1 cycle of 5 min at 96 o C; 35 cycles of 1min at 96ºC; 1min at 58 ºC; TEM-R CTGACAGTTACCAATGCTTA 1min at 72 ºC ; 1 cycle of 10 min at 72 o C SHV-F GGTTATGCGTTATATTCGCC 1 cycle of 5min at 96 ºC; 35 cycles of 1min at 96 ºC, 1min at 60oC, SHV-R TTAGCGTTGCCAGTGCTC 1min at 72 ºC; 1 cycle of 10 min at 72 ºC CTX - M-F ATGTGCAGYACCAGTAARGT 1 cycle of 7min at 94 o C; 35 cycles of 50 sec at 94 ºC, 40 sec at 50 ºC, CTX - M- TGGGTRAARTARGTSACCAGA 1 min at 72 ºC; 1 cycle of 5min at R 72 ºC. OXA- F ACACAATACATATCAACTTCGC 1 cycle of 5min at 96 o C; 35 cycles of 1min at 96 ºC, 1min at 60 ºC, 2 OXA- R AGTGTGTTTAGAATGGTGATC min at 72 ºC; 1 cycle of 10 min at 72 ºC. Reference Expected size (bp) Results A total of 146 clinical samples were obtained from 69 patients over a period of thirteen months. These samples included the following: urine, pus, blood, marrow aspirate, sputum, feces, abscesses, and oropharyngeal and nasopharyngeal swabs. The strains isolated from different specimen type are presented in Table 5.

75 58 Table 5. Strains isolated from different specimen type detected from patients with infections Specimen types Blood Isolates K. pneumoniae, E. coli, Pseudomonas sp., P. stutzery, Serratia sp., B. cepacia Urine feces Eye secretion E. coli E. coli Pseudomonas aeruginosa In relation to gender, (35/69) were male and (34/69) were female. Among the collected samples, we isolated 44 bacterial strains, 17 of which were gram-negative. The most frequent hematological diseases in the patients were acute lymphocytic leukemia (36/69) and acute myeloid leukemia (6/69) (Table 1). Table 1. Frequency of hematologic diseases diagnosed in this study Hematologic disease N Acute lymphocytic leukemia 36 Acute myeloid leukemia 6 Sickle cell anemia 4 Pancytopenia 4 Chronic myeloid leukemia 3 Chronic lymphocytic leukemia 3 Hemophilia 2 Multiple myeloma 2 Others 9 Total 69 Hypofibrinogenemia + hemophilia (2/9), Thalassemia (1/9), aplastic anemia (1/9), thrombocytopenic idiopathic purpura (1/9), acute hemolytic anemia (1/9), lymphoma (1/9), unidentified leucopenic disease (1/9), myelodysplastic syndrome (1/9)

76 59 Biochemical tests and 16S rrna sequencing detected E. coli (8/17), followed by Serratia sp. (2/17), Serratia liquefaciens (1/17) and B. cepacia (2/17) as the most frequent gram-negative strains. All the strains were tested for the production of ESBL and the E-test showed that (12/17) were ESBL producers (Table 3). All of them had their plasmid extracted and the molecular weights were 3.5, 7 and >15 Kb. The PCR assay showed that that (8/12) isolates carried bla TEM, bla CTX-M, bla OXA, bla SHV genes, (1/12) bla TEM gene and (3/12) bla TEM, bla CTX-M, bla OXA genes. As presented in Table 4, the results from antimicrobial susceptibility tests demonstrated antibiotic resistance in (15/17) of the isolates for tetracycline, (12/17) for ciprofloxacin, (1/17) resistance for cefoxitin/chloramphenicol, and (1/17) for amikacin and (3/17) for cefepime. Data regarding the molecular epidemiology of ESBL clonality and PCR amplification for the detection of chromosomal beta-lactamase resistance AmpC type in Pseudomonas spp. isolates have not been presented so far, but we believe that this will not expressively impact on this study as it was aimed to detect ESBLproducing strains in hematologic patients only. Our finding was based on a period of 13 months, during which clinical samples were obtained from a specific population. Therefore, caution is required when results are generalized as they must be based on posological orientations and new breakpoints for disk diffusion and microdilution according to the CLSI 2010 manual M100-S20.

77 60 Table 3. Gram-negative strains, ESBL phenotypes and genes detected from patients with infections Bacteria Identified Strains ESBL positive indeterminate negative n n N n ESBL encoding gene detected by PCR Escherichia coli blat EM, bla OXA, blactx-m, blashv, blatem, blaoxa, blactx-m. Klebsiella pneumoniae ND Serratia spp bla TEM, bla CTX-M, bla OXA. blatem Serratia liquefaciens ND Pseudomonas aeruginosa ND Pseudomonas stutzeri bla OXA, bla TEM, blactx-m. Pseudomonas spp bla TEM., bla CTX-M, bla SHV, bla OXA. Burkholderia cepacia bla TEM, bla CTX-M, bla SHV, bla OXA. Total

78 61 Table 4. Antimicrobial Susceptibility test (E-test) for 17 Gram-negative bacteria isolated from patients with bacterial infection Bacteria Antibiotics K. Serratia S. P. Pseudomonas B. E. coli P. stutzeri pneumoniae spp. liquefaciens aeruginosa spp. cepacia S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R Tetracycline Ciprofloxacin Ceftazidime Cefoxitin Chloramphenicol Amikacin Imipenem Cefepime S: susceptible; I: intermediate; R: resistant

79 62 Discussion ESBLs are enzymes that act by inhibiting the action of beta-lactam antibiotics (1, 25). Concerns regarding the clinical and epidemiological aspects of such ESBLproducing pathogens are related to the use of extended-spectrum antimicrobials such as carbapenems for their treatment (12, 22), thus increasing treatment costs as well as patient risks due to longer hospital stay and prolonged therapy (1, 29). Furthermore, hematologic patients often undergo chemotherapy, which can lead to an immunodeficient status and leave these patients susceptible to a wide range of infections (32, 33). This is particularly important with respect to nosocomial infection in the hospital environment, which can elevate the risks of mortality and morbidity, mainly in the case of infections caused by ESBL-producing bacteria. In our study, the most frequent ESBLs-producing bacteria were E. coli, B. cepacia, Serratia spp., and Pseudomonas spp. In addition, ESBL-producing strains of E. coli and K. pneumoniae have also been isolated in other studies from patients with outbreaks of bacterial peritonitis (32), bloodstream infections (33) in ICU (1) from different clinical samples from patients in Mwanza (Tanzania) (20), in Enugu (Nigeria) (31), and in France, Portugal (9), Brazil (33), as well as several other countries (2, 13, 16, 19, 37). These E. coli isolated from samples of the patients point to the possibility of a hospital-acquired infection probably due to inadequate antibiotic therapy, inappropriate prescriptions without culture results and susceptibility testing and cross-infections that contributed to increase the number of these resistant isolates (1, 10, 25, 27, 40). The detection of ESBL enzymes is very important, because according to CLSI M100-S17 and M100-S18 (25, 27) criteria, these organisms should be reported as resistant to all extended-spectrum beta-lactam antibiotics, regardless of their susceptibility test results. Currently, according to CLSI M100-S20, new interpretive criteria are available for routine ESBL testing (1, 25, 27).

80 63 The reduced sensitivity to cephalosporins detected in E. coli strains in this study might be due to the variations in substratum preference, the differing accuracy between tests for enzyme detection, weak inhibition by clavulanic acid, or different combined resistance mechanisms that led either to reduced or no sensitivity (26, 35). This type of phenotype could be demonstrated in other multicenter study developed in Norway in 2003, in which 60% of ESBL-producing isolates showed reduced sensitivity to extended-spectrum cephalosporin, possibly indicating an increased level of resistance (26, 36). Our findings demonstrated that all the ESBL-producing Enterobacteriaceae were sensitive to imipenem, while 94.1% were sensitive to amikacin, indicating that these agents can still be used in the treatment of infections caused by these pathogens in HEMOAM. Similar results have been observed by Tumbarello et al. (37) in a teaching hospital in Rome (Italy). The existence of ESBL-producing Pseudomonas spp. is of serious concern as it stands for a pathogen with the capacity to acquire resistance to a wide range of clinically important antimicrobials and it can lead to numerous infectious processes. In this study, we detected 33.4% of the isolates to be resistant to tetracycline and ciprofloxacin (12, 25, 29). Similar results have been observed in India, Iran, Spain, Portugal, Canada, and Brazil. However, in Norway, positive CTX-M isolates showed reduced sensitivity only to ciprofloxacin (12, 16, 24, 36). In Europe, 20% of hyperproductive ESBL isolates have demonstrated resistance to ceftriaxone and aztreonam, while in Latin America, reports show that the resistance rate is higher in relation to other regions of the world (12, 25). In Manaus (Brazil), our study provides the first data regarding the existence of ESBLs in clinical samples from patients. Thus, it is not possible to compare our results regarding the spectrum of antimicrobial resistance. The therapeutic alternative for treating infections caused by ESBL-positive pathogens such as Pseudomonas spp. lies in the use of imipenem or meropenem; however, this may stimulate the appearance of multiresistant strains in hospitals,

81 64 which could lead to additional serious problems for patients as well as difficulties for physicians regarding viable therapeutic options (12, 16, 25, 39). The control of bacterial resistance is directly related to the detection of this mechanism through laboratory and molecular tests as well as the implementation of rational use of antibiotics in hospitals (26, 39). We documented the presence of bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA genes in E.coli, Serratia spp., Pseudomonas spp., and B.cepacia strains (Table 3). Similar results were detected in other studies such as the bla CTX-M gene detected in E.coli isolates in Cambodia, Canada, United Kingdom (28) and in clinical outbreaks of CTX-M-15-type in India, Spain, and Portugal (9), considered as the most prevalent ESBL-encoding gene worldwide, now replacing TEM and SHV as the predominant ESBL isolate in European countries (14). The prevalence of ESBL production in Enterobacteriaceae in France (18) belonged to CTX-M variants such as CTX-M-I, and CTX-M-9. In Spain and Portugal, they frequently detected TEM-24, CTX-M-15, CTX-M-32 and SHV-12. In Bulgaria, CTX-M-3, CTX-M-15 and SHV-12 in S.marcescens isolates (18). In Amsterdam, CTX-M-1, SHV-1, TEM-116 in P. aeruginosa and CTX-M-1, SHV-1 in S. maltophilia (22). In Brazil, CTX-M-14, TEM-1, CTX-M-15, OXA-1, OXA-4 and OXA-7 (7, 22, 23). The detection of the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA genes in gramnegative isolates in this study allows us to consider the possibility of plasmidial resistance. Both the genes that encode the ESBLs and those that encode resistance to non-beta-lactam antibiotics are frequently located in the same conjugative plasmid, transmitted conjunctively from one isolate to another, showing the ability of being separated by selective pressure due to the use of multiple antibiotics under effective control (16, 26). The early identification of infectious processes linked to the use of appropriate antimicrobials based on microbiological diagnosis, rational prescription of antibiotics, and effective control can help avoid serious hospital infections. Most significantly, it is important to consider the inclusion of new antibiotics as therapeutic choices. These

82 65 measures will help the implementation of effective public policies for epidemiological surveillance and control by Brazilian health authorities in the State of Amazonas. This research showed the presence of gram-negative ESBL-producing bacteria infecting hematologic patients in HEMOAM. These strains carried the bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla OXA genes and were resistant to different antibiotics used in the treatment. It is necessary to perform screening and confirmatory test for phenotypic detection of these strains in a routine laboratory to avoid health care failure. Acknowledgements The authors are grateful to acknowledge the support provided by the Amazonas State Research Foundation (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM). Inputs to carry out this research derived from a project approved by the Research Program of SUS (the Brazilian National Health Care System): Shared Health Management - PPSUS- Posting 014/2006-FAPEAM Manaus, State of Amazonas, Brazil. This paper stems from the preliminary findings reported by the author s doctoral thesis at the Amazon State University (UEA) and the Amazon Tropical Medicine Foundation (FMT-AM) in the field of clinical bacteriology. In addition, the Amazon Hematology and Hemotherapy Foundation (HEMOAM), the Tropical Dermatology and Veneorology Foundation Alfredo da Matta (FUAM), and the Graduate Program of Biotechnology (PPGBiotec). Disclosure Statement No competing financial interests exist. References 1. Ahmed, S.H., Daef, E.A., Badary, M.S., Mahmoud, M.A., Elsayed, A.A.A Nosocomial blood stream infection in intensive care units at Assiut University Hospitals (Upper Egypt) with special reference to extended spectrum b-lactamase producing organisms. BMC Research Notes. 2:76.

83 66 2. Aladag, M.O., Durak, Y Investigating Some Antibiotics, Plasmids Profile and ESBL Characteristic of Klebsiella pneumoniae Isolated from Urinary System Infection. World Applied Sciences Journal. 6: (In Turkish). 3. Al-Zarouni, M., Senok, A., Rashid, F., Al-Jesmi, S.M., Panigrahi, D.M Prevalence and antimicrobial susceptibility pattern of extended-spectrum betalactamase-producing Enterobacteriaceae in the United Arab Emirates. Medical Principles and Practices. 17: Atifah, M.N., Loo, H.K.C., Subramaniam, G., Wong, E.H., Selvi, P., Ho, S., Kamarulzaman, A., Parasakthi, N Faecal prevalence of extended-spectrum ß-lactamase (ESBL)-producing coliforms in a geriatric population and among haematology patients. Malaysian J Pathol. 27: Augusti, G.R., Superti, S., Zavascki, A.P Prevalence of beta-lactamase production of extended-spectrum bacteremia in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. Scientia Medica. 17: (In Portuguese). 6. Bradford, P.A Extended-Spectrum-Lactamases in the 21 st Century: Characterization, Epidemiology, and Detection of This Important Resistance Threat. Clin Microbiol Rev. 14: Chmelnitsky, I., Carmeli,Y., Leavitt,A.,Schwaber,M.,Venezia, S.N CTX-M-2 and new CTX-M-39 enzyme are the major extended-spectrum beta-lacamase in multiple Escherichia coli clones isolated in Tel Aviv, Israel. Antimicrob Agents Chemother.49 (11): Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth Informational Supplement. Document M100-S20. CLSI, Wayne PA, Cormican, M.G., Marshall, S.A., Jones, R.N Detection of extendedspectrum β-lactamase (ESBL)-producing strains by the Etest ESBL screen. J Clin Microbiol. 34: Coque, T.M., Novais, A., Carattoli, A., Poirel, L., Pitout, J., Peixe, L., Baquero, F., Cantón, R., Nordmann, D.P Dissemination of clonally related Escherichia coli strains expressing extended-spectrum β-lactamase CTX-M-15. Emerg Infect Dis. 14: Dalmarco, E.M., Blatt, S.L., Córdova, C.M.M Laboratory identification of beta-lactamase extended-spectrum (ESBLs) - Review. RBAC. 38: (In Portuguese).

