EXPRESSÃO DO PCNA E p53 EM LEUCOPLASIAS DE MUCOSA JUGAL COM DIFERENTES GRAUS DE QUERATINIZAÇÃO (GRAUS I, II E III DE GRINSPAN)

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1 MELAINE DE ALMEIDA LAWALL EXPRESSÃO DO PCNA E p53 EM LEUCOPLASIAS DE MUCOSA JUGAL COM DIFERENTES GRAUS DE QUERATINIZAÇÃO (GRAUS I, II E III DE GRINSPAN)

2 MELAINE DE ALMEIDA LAWALL EXPRESSÃO DO PCNA E p53 EM LEUCOPLASIAS DE MUCOSA JUGAL COM DIFERENTES GRAUS DE QUERATINIZAÇÃO (GRAUS I, II E III DE GRINSPAN) Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Campus de Araçatuba, para obtenção do título de Mestre, pelo Curso de Pós-graduação em Odontologia. Área de Concentração: Estomatologia. Orientador: Prf. Dr. Marcelo Macedo Crivelini Araçatuba 2003

3 Dedicatória DEDICATÓRIA A Deus, que me proporciona saúde, fé e companhia para transpor os obstáculos de minha vida. Aos meus pais, Claudinê do Valle Lawall e Maria de Lourdes de Almeida Lawall, meus maiores exemplos. Aqueles que me ensinaram a ver o mundo real e ao mesmo tempo a perseguir todos os meus sonhos. Aos meus irmãos Marisa, Júlio, Mônica e Augusto que apesar de distante, estiveram sempre presentes em cada passo do meu caminho. Ao meu querido namorado José Flavio Affonso de Almeida, que esteve do meu lado em todos os instantes me estimulando e auxiliando. Por todo amor e compreensão. Se ninguém te ama, minha alegria é te amar. Se choras, quero consolar-te. Se és fraco, dar-te-ei minha força. Se ninguém precisa de ti, eu te procuro. Se és inútil, eu não posso passar sem ti. J. Fernández Maraties

4 Agradecimentos AGRADECIMENTOS Ao Professor Marcelo Macedo Crivelini, pela competência e eficiência com que conduziu a orientação deste trabalho. Aos Professores Renata Callestini, Norberto Perri Moraes, Glauco Issamu Miyahara, Alvimar Lima de Castro, Éder Ricardo Biazzola, Elerson Gaetti Jardim Júnior e Gilson Machado D antonio, pelos ensinamentos transmitidos durante toda a minha jornada. Aos professores Ana Maria Pires Soubhia, Cléa Adas Saliba Garbin e Wilson Roberto Poi que foram grandes mestres e mais que isso, grandes amigos durante todo o curso. Ao professor Eloi Dezan Júnior, pela ajuda na realização do trabalho e pela amizade. Os professores ideais são os que se fazem de pontes, que convidam os alunos a atravessar e depois, tendo facilitado a travessia, desmoronam-se com prazer, encorajando-os a criarem as suas próprias pontes.

5 Agradecimentos Aos funcionários do Departamento de Patologia e Propedêutica Clínica, Elaine Cristina Francischini Ferreira, José Carlos de Mendonça Neto, José Marcelo Tramarim, Luzia Maria de Oliveira Francischini, Maria Aparecida Martins da Silva, Marli Barbosa dos Santos e Washington de Brito Martins, pela colaboração, carinho e ajuda inestimável que me prestaram, o meu especial agradecimento. Aos amigos do curso de pós-graduação, que lutaram comigo nesta jornada, pelo espírito de solidariedade nos momentos difíceis e na expectativa de uma amizade duradoura. Aos meus queridos Vera Lúcia Gomes Affonso de Almeida e Honor Affonso de Almeida, que foram verdadeiros pais durante todo esse tempo. A minhas queridas amigas Thaís Gebrim Costa, Mirna Sato Nacano, Virgínia Ruiz Zimmer, Thaís Mara Manfrin e Lívia Guimarães Zina que tanto me estimularam a lutar pela realização desse sonho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP por ter viabilizado o desenvolvimento desse trabalho.

