(22) Data do Depósito: 26/02/2014. (43) Data da Publicação: 29/12/2015 (RPI 2347)

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1 INPI (21) BR A2 (22) Data do Depósito: 26/02/2014 *BR A República Federativa do Brasil Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial (43) Data da Publicação: 29/12/2015 (RPI 2347) (54) Título: COMPOSIÇÕES CONTENDO O ISOLADO JAB 68 DO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO METARHIZIUM ANISOPLIAE E USO DAS COMPOSIÇÕES (51) Int. Cl.: A01N 63/04; A01P 7/04 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO (72) Inventor(es): ANTONIO CARLOS MONTEIRO, DINALVA ALVES MOCHI, MARCOS ANTONIO CORRÊA, ROSEMEIRE CRISTINA LINHARI RODRIGUES PIETRO, JOSÉ CARLOS BARBOSA (74) Procurador(es): FABÍOLA DE MORAES SPIANDORELLO (57) Resumo: COMPOSIÃÃES CONTENDO O ISOLADO JAB 68 DO FUNGO ENTOMOPATOGÃNICO METARHIZIUM ANISOPLIAE E USO DAS COMPOSIÃÃES A invenã à o se refere ao desenvolvimento de composiã ões com o isolado JAB 68 do fungo entomopatogãªnico Metarhizium anisopliae, em peletes de alginato de sã³dio, e em óleo emulsionã vel e pã³ molhã vel. As composiã ões propostas sã o usadas no controle da mosca-dos-chifres. As composiã ões em óleo emulsionã vel e pã³ molhã vel tambã m podem ser usadas para o controle do carrapato de bovinos Rhipicephalus (Boophilus) microplus ou do carrapato de cã es Rhipicephalus sanguineus e para controle da cigarrinha da folha (Mahanarva posticata) e da raiz (Mahanarva fimbriolata) da cana-deaã úcar e das pastagens (Deois flavopicta).

2 1/48 COMPOSIÇÕES CONTENDO O ISOLADO JAB 68 DO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO METARHIZIUM ANISOPLIAE E USO DAS COMPOSIÇÕES CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se insere no campo de aplicação da Química, Farmácia, Microbiologia, Biotecnologia e, mais especificamente, na área de controle de pragas, uma vez que se refere ao desenvolvimento de diferentes composições com o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae, tais como: a) microencapsulado em peletes de alginato de sódio; b) em óleo emulsionável; c) em pó molhável. [002] As composições são destinadas ao uso na atividade agropecuária para controle da mosca-dos-chifres (Haema tobia ir ri tans), podendo ainda ser utilizadas para controle do carrapato de bovinos e das cigarrinhas das pastagens, e também na atividade agrícola para controle das cigarrinhas da cana-de-açúcar e outros insetos praga. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] Considerada um dos principais problemas da pecuária em vários países, a mosca-do-chifre Haematobia irri tans vem sendo sistematicamente estudada, devido aos significativos prejuízos econômicos associados ao seu parasitismo. Este inseto permanece no bovino durante toda a fase adulta, alimentando-se de sangue constantemente. Seu controle é feito quase que exclusivamente por meio de inseticidas químicos, o que se tornou um problema de importância crítica devido ao desenvolvimento de resistência da mosca a esses produtos. [004] O controle microbiano com a utilização de fungos

3 2/48 entomopatogênicos é ainda pouco explorado, já que, quando se deseja utilizar um patógeno em condições de campo, surge a necessidade de formulá-lo. [005] Os fungos entomopatogênicos são considerados agentes promissores para o controle biológico de pragas. Entre suas vantagens, hospedeiro e a não destaca se a especificidade poluição ambiental. Porém, ao o desenvolvimento de formulações é fundamental para bioinseticidas de origem fúngica, pois ainda stem limitações na aplicação e armazenagem desses produtos. [006] Os inseticidas microbianos exigem maiores cuidados no armazenamento devido à necessidade de preservar a viabilidade e patogenicidade do agente. Para isso a refrigeração é a forma mais usada na estocagem do produto, embora essa medida tenha efeito limitado sobre a sua preservação e encareça, tornando sua comercialização pouco prática. [ 007] Os componentes presentes nas formulações devem contribuir para o incremento da estabilidade e virulência do agente microbiano e eficácia do biocontrole, conferindo ao agente a capacidade de permanecer viável no ambiente pelo maior tempo possível a fim de garantir seu contato com o inseto hospedeiro. [008] Estratégias para o controle da mosca-dos-chifres consistem em atingir o inseto adulto parasitando o bovino ou as fases imaturas (ovo, larva e pupa) que ocorrem nas massas fecais dos bovinos. Alguns fatores podem interferir na eficácia do entomopatógeno, como as altas temperaturas na superfície do couro do bovino e a radiação ultravioleta, quando o fungo for pulverizado no animal, ou as altas

4 3/48 temperaturas no interior do aparelho gastrointestinal e o ph ácido do rumem e do abomaso, quando o fungo for rido pelo bovino, entre outro fatores limitantes. Assim sendo, é necess o desenvolver formulações que possam reduzir ou eliminar os efeitos indesejáveis destes fatores e contribuir para aumentar a eficácia e duração do controle. [009] Um dos principais obstáculos para o uso de fungos (fungos entomopatogênicos) no controle biológico de pragas da agricultura ou de parasitos externos (ectoparasitos) de animais de resse na pecuária (bovinos, por exemplo) é a falta de produtos disponíveis no mercado, que possam ser facilmente adquiridos e usados pelos produtores rurais. Formular estes produtos não é uma tarefa fácil, pois se tratam de bioprodutos, ou seja, produtos cujo ingrediente ativo é um organismo vivo (no caso, um fungo entomopatogênico) que geralmente tem vida curta e precisa de condições e cuidados especiais para ser armazenado e aplicado no campo. [010] A presente invenção busca solucionar estes problemas através do desenvolvimento de composições a base do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae, agregando aos esporos do fungo (ingrediente ativo), que são as partículas infectivas (tem capacidade de infectar e matar os insetos ou parasitos de interesse pecuário), substâncias e/ou condições que possibilitem aumentar a sobrevida (viabilidade) do pa tógeno, permitindo que seja armazenado vivo por pelo menos 12 meses em temperatura ambiente, e que seja de fácil aplicação e eficiente quando aplicado no campo (exerça a atividade patogênica, isto é, infecte e mate o inseto ou paras i ta). Portanto, o benefício

5 4/48 pretendido pela invenção é o desenvolvimento de composições para torná-las de fácil acesso e aplicação pelos produtores rurais. O fungo Metarhizium anisopliae [ 011] O fungo entomopatogênico Metarhizi um anisopliae começou a ser produzido e utilizado no Nordeste Brasileiro em 1969, para o estabelecimento do programa de controle da cigarrinha-da-folha da cana-de-açúcar. Em virtude dos bons resultados, vários laboratórios foram construídos nas usinas da Região Nordeste para a produção em larga escala desse entomopatógeno, sendo posteriormente produzido e comercializado também no Estado de São Paulo. [012] Em torno de 80% da produção de M. anisopliae têm sido utilizada para o controle de dois grupos de insetos, as cigarrinhas da cana-de-açúcar (50%) e as cigarrinhasdas-pastagens (30%), e os outros 20% vem sendo empregados contra gafanhotos, percevejos e outros insetos. [ 013] Atualmente existem inúmeras usinas de açúcar e álcool que produzem M. anisopliae para consumo próprio e algumas indústrias que produzem para comercialização. O processo de produção em massa do fungo no Brasil é o mesmo empregado em outros países da América Latina, no qual se utiliza o arroz cozido como substrato. [014] Para a aplicação, pode-se efetuar a lavagem dos grãos de arroz em água para a extração dos conídios ou aplicar na forma de grânulo. A refrigeração é a forma mais usada para a estocagem de produtos microbianos, apesar do esforço em se obter uma formulação do fungo que dispense o uso de refrigerador e freezer. As pesquisas com a manutenção do produto sob refrigeração demonstram a