84 Habeeb, K.C., Surekha, S., Lakshmi, S., Narasimha, G Multidrug resistance and Beta-lactamase production by Klebsiella pneumoniae. African Journal of Biotechnology. 6: Hujer, A.M., Kslar, K.S., Dietenberger, N.J., Bethel, C.R., Endimiani, A., Bonomo, R.A Detection of SHV β-lactamases in Gram-negative bacilli using fluorescein-labeled antibodies. BMC Microbiology. 9: Lim, K.T., Yasin, R., Yeo, C.C., Puthucheary,S., Thong, K.L Characterization of Multidrug Resistant ESBL-Producing Escherichia coli Isolates from Hospitals in Malaysia. Journal of Biomedicine and Biotechnology Macedo, M.L.A.P., Cartaxo, R.S., Almeida, T.C.C., Souza, L.B.S., Santana, W.J., Coutinho, H.D.M Mechanisms of resistance and detection of betalactamases. Ciênc Biol Saúde. 7:59-63 (In Portuguese). 16. Mansouri, M., Ramazanzadeh, R Spread of extended-spectrum betalactamase producing Escherichia coli clinical isolates in Sanandaj hospitals. J Biol Sci. 9: Miyoshi, T., Iwatsuki, T., Naganuma, T Phylogenetic characterization of 16S rrna gene clones from deep-groundwater microorganisms that pass through 0.2-micrometer-pore-size filters. Appl Environ Microbiol. 71: Mohammad, M. F., Somayeh, D., Nafiseh, R., Araz, M., Marzieh, Aligholi., Fereshteh, S., Mahmood, P., Davud, Y Distribution of blatem, blashv, blactx-m Genes Among Clinical Isolates of Klebsiella pneumoniae at Labbafinejad Hospital, Tehran, Iran. MDR 00 (00): Monstein, H.J., Tärnberg, M., Nilsson, L.E Molecular identification of CTX- M and blaoxy/k1 β-lactamase genes in Enterobacteriaceae by sequencing of universal M13-sequence tagged PCR-amplicons. BMC Infect Dis 9: Mshana, S.E., Kamugisha, E., Mirambo, M., Chakraborty, T., Lyamuya, E.F Prevalence of multiresistant gram-negative organisms in a tertiary hospital in Mwanza, Tanzânia. BMC Res Notes. 2:49. Available from: biomedcentral.com/ /2/ Mulvey, R.M., Bryce, E., Boyd, D., Agostini, M.O., Christianson, S., Simor, A.E., Paton, S Ambler Class A extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella spp. in Canadian hospitals. Antimicrob Agents Chemother. 48:

85 Naiemi, N., Duim, B., Bart, A A CTX-M extended-spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia. JMM 55: Novella, M.C.C., Guth, B.E.C., Castanheira, M., Carmo, M.S., Pignatari, A.C.C First description of blactx-m-14 and blactx-m-15 producing Escherichia coli isolates in Brazil. MDR 16(3): (In Portuguese). 24. Pasta, A.A.C., Fração, F.H.A., Magalhães, G.L.G., Quesada, R.M.B Prevalence and antimicrobial susceptibility test in strains of extended-spectrum beta-lactamase-producing (ESBL) Klebsiella pneumoniae isolated from patients in University Hospital /UEL. RBAC. 40: (In Portuguese). 25. Perez, F., Endimiani, A., Hujer, K.M., Bonomo, R.A The continuing challenge of ESBLs. Curr Opin Pharmacol. 7: Picão, R.C., Gales, A.C Extended-spectrum beta-lactamase-producing (ESBL) Pseudomonas aeruginosa: Nightmare or imagination? Prática Hospitalar. 49:79-84 (In Portuguese). 27. Romanus, I.I., Egwu, O.A., Ngozi, A.T., Chidiebube, N.A., Chika, E.P Extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-mediated resistance to antibiotics among Klebsiella Pneumoniae in Enugu Metropolis. Maced J Med Sci. 2:1-4 (In Nigerian). 28. Ruppé, E., Hem, S., Lath, S., Gautier, V., Ariey, F., Sarthou, J.L., Monchy, D., Arlet, G CTX-M β-lactamases in Escherichia coli from community-acquired urinary tract infections, Cambodia. Emerg Infect Dis. 15: Schmitt, J., Jacobs, E., Schmidt, H Molecular characterization of extendedspectrum beta-lactamases in Enterobacteriaceae from patients of two hospitals in Saxony, Germany. J Clin Microbiol. 56: Seok, H.J., Kwon, B., Jung, H.L., Seung, G.S., Geun, H.K., Ghil, J.J., Young, H.K., Byeong, C.J., Sang, H.L Molecular characterization of extendedspectrum beta-lactamases produced by clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli from a Korean Nationwide Survey. J Clin Microbiol. 42: Slama, T.G Gram-negative antibiotic resistance: there is a price to pay. Review. Critical Care. 12: Song, K.H., Jeonn, J.H., Park, W.B., Park, S.W., Kim, H.B., Oh, M.D., Lee, H.S., Kim, N.J., Choe, K.W Clinical outcomes of spontaneous bacterial

86 69 peritonitis due to extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella species: A retrospective matched case-control study. BMC Infect Dis 9: Superti, S.V., Augusti, G., Zavascki, A.P Risk factors for and mortality of extended-spectrum-b-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli nosocomial bloodstream infections. Rev Inst Med Trop. S. Paulo. 51: (In Portuguese). 34. Thierry, F., Guillaume, A., Valerie, G., Talarmin A., Raymond, B Extended-spectrum-lactamase-producing Enterobacteriaceae, Central African Republic. Emerg Infect Dis. 12: Thomson, KS Controversies about extended-spectrum and ampc betalactamases. Emerg Infect Dis. 7: Tofteland, S., Haldorsen, B., Dahl, K.H., Simonsen, G.S., Steinbakk, M., Walsh, T.R., Sundsfjord, A Effects of phenotype and genotype on methods for detection of extended-spectrum-lactamase-producing clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Norway. J Clin Microbiol. 45: Tumbarello, M., Sali, M., Trecarichi, E.M., Leone, F., Rossi, M., Fiori, B., De Pascale, G., D Inzeo, T., Sanguinetti, M., Fadda, G., Cauda, R., Spanu, T Bloodstream infections caused by extended-spectrum-lactamase-producing Escherichia coli: Risk factors for inadequate initial antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother. 52: Venkatachalam, K.V., Wanzhi, H., Mark, L.R., Timothy, P Characterization of TEM-1 B-lactamase mutants from position 238 to 241 with increased catalytic efficiency for ceftazidime. J Biol Chem. 269: Winn, J.W.C., Allen, S.D., Janda, W.M., Koneman, E.W., Procop, G.W., Schreckenberger, P.C., Woods, G.L Microbiological diagnosis. Color Atlas and Text. 6 th ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. 40. Smith, B.A., Gabasan, A., Zivin, T., Sordillo, E.M., Polsky, B Management of an outbreak due to ESBL-positive Klebsiella pneumoniae (ESBL+KP) in an ICU: Focusing on the basics. AJIC 33(5): e121-e122.

87 Artigo 2 Novel Methicillin resistant coagulase-negative Staphylococci clone isolated from patients with hematological diseases at the Blood Bank Center of Amazon, Brazil Cristina Motta Ferreira 1*, Felipe Gomes Naveca 2*, William Antunes Ferreira 3*, Cíntia Mara Costa de Oliveira 4, Maria das Graças Vale Barbosa 5. Authors affiliations: 1 Universidade do Estado do Amazonas ; Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado; Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas-HEMOAM, Manaus-Amazon-Brazil. Manaus-Amazon-Brazil. PhD student in Infectious and Tropical Diseases. 2 Instituto Leônidas e Maria Deane/FIOCRUZ. PhD in Microbiology. Manaus-Amazon- Brazil. 3 Fundação de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da Matta, Manaus- Amazon-Brazil; Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. PhD student in Infectious and Tropical Diseases. Manaus-Amazon-Brazil. 4,5 Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Manaus-Amazon- Brazil. 4 PhD in Biotecnhology; 5 PhD in Biological Sciences. *These authors contributed equally to this work Financial support: This Research Project (N r ) was funded by Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM. Manaus, Amazonas, Brazil, through a Grant Proposal approved for the SUS Research Program (called Gestão Compartilhada em Saúde-PPSUS-014/2006 ).

88 71 Corresponding author: Dr. Cristina Motta Ferreira. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas- HEMOAM, 4397 Constantino Nery Avenue, Chapada. Laboratory of Bacteriology, CEP: , Manaus, Amazonas, Brazil. Telephone: (55) ; cris_motta_ferr@yahoo.com.br Running title: Methicillin resistant Staphylococcus in Manaus Keywords: SCCmec, ST clones, coagulase-negative Staphylococcus, S. aureus, methicillin resistant, nosocomial infection, blood infection, hospital, hematologic disease. Abstract Methicillin-resistant Staphylococcus remains as a severe public health problem worldwide. We conducted MLST analysis that revealed three different sequence types isolated from patients with hematological diseases: S. aureus ST243, S. epidermidis ST2, and a new clone of S. epidermidis ST365. Those findings reinforce the potential of dissemination presented by multiresistant Staphylococcus. Methicillin-resistant Staphylococci stand as main pathogens responsible for high levels of infectious process worldwide. The methicillin resistance has to do with penicillin binding protein (PBP 2a) encoded by the meca gene, located at the staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). In S. aureus types I and VI are noticed, whereas types IV and V are found in S. epidermidis and S. haemolyticus (1). The genotype distribution of Staphylococci differs in different geographical regions. USA300 CAMRSA clone ST8 is dominant in the United States and the ST80 and ST30 in Europe, Kuwait, Singapore, the Southwest Pacific islands and, New Zealand (2). In relation to S. epidermidis, the ST69 clone, is predominant in Greece; ST57, ST88 in Portugal, ST2 in China, ST2, ST22, ST61, ST71 in Mexico and ST63 in Argentina (4). The risk for immunocompromised patients can be significant if they catch infections caused by those species in hospitals. The presence of

89 72 immunocompromised patients at the hospital and blood bank where this research took place is common due to chemotherapy applied against leukemia, myeloma, hemolytic anemia, hemophilia, etc. This can increase morbimortality risks due to prolonged hospitalization, spread of multi-resistant strains, and rise in treatment costs. Therefore, the resistance of these bacteria against antibiotics, their respective SCCmec and ST was identified. The knowledge of geographic distribution, transmission mechanisms, factors that contribute to the appearance and spread of these genotypes will help control hospital infection outbreaks and dissemination, and implement programs to supervise the resistance presented by these pathogens. The Study In the period from July 2007 to August 2008, we conducted a descriptive cross-sectional study including patients of both sexes, admitted to the HEMOAM Foundation, who had a previous diagnosis of hematologic disease, presenting clinical signs and symptoms suggestive of acute bacterial infection, whether feverish or not, or having developed fever during hospital stay. The HEMOAM Foundation is a high complexity hospital for hematological diseases that supplies blood and hemoderivatives for the city. Each patient provided more than one sample: urine, blood, sputum, feces, catheter tip, bone marrow aspirate, and abscess fluid along with oropharyngeal, ocular, perianal, nasopharynx, open wound, and skin lesion secretions were collected. Biochemical tests and nucleotide sequencing of the 16S rrna region presented Staphylococcus epidermidis, S. intermedius, S. aureus and Staphylococcus sp. as the most frequent species. Other isolated species were S. hyicus, S. haemolyticus, S. simulans, S. intermedius, S. lugdunensis (Table 1).

90 73 Table 1. Strains isolated from patients with hematologic disease Strains n Micrococcus sp 1 Staphylococcus aureus 4 Staphylococcus hyicus 1 Staphylococcus sp 5 Staphylococcus haemolyticus 1 Staphylococcus epidermidis 8 Staphylococcus simulans 1 Staphylococcus intermedius 4 Staphylococcus lugdunensis 2 TOTAL 27 The extraction of the genomic DNA of the 26 Gram-positive bacteria isolated from the 146 biological samples collected from 69 patients, and the PCR protocol for the identification of the meca gene, SCCmec, toxins (seh, arca, Setd) and the Panton-Valentine leukocidin gene was performed as described by Jonas et al. (2002) (5), Milheiriço et al. (2007) (6), and Strommenger et al. (2008) (7), confirming the presence of the meca gene and the absence of the lukpv gene. The PCR for MLST was made as described by Thomas et al. (2007) (8) and Enright et al. (2000) (9), disclosing three types of different sequences typing (ST): S. aureus ST243, one of S. epidermidis ST2, and two newly isolates of S. epidermidis ST365 clone. The ST243 strain harboured the SCCmec type I, III, V, ST2 the SCCmec type II, III, V, and ST365 the SCCmec type I, III, V (Table 2). The sequence of genes of this study is found at GenBank with the following access numbers: JN

91 74 Table 2. Phenotypes and genotypes profiles of the Staphylococcal strains isolated from patients with hematologic diseases *Gold standard; ǂ S. epidermdis: arcc, aroe, gtr, muts, pyrr, tpia, yqil; S. Phenotypes tests Genotypes tests aureus: arcc, aroe, glpf, gmk,pta, tpi, yqil ; Strains not determined (there is no SCCmec MLST protocols for those Oxac Cefox PBP2a meca* Allelic profileǂ MLST species yet). types S. epidermidis R S + + I,III,V S. epidermidis R S + + I,III,V S. epidermidis R R + + II,III,V S. aureus R R + + I,III,V S. intermedius R S + + I,III,V NT NT NT NT NT NT NT NT S. lugdunensis S S + + III NT NT NT NT NT NT NT NT Staphylococcus sp R S + + I,III,V NT NT NT NT NT NT NT NT Staphylococcus sp R S + + I,III,V NT NT NT NT NT NT NT NT Staphylococcus sp. R R + + I NT NT NT NT NT NT NT NT S. hyicus R R + + I,II,IV NT NT NT NT NT NT NT NT

92 75 The S. epidermidis ST 365 clone was isolated from the peripheral blood of two male and female patients (9 and 2 years old) presenting acute lymphocytic leukemia. The susceptibility tests showed that both presented resistance against methicillin, tetracycline, penicillin, oxacillin, and chloramphenicol; reduced sensitivity to ceftazidime and sensitivity to vancomycin, cefoxitin, ciprofloxacin, amikacin, imipenem and cefepime. The S. epidermidis ST2 clone isolated from blood infection from a 24-yearold patient with chronic myeloid leukemia presented resistance against methicillin, cefoxitin, oxacillin, amikacin, ceftazidime, ciprofloxacin, imipenem, cefepime; reduced sensitivity to chloramphenicol, and sensitivity to vancomycin. Its presence in our hospital may be due to colonized patients (reservoirs) or colonized patient, contaminated healthcare workers-to-patient transmission, resistance profile of the isolate in relation to antimicrobial agents, high formation of biofilm, recognized as a critical factor for the for the colonization of medical devices, heterogeneous expression of the gene and the SCCmec found in disease-associated isolates, ica gene cluster, insertion sequence element IS256, and the presence of SCCmec present in disease-associated strains. This reflects highly ability to adjust through genetic exchange to environmental changing and antibiotics therapy (10, 11). ST2, founder of the CC2 clonal complex, is considered as the prevalent international cause of most S. epidermidis hospital infections, also detected as an epidemic hospital pathogen worldwide and in different European hospitals (10, 11). The detection of resistant methicillin strains belonging to this virulent clonal lineage in hospitalized - mainly immunocompromised - patients, points to a possible hospital infection, as they had been in hospital for over 72 hours, did not come from other hospitals, received no prolonged antibiotic therapy at the moment of collection, and presented frequent use of catheter because of the treatment. The S. aureus ST243 clone isolated from a 30-year-old hemophilic patient with blood infection presented resistance to methicillin, penicillin, tetracycline, cefoxitin, oxacillin, and ceftazidime; sensitivity to ciprofloxacin, chloramphenicol, vancomycin,

93 76 and amikacin. Despite the in vitro sensitivity against imipenem and cefepime, CLSI M-100 S20 recommendations suggest that they should be reported as resistant due to low treatment effectiveness. The presence of ST243 in our hospital may have come from patient/patient or colonized patient/ contaminated healthcare workers- transmission and prolonged antibiotic therapy. Other risk factors that can be considered for hematogenous infection are nasal carriers, and skin/soft tissue infections (11, 12). This clone is spread over the USA, Thailand and Japan (data available at though only the Thailand clone is methicillin-resistant. The presence of the SCCmec III cassette in S. epidermidis, with no clinical importance in infections, must be revised, because the horizontal transfer of a large number of resistance genes between species opens way to methicillin resistance (13,14), which induces to the use of different antibiotics as a therapeutic option (mainly vancomycin). Another fact observed was the presence of SCCmec type V in S. epidermidis. Types IV and V are small, structurally similar elements that carry the meca gene as a unique antibiotic resistance encoder. As they have a high competitive transfer capacity, this can explain the presence of SCCmec type V in relation to type IV (15). Another important factor detected was the existence of various SCCmec types. This may suggest that multiple introductions are occurring. And their presence in the same ST may suggest a possible horizontal transfer between the species (9). Conclusions A horizontal transfer of the mec gene may be occurring, which favors the appearance of methicillin resistance between the species. Microbial resistance monitoring programs are important to avoid hospital infection outbreaks and the spread of pathogenic clonal lines. Acknowledgements We are grateful to acknowledge the support provided by Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas - FAPEAM. In addition, the Superintendent of the State of the Amazonas (SUFRAMA).