6 Sumário SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Conceito e terminologia Etiologia Associação com Candida sp Epidemiologia Aspectos Clínicos Histopatologia Classificação de Grinspan Pré-malignidade e Transformação Maligna AgNOR e transformação maligna Imuno-histoquímica p PCNA PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODO Seleção dos casos e análise morfológica Imuno-histoquímica

7 Sumário 5 RESULTADO Morfologia p PCNA Análise Estatística Tabelas Figuras DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS RESUMO ABSTRACT

8 Lista de Figuras LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Hiperqueratose em leucoplasia Grau I de Grinspan. H.E. 200x Figura 2 - Hiperqueratose em leucoplasia Grau II de Grinspan. H.E. 200x Figura 3 - Hiperparaqueratose e papilomatose em leucoplasia Grau III de Grinspan. H.E.50x Figura 4 - Expressão basal e parabasal do p53. Leucoplasia Grau I de Grinspan. 400x Figura 5 - Expressão basal e parabasal do p53. Leucoplasia Grau II de Grinspan. 400x Figura 6 - Expressão basal do p53. Leucoplasia Grau III de Grinspan. 400x Figura 7 - Marcação utilizada na contagem de células no epitélio de uma das leucoplasias (Grau I de Grinspan) com expressão do p x Figura 8 - Expressão do PCNA nas camadas basal, parabasal e espinhosa de leucoplasia Grau I de Grinspan. 200x Figura 9 - Expressão do PCNA nas camadas basal, parabasal e espinhosa de leucoplasia Grau II de Grinspan. 200x Figura 10- Expressão do PCNA restringindo-se às camadas basal e parabasal em leucoplasia Grau III de Grinspan. 100x Figura 11- Marcação utilizada na contagem de células no epitélio de uma das leucoplasias (Grau I de Grinspan) com expressão do PCNA. 200x

9 Lista de Tabelas LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Anticorpos empregados 68 Tabela 2 - Dados clínicos referentes às lesões estudadas 75 Tabela 3 - Número de células coradas pelo p53 em extensão epitelial de aproximadamente µm (Aumento de 400) 75 Tabela 4 - Número de células coradas pelo PCNA em extensão epitelial de aproximadamente µm (Aumento de 400x) 76 Tabela 5 - Análise de variância do número de células coradas pelo p53_ 76 Tabela 6 - Análise de variância do número de células coradas pelo PCNA 76

10 Lista de Abreviaturas e Siglas LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS C = graus Celsius % = porcentagem µm = micrômetro AgNOR = do inglês Argirophilic Nucleolar Organizer Region, nome dado a técnica de impregnação das NORs pela prata (Ag) bcl2= proteína bcl2 BSA = do inglês Bovine serum albumine, traduzido como albumina sérica bovina D1 = ciclina D1 DNA = do inglês Deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucléico DO-7 = anticorpo anti-p53 G1 = do inglês Gap, traduzido como intervalo G1. É o intervalo pósmitótico e pré-síntese de DNA G2 = do inglês Gap, traduzido como intervalo G2. É o intervalo durante o qual não ocorre síntese de DNA GMC 7,07 = programa de computador H&E = hematoxilina e eosina H 2 O 2 = dióxido de hidrogênio HCl = cloreto de hidrogênio KD = Kilo-dalton, unidade de peso molecular Ki-67 = antígeno ki-67 MDM2 = gene MDM2 mm = mili-molar NORs = do inglês Nucleolar Organizer Regions, traduzido como regiões organizadoras nucleolares p16 = proteína p16 p27 = proteína p27

11 Lista de Abreviaturas e Siglas prb = proteína Rb p53 = proteína p53 ou gene p53 PC 10 = anticorpo anti-pcna PCNA = do inglês Proliferating Cell Nuclear Antigen, traduzido como antígeno nuclear de proliferação celular ph = potencial hidrogeniônico rrna = do inglês Ribosomic Ribonucleic Acid, traduzido como ácido ribonucléico ribossômico S = refere-se a fase do ciclo celular na qual ocorre a síntese do DNA SABC = do inglês Streptavidin-Biotin Complex, traduzido como complexo Streptavidina-Biotina Tris = Tris-hidroxi-metil-aminometano USP = Universidade de São Paulo W = watt WHO = do inglês World Health Organization, traduzido como Organização Mundial da Saúde