6 5/48 eficiência para a conservação dos conídios ao se abaixar a temperatura, o que diminui o metabolismo do fungo, mantendo os conídios viáveis por mais tempo. Estudos apontam que estes produtos podem ser preservados por um mês em geladeira e por seis meses em freezer, já que a alta quantidade de água no produto final inviabiliza o armazenamento prolongado em temperatura ambiente. Devido a isso, os produtores normalmente sincronizam o pe odo de produção com a aplicação para tar o armazenamento. No entanto, o estudo de formulações a base de fungos entomopatogênicos evoluiu pouco, pois a maioria dos produtos necessita de refrigeração para serem comercializados. Formulação de fungos [ 015] Quando se deseja utilizar um entomopatógeno em campo, da mesma maneira que se utiliza um inseticida organossintético, é necessário obter uma formulação. O estudo das formulações de entomopatógenos tem avançado pouco no mundo e as mesmas são guardadas com grande segredo pelas companhias que as desenvolvem, sendo assim, a quantidade de informações disponíveis na literatura científica é bastante reduzida. [ 016] Uma formulação pode ser definida como um processo que se inicia com a produção do patógeno e segue com a adição de produtos que objetivem a manutenção da viabilidade e maior eficiência em atingir o alvo e atuar sobre o inseto. Os estudos de formulação devem ainda, considerar os efeitos da temperatura, da umidade, do inerte e a estabilidade do patógeno antes e depois que ele alcance o agro ecossistema, uma vez que o desempenho destes

7 6/48 entomopatógenos pode ser afetado por uma variedade de fatores ambientais. [017] Um aspecto extrao o da inovação tecnológica visando obter a formulação de fungos envolve o encapsulamento de microrganismos em microcápsulas ou peletes, onde polímeros como o alginato são utilizados para imobilizar bactérias e fungos. [018] Trabalhos que relatam essa cnica já foram descritos na literatura para a microencapsulação de conídios de fungos patógenos de plantas e micélios de fungos patógenos de insetos. Outros relatam a utilização de conídios microencapsulados de fungos nematófagos para o controle de nematóides paras i tos gastrintestinais de bovinos e ovinos; os resultados destes trabalhos mostraram eficiência dos fungos, mesmo após passagem pelo trato gast stinal de ruminantes, indicando que este tipo de preparo promove proteção aos microrganismos. [O 19] Para se desenvolver uma formulação a base de óleo emulsionável, precisa-se, primeiramente, definir o tipo de óleo a ser utilizado. Os óleos usados na agricultura são originados do petróleo (óleo mineral) e de vegetais (óleo vegetal), e quando adicionados à calda, aumentam a absorção, reduzem a deriva, retardam a evaporação da gota e atuam como espalhante e adesivo. Devido o baixo custo e a disponibilidade, tem-se usado muito o óleo de soja refinado no Brasil. [020] Vários surfactantes são necessários, também, para o bom desempenho do produto quando se deseja uma formulação em óleo emulsionável. No Brasil são poucas as pesquisas conduzidas relacionadas ao uso dos surfactantes.

8 7/48 Estes produtos são classificados de acordo com suas principais propriedades em: espalhantes, molhantes ou umectantes, aderentes, emulsificantes e dispersantes. Os espalhantes são substâncias que diminuem a tensão superficial das gotículas proporcionando o espalhamento completo da gota sobre a superfície tratada. Os molhantes ou umectantes retardam a evaporação da água, fazendo com que a gota permaneça mais tempo na super cie tratada, sendo importantes principalmente em condições de baixa umidade relativa do ar e elevada temperatura. Os aderentes aumentam a aderência dos líquidos ou sólidos à superfície. Os emulsificantes são substâncias que reduzem a tensão interfacial entre dois líquidos imiscíveis, proporcionando a formação de uma emulsão de um líquido em outro. Os emulsificantes também podem possuir atividade espalhante, adesiva e umectante. Os dispersantes das partículas através da redução das tam a aglomeração forças de coesão entre as mesmas, fazendo com que as suspensões mantenham-se estáveis por algum tempo. [021] Formulações de M. anisopliae a base de óleo são mais eficazes tanto para estudos de controle de pragas em laboratório quanto em campo, quando comparada a formulações aquosas. [022] No entanto a estocagem de produtos formulados a base de microrganismos é um dos maiores fatores limitantes deste processo. Em pré-ensaio realizado em nossos laboratórios, observamos que após 60 dias de estocagem na temperatura ambiente, grânulos secos de alginato de sódio contendo o fungo M. anisopliae, absorveram água do ambiente ocorrendo a germinação do entomopatógeno enquanto

9 8/48 armazenado. [023] A armazenagem de grânulos de alginato contendo o fungo Conio um minitans, antagonista do fungo Sclerotinia sclerotiorum, agente causal do mofo-branco, foi avaliado em temperaturas de 4 C e 28 C e concluíram que os grânulos armazenados a 28 De perderam a viabilidade após dois meses. [024] Para a preservação de uma formulação de Entomophthorales, foi realizado um estudo visando avaliar o efeito da combinação de dessecantes (sílica e glicerol) com redutores de oxigênio (vácuo e Ageless ZPT 200) na preservação de micélio seco dos fungos Ba tkoa sp. e Furia sp. Foi concluído que a combinação de sílica e Ageless prolongou a sobrevivência desses dois fungos formulados como micélio seco até 90 dias, armazenados a 3 De e 23 C, e que o uso de vácuo como redutor de oxigênio não prolonga a sobrevivência desses fungos, mesmo em associação com dessecantes. [025] O armazenamento dos conídios de M. anisopliae a -13 C foi eficiente para a manutenção da viabilidade por até um ano. Observou-se que a mistura do óleo de girassol com conídios do fungo, armazenado a 22 C, manteve 90% da viabilidade por até 240 dias. [026] Estudos laboratoriais sobre a formulação de fungos em óleos adjuvantes emulsionáveis para misturar com água foram desenvolvidos na Embrapa Cerrado, tendo-se observado que o óleo é capaz de melhorar a ação do fungo, evapora menos que a água, espalha-se melhor e protege o fungo contra os raios ul travioletas que poderiam matá-lo rapidamente.