94 77 Conflict of Interest The authors have no conflict of interest related to the development of the present study. Biographical Sketch Cristina Motta Ferreira, Biochemistry, MSc in Tropical Pathology, PhD student in Infectious and Tropical Diseases, professor of clinical bacteriology in the Nilton Lins University. The author develops activity, with emphasis on methicillin resistant staphylococci and beta-lactamase-producing bacteria (ESBL), at the Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas-HEMOAM, in clinical bacteriology laboratory. References: 1. Strandén A M, Frei R, Adler H, Flückiger U, Widmer AF. Emergence of SCCmec type IV as the most common type of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital. Infection. 2009; 37: Udo EE, O Brien FG, Al-Sweih N, Noronha B, Matthew B, Grubb WB. Genetic Lineages of Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Kuwait Hospitals. J.Clin Microbiol. 2008; 46: Liakopoulos A, Spiliopoulou I, Damani A, Kanellopoulou M, Schoina S, Papafragas E, et al. Dissemination of two international linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis clones in Greek hospitals. J Antimicrob Chemother. 2010; 65: Miragaia M, Lencastre H, Perdreau-Remington F, Chambers HF, Higashi J, Sullam PM, et al. Genetic Diversity of Arginine Catabolic Mobile Element in Staphylococcus epidermidis. Plos one. 2009; 4: e7722. Doi: /journal.pone Jonas D, Speck M, Daschner FD, Grundmann H. Rapide PCR-based identification of methicillin- resistant Staphylococcus aureus from screening swabs. J Clin Microbiol. 2002; 40: Milheiriço C, Oliveira DC, de Lencastre H. Update to the multiplex strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51: Strommenger B, Braulke C, Pasemann B, Schmidt C, Witte W. Multiplex PCR for

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96 79 5 DISCUSSÃO 5.1 Freqüência dos gêneros e espécies bacterianas. Neste estudo as bactérias mais freqüentes produtoras de ESBL foram a E. coli, B. cepacia, Serratia sp. e Pseudomonas aeruginosa. As E. coli produtoras de ESBL identificadas indicam uma possível infecção hospitalar, devido a uma inadequada antibióticoterapia, sem exame de cultura e teste de suscetibilidade e infecções cruzadas que contribuíram para a elevação do número desses isolados resistentes (1, 106, 142). Bactérias gram-negativas como K. pneumoniae, E. coli assim como outras espécies de enterobactérias tais como Salmonella sp., Serratia marcescens, Proteus sp., Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa e B. cepacia, podem produzir uma enzima denominada de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) (2, 102). As ESBLS são enzimas que agem inibindo a ação de antibióticos betalactâmicos. A grande preocupação clínica em relação a esses isolados, reside no uso de outras opções terapêuticas como os carbapenêmicos e ao elevado tempo de internação dos pacientes. Na FHEMOAM, os pacientes hematológicos são frequentemente submetidos a quimioterapia apresentando baixa em sua imunidade, tornando-se assim suscetíveis a uma ampla gama de infecção, principalmente as hospitalares, elevando o risco de mortalidade (114). 5.2 Identificação dos fenótipos de sensibilidade, sensibilidade reduzida e a resistência dessas bactérias aos antibióticos indicados no tratamento. Com relação a sensibilidade e resistência bacterianas, foram identificadas bactérias Gram-negativas produtoras da enzima ESBL resistentes as drogas betalactâmicas, e espécies de estafilococos (MRSA e MR-SCoN) resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos, com a presença do gene meca, localizado no SCCmec. A sensibilidade reduzida detectada nas E. coli pode ser devida a variação no substrato preferencial de ação, na fraca acurácia dos testes de detecção desta enzima, fraca inibição pelo ácido clavulânico ou diferentes mecanismos combinados de resistência bacteriana. Este tipo de fenótipo também foi detectado em outros

97 80 estudos. As enterobactérias produtoras de ESBL identificadas, demonstraram sensibilidade ao imipenem e amicacina, indicando que estes antimicrobianos ainda podem ser utilizados na rotina de tratamento (102, 118). A presença de Pseudomonas sp produtoras de ESBLs é preocupante, pois apresentam elevada capacidade de adquirir resistência a vários tipos de antibióticos. Neste estudo, 33,4% das mesmas apresentaram resistência a tetraciclina e ciprofloxacina. A opção terapêutica nesses casos reside no uso de meropenem e imipenem. Entretanto, o uso freqüente desses antimicrobianos pode estimular o surgimento de isolados mutiresistentes, o que pode prejudicar os pacientes (84, 118). A detecção de enzimas ESBL é muito importante pois, conforme os critérios do CLSI M100-S17 e M100-S18, devem ser reportadas como resistentes a todos os antibióticos beta-lactâmicos, independentemente do resultado do teste de suscetibilidade. O surgimento de bactérias produtoras de ESBL, responsáveis por processos infecciosos com elevada morbi-mortalidade, tem dificultado a opção terapêutica (29). Os genes detectados nos isolados produtores de ESBL como a E. coli, Serratia sp. Pseudomonas sp., e B. cepacia foram bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla OXA, indicando uma possível resistência plasmidial. Os genes que codificam as ESBLs e aqueles que codificam a resistência aos antibióticos não beta-lactâmicos, estão localizados no mesmo plasmído conjugativo, sendo transmitidos conjuntamente entre as bactérias, podendo ser separados por pressão seletiva devido ao uso de múltiplos antibióticos (84, 102). Nas bactérias Gram-positivas, a resistência a meticilina nos estafilococos ainda continua sendo um desafio para a saúde pública em diversos hospitais do mundo. Ela é expressa devido a produção da proteína ligadora de penicilina, codificada pelo gene meca, localizado no cassete cromossômico estafilocócico mec, sendo o mais freqüente o tipo I e VI nos S. aureus e, nos estafilococos coagulase negativos o tipo IV e V. Esses patógenos representam um risco potencial para os pacientes, principalmente os imunodebiltados. Na FHEMOAM, a presença de pacientes imunodebilitados é comum devido a quimioterapia a que são submetidos

98 81 para tratamento da doença de base como leucemia, mieloma,anemia hemolítica dentre outras, contribuindo assim para a elevação do risco de morbi-mortalidade, prolongamento no tempo de internação e disseminação de isolados resistentes entre os pacientes (124). 5.3 Identificar as alterações genético-moleculares de resistência envolvidas. O clone do estafilococo coagulase negativo ST2, isolado do sangue periférico dos pacientes, apresentou resistência a meticilina. Sua presença pode estar relacionada com a formação de biofilme, reconhecido como fator crítico para colonização de equipamentos hospitalares, perfil de resistência do isolado aos antibióticos utilizados na rotina hospitalar, expressão heterogênea do gene mec, clone do gene ica, sequência do elemento de inserção IS256 e ao SCCmec presente em isolados associados a doença. O clone ST2 é reconhecido internacionalmente como o agente responsável por inúmeros casos de infecções em vários hospitais da Europa. A detecção de isolados resistentes a meticilina pertencentes a esse clone virulento, sugere uma possível infecção hospitalar, pois os pacientes também utilizavam cateteres, estavam internados há mais de 72 horas, não eram procedentes de outros hospitais e nem submetidos a antibióticoterapia prolongada (139). A presença do clone de S. aureus ST243, isolado de infecção hematogênica dos pacientes, pode ser devida a transmissão por contato direto entre pacientes, antibióticoterapia prolongada ou pacientes colonizados/ corpo clínico contaminado. Outros fatores importantes que podem contribuir para o desenvolvimento de infecção sanguínea são o portador nasal e as infecções de tecido mole. O clone ST243 apresentou resistência a meticilina sendo detectado apenas nos Estados Unidos, Japão e Tailânda. Somente o clone da Tailândia apresentou resistência a meticilina, os demais foram sensíveis (139). Em relação ao cassete cromossômico, o tipo III detectado no S. epidermidis, considerado anteriormente como agente sem importância clínica, deve ser revisto, pois a transferência de vários genes de resistência, pode induzir o desenvolvimento da resistência a meticilina, tendo como conseqüência o uso de diferentes antibióticos

99 82 como opção terapêutica (principalmente a vancomicina). A presença do SCCmec V em relação ao tipo IV no S. epidermidis, pode ser explicada pela elevada competitividade entre ambos no momento da transferência entre os isolados. Outro fator importante observado foi a presença de varios tipos de SCCmec. Isto sugere que múltiplas introduções de cassetes podem estar ocorrendo, e a presença de um mesmo tipo de SCCmec em um único clone, pode indicar também transferência horizontal do gene mec entre as espécies (11, 64).

100 83 6 CONCLUSÃO Freqüência dos gêneros e espécies bacterianas 1. Identificaram-se pacientes hematológicos com infecção ocasionada por bactérias Gram-positivas e negativas resistentes a diferentes grupos de antibióticos. As bactérias Gram-positivas mais frequentes foram os Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus aureus e Staphylococcus sp., enquanto que as Gram-negativas, foram a Escherichia coli, Serratia sp., Serratia liquefaciens e Burkholderia cepacia. Identificação dos fenótipos de sensibilidade, sensibilidade reduzida e a resistência dessas bactérias aos antibióticos indicados no tratamento. 2. Com relação a sensibilidade e resistência bacterianas, foram identificadas bactérias Gram-negativas produtoras da enzima ESBL resistentes as drogas beta-lactâmicas, e espécies de estafilococos (MRSA e MR-SCoN) resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos, com a presença do gene meca, localizado no SCCmec. Identificar as alterações genético-moleculares de resistência envolvidas. Os genes detectados nos plasmídeos isolados das bactérias Gram-negativas foram bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla OXA comprovando a presença de isolados implicados em processos infecciosos hospitalares. Os clones das espécies de estafilococos detectados foram: - S. aureus ST 243 (SCCmec I, III, V) (4133 MLST database). - S. epidermidis ST2 (SCCmec II, III, IV,V) (529 MLST database). - Dois isolados pertencentes ao novo clone de S. epidermidis - ST 365 (SCCmec I, III, V) (527,528 MLST database). A identificação do S. aureus ST 243 (SCCmec I, III, V, S. epidermidis ST2 (SCCmec II, III, IV,V), e do novo clone S. epidermidis ST 365 (SCCmec I, III, V), nos

101 84 estafilococos meticilina resistentes, comprovam a presença de linhagens patogênicas implicadas em processos infecciosos hospitalares. A presença dos diferentes tipos de cassetes nos isolados meticilina resistentes sugere múltipla introdução e, sua presença no mesmo ST, transferência horizontal do gene mec.

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120 103 8 Anexos 8.1 Termo de Consentimento Livre esclarecido Prevalência e sensibilidade a antibióticos das bactérias aeróbicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM Este é um trabalho de pesquisa que tem como finalidade realizar um exame do micróbio que esteja provavelmente causando uma infecção em seu corpo, e o resultado do exame poderá trazer boas coisas para a sua saúde, pois será encaminhado para o médico que fará o tratamento adequado. Para realizar o teste será necessária a coleta do seu sangue com agulha descartável, onde você sentirá um leve aperto em seu braço e um pouco de dor no momento da picada da agulha, mas nada disto comprometerá sua saúde ou seu bem estar físico. Poderá sentir também, dependendo do tipo de exame e a solicitação do médico, uma sensação de um swab (cotonete grande) que será passado em alguma parte de seu corpo (garganta, nariz, ferida), ou a urina que tiver que coletar. Não se preocupe com seu sangue, pois logo após termos feito os exames ele será desprezado e somente será guardado num freezer o germe que foi identificado como o responsável pela sua doença infecciosa. Caso o(a) Sr. (a) ou seu filho concorde em participar, estarão nos ajudando a ter informações sobre sua saúde e também como prevenir algumas doenças graves. O projeto poderá ser encerrado se ocorrerem problemas além dos mencionados acima que possam prejudicá-lo. O Sr (a) ou seu filho poderão ser ressarcidos (as) pelos integrantes da pesquisa, caso haja algum tipo de prejuízo físico extremo, durante a coleta do exame para a pesquisa, mas não se preocupe pois para este projeto vocês não correm esse risco. Todos os resultados dos exames feitos serão mantidos em segredo e somente o (a) Sr.(a), e/ou seu filho e/ou o responsável pelo projeto poderão ver os resultados. Também queremos lhe dizer que eles poderão ser publicados em uma revista médica para que outros colegas da nossa profissão possam tomar conhecimento e tentar ajudar outras pessoas. O (a) Sr. (a) ou seu filho terão liberdade a qualquer momento de sair do estudo sem que isso lhe traga algum prejuízo ao seu modo de vida e qualquer dúvida poderá ser tirada com a responsável que é a Drª Cristina Motta Ferreira pelo telefone ramal 0109 ou na Fundação HEMOAM, Laboratório de Microbiologia pelo período da tarde. Eu,......recebi a explicação de que serei um dos participantes dessa pesquisa. Se eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de minha confiança lerá este documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome. Por estar devidamente informado (a) e esclarecido (a) sobre o este termo, livremente, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso meu consentimento para a minha inclusão. Eu,...responsável pelo paciente menor de idade...recebi a explicação de que o mesmo será um dos participantes dessa pesquisa. Se eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de minha confiança lerá este documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome. Por

121 104 estar devidamente informado (a) e esclarecido (a) sobre o este termo, livremente, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso meu consentimento para a minha inclusão /.../... Assinatura do paciente Data / / Impressão do polegar direito do paciente, caso este não saiba escrever seu nome.... Assinatura do pesquisador que conversou com o paciente

122 Anexo 2 PROTOCOLO MÉDICO Prevalência e sensibilidade a antibióticos das bactérias aeróbicas isoladas de processos infecciosos de pacientes com doenças hematológicas da Fundação HEMOAM Nome do paciente: Registro: Data do exame: D. Nasc: Idade: Procedência Clínica ( ) Leito ( ) nº Ambulatório ( ) Dados Clínicos: Provável origem do processo infeccioso: comunitário ( ) hospitalar ( ) Relacionado a procedimento invasivo? Sim ( ) Não ( ) Cirurgia? Qual? Doença Hematológica: Anemia aplástica ( ) Leucemia (LLA) ( ) A.falciforme ( ) Leucemia (LMC) ( ) Leucemia (LLC) ( ) LMA( ) Mieloma Múltiplo( ) Linfoma ( ) Hemofilia ( ) Foco infeccioso- Descrição da Amostra: Trato respiratório: Ouvido: Otite ( ) Seios da face: Sinusite ( ) Boca: Abcesso dentário ( ) Úlcera ( ) Faringe( ) amigdala ( ) Pulmão: tuberculose ( ) pneumonia ( ) escarrro( ) Coração: endocardite ( ) Trato urinário: infecção urinária ( ) Sintomático ( ) assintomático ( ) jato médio ( ) sonda de alívio ( ) punção suprapúbica ( ) saco coletor( ) Trato intestinal: diarréia ( ) tiflite ( ) Pele: ferida cutânea ( ) abcessos ( ) úlceras ( ) foliculite ( ) sepse( ) ponta de cateter ( ) foco de origem desconhecida ( ) próteses ( ) outros ( ) Hemocultura: sangue periférico ( ) sangue colhido de cateter ( ) Topografia(local da coleta) nível de coleta : superficial ( ) profunda ( ) Via de obtenção de material: punção ( ) swab ( ) raspado ( ) drenagem ou fístula ( ) dreno ( ) outros : Fez uso nos últimos dias de antibiótico? Sim ( ) não ( ) Quais? Existe infecção em outra topografia? Sim ( ) não ( ) Existe comprometimento imunológico? Sim ( ) não ( ) É paciente transferido de outro hospital? Sim ( ) não ( )

123 106 É portador de bactérias multirresistentes? Sim ( ) não ( ) Condição clínica do paciente: febre antes da internação ( ) febre no decorrer da internação ( ) neutropenia febril ( ) neutropenia afebril ( ) febre após alta da internação ( ) Data do pedido _/ / Médico solicitante (Nome legível) e CRM :

124 Anexo 3 PROTOCOLO LABORATORIAL Nome: Registro: Procedência Data: Clínica ( ) Leito ( ) Ambulatório ( ) Local do Nascimento Médico: Amostra biológica coletada: Data da coleta / / Responsável pela coleta Natureza do teste solicitado: teste direto ( ) Gram ( ) Ziehl ( ) Rotina bacteriológica (Gram+cultura) ( ) Resultados: Método de Gram: BGN ( ) BGP ( ) CGP ( ) CGN ( ) Testes Identificação de cocos (Micrococos e estafilococos): Catalase pos ( ) negativa( ) Ferment. Manitol Coagulase pos ( ) negativa( ) Novobiocina halo mmm sensível ( ) halo mmm resistente ( ) Furazolidona halo mmm sensível ( ) halo mmm resistente ( ) Bacitracina halo mmm sensível ( ) halo mmm resistente ( ) polimixina B halo mmm sensível ( ) DNAse PYR Testes Identificação de Estreptococos: Catalase pos ( ) negativa( ) Hemólise alfa (parcial) ( ) beta (total) ( ) gama (ausência) ( ) Bacitracina halo mmm sensível ( ) halo mmm resistente ( ) Optoquina halo mmm sensível ( ) halo mmm resistente ( ) STX halo mmm sensível ( ) halo mmm resistente ( ) Cresc e em NaCl 6,5% PYR Bile-esculina CAMP Testes Bioquímicos: Oxidase Glicose (gás) Sacarose Maltose Lactose H2S Oxidase Citrato Uréia Manitol TSI Motilidade Lisina Arginina Ornitina Indol Triptofano desaminase gelatina Beta lactamase Microorganismo identificado: Resultado do Teste de Suscetibilidade (difusão com disco): Microrganismo Gram-positivo ( ) Eritromicina ( ) S ( )R Sulfazotrim ( )S ( )R Oxacilina ( )S ( )R Rifampicina ( )S ( )R Gentamicina ( )S ( )R Tetraciclina ( )S ( )R Cefepime ( )S ( )R Vancomicina ( )S ( )R Penicilina G ( )S ( )R Cloranfenicol ( )S ( )R Clindamicina ( )S ( )R Ciprofloxacin ( )S ( )R Microrganismo Gram-negativo ( ) Ampicilina ( )S ( )R Amicacina ( )S ( )R Sulfazotrim ( )S ( )R Gentamicina ( )S ( )R Imipenem ( )S ( )R Amoxicilina + Clavulanato ( )S ( ) R