12 INTRODUÇÃO Introdução

13 Introdução 13 1 INTRODUÇÃO Certas alterações na mucosa bucal podem preceder o desenvolvimento do câncer e compõem o grupo das lesões denominadas pré-malignas ou cancerizáveis. Dentre essas lesões pré-malignas a mais comum é a leucoplasia. Leucoplasia é um termo eminentemente clínico, utilizado para definir lesões predominantemente brancas que não podem ser identificadas como outras doenças nem clínica, nem histologicamente. Grande parte dessas lesões felizmente não têm nenhum tipo de alteração morfológica pré-maligna. Contudo, existem lesões que sofrem o processo de malignização o que torna necessário o estudo mais aprofundado das mesmas. O potencial de malignização das leucoplasias sempre esteve associado à presença ou ausência de displasia. Entretanto, a literatura vem comprovando que a avaliação das displasias é muito subjetiva e que leucoplasias com essas alterações nem sempre sofrem malignização enquanto outras, sem displasias, podem transformar-se em carcinomas. Assim, tornou-se interessante a busca de informações que identificassem alterações nas células epiteliais antes mesmo do desenvolvimento das displasias. Exemplo disso seria o uso imuno-histoquímico de biomarcadores que esclareçam o processo da carcinogênese e que contribuam para o desenvolvimento de parâmetros para o diagnóstico, prognóstico e tratamento das leucoplasias.

14 Introdução 14 A técnica imuno-histoquímica com anticorpos específicos de proliferação celular ou malignização vem sendo amplamente empregada para melhorar nossos conhecimentos a respeito de lesões potencialmente malignas que ditam o desenvolvimento dos carcinomas, independente da presença de alterações morfológicas reconhecidas. Assim, estudamos a proteína p53 e PCNA, a fim de verificar se existe alguma correlação entre o grau de queratinização das leucoplasias e a expressão desses marcadores, sem que as lesões apresentem sinais de displasia.

15 REVISÃO DA LITERATURA Revisão de Literatura

16 Revisão de Literatura 16 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Conceito e Terminologia Atualmente, o conceito mais aceito de leucoplasia descreve a lesão como sendo uma mancha ou placa branca que não pode ser removida por raspagem e não pode ser caracterizada clínica ou histológicamente como outra doença, sendo um termo eminentemente clínico (WHO, 1978). 106 O termo leucoplasia foi usado durante anos de maneira ambígua, assumindo significado histológico para alguns autores e clínico para outros, o que proporcionou resultados e interpretações errôneas de diversos trabalhos (Áxell,1987). 1 Schwimmer 85 em 1877, foi quem primeiro usou a denominação leucoplasia para descrever lesões esbranquiçadas anteriormente denominadas ictiose, tilose, ou psoríase bucal. Já em 1946/1947, Hobaek 42 restringiu o uso do termo leucoplasia para aquelas lesões que se apresentavam como placas brancas de forma irregular com distribuição variada pela mucosa bucal, apresentando-se mais freqüentemente como lesão única. Em 1954, Kollar et al. 48 sugeriram descontinuar o uso da palavra leucoplasia como termo diagnóstico e adotar a seguinte nomenclatura histológica para as lesões pré-neoplásicas e neoplásicas de aspecto esbranquiçado: 1) hiperplasia; 2) hiperqueratose simples; 3)