10 9/48 [027] Essa formulação pode ser armazenada a 27 C por 35 semanas, mantendo a viabilidade do fungo acima de 80% e, por pelo menos 40 semanas, a 10 C, com viabilidade superior a 90%, e quanto à radiação ultravioleta, o fungo teria uma tolerância de até seis horas. [028] A viabilidade de blastósporos e conídios do fungo entomopatogênico Sporothrix insectorum, em formulação líquida e sólida, foi avaliada após o seu armazenamento em temperatura ambiente, geladeira e freezer. Observou-se, que o armazenamento em geladeira foi o melhor método estudado, permitindo que o fungo ficasse estocado por dois meses. A mosca-dos-chifres Haematobia irritans [029] Originária da África, Haematobia irritans, atingiu a Europa e, através das importações de animais, chegou aos Estados Unidos em 1888, alastrando-se até chegar à América do Sul, Venezuela e Guiana Inglesa, onde encontrou clima propício para o seu desenvolvimento. No Brasil, foi constatada a presença da mosca em Roraima, em 1978, sendo oficialmente notificada em 1980, podendo ser encontrada hoje em todo território nacional. No Estado de São Paulo, surgiu em 1990 nas cidades do noroeste do Estado, onde existem grandes concentrações de rebanhos de gado de corte. [030] O nome mosca-dos-chifres foi dado porque na Europa atacava preferencialmente a base dos chifres dos animais; aqui no Brasil, ataca praticamente todo o corpo do bovino, localiza-se nas partes que ficam fora do alcance do movimento da cabeça e cauda (cupim, costas, barriga e pernas), na virilha e no ventre dos animais, procura se proteger do sol, onde acaba atacando também.

11 10/48 [031] As moscas adultas de ambos os sexos, permanecem no animal dia e noite, alimentando-se exclusivamente de sangue; após a fecundação as fêmeas depositam seus ovos em grupos de 10 a 20, nas bordas de massas fecais recémdepositadas; o período de vida de uma fêmea pode ser de até 40 dias e durante este período ovipositam de 80 a 300 ovos. O desenvolvimento larval, composto de três instares, ocorre nas fezes, e a empupação se dá no solo até a emergência do adulto. Seu ciclo de desenvolvimento é rápido, mas depende da temperatura e consti ção da massa fecal. Em experimento, observou se período mínimo de 9,6 dias em temperatura de 27 C para o desenvolvimento do inseto nas fezes até o início da emergência do adulto. Fato semelhante foi observado quando em temperatura entre 27,3 e 30,2 C, a emergência ocorreu em nove dias, e ainda, em 17 dias em temperatura de 19,4 C, simulando o junho. rno do mês de [032] Os prejuízos causados pela mosca-dos-chifres decorrem da perturbação que demonstram os bovinos parasitados, devido ao intenso e incessante número de picadas do inseto, fator que interfere no descanso, na alimentação e, consequentemente, na produtividade animal. [033] Uma infestação média de 500 moscas/animal leva a perda de 60 ml de sangue/dia e de 40 Kg de peso vivo/ano. Em uma proporção de 100 moscas por animal, pode-se esperar a diminuição de 8,1 kg no ganho de peso, durante o período de um ano. [034] Os prejuízos econômicos atingem também a indústria do couro, isso porque a pele, com grande número de picadas e infecções secundárias fica espessa, ocorrendo

12 11/48 endurecimento e perda de valor. A mosca-dos chifres representa um prejuízo anual de 150 milhões de dólares para a pecuária nacional de bovinos. O controle químico e biológico do inseto [035] Diversos estudos têm sido realizados, enfocando, principalmente, qual tem sido o controle químico da mosca-dos chifres, o amplamente utilizado em todo país. O uso excessivo e incorreto de produtos qu cos tem determinado um agravante da situação, afetando negativamente aspectos econômicos e ambientais. [036] Na prática, o controle químico tem levado ao desenvolvimento da resistência da mosca a diferentes classes de inseticidas, com marcante rapidez e intensidade, o que é uma situação irrevers 1, pois a não utilização de piretróides por períodos de 2 a 6 anos, não retorna a suscetibilidade da mosca aos mesmos. Inseticidas organofosforados começaram a ser utilizados em áreas onde já foi constatada a resistência do inseto a piretróides, mas de acordo com o diagnóstico, populações de H. irritans são resistentes também a organofosforados. [ 037] Uma boa estratégia para diminuir a dependência do uso exclusivo de inseticidas químicos, é o controle integrado, que envolve mais de uma técnica para combater uma determinada praga, contribuindo para a conservação de seus inimigos naturais. Entre estas técnicas pode-se citar o uso de microrganismos entomopatogênicos, que visa à utilização racional dos patógenos, podendo ser aplicados puros ou mesmo na forma em que são produzidos. [ 038] Existem na li ter atura alguns trabalhos sobre o potencial da bactéria entomopatogênica Bacillus

13 12/48 thuringiensis para o controle de H. irritans. Em relação à ação de fungos entomopatogênicos foi relatado a ocorrência natural de as espécies de fungos sobre H. ir ri tans, entre os quais se destacam M. anisopliae e Isaria fumosorosea, em pastagens na Dinamarca. A suscetibilidade de ovos, pupas e adultos de H. ir r i tans a isolados dos fungos M. anisopliae, B. bassiana e I. fumosorosea foi avaliada em condições de laboratório. O emprego de formulações destes mesmos fungos para o controle de adultos da mosca também foi avaliado. Ambos os estudos obt ram bons resultados do controle do inseto em laboratório. [039] Obtiveram-se excelentes resultados ao realizar experimentos em laboratório com isolados de M. anisopliae, B. bassiana, I. fumosorosea e I. farinosa, para todos os estágios do ciclo de vida da mosca-dos-chifres. Neste estudo foi observado que as fases mais suscept is, na qual ocorreram 100% de morte, foram a de larva e a de adulto do inseto, e ainda que M. anisopliae foi o mais virulento para estas fases de H. irritans. [040] Após obter estes resultados em laboratório, foram realizados dois experimentos em campo, um para o controle de larvas e outro para o controle de adultos do parasito. No primeiro, M. anisopliae foi microencapsulado em peletes de algina to de sódio e fornecido aos bovinos, junto à alimentação, para o controle de larvas nas massas fecais, observando 40% de redução na emergência de adultos no grupo de animais tratados em comparação ao grupo controle. No segundo, os bovinos foram pulverizados com suspensão aquosa do isolado fúngico e observou-se expressiva redução na quantidade de insetos adultos que

14 13/48 parasitavam os animais. [041] Estes trabalhos contribuíram para o conhecimento científico sobre a mosca-dos-chifres, principalmente ao mostrar, que em campo, os fungos entomopatogênicos são uma alternativa promissora para combater, tanto adultos em bovinos, quanto formas imaturas do inseto em massas fecais. No entanto, novos estudos são necessários, principalmente para obter formulações adequadas que possam ser empregadas visando melhorar a eficiência do controle. ESTADO DA TÉCNICA [042] O pedido de patente MX N descreve um processo para a encapsulação de uma matriz polimérica de alginato de sódio, fungos entomopatogênicos dos gêneros Bea a sp., Metarhizium sp. e Nomurea sp., de liberação controlada, para utilização como pesticidas orgânicos em plantações agrícolas. Esse documento em nada se assemelha com a presente invenção, porque não descreve uma composição em peletes de alginato de sódio contendo o isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae, além disso, as aplicações potenciais são distintas. [ 043] Um farelo em pó granular contendo fungo Metarhizium anisopliae foi descrito no pedido de patente JPH N para o controle de larvas de besouro de ouro e prevenção da poluição ambiental pela pulverização do mesmo em gramados onde esta larva cresce. Esse documento patentário também não se assemelha com o presente pedido, pois não descreve uma composição em pó contendo o isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae, além das aplicações potenciais também serem diferentes. [044] O pedido de patente CN N refere-se à