125 108 Ceftazidima ( )S ( )R Ciprofloxacin ( )S ( )R Cefalotina ( )S ( )R Cefuroxima ( )S ( )R Cefepime ( )S ( )R Cefoxitina ( )S ( )R Urinocultura ( ) sim ( ) Não Contagem de colônias... Ácido Nalidixico ( )S ( )R Gatifloxacin ( )S ( )R Ampicilina ( )S ( )R Norfloxacina ( )S ( )R Gentamicina ( )S ( )R Nitrofurantoína ( )S ( )R Tetraciclina ( )S ( )R Cefalotina ( )S ( )R Cefepime ( )S ( )R Sulfazotrim ( )S ( )R Cloranfenicol ( )S ( )R Ciprofloxacin ( )S ( )R Técnico responsável pelos resultados de exame:

126 Anexo 4 Protocolos Laboratoriais Coloração pelo método de Gram Fonte: Winn et al Solução de violeta de metila Solução 1: Violeta de metila P.A. (Neon)... 2,0g Álcool etílico 99,5GL P.A. (Labsynth) ,0mL Álcool metílico 99,5GL P.A. (Granquimica) ,0mL Solução 2: Oxalato de amônia P.A. (Reagen) g Água deionizada ,0mL Obs: Misturar as soluções 1 e 2, deixando em repouso por 24 horas ao abrigo da luz filtrando em papel de filtro comum, estocando em frasco âmbar ao abrigo da luz. 2 - Preparo da solução de lugol (estoque) Iodeto de potássio P.A.... 4,5g Iodo metálico P.A.... 3,0g Água deionizada ,0mL Preparo da solução de lugol diluído 1/20 (uso) Em frasco apropriado, juntar 2ml de lugol (estoque) com 38ml de água deionizada. Obs: Misturar o Iodeto de Potássio (Merck) na água, até a completa dissolução. Acrescentar o Iodo metálico (Cinética Química) até completa dissolução com água destilada. Estocar em frasco âmbar ao abrigo da luz.

127 Solução de safranina Safranina O P.A.... 2,5g Água deionizada mL Obs: Misturar a safranina O (Vetec) na água até completa dissolução. Estocar em frasco âmbar ao abrigo da luz. 4 - Solução descorante Álcool etílico a 95,5 GL. 5 - Técnica de coloração a) Cobrir o esfregaço com violeta de metila (Vetec, lt. 25) por 15seg; b) Adicionar água deionizada sobre a lâmina com violeta de metila por 45seg; c) Escorrer o corante e lavar em água corrente; d) Cobrir a lâmina com lugol diluído 1/20 (uso), por aproximadamente 1 minuto; e) Escorrer o lugol e lavar em água corrente; f) Descorar o esfregaço adicionando álcool etílico 95,5 GL até que não haja mais o desprendimento de corante; g) Lavar em água corrente; h) Cobrir a lâmina com safranina O por aproximadamente 30seg; i) Lavar em água corrente; j) Deixar secar a temperatura ambiente antes de examinar ao microscópio.

128 111 Fonte: Manual Anvisa módulo III (116). Protocolo de Coleta de material Biológico Instrução para coleta Hemocultura: A hemocultura é o exame definitivo para o diagnostico de invasão de microorganismos na corrente sanguínea. Definição de hemocultura: Coleta de um par de frascos, num mesmo momento e num único local (frasco aeróbio e anaeróbio ou dois frascos aeróbios, por exemplo) Obs.: A coleta de mais de 2 frascos (3,4,5...) num mesmo momento e de um único local deve ser interpretada como uma hemocultura única. Técnica: 1-Colher antes da administração de antibióticos (quando possível) ou na troca dos mesmos; 2-Lavar as mãos e seca-las; 3-Usar luvas estéreis; 4-Remover o selo da tampa do frasco de hemocultura, e fazer assepsia previa nas tampas com álcool a 70 %. 5-Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não deverá mais ser tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com álcool a 70 % de forma circular e de dentro para fora, concetricamente. 6-Aplicar solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) também com movimento em espiral de dentro para fora. Para ação adequada do iodo, deixar secar por 1 a 2 minutos antes de efetuar a coleta. Para pacientes alérgicos ao iodo, passar novamente o álcool a 70 %. 7-Venopunção: coletar a quantidade de sangue e o numero de amostras recomendadas de acordo com as orientações descritas ou discriminadas no pedido medico. 8-Não é necessária a troca de agulhas para inoculação nos frascos.

129 112 9-Misturar o conteúdo nos frascos por inversão (método manual). 10-Limpar o local da venopunção com álcool a 70% removendo todo o iodo; 11-Identificar cada frasco conforme a padronização e enviar ao laboratório juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida, em caso de frasco automatizado não rasurar o código de barra. Observações: Não é recomendada a coleta de hemocultura através de cateteres ou cânula, por demonstrarem nível significativo de contaminação quando comparada à veia periférica. Preferir punções venosas, pois as artérias não trazem beneficio em relação a recuperação de microorganismos. Método de coleta do sangue e o volume coletado influenciam diretamente no sucesso de recuperação de microorganismos e uma interpretação adequada dos resultados. O melhor momento da coleta: 1-Antes de instituir a terapêutica antimicrobiana. 2-Antes do pico febril ou da ascenção da temperatura (30 a 90 minutos: bacteremia máxima). 3-Se não for possível detectar a ascensão da temperatura, coletar durante ou imediatamente ao pico febril. Volume e número de amostras: A sensibilidade aumenta 3% a cada ml de sangue coletado. Trabalhos recentes mostram que, quanto maior o volume de sangue, por amostra, melhor a recuperação do microorganismo(respeitando a porção sangue/ meio), sendo que o volume ideal corresponde a 10 % do volume total do frasco de coleta. Os frascos de sistemas automatizados permitem a coleta de até 10 ml de sangue. O número de frascos

130 113 deverá ser coletado de acordo com as condições clinicas do paciente. Preconiza-se para o paciente adulto a coleta de 20 ml de sangue a cada hemocultura, ou seja, 02 frascos de hemocultura a cada coleta. Os frascos do sistema manual com 45 ml de meio, coletar 5 ml de sangue. Frascos pediátricos de sistemas automatizados permitem a coleta de 1 a 4 ml de sangue.no caso de recém - nascidos e crianças pequenas, coletas apenas um frasco de hemocultura. Os frascos de sistema manual com 9 ml de meio, coletar 1 ml de sangue. Um total de 3 culturas em 24 horas costuma ser suficiente para descartar bacteremia ou endocardite. Coletas acima de quatro amostras não trouxeram maior índice de recuperação microbiana. Obs.: O uso de frascos específicos para cultura de anaeróbios e micobactérias, deve ser considerado apenas em situação especificas onde ser pode esperar participação de anaeróbios e micobacterias, e, deverá ser solicitado para tal. Ou ainda, nos quadros clínicos cirúrgicos envolvendo o trato digestivo, infecções pélvicas e outros, coletar sistematicamente um par de frascos: aeróbio e anaeróbio. Nunca resfriar o frasco e enviar o mais rápido possível ao laboratório Condições clínicas especificas Infecções Sistêmicas e localizadas (sepse, osteomielite, meningite): Duas amostras sanguíneas de punções venosas diferentes (braço direito e esquerdo) com intervalo de, no máximo 5 minutos, entre as punções. Se possível 10 a 20 ml por amostra. Bacteremia ou febre de origem desconhecida (abscessos, febre tifóide, brucelose): Duas as três amostras coletadas no primeiro dia de punções venosas diferentes com intervalos superiores a uma hora. Se negativo, 24 ou 36 horas após, colher mais duas amostras. Endocardite: Aguda: três amostras sanguíneas de punções venosas diferentes (braço esquerdo e direito) nas 1º a 2 º horas com intervalos mínimos de 20 a 30 minutos.

131 114 Subaguda: três amostras no primeiro dia (15 min. Ou mais de intervalo). Se o resultado for negativo, após 24 horas obter mais duas amostras. Pacientes com picos febris regulares, coletar duas amostras antes do inicio da febre (1 hora), evitar o pico febril. Crianças: duas culturas são recomendadas para diagnostico de bacteremias em recém-nascidos. Pacientes em uso de antimicrobianos, coletar duas hemoculturas separadamente, em cada dia, durante 3 dias consecutivos, se as primeiras negativas. Trato respiratório: Escarro: 1-Lembrar que este material não é considerado ideal para avaliação microbiológica, do trato respiratório. 2-A melhor coleta é feita com a supervisão direta do pessoal de enfermagem treinado ou fisioterapeuta. 3-Orientar o paciente sobre a importância da coleta do escarro e não da saliva. 4-Colher o escarro através da tosse, de modo que o material venha do peito e não da garganta. 5-Colher somente uma amostra por dia, se possível, o primeiro escarro da manhã, antes da ingestão de alimentos, em recipiente estéril da boca larga e enviar o mais rapidamente possível ao laboratório. 6-Orientar o paciente para escovar os dentes somente com água, e gargarejar varias vezes a boca com água. Não usar pasta de dente ou colutórios. Obs.: Caso o paciente tenha dificuldade de escarrar, esta amostra poderá se induzida por inalação de 20 ml de 3% a 10% de NaCl 0,85% ou ser realizada coleta por aspiração transtraqueal.

132 115 Secreção de orofaringe: 1-O sucesso de detecção do germe depende da amostra coletada exatamente na área inflamada, evitando outros sítios da cavidade oral. 2-Solicitar ao paciente que abra bem a boca. 3-Usando o abaixador de língua e swab estéril, fazer esfregaço sobre as amídalas e faringe posterior, evitando tocar na língua e bochechas. 4-Passar o swab nas áreas hiperemiadas (faringe posterior, pilare D e E, ou abaixo das amigdalas), próximo aos pontos de supuração ou abaixo das placas ou membranas. 5-Coletar preferencialmente dois swabs e colocá-los em meio transporte quando houver. 6-Enviar imediatamente ao laboratório para evitar a secagem do marterial, quando não houver meio de transporte. Secreção de nasofaringe: 1-A coleta deve ser feita antes do uso de produtos tópicos. 2-Introduzir em swab flexível e estéril, pelo meato nasal, paralelo ao palato superior, buscando atingir o orifício posterior das fossas nasais, tentando evitar tocar o swab na mucosa da narina, fazer um discreto movimento circular e retirá- lo. 3-Recolocar o swab no tubo com meio de transporte e enviar ao laboratório imediatamente. URINA: 1- A coleta deve ser feita pela manhã, preferencialmente da primeira micção do dia, ou então após retenção vesical de duas a três horas. Crianças: 1-Realizar assepsia rigorosa prévia dos genitais com água e sabão neutro e posterior secagem com gaze estéril.

133 116 2-Ideal: jato médio espontâneo. 3-Em lactentes em que não se consegue colher através do jato médio, pode se usar o saco coletor de urina, porém, a troca deve ser realizada de 30 em 30 minutos e ao trocar o coletor, refazer a assepsia. 4-Casos especiais (RN, lactentes de baixo peso, resultados repetidamente duvidosos) indicar punção vesical suprapúbica, que deverá ser realizada por médico. Adultos do sexo feminino: 1-A coleta deve ser supervisionada pessoalmente por uma enfermeira ou auxiliar treinada. 2-Orientar a paciente que ao sentar no vaso sanitário, deverá afastar os grandes lábios com uma das mãos e com a outra lavar as genitálias de frente para trás, utilizando gaze estéril. 3-Continuar afastando os grandes lábios para urinar, o primeiro jato de urina deve ser desprezado no vaso sanitário. Colher o jato médio urinário no frasco fornecido pela enfermagem, evitando encher o frasco. 4-Fechar bem o frasco e entregar ao pessoal de enfermagem. 5-Enviar ao laboratório até 30 minutos, caso não seja possível, as amostras deverão ser resfriadas até 2 horas. Adultos do sexo masculino: 1-A coleta deve ser feita pela manhã, preferencialmente da primeira micção do dia, ou então após retenção vesical de duas a três horas. 2- Realizar a higiene local da genitália utilizando uma gaze estéril embebida com água e sabão neutro e gaze estéril. 3-Coletar jato médio em um frasco estéril descartável e levar ao laboratório Pacientes cateterizados com sistema de drenagem fechada: 1-Colher a urina puncionando- se o cateter na proximidade da junção com o tudo de drenagem. Não Colher urina da bolsa coletora. 2-No pedido laboratorial deverá constar que o paciente está cateterizado.

134 117 Ponta de sonda vesical: 1-Não realizar cultura da ponta da sonda vesical, porque o crescimento bacteriano representa a flora de uretra distal. 2-Recomenda-se cultura de urina após 48 horas da retirada da sonda na monitoração de processos infecciosos. 3-Urocultura realizadas antes deste período podem fornecer resultados positivos sem que eles estejam, necessariamente, associadas à infecção. Fezes: 1-Devem ser coletadas no inicio ou fase aguda da doença, quando os patógenos estão usualmente presentes em maior número e, preferencialmente, antes da antibióticoterapia, e quatro dias após o uso de contrastes radiológicos. 2-Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte (Cary Blair ou salina glicerinada tamponada), em quantidade equivalente a uma colher de sobremesa. Preferir sempre as porções mucosas e sanguinolentas. 3-Fechar bem o frasco e agitar o material. 4-Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar na geladeira a 4ºC, no máximo por um período de 12 horas. Marcar o horário da coleta. Swab retal: 1-Usar swab de algodão. 2-Umedecer o swab em solução salina estéril (não usar gel lubrificante) e inserir no esfíncter retal, fazendo movimentos rotatórios. 3-Ao retirar certifique-se que existe coloração fecal no algodão. 4-Enviar ao laboratório no intervalo de 30 minutos ou utilizar o meio de transporte Cary Blair. Lesões abertas úmidas e úlceras: 1-Esta coleta deve ser realizada pelo médico assistente.