15 14/48 preparação de uma composição para prevenir e controlar carrapatos. A composição pode ser um óleo ou pó e é preparada de 90 a 99 por cento em peso do esporo do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em pó e 1 a 10 por cento em peso de deltametrina. Apesar de o documento descrever uma composição do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae em pó ou em óleo, o mesmo difere da presente invenção, pois inclui um medicamento em sua composição e, a eficiência da mesma está relacionada a esta associação, em que o papel do fungo é complementado pelo medicamento a ser utilizado. Além disso, não descreve o uso especifico do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae. [045] O pedido de patente JPH No descreve um inseticida contendo células de fungos pertencentes ao gênero Metarhizium ou os ingrediente ativo. A natureza esporos dos mesmos como desta composição já difere por si só da presente invenção, pois não descreve composições em peletes de alginato de sódio, em óleo emulsionável ou em pó molhável. Objetivo e Vantagens da Invenção [ 04 6] O objetivo da presente invenção é: analisar a compatibilidade de inertes e adjuvantes (agentes molhantes, dispersantes, aderentes, antiumectantes, espalhantes e fotoprotetores, dentre outros) com o isolado JAB 68 do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae, para o desenvolvimento de composições em peletes de alginato de sódio, e em óleo emulsionável e pó molhável. [047] Fungos entomopatogênicos como o Metarhizium anisopliae são capazes de infectar e matar insetos, tendo já sido demonstrada sua eficiência em campo. No entanto, o

16 15/48 fungo não deve ser usado "in natura", pois tem baixa sobrevivência quando armazenado em temperatura ambiente e quando aplicado no campo. [048] As composições propostas aumentam a sobrevivência do fungo armazenado em temperatura ambiente e melhoram sua eficiência no campo, pois permitem a distribuição homogênea quando aplicado e atingem o inseto alvo na fase em que é mais suscept 1 ao fungo, aumentando sua sobrevivência em campo e protegendo-o das intempé s ambientais. Ainda, não poluem, não deixam resíduos tóxicos, não causam desequilíbrios ecológicos e reduzem custos de aplicação, pois normalmente são mais baratos que os inseticidas químicos e permitem disponibilizar aos produtores rurais produtos biológicos de fácil manuseio e aplicação, produtos estes que ainda não estão disponíveis no mercado. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [049] A invenção se refere ao desenvolvimento de composições com o isolado JAB 68 do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae, em peletes de alginato de sódio, e em óleo emulsionável e pó molhável. [050] As composições propostas são usadas no controle da mosca-dos-chifres, importante ectoparasito de bovinos que afeta severamente a pecuária lei te ira e de corte no Brasil e também em vários outros países. [051] A composição em peletes de alginato de sódio destina-se a controlar larvas da mosca, sendo fornecida aos bovinos junto com a alimentação. As composições em óleo emulsionável e pó molhável destinam-se ao controle de adultos da mosca, sendo pulverizadas sobre o corpo dos

17 16/48 bovinos. [ 052] As composições em óleo emulsionável e pó molhável também podem ser usadas para o controle do carrapato de bovinos Rhipicephalus (Boophilus) microplus ou do carrapato de cães Rhipicephalus sanguineus, sendo aplicadas no corpo dos animais ou no ambiente habitado ou frequentado por estes, para controle das várias fases do ciclo de vida do carrapato (larvas, ninfas e adultos). [053] A tecnologia permite, ainda, o uso das composições em óleo emulsionável e pó molhável, para controle da cigarrinha da folha (Mahanarva posticata) e da raiz (Mahanarva fimbriolata) da cana-de açúcar e das pastagens (Deois flavopicta), em vista da patogenicidade do fungo Metarhizium anisopliae para estes insetos. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [054] A invenção se refere ao desenvolvimento de composições com o isolado JAB 68 do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae, em peletes de alginato de sódio, em óleo emulsionável e pó molhável, para uso no controle da mosca-dos-chifres. [055] O fungo utilizado foi o isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae. O isolado foi revigorado em placas de Petri contendo o meio de cultura de batata, dextrose e ágar (BDA), acondicionado em estufa a 27 ± 0,5 C durante 15 dias. [056] A fim de verificar quais os componentes mais adequados para cada uma das composições propostas, foram realizados diversos testes de compatibilidade. Produtos para formulação das composições [057] Para compor as composições foram avaliados

18 17/48 diversos produtos com diferentes funções, conforme a Tabela 1. Tabela 1. Produtos avaliados para formar as composições Nome Nome técnico e/ou nome Concentrações comercial/função químico avaliadas Agente gelificante Agente espessante Alginato de sódio 2% Farinha de aveia 2% Agente conservante Benzoato de sódio Agente molhante e dispersante Of2% Tween 80 Unitol L-20 Polisorbato 80; Monooleato Of01; OfOS; Of2; de sorbitan etoxilado o f s; 1f0% Álcool laurílico etoxilado o f o 1; o f os; o f 2; 2 OE o f s; 1f0% Agente aderente Polivinilpirrolidona K-30 o f o 1; o f os; o f 2; OfS; 1f0% Agente antiumectante Of01; OfOS; o f 1; Aerosil 200 Sílica pirogênica; Dióxido o f s; 1 f o; 2 f o; de silício 3f0% o f o 1; o f os; o f 1; - Talco o f s; 1 f o; 2 f o; 3f0% - Celulose microcristalina Of01; OfOS; Of1; OfS; 1f0% Fotoprotetor hidrossolúvel - Complexo de filtros UVA/UVB Of01; OfOS; Of1; o f s; 1; 2; 3; 4;

19 18/48 5% o f o 1; o f os; o f 1; Meti1eno bis benzotriazo1i1 Tinosorb M"' OfS; 1; 2; 3; 4; tetrametilbutilfenol 5% Eusolex 262 Neo Heliopan BB Neo Heliopan E1000 Eusolex 6007 Ácido-2-fenil-benzimidazol- Of01; OfOS; Of1; 5- sulfônico OfS; 1; 2; 3; 4% Fotoprotetor lipossolúvel Benzofenona 3; 2-hidroxi-4- o f 5; 1 f o; 2 f o; metoxibenzofenona 4 f o; 6f0% o f 5; 1 f o; 2 f o; Isoamil p-metoxinamato 4 f o; 6f0; 8 f o; 10f0% Octil dimetil PABA-Padimato o f 5; 1f0; 2 f o; o 4 f o; 6f0; 8f0% Agente emulsificante Alkamuls vo Mistura de ácido graxo 2003 polietileno glicol esteres 1 f o; 2 f o; 3 f o; 4 f o; 5 f o; 6 f o; 7f0% Agente espalhante Dow Corning Q2- Of01; Of025; 5211 Silicone Of05; Of075; Superweting Agent Haiten Agral Of10% Polioxietileno alquil o f o 1; o f 05; o f 1; fenol éter Of5; 1f0% Nonil fenoxi poli Of01; Of05; o f 1; (etilenoxi) etanol Of5; 1f0% Agente tensoativo com ação emulsificante Of01; OfOS; Of1; - Lauril éter sulfato de o f 2; Of3; o f 4; sódio Of5; 1f0%

20 19/48 Agente estabilizante e alcalinizante - Trietano1amina o f o 1; o f os; o f 1; 0,5; 1,0% Isoparafina, óleos comerciais de soja, de Inerte oleoso amendoim, de milho, de canola, de girassol, de oliva, NaturfL Oi f Quimióleo 0 f óleo mineral Inerte em pó seco Caulin U.S.P. (esterilizado) Teste de tibilidade dos entes das [058] Os produtos destinados ao uso como adjuvantes nas composições peletizadas, em óleo emulsionável e pó molhável t ram sua compatibilidade com o isolado JAB 68 do fungo M. anisopliae avaliadas. Tais produtos e as doses testadas foram empregados em quantidades adequadas aos ensaios. [059] Após revigoramento, o isolado fúngico foi inoculado em meio BDA, contido em placa de Petri, após receber cada produto em sua respectiva dose. No teste de compatibilidade de fotoprotetores lipossolúveis, usou-se o meio mínimo de Pontecorvo substituindo-se a fonte de carbono por óleo contendo emulsificante e o fotoprotetor. Todos os produtos foram adicionados ao meio na temperatura próxima de 45 C, evitando assim, alterações das suas propriedades. [060] Como parâmetro de avaliação do desempenho do fungo, em relação aos diferentes produtos, nas diferentes concentrações, foi analisado o crescimento vegetativo das colônias, a esporulação e a germinação de conídios. O crescimento vegetativo foi quantificado através de medidas,

21 20/48 em milímetro, de três diâmetros previamente marcados na parte externa do fundo as placa de Petri. A inoculação foi feita por picada em ponto central e as placas foram acondicionadas em estufa a 27 ± O, 5 C. As medidas do crescimento da colônia foram realizadas a cada três dias até o 15 dia após a inoculação. [061] A esporulação foi avaliada coletando se em cada placa uma amostra do centro, uma do meio e outra da periferia da colônia do fungo, com auxílio de um anel metálico de 8 mm de diâmetro, no dia de incubação. Estas amostras foram transferidas individualmente para tubos de ensaio contendo 10 ml de uma mistura ( 1: 1) de solução de NACL (0,089% p/v) e Tween 80 (0, 1% v/v). Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos foi feita a contagem dos conídios com auxílio da câmara de Neubauer em microscópio óptico com 400 aumentos. Com base nos valores obtidos calculou-se a quantidade de conídios produzidos por toda a colônia. [062] A germinação dos conídios foi avaliada através de microcul ti vo e exame direto de lâmina ao microscópio. Após demarcação de três campos na face inferior de cada lâmina, as mesmas foram acondicionadas em placas de Petri, com alta umidade relativa, mantida por dois chumaços de algodão umidecidos com água destilada. Para não tocar o fundo da placa, sob cada lâmina foram dispostos dois palitos na posição horizontal. A superfície de cada lâmina foi recoberta por 4 ml de meio BDA (ou meio mínimo de Pontocorvo com a fonte de carbono substituída conforme já mencionado), contendo os diferentes produtos nas respectivas concentrações. Em cada campo foi inoculado 0,1

22 21/48 ml da suspensão fungica contendo 10 6 conídios ml- 1 As placas foram mantidas a 27 ± 0,5 C durante 15 horas. Em seguida, foram observados 150 conídios por campo, entre germinados e não germinados, obtendo-se a porcentagem de conídios viáveis. [O 63] Para determinar o efeito tóxico dos produtos, foi utilizada a fórmula abaixo, a qual contém parâmetros de crescimento vegetativo, esporulação e germinação: I.B = 47 [CV] + 43 [ESP] + 10 [GER] 100 em que: I.B. = Índice biológico; CV porcentagem de crescimento vegetativo da colônia após 15 dias, com relação à testemunha; ESP porcentagem de esporulação após 15 dias, em relação à testemunha; GER = porcentagem de germinação dos conídios após 15 horas, em relação à testemunha. [064] Não foram utilizadas casas decimais para o cálculo do I.B. [065] Com os valores obtidos de I.B. foi feita a classificação toxicológica dos produtos, nas diferentes dosagens, de acordo com a seguinte escala: - de O a 41 - tóxico; - de 42 a 66 - moderadamente tóxico; - superior a 66 compatível. Teste de di de conídios do isolado JAB 68 de Metarhizium ani te [066] Tubos de ensaios contendo os agentes molhante e dispersante selecionados nos testes de compatibilidade, em

23 22/48 várias concentrações, receberam conídios do fungo para avaliar a eficiência da dispersão. [O 67] Após vigorosa agitação em agitador e rico de tubos, uma gota da suspensão formada foi transferida para câmara de Neubauer e levada para microscópio ótico, onde foi realizada a contagem de conídios isolados dos demais e de grupos de conídios. Teste de dispersão de conídios do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae em óleos [068] Para compor a composição emulsionável, foi avaliada a dispersão dos conídios do fungo em óleos minerais e óleos obtidos de plantas em vários tempos de agitação. Tais óleos serão usados como inertes na composição. [069] Para tanto, conídios do fungo foram adicionados ao óleo contido em tubo de ensaio, juntamente com o emulsificante selecionado de acordo com os resultados dos testes realizados. Após vigorosa agitação em agitador elétrico de tubos, uma gota da emulsão formada foi transferida para câmara de Neubauer e levada para microscópio ótico, onde foi realizada a contagem de conídios do fungo isolados dos demais e de grupos de conídios. Teste de fotoproteção [ 07 O] Para avaliar o efeito dos produtos que serão usados como fotoprotetores nas composições, foi confeccionada uma suspensão (fotoprotetor hidrossolúvel) ou emulsão (fotoprotetor lipossolúvel) de conídios do fungo em tubo de ensaio e adicionado o fotoprotetor em uma das concentrações a serem testadas.

24 23/48 [071] Após vigorosa transferida para placa de simulador solar. Após agitação, a suspensão Petri e submetida à luz intervalos de tempo foi de um pré estabelecidos, foram colhidas amostras desta suspensão e realizado o teste de germinação dos conídios presentes na suspensão irradiada, conforme metodologia descrita acima. etes de al em óleo emulsionável e pó molhável [072] O preparo da mucilagem de alginato de sódio com farinha de aveia foi realizado segundo metodologia descrita na literatura e a microencapsulação em solução de cloreto de cálcio foi conduzida conforme ensinamentos do estado da técnica. [073] Todos os produtos selecionados para compor a composição foram acrescentados na mucilagem de alginato de sódio. Os microgrânulos obtidos foram lavados e secos em fluxo contínuo de ar em temperatura ambiente entre 26 e 29 oc. [074] O preparo das composições em óleo emulsionável e pó molhável foi realizado acrescentando aos respectivos inertes, produtos selecionados nos testes de compatibilidade, nas concentrações adequadas, juntamente com conídios do isolado JAB 68 de M. anisopliae, sendo a seguir vigorosamente agitados para homogeneização. [075] Estas preparações constituíram as respectivas frações oleosas ou pó destas composições. Componentes que, devido suas características ou concentrações a serem usadas, não puderam ser adicionados nas frações oleosa ou pó, foram usados para compor a fração aquosa destas composições.