135 118 2-A área ao redor da lesão deverá ser limpa com gaze embebida em álcool a 70%. 3-Remover crostas e excesso de secreção com solução salina e gaze estéril. 4-Passar o swab na base e nas bordas da lesão, colocar o swab no meio de transporte e enviar o mais rápido possível para o laboratório, sem refrigerar. Observações: Não coletar o pus emergente. O material das margens da lesão e a parte mais profunda do sítio escolhido são mais representativos e possuem maior viabilidade de microrganismos. A cultura de lesões secas e crostas não são recomendadas, a menos que a obtenção de exsudato não seja possível. A coleta de ferida de queimadura deve ser realizada após extensa limpeza e debridamento da lesão. Biopsia de pele é a técnica mais recomendada. Espécimes cirúrgicos biópsias e secreções: 1-Esta coleta é realizada pelo médico assistente. 2-Verificar, no momento do recebimento do material, se as instruções de coleta foram seguidas. 3-Colher o material por aspiração com seringa. 4-Técnica de coleta asséptica. Secreção conjuntival (Ocular): 1-A coleta deverá ser realizada antes do uso de qualquer produto tópico. 2-Retirar o excesso de secreção purulenta com gaze estéril. 3-Com uma das mãos afastar as pálpebras superior e inferior, e com a outra passar o swab na mucosa conjuntival. 3-Colocá-lo no meio de transporte e enviar diretamente ao laboratório. Semeadura em meios de cultura Fonte: Manual Anvisa módulo V (110) ; Oplustil et al (109)

136 119 Tabela 1- Meios de culturas de triagem para semeadura primária Meios de cultura Urina Fezes HEMOCULTURAS Secreções Ponta de cateter Líquidos Fragmentos Lavabo Brônquico Meios utilizados Laminocultivos ( CLED/MacConkey), Ágar EMB + CLED Selenito (Meio Líquido), ágar EMB e Agar SS Frascos de Hemocultura Ágar sangue ou chocolate BEM Ágar sangue Ágar sangue (EMB), frascos de hemocultura Ágar sangue meio líquido TSB (frascos de hemocultura) Ágar sangue, Ágar chocolate EMB. Preparo dos materiais clinicos e semeadura inicial Amostras recebidas em swab : Amostras colhidas com swab são utilizadas para a coleta de diversos materiais clínicos, mas seu uso deve ser evitado quando outras metodologias podem ser empregadas. Quando as amostras forem coletadas em swab duplo utilizar um dos swabs para fazer o esfregaço em uma lâmina, e o outro, para colocar no meio de transporte (caso não seja semeado na mesma hora). Quando somente um swab for coletado, suspender o swab em um pequeno volume de solução fisiológica estéril (esta na geladeira), agitar (vortex ou centrifuga) 2000 por dois comprimir o swab na parede do tubo e utilizar esta suspensão para o preparo do esfregaço e semeadura nos meios aquáticos. Semear por esgotamento nos meios apropriados, colocar na estufa a 35º C. OBS.: Não deixar o swab dentro do tubo sem meio de transporte, ou colocar na geladeira ou estufa para ser semeado no outro dia. Sempre executar semeadura primaria. Cultura de urina:

137 120 1-Abrir o lâminocultivo e submergir a lâmina contendo e meio de cultura na urina recém-coletada. Ambas as superfícies dos meios de cultura devem ser completamente umedecidas pela urina. 2-Retirar o excesso de urina deixando-a escorrer junto à borda do recipiente. 3-Fechar o tubo e encubar ente 35º C+- 1ºC em posição vertical durante 18 a 24 horas. Obs.: Sempre fazer uma lâmina a fresco e observar a presença de leucócitos, eritrócitos e bactérias. Cultura de fezes: Amostra aceitável: 1-Fezes sem conservante devem ser encaminhadas e processadas no máximo dentro de 1 hora após a coleta. 2-Fezes com conservante podem ser mantidas á temperatura ambiente por ate 24 horas. Amostra não aceitável: Amostras sem conservantes que foram obtidas há mais de três horas Várias amostras colhidas no mesmo dia de urina e fezes Fezes liquidam colidas ou enviadas em fraldas. Procedimento 1-Semear três a quatro alçadas de fezes no tubo contendo meio selenito (meio enriquecida). 2-Colocar o tubo na estufa por 12 a 18 horas. 3-Semear depois para os meios selenito, ágar SS e ágae BEM. 4-Incubar por mais de 18 a 24 horas.

138 121 Conservantes mais comuns: Glicerina tamponada Cary-blair (meio de transporte para fezes) Swab com meio de transporte Stuart Obs.: Se houver suspeita de vibrio spp, a amostra de fezes ou swab retal deve ser encaminhada em cary-blair à temperatura ambiente. Hemocultura: Procedimento 1- Identificar o frasco com: nome do paciente, data e hora da coleta e numero da amostra. 2-Levantar a parte central da tampa de alumínio com o auxilio de uma pinça. 3-Fazer assepsia da tampa de borracha com álcool 70% e deixar secar e introduzir o sangue: 5ml no frasco para adulto e 1ml no frasco pediátrico. 4-Incubar a 35ºC com agulha estéril para realizar a incubação em aerobiose. 5-Se possível coletar 02 amostras. 6- Sepse, pneumonia, meningite, artritre e pielonefrite: 2 a 3 hemoculturas antes do início da terapia. Coletar sem necessidade de intervalo, intercalando os sítios da punção. 7-FOI, endocardite ou outra bacteriemia ou fungemia contínua: 2 a 3 hemoculturas com 20 min de intervalo entre as coletas. Se forem negativas nas primeiras 24hs, repetir o procedimento. 8-Paciente em uso de terapia antimicrobiana- utilizar frasco com inibidores de antibióticos e coletar antes da próxima dose do antibiótico. Técnica para processamento de hemocultura manual Frasco de hemocultura- incubar a 35ºC em C02. Após 24hs (1º dia)-- semear em ágar: sangue, chocolate, Mac Conkey e realizar o teste de Gram (sugerir

139 122 agrupamento). Resultados: Positivo- sem crescimento em ágar sangue e chocolate com bactérias no Gram, semear em anaerobiose. Relatar cultura positiva para anaeróbio. Não realizamos este tipo de cultura. Negativo- emitir resultado parcial reincubar. Reincubar a 35ºC. Após 48hs(2º dia) semear em Agar sangue, chocolate, Mac Conkey e BEM. Realizar o Gram. Resultados: Positivo- emitir resultado parcial- identificação e TSA (cocos ou bastonetes) Negativo- emitir resultado parcial reincubar. Reincubar 35ºC. Após 120hs (5º dia) semear em Agar: Chocolate, Mac Conkey e EMB. Realizar o Gram. Resultados: Positivo- emitir resultado parcial- identificação e TSA (cocos ou bastonetes). Negativo- emitir resultado parcial reincubar. Reincubar 35ºC. Após o 7º dia: Semear uma gota em ágar chocolate. Resultados: Positivo- emitir resultado parcial- identificação e TSA (cocos ou bastonetes). Negativo- resultado neg, desprezar o frasco. FUNGOS????

140 123 OBS: No resultado emitir o sítio da coleta, horário e temperatura do paciente no momento da coleta. Microrganismos mais freqüentes em hemocultura: S. aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus spp., Streptococcus spp., mais raramente Listeria spp.. Entre os fungos temos Cândida spp., Crytococcus neoformans. Entre os gram-negativos: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, N. meningitidis e outros. Em crianças ocorrem também os mesmos que nos adultos, mas há maior prevalência de bacteremia por estafilococos, estreptococos, (S. pneumoniae), meningococos, hemófilos. Cultura de secreções: Material clínico: Amostras de exsuadato de lesão: Superficial Profunda Operatória Obs.: Quando for solicitada bacterioscopia conjuntamente com a cultura, é recomendado coletar dois swabs. Um dos swabs deve ser utilizado imediatamente após a coleta para confeccionar uma lâmina e outro ser colocado em meio de transporte. Procedimento Incubação nos meios de cultura: Amostra não coletada com swab : Ágar sangue, chocolate (opcional para feridas profundas) e EMB.

141 124 Swab sem meio de transporte: Ressuspender a amostra colhida com swab em volume pequeno de caldo TSB (o mesmo de hemocultura) ou solução fisiológica estéril. Homogeneizar vigorosamente a solução para inocular em ágar sangue e ágar EMB e fazer uma lâmina para a coloração de gram. Swab como meio de transporte: Semear em ágar sangue e ágar EMB. Seringa: Inocular diretamente em ágar sangue e ágar EMB. Protocolo para Identificação de Cocos Gram-positivos Fonte: Manual Anvisa módulo V (110). Tabela 2- Divisão dos cocos Gram positivos pela prova da catalase Staphylococcus spp Enterococcus spp Micrococcus spp. Streptococcus spp. Planococcus spp Aerococcus spp Stomatococcus spp. Gemella spp., Leuconostoc spp. Lactococcus spp., Stomatococcus spp.

142 125 1-Teste da catalase 1- Reagentes a) Peróxido de hidrogênio a 3 ou 30% armazenado em frasco escuro, sob refrigeração. b) Cultura pura (24h) do isolado bacteriano. 2 - Controle de qualidade a) Devem-se realizar os testes de controle com microorganismos positivos (S. aureus) e negativos (Streptococcus spp.), diariamente ou antes de se testar a bactéria em estudo. 3 Procedimento técnico: a) Com agulha de inoculação ou aplicador de madeira estéril, transferir coletar uma colônia para a superfície de uma lâmina de vidro. b) Acrescentar uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% ou 30%. 4 Interpretação O aparecimento rápido e prolongado de bolhas ou de efervescência significa que o teste é positivo. 2-Teste da citocromo oxidase (oxidase) 1- Reagentes a) Diidrocloreto de tretrametil-p-fenilenodiamina, 1% (reagente de Kovac) b) Diidrocloreto de dimetilp-fenilenodiamina, 1% (reagente de Gordon e Mcleod) Reativo: (Merck) Diidrocloreto de tetrametil ou dimetil-p-fenilenodiamina P. A.... 1g Água deionizada... 10mL

143 Controle de qualidade a) Devem-se realizar testes de controle com bactérias que apresentam reações positivas (E. coli) e negativas (P. aeruginosa), rotineiramente. 3 Procedimento a) Adicionar duas a três gotas diretamente na colônia bacteriana a ser estada b) Procedimento direto em tira de papel. OBS: Algumas gotas do reagente são adicionadas em papel de filtro ou em discos de tiras de papel comerciais impregnados com reagente seco. Em qualquer dos métodos, utiliza-se alça de platina ou aplicador de madeira impregnada com a colônia suspeita na área do papel de filtro. 4 Interpretação O aparecimento de cor azul-escura no local da inoculação no intervalo de 10 segundos significa que a colônia é positiva para produção de citocromo oxidase. 3-Diferenciação de gêneros e espécies Fonte: Manual Anvisa módulo V (110). Tabela 3 - Provas bioquímicas para identificação dos gêneros de Cocos Grampositivos catalase positivos Gênero Motilidade NaCl 5% Oxidase Bacitracina Tétrade Manitol Staphylococcus Neg + Neg Resist até o variável disco Planococcus + + Neg variável Cresce fermenta Micrococcus Neg + + Sens + Cresce não >=10mm fermenta Stomatococcus Neg Neg Neg variável

144 127 Tabela 4- Identificação das espécies de cocos Gram-positivos catalase positivos Espécies DNAse PYR Novob Uréia Polimixina Outras S.aureus + Neg Sens Variável Resist Pig amarelo S.epidermidis Neg Neg Sens + Resist S.lugdunensis Neg + Sens Variável Variável Ornitina+ S.haemolyticus Neg + Sens Neg Sens Ornitina neg S.saprophyticus Neg Neg Resist + Sens Isolado em urina S.schleiferi Neg + Sens Neg Sens Sacarose neg S.intermedius + + Sens + Sens S. hyicus + Neg Sens Variável resist Identificação das espécies de cocos Gram-positivos catalase positivos Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais os mais freqüentes são: 1- S. epidermidis causador de infecções de cateteres e próteses e o mais freqüente microrganismo encontrado em hemocultura. 2- S. saprophyticus- causador de ITU em mulheres. 3- S. haemolyticus-importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos, pode ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue de carneiro.

145 128 Tabela 5- Esquema para diferenciação de espécies de Cocos Gram-positivos catalase negativa sensíveis a vancomicina Espécie Hemólise Bacitracina Optoquina SXT NaCl Bile CAMP 6,5% esculina S. pneumoniae α- hemólise Variável Sens Sens S. pyogenes β- hemólise Sens Resist Resist S. agalactiae Gama Novobiocina - hemólise sensível Enterococcus gama ou α- hemólise Resist Resist Resist Resist Resist Resist Grupo Viridans α- hemólise S. bovis Gama ou α- hemólise PYR Test Fonte: PROBAC DO BRASIL Indicações: Baseado na hidrólise enzimática da L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide, o PYR TEST destina-se à identificação dos Streptococcus spp, Staphylococcus spp e bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose. A hidrólise do L-pyrrolidonyl-beta-naphtylamide através da enzima L-pyroglutamylaminopeptidase é verificada através da reação do PYR Reagente com a betanaphtylamide livre, que forma uma Base de Schiff de coloração vermelha. Procedimento: 1-Com o auxílio de uma pinça previamente flambada, retirar um disco de PYR do frasco.

146 129 2-Utilizando uma pipeta ou um frasco conta-gotas, impregnar o disco de PYR com água destilada estéril ou água de torneira* Depositá-lo sobre uma lâmina ou placa de Petri. 3-Com o auxílio de uma alça previamente flambada, faça um esfregaço da bactéria recém isolada a ser identificada no disco de PYR umedecido. 4-Aguardar 5 minutos, a temperatura ambiente, e colocar uma gota do PYR reagente. As reações positivas ocorrem em até 1 minuto. * O uso de salina torna a reação mais lenta e menos intensa. Leitura: PYR positivo: O desenvolvimento de uma cor vermelho-cereja indica resultado positivo. PYR negativo: Uma coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo. Observação: Dos Streptococcus spp (cocos Gram positivos, catalase negativa) o Streptococcus pyogenes e o Enterococcus spp são PYR positivo. Nos casos de amigdalite bacteriana, com isolamento de estreptococos beta hemolíticos a prova rápida de PYR é extremamente útil para o diagnóstico do S.pyogenes e o tratamento precoce do paciente. Precauções: Após leitura os discos devem ser descartados conforme as recomendações vigentes para resíduos de serviços de saúde. Apresentação: Caixa com 24 discos de PYR e 1 frasco com 2 ml de PYR Reagente. Conservação: Manter em geladeira (2º a 8º C), ao abrigo da luz. Validade: 3 meses.

147 130 Protocolo para Identificação de Bastonetes Gram-negativos Principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica ENTEROKIT B Fonte: PROBAC DO BRASIL 1. Fermentação da glicose 2. Fermentação da lactose 3. Motilidade 4. Utilização de citrato 5. Descarboxilação da lisina 6. Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) 7. Produção de gás (CO2) 8. Oxidase 9. Produção de indol 10. Produção de urease 11. Produção de fenilalanina desaminase ou opção triptofanase 12. Produção de gelatinase ou opção DNAse Provas complementares de Identificação 1- Fermentação de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. 2- Utilização de aminoácidos: arginina e ornitina 3-Hidrólise da esculina, etc. 4- ONPG 5-Utilização de acetato 6-Provas úteis, mas pouco utilizadas: vermelho de metila, voges-proskauer, crescimento em KCN, tartarato de jordan e lipase. Os esquemas de identificação baseiam-se na determinação dos gêneros e espécies mais isolados na clínica, e nas provas mais características de cada gênero

148 131 e espécie, baseado em alguns critérios como: facilidade de execução, facilidade de interpretação, custo, rapidez para leitura, etc. ENTEROKIT B Fonte: PROBAC DO BRASIL Indicações: O Enterokit B consiste dos seguintes meios: EPM, MILi e Citrato de Simmons. O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás em glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação do triptofano. O meio MlLi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina. O Citrato de Simmons oferece o teste de utilização do citrato como única fonte de carbono. Os três meios totalizam 8 testes que somados ao da fermentação da lactose na placa de isolamento, permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas de espécimes clínicos. Procedimento: 1-Tocar a colônia com agulha de platina e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MlLi. 2-Para inocular o meio de Citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superfície inclinada. No meio 3-EPM introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo. 4-Incubar o Enterokit a 35 C ± 2 C com as tampas semi-rosqueadas e fazer a leitura após 18 horas a 24 horas. Leitura e interpretação: 1. Meio EPM Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo. Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade. Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não.

149 132 Desaminação do triptofano (LTD): Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do meio. 2. Meio MlLi Motilidade (MOT): A bactéria móvel cresce além da linha de picada. A imóvel somente nesta linha. Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo. Produção de indol: Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs à superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo mantém sua cor inalterada. 3. Meio Citrato de Simmons A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofre alteração. Precauções: Após o uso, o produto deverá ser descartado conforme as recomendações vigentes para resíduos de serviços de saúde. Apresentação: Caixa com 16 conjuntos e um frasco de Reativo de Kovacs. Conservação: Manter em temperatura ambiente entre 10º e 25ºC (local fresco). Validade: 6 meses.

150 133 Tabela 6- Identificação de gênero e espécie bacteriana NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA 000 Shigella 004 Shigella spp - Yersinia enterocolitica - Escherichia coli 006 Escherichia coli 011 Citrobacter freundii 012 Hafnia alvei 013 Serratia marcescens - Hafnia alvei 014 Escherichia coli 015 Citrobacter diversus 016 Escherichia coli 035 Providencia stuartii - Providencia alcalifaciens 040 Yersinia pseudotuberculosis - Yersinia enterocolitica 044 Yersinia enterocolitica 051 Citrobacter freundi 053 Serratia marcescens 055 Citrobacter diversus 070 Proteus penneri 074 Morganella morganii 075 Providencia stuartii - Providencia rettgerii 111 Citrobacter freundii 112 Salmonella Typhi 113 Salmonella spp 151 Citrobacter freundii 170 Proteus mirabilis - Proteus penneri 171 Proteus mirabilis 174 Proteus vulgaris 175 Proteus vulgaris 202 Hafnia alvei 204 Escherichia coli 206 Escherichia coli 210 Salmonella Paratyphi A - Serratia liquefaciens 211 Citrobacter freundii - Serratia liquefaciens 212 Hafnia alvei - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens 213 Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens 214 Escherichia coli

151 134 Tabela 6- Identificação de gênero e espécie bacteriana NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA 215 Citrobacter diversus 216 Escherichia coli 235 Providencia alcalifaciens 251 Citrobacter freundii 253 Serratia marcescens 255 Citrobacter diversus 270 Proteus penneri 274 Morganella morganii 310 Salmonella Paratyph A 311 Citrobacter freundii 312 Salmonella Choleraesuis 313 Salmonella Choleraesuis - Salmonella spp 316 Edwardsiella tarda 351 Citrobacter freundii 370 Proteus mirabillis - Proteus penneri 371 Proteus mirabillis 374 Proteus vulgaris 375 Proteus vulgaris 404 Escherichia coli 406 Escherichia coli 410 Serratia liquefaciens 411 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp 412 Serratia liquefaciens 413 Serratia sp. 414 Escherichia coli 415 Citrobacter diversus 416 Escherichia coli 417 Serratia odorífera 443 Klebsiella pneumoniae 447 Klebsiella oxytoca 451 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae 455 Citrobacter diversus 511 Citrobacter freundii 551 Citrobacter freundii

152 135 Tabela 6- Identificação de gênero e espécie bacteriana NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA 604 Escherichia coli 606 Escherichia coli 607 Klebsiella oxytoca 610 Serratia liquefaciens 611 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp 612 Serratia liquefaciens 613 Enterobacter aerogenes - Serratia SP 614 Escherichia coli 615 Citrobacter diversusi 616 Escherichia coli 643 Klebsiella pneumoniae 647 Klebsiella oxytoca 651 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae 655 Citrobacter diversus 711 Citrobacter freundii 751 Citrobacter freundii Referências bibliográficas: 1. Ewing, W. H., Edwards and Ewing s Identification of Enterobacteriaceae, 4th edition. Elsevier Science Publishing Co., Inc., N. York. 2. Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., EPM - Uma modificação do meio de Rugai e Araújo, para a realização simultânea dos testes de produção de gás a partir de glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol., 13: Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., MILi - Um meio para a realização dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol., 13: Farmer III, J. J. e cols Biochemical Identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol., 21:

153 136 ENTEROKIT C Fonte: PROBAC DO BRASIL Indicações: O ENTEROKIT C consiste nos testes de descarboxilação da lisina, arginina e ornitina (base Moeller), fermentação de adonitol e arabinose e liquefação da gelatina. Sua finalidade principal é complementar o Enterokit B na identificação das espécies mais importantes de Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia. Assim todas as vezes que o Enterokit B não identificar o microrganismo com precisão, recorre-se ao Enterokit C. A soma dos testes do Enterokit B e C permite diagnosticar com segurança as espécies mais importantes de Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia. O Enterokit C também é extremamente útil na identificação de amostras atípicas pertencentes aos outros gêneros de enterobactéria. Composição/Conjunto: Meios Descarboxilase de Moeller: Controle, Lisina, Arginina e Ornitina...4 ml/tubo Meio de Adonitol...4 ml/tubo Meio de Arabinose... 4 ml/tubo Meio de Gelatina... 1 fita/tubo Procedimento: 1-Inocular os meios de Moeller (lisina, arginina, ornitina e controle) da maneira usual, e os meios de adonitol e arabinose por picada central, introduzindo a agulha até o fundo do tubo 2-Pingar 10 gotas de salina estéril, no tubo identificado como Gelatina, com o auxílio do conta gotas, que acompanha o produto. 3-Com o auxílio de uma alça, turvar a salina (inóculo pesado). 4-Incubar a 35º ± 2 C durante 24 a 48 hs.

154 137 Leitura e interpretação: Descarboxilação de lisina, arginina e ornitina: quando positiva, o meio adquire cor púrpura discreta ou intensa; se negativa, a cor do meio permanece inalterada. Fermentação de adonitol e arabinose: quando positiva, o meio se torna rosa discreto ou intenso; se negativa, a cor do meio permanece inalterada. Liquefação da gelatina: Gelatinase +: utilização da gelatina impregnada na fita, com alteração da cor cinzaesverdeada opaca para azul transparente. Gelatinase -: a cor da fita de gelatina permanece inalterada. Na tabela, são apresentadas as características das principais espécies de enterobactérias. Apresentação: Caixa com 6 conjuntos. Conservação: Manter em temperatura ambiente (entre 10 e 25 C) Validade: 6 meses. Tabela 7- Diferenciação das enterobactérias pelo Enterokit C Bactérias % de Amostras positivas Enterob. Lisina Argin. Ornitina Gelat. Adon. Arabinose E. coli Shigella sp S. sonnei E. tarda Salmonella sp S. typhi S. paratyphi A C. freundii C. diversus K. pneumoniae K. oxytoca E. aerogenes E. cloacae

155 138 Tabela 7- Diferenciação das enterobactérias pelo Enterokit C Bactérias % de Amostras positivas Enterob. Lisina Argin. Ornitina Gelat. Adon. Arabinose Hafnia alvei S. marcescenes P. mirabilis P. vulgaris P. rettgeri P. stuartii P. alcalifaciens M. morganii Y. enterocolitica Y. pestis Y. pseudotuberculosis

156 139 EPM-MILi Fonte: PROBAC DO BRASIL Indicações: Identificação bioquímica das bactérias da Família Enterobacteriaceae. Composição: Meio EPM: Este meio é uma modificação do meio de Rugai e Araújo e contém os seguintes testes: produção de gás por fermentação de glicose, produção de H2S, hidrólise de uréia e desaminação do triptofano. Meio MILi: Este meio é utilizado para avaliar a motilidade, produção de indol e descarboxilação da lisina. Os sete testes, quando considerados com os resultados da reação de fermentação da lactose observada nas placas de isolamento (lactose positiva ou negativa), permitem identificar presuntivamente as seguintes enterobactérias: Shigella, Salmonella, E. coli e Y.enterocolitica. Procedimento: 1. Semeadura Tocar com agulha de platina uma colônia bem isolada e inocular os 2 meios com o mesmo inóculo. Para inocular o meio EPM, introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio. A inoculação do MILi deve ser feita por picada central, introduzindo a agulha até o fundo do tubo. Incubar entre 35 C a 37 C com as tampas semi-rosqueadas e fazer a leitura após 18 a 24 horas. 2. Leitura e interpretação Meio EPM Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio do fundo do tubo. Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.

157 140 Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não. Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do meio. Quando a reação é negativa a superfície do meio adquire cor azul ou raramente amarela. Meio MILi Motilidade: A bactéria móvel cresce além da picada turvando parcial ou totalmente o meio. A bactéria imóvel cresce somente na picada. Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada, o meio adquire cor púrpura. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarela nítida nos seus 2/3 inferiores. Produção do indol: Após leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4 gotas do Reativo de Kovacs a superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo mantém sua cor inalterada. A tabela mostra as características dos enteropatógenos nos meios EPM e MILi, bem como os resultados da reação de fermentação da lactose observados nos meios de isolamento (lactose positiva ou negativa). A identificação complementar destas bactérias pode ser feita por meio de testes de aglutinação em lâmina com anti-soros correspondentes a cada um deles (ver linha de soros Probac do Brasil). Precauções: Após o uso o produto deverá ser descartado seguindo-se as normas vigentes de resíduos de serviços de saúde. Não utilizar o produto em caso de turvação do meio líquido ou na presença de outros sinais de contaminação. Conservação: Manter em temperatura ambiente entre 10 a 25 C (local fresco).

158 141 Validade: 6 meses. Tabela 8- Características dos enteropatógenos da família Enterobacteriaceae nos meios EPM-MILi. Lactose Meio EPM Meio MILi (placa de isolamento) Aspecto Geral Gás H 2 S U LTD Mot I Lis Shigella dysenteriae B/Am e S/Az - flexneri Au/b(a) e Au/e - a /- - boydii Shigella B/Am e S/Az - sonnei Au/b e Au/e E.coli B/Am e S/Az +/- invasora AP/b e Au/e +/ E.coli B/Am e S/Az + outras G/b e Au/e +/ Salmonella -b B/Am e S/Az P/b e P/e Yersinia B/Am e S/Az enterocoliti - Au/b e Au/e ca /+ - U: urease, LTD: L-triptofano desaminase, Mot: motilidade, I: indol, Lis: lisina, B/Am: Base Amarela, Au/b: Ausência de bolhas de gás, Au/e: Ausência de enegrecimento, B/Az: Base Azul, P/b: Presença de bolhas de gás, P/e: Presença de enegrecimento, S/Az: Superfície Azul, G/b: Geralmente com bolhas de gás e AP/b: Ausência ou presença de bolhas de gás a) Alguns sorotipos de Shigella flexneri e Shigella boydii produzem gás. b) A Salmonella Typhimurium lactose + é raramente isolada atualmente. Referências bibliográficas: 1. Almeida, P. C. A. & Trabulsi, L. R. - Características culturais, bioquímicas, sorológicas e virulência de amostras de Salmonella typhimurium fermentadoras de lactose. Rev. Microbiol., 5:27-35, Edwards, P. R. & Ewing, W. H. - Identification of Enterobacteriaceae Burgess Publishing Company, Minneapolis, Minnesota, 1972.

159 Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., MILi - Um meio para a realização dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol., 13: Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., EPM - Uma modificação do meio de Rugai e Araújo, para a realização simultânea dos testes de produção de gás a partir de glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol., 13:

160 143 KIT NF Fonte: PROBAC DO BRASIL Indicações: O KIT NF da PROBAC DO BRASIL é constituído pelos testes de oxidase, utilização de glicose em meio base OF, descarboxilação de lisina e arginina (base Moeller), liquefação da gelatina, hidrólise da uréia, DNAse, e sensibilidade a polimixina. Os resultados destes testes permitem identificar a maioria dos bacilos Gram negativos não fermentadores da glicose isolados na rotina laboratorial. Características dos componentes: Meios OF glicose com óleo e sem óleo... 4 ml/tubo. Meios Descarboxilase de Moeller: controle, lisina e arginina...2 ml/tubo. Meio de Gelatina... 1fita/tubo. Meio DNAse...6 ml/placa. Uréia...3 ml/tubo Polimixina...6 discos/frasco Fitas para determinação de oxidase...6 fitas/frasco Procedimento: Os testes devem ser realizados a partir de colônias isoladas e puras com 24 horas de crescimento. 1-Oxidase: com auxílio de alça de platina, bastão de vidro ou madeira, faça um esfregaço da colônia na fita de oxidase. -Não utilize qualquer tipo de alça ou bastão que contenha vestígios de ferro, pois este poderá provocar uma reação falso-positiva. -Não utilize colônias de meios com indicadores, pois poderão apresentar resultados falso-positivos. -Meios de cultura: inocular densamente todos os meios do KIT NF, a partir do crescimento bacteriano no meio EPM ou agar inclinado:

161 144 2-OF glicose com óleo e sem óleo: inocular por picada central, introduzindo a agulha até o fundo. -Controle, Lisina e Arginina: inocular com alça ou agulha, depositando o inóculo na parede do tubo, abaixo do óleo mineral. -Gelatina: - pingar 10 gotas de salina estéril, no tubo identificado como GEL, com o auxílio do conta gotas, que acompanha o produto. Com o auxílio de uma alça turvar a salina (inóculo pesado). -Uréia: semear com inóculo denso na superfície do meio. -DNAse: semear 2-3 colônias em spot ( círculo de 0,5 cm de diaâmetro) deixando bastante espaço entre os teste para avaliar a presença de halo. -Polimixina: fazer antibiograma em M.Hinton e colocar o disco. -Incubar os meios de cultura a 37ºC durante h; quando houver dúvidas quanto a interpretação dos testes, reincubar por mais 24 a 48 h e fazer nova leitura. Interpretação do resultado: A) Teste de Oxidase: a leitura é feita em poucos segundos: Oxidase + : o esfregaço bacteriano na fita apresenta coloração rosa intenso, que após alguns segundos pode mudar para preta. Oxidase -: o esfregaço bacteriano não apresenta alteração de cor. A cor rosa intensa aparece rapidamente (15-20 segundos). Após este intervalo, cores: rosa, violeta pálido são falsos positivos. A B. cepacia pode dar reação fraca. B) Tabela 9- Glicose O/F: OF glicose Tubos c/ óleo s/ óleo Oxidação do açúcar (Oxidativo) Inalterado amarelo só na superfície Não utilização do açúcar (Inerte ou alcalino) 1 Inalterado inalterado ou azulado Fermentação da glicose (Fermentador ou Ácido) 2 amarelo amarelo 1. Aguardar no mínimo 72 h para definir como inerte, pois pode ocorrer a oxidação tardia ou lenta. 2. Quando a bactéria fermenta a glicose, não pode ser identificada pelo KIT NF II. Deve ser repicada em ENTEROKIT B para diagnóstico.

162 145 C) Descarboxilação de aminoácidos: Lisina e Arginina: -Cor púrpura do meio mais acentuado que a do tubo controle: utilização do aminoácido. -Cor do meio igual ou mais amarelada que a do tubo controle: não utilização do aminoácido. Se negativo aguardar até 5 dias. Apenas uma prova deve ser positiva, exceto a B.cepacia que pode ser ornitina + e lisina +. D) Gelatina: Gelatinase (+): Utilização da gelatina impregnada na fita, com alteração da cor de cinza metálica para azul transparente. Gelatinase (-): A cor da fita permanece inalterada. Obs: antes de fazer a leitura, agitar suavemente o tubo. E) Uréia: a cor rosa forte aparece em parte do ápice ou em todo o meio após h de incubação: ligeira mudança de cor rósea no ápice que não progride com maior incubação é considerada negativa. A Bordetella bronchiseptica pode dar reação positiva em 4 h. F) DNAse: adicionar ácido clorídrico 1N e aguardar 5 minutos. Observar a presença de halo transparente em volta do inoculo e o restante do meio fica leitoso. Se negativo repetir o teste com leitura em 48 h. Sempre usar uma cepa controle positivo e negativo. G) Polimixina: qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade. Provas adicionais não incluídas: -Crescimento em Mac Conkey: Semear com alça uma colônia isolada o crescimento deverá ocorrer entre 1 e 3 dias. -Motilidade: Se a motilidade em tubo for negativa, recomenda-se a confirmação do resultado com o teste em lâmina. -Teste de motilidade em lâmina: Inocular 2 colônias em um caldo TSB e incubá-lo pó h á 37ºC. Agitar o tubo e com uma pipeta ou alça estéril retirar uma gota e depositar sobre uma lâmina. Sobre a gota depositar uma lamínula e observar com aumento de 400

163 146 vezes. A presença de muitas ou poucas bactérias cruzando o campo é significativa de motilidade positiva. Movimentos vibratórios fracos são considerados negativos. A motilidade deve ser observada em 37º e 20ºC. -Coloração de Gram: Realizar a coloração de Gram para a observação da morfologia bacteriana -Crescimento a 42º C: semear 2 colônias no meio. Incubar a 42º C. A prova será positiva quando ocorrer com a turbidez do meio ou for nítido o aumento da densidade bacteriana. O ideal é comparar com um controle mantido a temperatura ambiente. A interpretação dos resultados obtidos no KIT NF deve ser realizada de acordo com o Sistema Numérico que acompanha o produto. Quando necessário, outros testes podem ser realizados para confirmação do diagnóstico. Apresentação: Caixa com 6 conjuntos. Validade: 6 meses. Conservação: Manter os meios de cultura em temperatura ambiente 10º- 25ºC (local fresco). Manter as Fitas de Oxidase, os discos de polimixina e as placas de DNAse em geladeira (2 a 8º C). Precauções: Após o uso, o produto deverá ser descartado conforme as recomendações vigentes para resíduos de serviços de saúde.