25 24/48 Análise estatística [076] Para avaliar a compatibilidade do fungo com cada produto, nas respectivas doses usadas, foram utilizadas 4 ições para o crescimento radial, 4 para a esporulação e 3 para a germinação de conídios. [077] Para cada parâmetro analisado, foi feito um controle, sem adição de produto ao meio de cultivo. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado (DIC). Os dados de todos os ensaios foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para execução das análises foi utilizado programa estatístico apropriado. Resultados [078] O alginato de sódio (2%), a farinha de aveia comercial ( 2%) f o benzoato de sódio (0,2%) e a microencapsulação em solução de cloreto de cálcio (O, 3M) não mostraram qualquer efeito tóxico sobre o fungo. [079] O caulim é um mineral composto de silicato de alumínio, solúvel em água e quimicamente inerte em ampla faixa de ph. A avaliação da compatibilidade dos adjuvantes, em várias concentrações, com o isolado do fungo, a dispersão dos conídios e o efeito dos fotoprotetores apresentaram os resultados descritos abaixo. [080] Para os testes realizados, as médias apresentam seus valores originais, mas a análise estatística do crescimento e da esporulação é realizada com dados transformados em log (x+5) e a análise da germinação é realizada com dados transformados em are sen ~x/100. [081] Ainda, as médias seguidas pela mesma letra, na

26 98,16 25/48 coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p ~ 0,05) e os símbolos indicam: Ns Não significativo; * Significativo a 5% de probabilidade; Significativo a 1% de probabilidade. tibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium ani iae com a tes molhante e di te Tabela 2. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com agentes molhante e dispersante em várias doses e classificação toxicológica dos produtos. Esporulação Agente e Crescimento Germinação Índice Classificação (x 10 9 doses (%) (mm) (%) biológico Toxicológica con. /col.) Tween 80 (Polisorbato 80) Controle 73,37 a 5,59 ab 99,70 a 0,01 74,75 a 6,72 a 99,85 a 110 Compatível 0,05 76,50 a 5,93 ab 98,89 a 105 Compatível 0,1 73,87 a 3,92 ab 99,70 a 87 Compatível 0,5 76,25 a 3,45 ab 99,78 a 85 Compatível 1,0 76,25 a 3,04 b 99,63 a 82 Compatível Teste F 3 f 6 9* 3 f 8 o* 1 r 83 NS c.v. (%) 0,40 7,48 2,22 Unitol L-20 (Álcool laurílico etoxilado 2 OE) Controle 72,25 a 4,12 a 99,30 a 0,01 75,75 a 1,52 b 97,50 b 75 Compatível 0,05 72 f 62 a 0,99 bcd 98,60 ab 68 Compatível 0,1 63,25 b 1,27 bc 1 b 64 Mod. tó n "' 32,3 '-' I v f~::; '-.-U?l élh 35 1,0 25,50 '-' 0,03 d ::;",:;o b 27 Tóxíco I m..,. 341,15** 25,2 7,80

27 26/48 tibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com agentes antiumectantes Tabela 3. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com agentes antiumectantes em as doses e classificação toxicológica dos produtos. Esporulação Índice Agente e Crescimento Germinação Classificação (x 10 9 biológic doses (%) (mm) (%) Toxicológica con. /col.) o Talco Controle 72,50 e 4,30 a 100,00 a 0,01 75,37 d 3,60 a 99,85 a 95 Compatível 0,05 77,00 cd 3,97 a 99,85 a 99 Compatível 0,1 78,75 cd 4,42 a 99,78 ab 105 Compatível 0,5 80,12 ab 3,85 a 99,63 abc 100 Compatível 1,0 81,87 a 3,32 a 99,04 bcd 96 Compatível 2,0 79,25 b 4,27 a 98,73 cd 103 Compatível 3,0 78,12 bc 3,58 a 98,26 d 95 Compatível Teste F 39,6 1,0 11, 06** c.v. (%) 0,26 4,20 1,56 Aerosil 200 (Sílica pirogênica) Controle 74,25 a 5,17 a 99,20 ab 0,01 74,37 a 4,17 a 99,00 ab 92 Compatível 0,05 73,50 ab 3,33 ab 98,86 ab 84 Compatível 0,1 73,62 ab 5,22 a 99,00 ab 100 Compatível 0,5 70,37 bc 2,45 ab 98,56 ab 75 Compatível 1,0 67,12 c 2,95 ab 97,73 b 77 Compatível 2,0 55,00 d 1,48 b 99,53 a 57 Mod. tóxico 3,0 48,00 e 0,76 b 99,33 ab 47 Mod. tóxico

28 27/48 Teste F 247fl2 7f73 3f0 c.v. (%) Of45 7f06 1 f 87 Celulose microcristalina Controle 7lfl2 a 4f50 a 99f82 a Of01 68f50 b 5f55 a 99f78 a 108 Compatível Of05 68f50 b 4f40 a 99f78 a 97 Compatível Of1 70f37 ab 3f47 a 99f92 a 90 Compatível Of5 68f62 b 3f75 a 99f85 a 91 Compatível 1f0 69f25 ab 4f42 a 99f85 a 98 Compatível Teste F 5f57 0 f 7 2NS 0 f 67NS c.v. (%) Of29 7 f 91 lf70 tibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium ani iae com o a te aderente e tetor Tabela 4. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com o agente aderente e protetor em várias doses e classificação toxicológica. Esporulação Agente e Crescimento Germinação Índice Classificação (x 10 9 doses (%) (mm) (%) biológico Toxicológica con. /col.) Polivinilpirrolidona K 30 Controle 74f75 a 4f60 a 99f80 a Of01 73f75 a 3f32 a 99f50 a 87 Compatível Of05 74f50 a 5f22 a 99f56 a 106 Compatível Of1 75f50 a 7fl5 a 99f36 a 124 Compatível Of5 74f50 a 3f80 a 99f80 a 92 Compatível 1f0 74f87 a 4f42 a 99f66 a 98 Compatível Teste F 0 f 5 7NS 1 f 4 4 NS 0 f 7 2NS c.v. (%) Of30 8f30 2f24 Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium

29 28/48 ani iae com fot tetores hidrossolúveis Tabela 5. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com fotoprotetores hidrossol s em as doses e classificação toxicológica dos produtos. Cresciment Esporulação Índice Agente e Germinação Classificação o (x 10 9 biológic dose (%) (%) Toxicológica (mm) con. /col.) o Tinosorb w (Metileno-bis-benzotriazolil tetrametilbutifenol) Controle 76,12 a 6,44 a 99,86 a 0,01 76,37 a 6,00 a 99,80 ab 97 Compatível 0,05 77,25 a 6,87 a 99,73 abcd 104 Compatível 0,1 76,37 a 6,21 a 99,78 abc 99 Compatível 99,11 0,5 75,00 ab 4,24 a 85 Compatível abcde 1,0 72,00 b 4,52 a 98,29 bcde 84 Compatível 2,0 44,00 c 0,63 b 98,06 c de 41 Tóxico 3,0 44,25 c 0,48 b 98,13 bcde 40 Tóxico 4,0 45,25 c 0,42 b 97,90 de 41 Tóxico 5,0 45,50 c 0,86 b 97,56 e 44 Tóxico Teste F 681,6 28,49** 7,12** c.v. (%) 0,46 6,02 2,28 Complexo de filtros UVA/UVB Controle 74,37 a 7,23 a 99,92 a 0,01 71,62 ab 3,84 b 99,92 a 78 Compatível 0,05 73,25 a 4,41 b 99,85 a 83 Compatível 0,1 71,75 ab 4,34 b 99,85 a 81 Compatível 0,5 71,87 ab 4,48 b 99,78 a 82 Compatível 1,0 69,25 bc 4,77 b 99,78 a 82 Compatível 2,0 51,25 e 1,01 c 99,11 a 48 Mod. tóxico