164 147 ESQUEMA NÚMERICO PARA IDENTIFICAÇÃO EM BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS Etapa 1 Fazer as seguintes provas: Oxidase Motilidade O/F Glicose / Controle Crescimento em Mac Conkey Gram Gelatina DNAse Uréia Lisina Arginina Crescimento a 42ºC Teste de sensibilidade a polimixina Tabela 10- Valores das provas de Oxidase e Motilidade VALORES PROVAS Provas positivas Provas negativas Oxidase 4 0 Motilidade 2 0 Somar valores obtidos para as provas de oxidase e motilidade= A Tabela 11- Valores das provas de OF, MC e Morfologia VALORES PROVAS Provas positivas Provas negativas OF Oxidativo=4 Inerte ou alcalino=0 Mac Conkey Crescimento=2 Não crescimento=0 Morfologia (Gram) Bacilo=1 Coco/cocobacilo=0 Somar valores obtidos para as provas de OF glicose + Crescimento em Mac Conkey + Gram= B

165 148 Tabela 12- Valores dos testes bioquímicos Leitura AB C D E 42º C Gel DNA URE LIS ARG PMX * * 01 * * 02 * * 03 * * 06 * * 07 * * 22 * * * 26 * * * * * * 40 * * * 41 * * * * 42 * * * 43 * * * 45 * * * 47 * * * 63 * * * * * 65 * * 67 * * *Campos preenchidos não considerar a leitura da prova Leitura ABCDE Etapa 3 Provas complementares Estas provas poderão ser indicadas para caracterizar alguns não fermentadores ou diferenciar outros cujas provas empregadas apresentaram padrão semelhante. 1. Citrato 2. Crescimento em NaCl 6,5% 3. Esculina 4. Indol 5. PYR Etapa 4 Localizar o número com 5 algarismos obtido e a correspondente identificação na coluna da esquerda.

166 149 A tabela de freqüência mostra para alguns microrganismos a freqüência que o conjunto de provas pode ocorrer. Frequências baixas (<10% ) sugerem necessidade de revisão das provas (p. ex. aguardar mais tempo para interpretar provas negativas ou repetição de todas elas). Números não encontrados sugerem bactéria com padrão não comum, falha de interpretação de uma ou mais provas ou bactéria rara.

167 150 Tabela 13- Identificação de isolados Não fermentadores A B C D E Freq. Provas complementares % Acinetobacter iwofii Citrato negativo Acinetobacter iwofii Citrato negativo A.haemolyticus Citrato negativo A.haemolyticus Citrato positivo A.calcoaceticus Citrato pos. hemólise em Agar sangue pos. A.baumannii Citrato positivo A.baumannii Citrato positivo A.calcoaceticus Citrato positivo A.baumannii Citrato positivo A.baumannii Citrato positivo A.haemolyticus Citrato positivo A.haemolyticus Citrato pos. hemólise em Agar sangue pos. Acinetobacter spp 0 0/1/2/3/ 4/5/6/7 2/0 2/ Citrato pos. hemólise em Agar sangue pos S.maltophilia S.maltophilia P.oryzihabitans B. cepacia P. luteola Esculina pos. e PYR pos P.oryzihabitans Esculina neg. e PYR pos B.cepacia PYR negativo S.maltophilia PYR negativo Moraxella spp Moraxella catarrhalis Moraxella lacunata C.indologenes

168 151 Tabela 13- Identificação de isolados Não fermentadores A B C D E Freq. % Provas complementares C.meningosepticum Moraxella spp M/Ureolytica M.canis C.Indologenes indol pos C.Meningosepticum indol pos S.paucimobilis indol neg Sphingobacterium indol neg Sphingobacterium indol neg C.Indologenes indol pos C.Meningosepticum indol pos Sphingobacterium indol neg Sphingobacterium indol neg C.Indologenes indol pos C.Meningosepticum indol pos A.Denitrificans NaCl 6,5% neg. e PYR pos A.faecalis NaCl 6,5% pos.e PYR neg B. bronchiseptica Uréia pos. ++ e PYR neg. A. Denitrificans Uréia Fraca e PYR pos S. Paucimobilis S. Paucimobilis S. Paucimobilis S. Paucimobilis A. xilosoxidans Esculinaneg., NaCl6,5%neg. S.Paucimobilis Esculina positiva P.Stutzeri B.cepacia A. xilosoxidans Esculina neg.,nacl 6,5% S.paucimobilis Esculina positiva P.stutzeri B.cepacia Esculinaneg., NaCl6,5%pos. P. putida P.aeruginosa NaCl 6,5%=Variável P.mendocina NaCl 6,5%=positiva B.pseudomallei A.Xilosoxidans

169 152 Tabela 13- Identificação de isolados Não fermentadores A B C D E Freq. % Provas complementares B. cepacia A.Xilosoxidans B.cepacia S.paucimobilis Esculina positiva S.putrefaciens H2S pos.,no TSI e Esculina S.Paucimobilis B.cepacia B.cepacia P.fluorescens P.aeruginosa B. pseudomallei B. cepacia B. cepacia S. putrefaciens H2S positivo no TSI S. putrefaciens H2S positivo no TSI S. putrefaciens H2S positivo no TSI Tabela 14- Valores das provas bioquímicas Colônias com Pigmento rosa Microrganismo A B C D E Microrganismo Methylobacterium spp Roseomonas spp 6/4/2/0 5/ /4/2/0 7/6/3/ Coral e seca Rosada e mucóide

170 153 Penicillin-binding protein (PBP2 ) Teste de Aglutinação em Látex Fonte: Kit PBP 2 - Oxoid Brasil Introdução Este teste é um ensaio de aglutinação rápida em látex, para a detecção de PBP2 (também chamado de PBP2a), em Staphylococcus spp. Isolados, como uma ajuda a identificação de Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) e Staphylococcus coagulase negativa meticilina resistente. Princípio do teste Os Staphylococcus spp. são a principal causa de infecções nosocomiais e de infecções comunitárias adquiridas no mundo. Em muitas instituições aproximadamente 25% a 50% das cepas de S. aureus e 75% das cepas de Staphylococcus coagulase (CoNS) são resistentes a meticilina. Os MRSA podem ser vistos como um problema particular pela facilidade com que certas cepas epidêmicas se difundem e colonizam pacientes debilitados. O tratamento de cepas sensíveis com penicilinas resistentes a penicilinase (PRP) é recomendável, uma vez que as drogas ß-lactâmicas são facilmente absorvidas pelos líquidos corpóreos e tecidos, causam menores complicações durante o tratamento e não selecionam os organismos vancomicina-resistentes. A identificação segura de meticilina resistente é, portanto importante. Cepas de S. aureus com reduzida sensibilidade para PRP estão divididas nas seguintes categorias: (I) (II) (III) S. aureus meticilina resistente (MRSA), que possui uma baixa afinidade a proteína de ligação à penicilina PBP2, codificada pelo gen meca; S. aureus bordeline meticilina resistente (BORSA), geralmente assim considerado por possuir ums hiperprodução de beta lactamase tipo A; e Cepas com PBPs modificado devido à capacidade de alteração da penicilina binding ou a hiperprodução de PBPs (MODSA). MODSA são raramente isolados e sua resposta clínica à terapia aos beta-lactâmicos não tem sido bem estudada. Desse modo, para propostas clínicas, com

171 154 raras exceções, a presença de PBP2 é responsável pela meticilina resistência nos tratamentos de infecções com S. aureus e CoNS. O fenótipo de meticilina resistente pode ser altamente heterogêneo, dificultando a detecção pelos métodos convencionais dos testes de sensibilidade a antimicrobianos, como a concentração mínima inibitória (MIC) ou a triagem em disco e Agar. A precisão deste método é afetada pelo tamanho do inoculo, tempo e temperatura de incubação, meio, ph, concentração de sal e outros fatores. Em adição, estes métodos de cultura requerem 24 horas de incubação para resultados precisos. CoNS com freqüência produzem os mais baixos níveis de PBP2 e requerem indução por exposição de um PRPS para produzir suficiente produto a ser detectado. A detecção do gen meca, tem sido considerado o padrão ( gold standard ) para a determinação de meticilina resistente devido a sua precisão, mas o método é extremamente trabalhoso e de alto custo. O teste de Látex Oxoid PBP2 possui a vantagem de detectar diretamente a proteína do PBP2 num tempo rápido e com o mínimo de trabalho. O teste tem potencial para ser até mais preciso que a detecção pelo gen meca, uma vez que resultados falso positivos não ocorrem com cepas que apresentam meca, mas são incapazes de produzir o produto de proteína do gene. Em adição, o teste não detecta cepas que são hiperprodutoras de beta lactamase ou PBPs. O teste Oxoid PBP2 foi previamente avaliado mundialmente, demonstrando possuir uma alta sensibilidade e especificidade. Partículas de látex sensibilizadas com anticorpo monoclonal contra PBP2 reagem especificamente com os Staphylococcus meticilina resistentes causando aglutinação visível a olho nu. Componentes do kit - DR901 Látex Teste sensibilizado com anticorpo monoclonal contra PBP2. - DR902 Látex Controle sensibilizado com anticorpo monoclonal da mesma subclasse de IgG mostrando não reatividade com as proteínas de S. aureus. - DR903 Reagente de Extração 1 - DR904 Regente de Extração 2 Cartões de Teste Bastões homogenizadores Folheto de instrução

172 155 Materiais necessários, mas não fornecidos - Micropipetas e ponteiras (50µl) - Alças microbiológicas (5µl/1µl) - Banho-maria ou banho aquecido - Centrífuga (1500 x g) - Tubos de microcentrífuga (tampa de segurança) - Desinfetante apropriado para laboratório Precauções Este produto se destina exclusivamente ao uso diagnóstico in vitro. O tempo de aquecimento deve ser de três minutos. Aquecimento por mais de cinco minutos pode causar diminuição da sensibilidade. Aquecimento somente por um minuto ou menos, pode causar uma aglutinação não específica. Ao remover o sobrenadante a ser utilizado pelo teste após a centrifugação, retirara a pipeta cuidadosamente para evitar que o material sólido do fundo do tubo não seja aspirado. A utilização de material sólido pode causar aglutinação não específica. Misturar bem os reagentes (Látex) antes se sua utilização, para a obtenção de uma suspensão homogênea. Os reagentes contém como preservante azida sódica a 0,095%. A azida sódica é tóxica e pode reagir com encanamentos de chumbo ou cobre produzindo metais de azida que são explosivos por contato. Para prevenir o acúmulo de azida nos encanamentos, lavar abundantemente com água imediatamente após despejar os reagentes no esgoto. Como as amostras podem conter organismos patogênicos, manipular utilizando precauções apropriadas. Os procedimentos de extração podem não matar as bactérias; portanto a extração deve ser realizada segundo as mesmas precauções. Os reagentes de extração 1 e 2 contém uma leve solução irritante e um fraco ácido. Evitar contato direto através do uso de equipamentos de proteção convenientes. Caso o material entrar em contato com a pele, membranas mucosas ou olhos, lavar imediatamente o local com água em abundância. Armazenagem Armazenar o kit entre 2 e 8 C. Nestas condições os reagentes manterão sua

173 156 atividade até a data de validade mostrada na caixa. Procedimento para controles Para cada novo lote do kit e semanalmente, os seguintes procedimentos para controle deverão ser realizados. 1. Controle Positivo Utilizar uma cepa MRSA conhecida como ATCC (Culti-Loops Oxoid C9022L). Seguir o método informado no procedimento do teste. Assegurar que a aglutinação ocorra dentro de 3 minutos. 2. Controle Negativo Utilizar uma cepa conhecida de Staphylococcus aureus Meticilina Sensível (MRSA) como a ATCC ou ATCC (Culti-Loops Oxoid C7010L ou C7011L). Seguir o método informado no procedimento do teste. Assegurar que a aglutinação não ocorra dentro de 3 minutos. Não utilizar o teste se as reações observadas com os organismos controles estiverem incorretas. 3. Não utilizar o kit após a data de validade. Importante nota de procedimento Não encostar o conta gotas no cartão de teste onde se encontra a amostra para evitar a contaminação dos reagentes. Assegurar que as tampas dos reagentes estejam fechadas após a sua utilização evitando assim uma contaminação ou ressecamento dos mesmos. Após o uso, retornar o kit ao refrigerador assegurando que os frascos estejam na posição correta. Preparação da cultura As colônias poderão ser testadas a partir dos seguintes meios de cultura: Tryptone Soya Agar (TSA) com 55 de sangue de carneiro, Muller-Hinton Agar. O uso de culturas recentes (18 A 24 hs) é recomendado. Entretanto, para garantir crescimento suficiente, culturas com crescimento entre 24 e 48 horas poderão ser testadas se necessário. O desempenho verificado nos dados constantes nesta bula foi gerado utilizando estes meios como parte do processo submetido ao FDA (North American Food and Drugs Administration). Os dados demonstram que o teste também é efetivo com colônias de S. aureus provenientes de Tryptone Soya Agar e

174 157 Columbia Agar com 5% de sangue de cavalo, Iso-Sensitest Agar e DSTA. Estes meios são comumente utilizados na Europa, mas não nos EUA, e, portanto, não foram utilizados nos testes que geram os dados mostrados na seção Características de Desempenho. Requisito especial O teste PBP2 deve ser realizado somente com as espécies de Staphylococcus spp. (cocos Gram positivos). O teste de coagulase ou equivalente deve ser realizado para determinar se as cepas isoladas são Staphylococcus aureus ou outras espécies de estafilococos. Preparação para inoculo Para os Staphylococcus aureus, o teste pode ser realizado a partir de colônias em placa de isolamento primário, se o crescimento for suficiente, ou a partir de subculturas do isolado. Outras espécies de bactérias não devem estar presentes na placa para não interferir no teste. Para Staphylococcus coagulase negativa, uma indução é necessária para a produção de PBP2 suficiente. 1. Preparar uma suspensão em caldo do microrganismo no padrão da escala de McFarland 1 e semear em uma placa de TSA com sangue, Columbia Sangue Agar ou Mueller-Hinton Agar. Alternativamente inocular a placa de ágar com várias colônias e semear em quatro quadrantes. 2. Colocar um disco de oxacilina (1µg/ml) sobre o microrganismo semeado ou no principal quadrante inoculado. 3. Incubar a 37 C por não menos de 24hs e não mais de 48hs. Cuidado: Para evitar resultados falsos negativos, não realizar o teste se não houver inóculo suficiente disponível.

175 158 Método do teste Procedimento de Extração do PBP2 1. Adicionar 4 gotas do Reagente 1 em um tudo de microcentrífuga. 2. Aproximadamente 1.5 x 10 9 (3-5 µl) células devem ser testadas. Isto pode ser conseguido usando uma alça estéril de 5µl para remover suficiente quantidade de células e completar o diâmetro interno da alça. Alternativamente, uma alça estéril de 1 µl pode ser utilizada para remover várias colônias num tamanho equivalente de 1 µl ou 1mm de altura cobrindo todo o diâmetro caso grumos estejam presentes. Uma suspensão muito turva deve ser observada. 3. Colocar o tubo em um Banho-Maria ou em um bloco aquecido (SUPERIOR A 95 C) e aquecer Por 3 minutos. 4. Retirar o tubo de microcentrífuga e deixar atingir a temperatura ambiente. 5. Adicionar 1 gota do Reagente 2 no tubo e misturar. 6. Centrifugar a 1500 x g por 5 minutos, ou seja, rpm para um raio de rotação de 15 cm ou 4500rpm para um raio de rotação de 4,5cm. Utilizar o sobrenadante para o teste. Procedimento de aglutinação em Látex 1. Para cada sobrenadante a ser testado, utilizar um círculo do cartão de teste para testar com o Látex Reagente e outro para testar com Látex Controle. 2. Homogenizar os reagentes de Látex por inversão por várias vezes, e adicionar uma gota de Látex Teste ou Látex Controle em cada um dos círculos. 3. Colocar 50µl do sobrenadante no círculo teste e no círculo controle, com cuidado para evitar a formação de bolhas. Misturar o látex e o sobrenadante em cada círculo utilizando os bastões homogenizadores. 4. Imprimir ao cartão teste movimentos rotatórios por três minutos e observar a aglutinação sob condições normais de luminosidade. Anotar os resultados observados no teste e controle.

176 Descartar o cartão teste com segurança em recipiente contendo solução desinfetante ou em descarte de materiais infecciosos. Tabela 15 - Leitura e interpretação dos resultados da PBP 2a Aglutinação verificada com Látex teste, mas não com o Látex controle em 3 minutos Nenhuma aglutinação verificada com o Látex Teste em 3 minutos Aglutinação verificada com o Látex Controle em 3 minutos Aglutinação verificada com Látex teste, mas não com o Látex controle em 3 minutos PBP2 Positivo (MRSA) PBP2 Negativo (MRSA) Indeterminado PBP2 Positivo (MRSA) Tabela 16- Tipos de reação de aglutinação Negativa (-) Uma suspensão de partículas homogênea sem grupos visíveis. Fracamente Positiva (+) Fortemente Positiva (+) Grupos pequenos, mas definidos contra o fundo turvo Grupos grandes e pequenos contra um fundo ligeiramente turvo ou grandes grumos contra um fundo muito claro Obs: Ocasionalmente, reações negativas podem apresentar uma aparência granular fina ou reações podem ser observadas. Nestes casos, a visualização do fundo pode ser utilizada para interpretar o resultado. Um fundo opaco indica um resultado negativo e um fundo claro pode ser interpretado como resultado positivo. Limitações Resultados indeterminados devem ser retestados com um material extraído recentemente. Se, sob reteste o resultado se mantiver indeterminado, a resistência a meticilina deverá ser determinada por outro método. Resultados falsos negativos podem ocorrer se for utilizado no teste material

177 160 insuficiente. Neste caso, o teste deverá ser repetido com a quantidade suficiente de material. Verdadeiros resultados positivos geralmente apresentam fortes reações. Reações falso positivas ocorrem raramente, e são limitadas geralmente a fracas reações. Estes resultados podem ser verificados por retestes em culturas recentes. Staphylococcus aureus hiperprodutores de PBP ou chamados de S. aureus modificados (MODSA) e cepas S. aureus bordeline resistente (BORSA) não possuel PBP2 e não se espera reação neste teste. Cepas de alguns microrganismos podem ter baixo nível de meticilina resistência ou em raros caos, produzirem PBP2 em baixas quantidades e apresentarem resultados falsos negativos. Devido às limitações de sensibilidade e especificidade dos testes de sensibilidade para Staphylococcus coagulase negativa, determinados pelo NCCLS, particularmente para outras cepas que não o Staphylococcus epidermidis, os resultados do ensaio de PBP2 não devem concordar com os resultados dos testes de sensibilidade. Cepas com MICs > 4 g/ml de resistentes, apesar do resultado no teste de PBP2. Características de Desempenho O teste de aglutinação em látex Oxid Penicillin-Binding protein foi avaliado em 4 laboratórios geograficamente diversos com isolados clínicos frescos de S. aureus. 201 isolados foram testados com os métodos do NCCLS e com o teste Oxid PBP2 para cada três meios. Uma fraca reação falso positiva (negativa na repetição) em TSA com sangue foi encontrada no látex Oxoid. Todas as reações positivas foram fortes, exceto três reações fracas (mas positivas) com ágar Mueller-Hinton.

178 161 Tabela 17- Resultados do teste com 201 isolados clínicos frescos de S. aureus de quatro laboratórios NÚMERO TESTADO MRSA BORSA A MSSA Crescimento com Agar Sal Oxacilina MIC > 4g/ml NCCSL Látex positivo com TSA Sangue Látex positivo com Columbia Sangue Látex positivo com Mueller- Hinton (1) a 68(3) a A MICs foram de 2mg/ml e meca foi negativo a Número de fracas reações mostradas em parênteses 2. Teste de desafio de cepas de S. aureus em três áreas geograficamente distintas Três laboratórios examinaram cada um, uma série previamente coletada de cepas de S. aureus para desafio e compararam o resultado do PBP2 com os resultados dos métodos determinados pelo NCCLS para os MRSA. Um total de 774 cepas foram testadas utilizando TSA com sangue. A sensibilidade encontrada no teste Oxid PBP2 foi de 98,5% e a especificidade foi de 100%. As sensibilidades encontradas nos métodos de triagem em ágar e MIC foram de 98,7% e 99,2% e as especificidades foram de 90,0% e 88,7%. Duas cepas de MODSA foram também testadas separadamente, ambas tiveram resultados negativos com o teste de Látex. 3. Teste de Staphylococcus coagulase negativa Dois laboratórios testaram Staphylococcus coagulase negativa pelo PBP2 após a indução com os discos de oxacilina. Um laboratório testou 115 cepas resistentes a meticilina e 45 cepas sensíveis a meticilina, incluindo 58 isolados clínicos recentes. A sensibilidade foi de 96,5% para os testes utilizando TSA com sangue e 95,6% utilizando o Mueller-Hinton Agar.

179 162 A especificidade foi de 100% utilizando TSA com sangue e 98% utilizando o Mueller-Hinton Agar. A obtenção de um bom inóculo foi mais difícil com Mueller- Hinton Agar. O segundo laboratório testou 212 cepas de meticilina resistente e 203 cepas de meticilina sensível obtendo uma sensibilidade de 99,5% e uma especificidade de 99,5% utilizando o inóculo crescido em Columbia Agar. 4. Reprodutibilidade Dez diferentes cepas bem caracterizadas de Staphylococcus aureus (3MRSA, 3MSSA, 3 BORSA e MODSA) foram enviadas a três laboratórios geograficamente diversos com cada cepa submetida por 5 vezes em códigos cegos. Todos os 150 resultados obtidos concordaram com os resultados esperados com 100% de reprodutividade. As três cepas meca positivas foram positivas todas as vezes que foram testadas (45/45 testes). As três cepas MSSA e as três cepas BORSA apresentaram resultados negativos toda vez que o teste foi realizado (90/90 testes). A MODSA obteve um MIC de 16µg/ml para a oxacilina e um resultado negativo no Oxoid Latex Teste, como esperado, toda vez que os teste foi realizado (15/15 testes).

180 163 Teste de suscetibilidade pelo método ETEST Fonte: Etest- PROBAC DO BRASIL 1 - Utilização O Etest é uma técnica quantitativa, que permite a determinação da concentração mínima inibitória (MIC) dos agentes antimicrobianos e a detecção dos mecanismos de resistência para uma variedade de microrganismos. 2 - Fundamento O Etest consiste numa tira de plástico inerte, não poroso (5 x 57 mm). A superfície superior da tira contém uma escala que expressa a CMI em μg/ml e o código identificador do agente antimicrobiano ou reagente (figura 1). Na superfície inferior da tira está um gradiente de concentrações, correspondentes a 15 diluições duplas, do antibiótico pré-definido baseado no método convencional para a determinação da MIC. Quando a tira de Etest é aplicada à superfície, previamente inoculada, do meio, o gradiente do antimicrobiano e imediatamente transferido para a matriz da gelose. O gradiente contínuo de concentrações, estabelecido ao longo da tira, mantém-se estável durante um longo período de tempo, cobrindo os tempos críticos para uma grande variedade de microrganismos. Após 24 horas ou mais de incubação, forma-se uma elipse de inibição, simétrica e centrada ao longo da tira. O ponto de intercepção da elipse com a tira corresponde ao valor da MIC em μg/ml, que é lido diretamente na escala e posteriormente relacionado à tabela padrão para indises de resistência, sensibilidade reduzida ou sensibilidade. 3 - Conservação A embalagem selada deve ser conservada, de acordo com as condições especificadas na carteira de folha de alumínio até à expiração do prazo de validade. As tiras Etest que permanecem numa embalagem aberta, devem ser mantidas secas, conservadas num contentor estanque ao ar ou num tubo de conservação com dessecante ou re-selando a carteira com uma mola e utilizá-la até à expiração

181 164 do prazo de validade. Quando não estão em utilização, as tiras Etest devem ser protegidas da humidade e da luz. 4 Manipulação A menos que seja conservada numa sala de temperatura controlada (18 a 22 C), a embalagem deve atingir a temperatura ambiente antes de ser aberta. Abra a carteira de folha de alumínio e retire as tiras manualmente com os dedos, pinça ou com aplicador específico. Não toque no lado da tira, que tem os reagentes, isto é, no lado oposto da escala MIC. 5 Método Meio de cultura Seleccione os suplementos adequados ao microrganismo a ser ensaiado. Assegure-se que o meio cumpre as especificações do controlo de qualidade, profundidade da gelose de 4.0 ± 0.5 mm. Preparação do Inóculo Emulsione várias colónias isoladas, a partir de uma cultura pura overnight, para um meio de suspensão adequado. Os organismos fastidiosos devem ser suspensos num caldo e utilizados no período de 15 minutos. Compare a turvação com o padrão McFarland adequado. Inoculação Mergulhe uma zaragatoa de algodão estéril na suspensão de inóculo e pressione contra a parede interna do tubo, para remover o excesso de líquido. Espalhe cuidadosamente em toda a superfície do meio gelosado, em três direcções, também pode ser utilizado o Retro C80 (inoculador rotativo). Para testes com antifúngicos, abra 2 sulcos na placa, mergulhando a ansa no inoculo, entre eles. Deixe que o excesso de humidade seja completamente absorvido e que a superfície esteja completamente seca, antes de aplicar as tiras Etest.

182 165 Aplicação das tiras Aplique a tira de Etest à superfície do meio de cultura com a escala de CMI de frente e virada para cima (para a abertura da placa). Tal pode ser feito com pinça, com um aplicador manual, Nema C88 (caneta de vácuo) ou Simplex C76 (aplicador automático). Assegure-se que a tira fica totalmente em contacto com a superfície do meio de cultura e sem bolhas de ar. Uma vez aplicada, não remova a tira (figura 2). Incubação As placas são colocadas na estufa de incubação, na posição invertida (com a tampa para baixo); as temperaturas e os tempos de incubação são aplicados de acordo com os microrganismos em estudo. Leitura O valor de MIC é lido no ponto onde a elipse de inibição intersecta a tira. No endereço estão disponíveis vários padrões de crescimento/inibição para diferentes microrganismos, assim como oprocedimento correto para a leitura dos resultados. Figura 1 Figura 2 Figura 1 e 2 Imagem da fita de E-teste para ESBL com a escala em MIC aplicadas no meio de cultura. Fonte: AB Bidisk

183 166 Teste de Suscetibilidade pelo método Eteste para confirmação in vitro de ESBL cefotaxime/cefotaxime + clavulanic acid ceftazidime/ceftazidime + clavulanic acid Fonte: Etest para ESBL- PROBAC DO BRASIL Reagents 100 ou 30 unidades de fitas E-teste reagents de cada CT/CTL ou TZ/TZL Armazenamento Todos os pacotes com fitas não abertas ou não utilizadas devem ser armazenados a -20 C ou na temperatura sigerida na bula do kit até a data de expiração do mesmo. Fitas não utilizadas devem ser armazenadas em um frasco contendo sílica colorida para retirar a umidade. Proteger as fitas Etestes da exposição a misturas, calor e luz direta forte em qualquer hora. Evitar a penetração de umidade dentro do pacote ou no frasco. As fitas devem ser mantidas secas. Manuseio Antes de utilizar as fitas Eteste de um pacote fechado, inspecionar visualmente para verificar se está intacto. Não utilizar as fitas se o pacote estiver danificado. Ao retirar do freezer a -20 C, deixar o pacote ou container atingir a temperatura ambiente por 30 minutos. A umidade condensada na superfície de fora deve evaporar antes de abrir o pacote. Abra o pacote de acordo com as instruções. Ao segurar as fitas de Eteste, pegue apenas a fita na área de Eteste ESBL. Não toque na superfície da fita com o antibiotic, por exemplo, o lado oposto da escala. As fitas podem ser colocadas utilizando-se um aplicador (figura 2).

184 167 Precauções O Eteste ESBL é somente para uso diagnóstco in vitro. O uso apropriado do sistema requer o conhecimento de pessoal terinado em microbiologia e teste antimicrobiano. O Eteste ESBL deve ser utilizado de acordo com os procedimentos descritos. Procedimentos assépticos devem ser realizados todas às vezes que se utilizar espécimes bacterianas e medidas de precaução devem ser tomadas contra danos microbiológicos. As placas de Agar devem ser esterilizadas após uso, antes do descarte. Ocasionalmente a estática pode ocasionar a aderência de uma ou mais fitas. Tenha certeza que você separou as fitas e as appliqué somente uma vez na superfície do ágar. Devido à rápida difusão do antibiotico, as fitas Eteste ESBL não podem se removidas uma vez em contato com a superfície do ágar. Consultar o guia técnico do Eteste ( e ler a bula do mesmo antes da utilização. Procedimento Materiais necessários que não acompanham as fitas: Placas de ágar Mueller Hinton (depth of 4 ± 0.5 mm) Salina estéril (0.85% NaCl) lupa estéril, swabs, tubos, pipetas e tesouras Aplicador manual de Eteste Turbidez número 0.5 da escala padrão de McFarland Incubatora (35 ± 2 C) Cepas de controle de qualidade Frasco de estocagem com sílica Informação técnica adicional Technical Manual

185 168 Meio de ágar Tenha certeza de que a espessura do ágar seja 4.0 ± 0.5 mm com ph 7.3 ± 0.1. Preparação do inóculo Emulsionar várias colônias recém isoladas de uma cultura de 24hs em meio sólido, em salina até uma turbidez de 0.5 da escala padrão de McFarland. Se o inoculo estiver correto, uma camda confluente será obtida após a incubação. Faça uma contagem de colônias para verificar se o seu procedimento atingiu uma densidade correta do inóculo no que se refere à UFC/mL Nota: Como as ESBL são dependentes do inóculo, uma quantidade muito pesada ou leve da mesma afeta diretamente o resultado. O excesso da enzima pode interferir no componente do ácido clavulânico no teste e reduzir potencialmente o raio do MIC da CT/CTL ou TZ/TZL e fornecer um resultado falso negativo. Ao contrário, pouca enzima pode fornecer um MIC baixo para a CT ou TZ, e reduzir o raio da CT/CTL e TZ/TZL. Inoculação Inserir um swab estéril, não tóxico na suspensão do inóculo. Remover o excesso de fluido pressionando o swab contra a parede interna do tubo. Passar o swab na superfície do ágar por 3 vezes, rodando a placa aproximadamente 60º cada vez, para assegurar uma boa distribuição. Permitir que a umidade seja absorvida por aproximadamente 15 minutos de modo que a superfície esteja completamente seca antes de aplicar as fitas de ESBL.

186 169 Aplicação Verificar se a superfície do ágar inoculado esteja completamente seca antes de aplicar as fitas. Abra o pacote e aplique às fitas conforme descrito abaixo. Manuseio As fitas de Eteste ESBL podem ser aplicadas na superfície do ágar inoculado com uma pinça, um aplicador de Eteste manual, ou Nema C88. Sempre coloque a fita no ágar com a escala do MIC para cima (na direção da placa aberta), e o gradiente do antibiótico na superfície do ágar. Se for colocada de modo errado, não será formada a zona de elipse devido ao antibiótico não ter se difundido pela fita pástica não porosa. Tenha certeza de que toda a fita esteja em completo contato com a superfície do ágar. Se necessário, remover o ar das mesmas pressionando-as gentilmente com a pinça, sempre movendo da mais baixa concentração até a mais alta. Pequenas bolhas abaixo das fitas não afetam o resultado. Uma vez aplicada, a fita não pode ser movida pois o antibiótico é rapidamente liberado na superfície do ágar. Incubação Incubar as places de agar numa posição invertida a 35 ± 2 C por horas em temperatua ambiente. Leitura Quando o crecimento bacteriano estiver visível, ler os valores do MIC para CT, CTL, TZ e TZL, onde as respectivas elipses inibitórias se encontram com a fita (figura 4). Crecimento em todo o gradiente sem zona de inibição indica que o MIC é maior ou igual ( ) ao maior valor na escala de leitura. Uma elipse inibitória abaixo do gradiente indica que o MIC é menor (<) do que o menor valor na escala. Quando colônias mutantes estiverempresentes na elipse de inibição, ler o MIC onde estas colônias estiverem completamente inibidas. Para valor de MIC em alta escala, elipse de inibição pode ser muito pequena ou não claramente discernível. Ocasionalmente, uma zona fantasma (phantom zone) pode ser vidualizada abaixo do gradiente de CTL ou TZL e a elipse pode ou não ser vista em prózimo ao fim da fita de CT ou TZ (Figura 5). Elipse de inibição de CT ou TZ pode também ser deformada no final da fita (Figure 6). A presença de uma zona fantasma ou deformação da elipse é uma

187 170 vantagem única da técnica de fita do Eteste ESBL. Ela indica claramente a detecção da ESBL em raios não usuais de sinergia entre o substrato ß-lactâmico de CT ou TZ e o ácido clavulânico difundido através da seção CTL ou TZL. Diferentes padrões de inibição de crescimento são ilustrados nas figuras de 4-7. Diferentes padrões de inibição de crescimento: Figure 4. Corte ESBL positiva: MIC CT/CTL =1.5/0.047 =32 Figura 5. Zona fantasma de inibição abaixo de CT indicativa de ESBL. Figura 6. Deformação da inibição da elipse de TZ indicativo de ESBL. Figura 7. Quando o valor de MIC estiver acima dos valores de testes, o resultado é não determinado (ND).