30 29/48 3r0 66r25 d 1r25 c 99r48 a 59 Mod. tóxico 4r0 67r00 cd 1r26 c 99r48 a 60 Mod. tóxico 5r0 65r00 d 1r01 c 99r70 a 57 Mod. tóxico Teste F 186r34** 38r9 Ü r 27NS c.v. (%) Or34 3r91 2r00 Eusolex 262 (Ácido fenil-benzimidazol sulfônico) + Trietanolamina (1:1 v/v) Controle 70r87 c 9 r 17 a 100r00 a Or01 70r00 c 7 r 14 a 99r92 ab 100 Compatível Or05 77r75 ab 6r98 ab 99r86 ab 101 Compatível Or1 79r75 a 9r66 a 99r70 abc 122 Compatível Or5 73r50 bc 8r83 a 99r26 bcd 112 Compatível 1r0 62r25 d 4r08 b 98r60 d 76 Compatível 2r0 44r50 e 1r22 c 99r23 bcd 47 Mod. Tóxico 3r0 36r87 f Or90 c 99r26 bcd 40 Tóxico 4r0 29r25 g Or45 c 98r90 cd 32 Tóxico Teste F 566r28** 46r62** 10r65** c.v. (%) Or67 5r 18 1r46 Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com fotoprotetores lipossolúveis Tabela 6. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com fotoprotetores lipossolúveis em várias doses e classificação toxicológica dos produtos. Cresciment Esporulação Índice Agente e Germinação Classificação o (x 10 9 biológic doses (%) (%) Toxicológica (mm) con. /col.) o Neo Heliopan BB (Benzofenona 3) Controle 64r25 a 2r19 a 99r80 a Or5 62r00 abc 1 r 97 a 99r50 a 94 Compatível

31 30/48 1,0 62,75 ab 1,77 a 99,26 a 91 Compatível 2,0 62,50 abc o' 91 b 99,10 a 74 Compatível 4,0 59,75 bc 0,46 b 99,13 a 63 Mod. tóxico 6,0 58,75 c 0,65 b 99,83 a 64 Mod. tóxico Teste F 5,88** 37,53** NS c.v. (%) 0,60 2,08 2,03 Neo Heliopan E1000 Controle 50,25 a 3,30 a 99,46 a 0,5 44,00 b 2,36 ab 99,43 a 82 Compatível 1,0 35,25 c 1,93 ab 99,63 a 68 Compatível 2,0 35,50 c 1,52 ab 99,73 a 63 Mod. Tóxico 4,0 34,00 c 1,84 ab 99,63 a 66 Mod. Tóxico 6,0 29,75 d 1,30 b 99,73 a 55 Mod. Tóxico 8,0 27,50 d 2,18 ab 99,86 a 64 Mod. Tóxico 10,0 28,50 d 1,42 b 99,46 a 55 Mod. Tóxico Teste F 84,43 ** 2,72 ** 0,5 c.v. (%) 1,09 5,51 2,22 Eusolex 6007 (Octil dimetil PABA - Padimato O) Controle 49,00 a 3,98 a 99,80 a 0,5 46,25 a 2,46 a 99,80 a 81 Compatível 1,0 46,25 a 2,44 a 99,80 a 81 Compatível 2,0 46,25 a 1' 60 a 99,73 a 76 Compatível 4,0 46,25 a 2,13 a 99,63 a 77 Compatível 6,0 41,75 b 2,24 a 99,73 a 74 Compatível 8,0 45,00 ab 1,71 a 99,80 a 72 Compatível Teste F 6,40** 1' NS c.v. (%) 0,88 7,55 1' 80 tibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium ani iae com a te emulsificante

32 31/48 Tabela 7. tibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com o agente emulsificante em as doses e classificação toxicológica. Cresciment Esporulação Agente e Germinação Índice Classificação o (x 10 9 doses (%) (%) biológico Toxicológica (mm) con./col) Alkamuls vo 2003 (mistura de ácido graxo polietileno glicol ésteres) Controle 72,00 a 6, 61 a 100,00 a 1,0 68,75 b 4,51 ab 99,86 a 98 Compatível 2,0 62,75 c 3, 11 b 99,86 a 80 Compatível 3,0 63,00 c 2,22 b 99,80 a 70 Compatível 4,0 60,75 cd 2,95 b 99,93 a 64 Mod. tóxico 5,0 58,50 de 3,08 b 99,86 a 67 Mod. tóxico 6,0 57,50 e 2,18 b 99,86 a 68 Mod. tóxico 7,0 58,50 de 2,03 b 99,86 a 62 Mod. tóxico Teste F 79, 67** 5,28** 0,1 c.v. (%) 0,40 7,01 1,92 Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com agentes espalhantes Tabela 8. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com agentes espalhantes em várias doses e classificação toxicológica dos produtos. Esporulação Agente e Crescimento Germinação Índice Classificação (x 10 9 doses (%) (mm) (%) biológico Toxicológica con. /col.) Dow Corning Q Superweting Agent (silicone) Controle 74,00 a 5,78 a 99,96 a 1'\ 1'\1 73,25 a 6, 18 (\(\ (\') 103 Compatível 0,025 72,00 ab 3,87 99,76 a 84 Compatível...,G5 69,75 bc 3,08 CUJ '" I 99,80 a 77 Compatível

33 32/48 0,075 67,50 cd 1,35 b 99,73 a 64 Mod. tóxico 0,10 67,00 d 1' 11 b 99,63 a 61 Mod. tóxico Teste F 25,10** 6,02** 0,8 c.v. (%) 0,36 9,40 2,06 Haiten Controle 75,62 a 4,67 a 99,33 a 0,01 71,86 a 4,07 a 99,06 a 92 Compatível 0,05 67' 62 b 3,56 a 99,33 a 85 Compatível 0,1 72,50 a 3,69 a 99,10 a 89 Compatível 0,5 32,87 c 0,22 b 99,26 a 32 Tóxico 1,0 25,50 d 0,35 b 98,86 a 29 Tóxico Teste F 1186,26** 58,75** NS c.v. (%) 0,61 3,57 1' 80 Agral Controle 77,25 a 8,15 a 98,83 a 0,01 70,12 a 5.32 ab 98,23 a 81 Compatível 0,05 54,87 b 4,52 b 99,10 a 67 Compatível 0,1 41,87 c 1,74 c 98,66 a 45 Mod. tóxico 0,5 22,00 d 0,00 d 98,73 a 23 Tóxico 1,0 23,00 d 0,00 d 98,56 a 24 Tóxico Teste F 196,95** 40,35** NS c.v. (%) 1,78 6, 10 1' 64 Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com o agente tensoativo com ação emulsificante Tabela 9. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium ani iae com o a te tensoa ti vo com a emulsificante em várias doses e classificação toxicológ~ca. Agente e Crescimento Esporulação Germinação Índice Classificação doses (%) (mm) (x 10 9 (%) biológico Toxicológica

34 33/48 con. /col.) Lauril éter sulfato de sódio Controle 7lf25 a 6f37 ab 99f80 ab Of01 72 f 00 a 6f54 a 99f86 a 102 Compatível Of05 70f00 a 3f90 bc 99fl0 c 82 Compatível Of1 70f00 a 3f94 bc 99f33 bc 83 Compatível Of2 50f75 b 2f32f cd ofoo d 49 Mod. tóxico Of3 38f25 c Of93 de ofoo d 31 Tóxico Of4 35f00 c Of71 de ofoo d 28 Tóxico Of5 29f25 c Of57 e ofoo d 23 Tóxico 1f0 17f25 d Of07 e ofoo d 12 Tóxico Teste F 75f70** 35f88** 6209f48** c.v. (%) 2f63 5fl6 2f61 tibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com o agente estabilizante e alcalinizante Tabela 10. Compatibilidade do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae com o agente estabilizante e alcalinizante em várias doses e classificação toxicológica. Esporulação Agente e Crescimento Germinação Índice Classificação (x 10 9 doses (%) (mm) (%) biológico Toxicológica con. /col.) Trietanolamina Controle 73f50 d 4f40 a 99f63 a Of01 75f50 bc 3f85 a 99f36 ab 96 Compatível Of05 77fl2 abc 4f80 a 99 f 56 a 106 Compatível Of1 78f75 ab 3f82 a 99f56 a 98 Compatível Of5 80f25 a 4f35 a 90f40 a 104 Compatível 1f0 74f25 c 3f72 a 99f36 ab 94 Compatível 2f0 60f00 d 2f64 ab 99f23 ab 74 Compatível

35 34/48 3,0 45,00 e 1,24 bc 98,13 bc 51 Mod. Tóxico 4,0 38,75 f 0,47 c 97,16 c 39 Tóxico Teste F 637,13** 9,51** 8,50** c. v. (%) 0,46 6, 16 1,51 Dispersão de conídios do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae pelos agentes dispersantes Tabela 11. Dispersão de conídios do isolado JAB 68 de Metarhizium ani iae utilizando várias doses dos a tes dispersantes Porcentagem de conídios individualizados ou Dispersante agrupados Doses (%) Individu Grupo Grupo Grupo Grupo ais de 2 de 3 de 4 de 5 Grupo de 6 ou mais 13,39 0,1 77,30 a 4,18 a 2,38 a 1,82 a 0,90 a a 1,62 0,2 83,78 a 9,76 a 3,53 a 0,29 a 1,00 a ab 11' 84 1,80 0,3 81,03 a 3,69 a 0,95 a 0,66 a a ab Tween 80 11' 87 0,4 81,32 a 5,03 a 0,44 b 1,04 a 0,27 a a 1' 64 0,5 83,63 a 9,88 a 3,46 a o' 64 a 0,73 a ab 14,16 2,00 o' 6 79,51 a 3,41 a 0,76 a 0,15 a a ab 14,76 1' 64 0,7 77,86 a 3,82 a 0,84 a 1,06 a a ab 10,90 1' 94 0,8 83,64 a 2,41 a 0,77 a 0,30 a a ab

36 35/48 13,19 1,91 o, 9 78,68 a 3,98 a 1,53 a 0,69 a a ab 12,54 1,77 1,0 82,21 a 2,30 a 0,85 a 0,32 a a ab 10,60 1,45 0,01 84,47 a 2,76 a 0,49 a 0,22 a a ab 11,32 1,75 0,02 81,93 a 3,57 a 0,69 a 0,72 a a ab 13,68 1,79 Unitol L-20 0,03 79,66 a 3,99 a 0,25 a 0,61 a a ab 12,17 1,38 0,04 83,66 a 1,48 a 0,30 a 0,99 a a ab 12,66 0,81 0,05 83,18 a 2,01 a 0,40 a o, 92 a a ab Teste F Tratamentos NS NS NS 1' 8 8NS 1' 5 9NS NS Tween 80 x Unitol L- 20 Doses dentro de Tween 80 Doses dentro de Unitol L-20 2, NS 2, 9 0,7 8,68** 0,0 1, 6 1,4 0 f 2 8NS 2,64* 1,3 1 r 3 6NS 0,7 0 r 51NS 1,5 0 f 9 9NS o, 6 0,8 c. v. (%) 3,93 11,22 31,40 24,34 55,26 69,61 Dispersão de conídios do isolado JAB 68 de Metarhizium anisopliae em óleos. Tabela 12. Dispersão de conídios do isolado JAB 68 de Metarhizium ani iae em vários óleos e odos de ag~ t açao Fatores Analisados Porcentagem de conidios individualizados ou agrupados I I Grupo I Gr ~ I I de 6

37 36/48 ais de 2 de 3 de 4 5 ou mais Óleos (A) 18,18 Isoparafina 65,83 ab 7,44 a 4' 98 a 1,98 a 1,57 ab ab Soja 59,92 bc 21,96 a 8,85 a 4,54 a 2,05 a 2,66 ab 20,56 Amendoim 60,17 bc 7,80 a 5,16 a 3,44 a 2,84 ab ab Milho 60,09 bc 22,20 a 8,39 a 5,29 a 2,77 a 1,23 ab 18,90 Cano la 58,02 c 10,45 a 5,54 a 3,05 a 3,71 a ab 20,69 Girassol 58,64 c 10,39 a 4,64 a 2,34 a 3,26 ab ab 18,31 Oliva 60,84 bc 7' 90 a 6,44 a 2,85 a 3,63 a ab Quimióleo 67,45 a 16,93 b 8,C6 a 4,30 a 2,56 a 0,67 b 63,43 18,43 Natur'L Oil 7' 69 a 5,85 a 2,60 a 3,28 ab abc ab 19,42 Mineral 59,99 bc 8' 86 a 5,59 a 2,74 a 3,37 ab ab Teste F 4,86** 3,14** 1 r 54 NS o' 8 ONS 0 r 54NS 3,18** dms (5%) 3,88 3,27 3,97 5,62 0,14 o' 16 Períodos de agitação (B) 2 minutos 59,11 b 20,21 a 8' 19 a 6,07 a 3,20 a 3,21 a 5 minutos 60,93 ab 19,48 a 8,65 a 5,11 ab 2,36 a 3,45 a 10 minutos 61,06 ab 20,08 a 8' 64 a 5,25 ab 2,49 a 2,44 a 15 minutos 63,33 a 19,26 a 8,35 a 5,18 ab 2,04 a 1,81 a 20 minutos 62,77 ab 18,76 a 9,C8 a 4,05 b 3,12 a 2,2 a Teste F 2,79** 0,7 0,3 2,66** 1,7 2' 1 dms (5%) 2,35 1,98 2,41 3,41 0,08 0,09