17 Revisão de Literatura 17 hiperqueratose complexa; 4) câncer intraepitelial e 5) carcinoma epidermóide. Bernier, 13 em 1955, sugeriu que a denominação leucoplasia fosse dada somente para lesões que apresentassem disceratose histologicamente, o que conotaria sua pré-malignidade, e sugeriu o termo pachyderma oralis na ausência do quadro histológico. Da mesma forma Shira, 89 em 1957, afirmou que o termo leucoplasia era utilizado para descrever lesões que na maioria das vezes representavam espessamentos benignos da mucosa, sem considerar sua conotação prémaligna. A utilização do termo leucoplasia somente no sentido clínico passou a ser mais amplamente aplicado após 1960 com Waldron & Shafer (1975), 103 apesar de ter sido sugerido anteriormente por outros autores. Pindborg et al. (1963) 71 conceituaram leucoplasia como uma lesão esbranquiçada que não pudesse ser removida por raspagem e nem ser diagnosticada como outra lesão. Silverman Junior & Rozen 90 em 1968, acrescentaram à definição de Pindborg et al. (1963) 71 a impossibilidade das lesões desaparecerem mesmo com a remoção de agentes irritantes. Em 1968, Lemmer & Shear 52 utilizando o termo leucoplasia com sentido histológico, determinaram que em tais lesões a presença de displasia de discreta a severa seria critério essencial para seu

18 Revisão de Literatura 18 diagnóstico. Contrariando esse conceito, Califano & Caputo (1969) 20 descreveram as leucoplasias como manchas ou placas brancas sobre a mucosa oral, que não poderiam ser removidas por raspagem, não poderiam ser classificadas nem clínica nem histológicamente como outras enfermidades e que caracterizavam-se por hiperqueratose sem displasia celular. Já a WHO 106, em 1978, recomendou que o termo leucoplasia deveria ser usado somente para descrição clínica de placas ou manchas brancas que não pudessem ser caracterizadas clínica ou histológicamente como outra doença, e que o uso desse termo não poderia estar relacionado à presença ou ausência de displasia. Em 1984, Axéll et al. 2 acrescentaram à definição da WHO 106 que as leucoplasias não poderiam ser associadas com nenhum agente causal físico ou químico, exceto o uso de tabaco. Determinaram que a descrição completa de uma lesão leucoplásica compreenderia características etiológicas, clínicas, topográficas e histológicas. Assim, classificaram as leucoplasias de acordo com seus fatores etiológicos em leucoplasias idiopáticas, aquelas que não possuíam fator etiológico definido e leucoplasias associadas ao tabaco, representadas por manchas ou placas esbranquiçadas associadas ao uso do tabaco ou resultantes desse hábito. As demais lesões que possuíssem uma causa local determinada receberiam o nome de acordo com seus fatores etiológicos conhecidos e não se chamariam leucoplasias, como por exemplo lesões friccionais, lesões associadas a restaurações dentais.

19 Revisão de Literatura 19 Posteriormente, em 1996, Axéll et al. 3 alteraram sua definição de leucoplasia considerando apenas aquelas lesões predominantemente brancas da mucosa bucal que não pudessem ser caracterizadas como nenhuma outra doença definida. Além disso, criaram o diagnóstico provisório, que seria realizado a nível clínico, e o diagnóstico definitivo que requereria a exclusão de fatores etiológicos. Caso a lesão persistisse, haveria a necessidade de um exame histopatológico. 2.2 Etiologia Em 1900, Paget 67 relacionou a leucoplasia ao uso do tabaco chamando-a de mancha branca do fumante. Já Butlin 19 em 1855, considerou a mancha do fumante como um estágio precoce de uma lesão branca mais avançada denominada por ele como leucoma. Diversos outros autores como Hobaek (1946/1947); 42 Lemmer & Shear (1968); 52 Mehta et al. (1969); 60 Pindborg (1971); 69 Waldron & Shafer (1975); 103 Bánóczy (1977); 5 a WHO (1978); 106 Áxell et al. (1984); 2 Gupta et al. (1992) 39 e van Der Wall (1995) 99 associaram o fumo ao desenvolvimento de lesões leucoplásicas. Para Mehta et al. (1969) 60 a localização intra-oral dessas lesões variou de acordo com os hábitos tabagistas dos indivíduos, estando assim as lesões de mucosa labial associadas ao hábito de hookli smoking e as lesões de palato associadas ao hábito de fumar o cigarro ao contrário. Já para Bánóczy (1977) 5 o fumo favorecia o desenvolvimento das leucoplasias, enquanto

20 Revisão de Literatura 20 fatores mecânicos, o álcool e diferenças de potencial elétrico atuariam como fatores etiológicos somente quando em associação. A sífilis foi relatada como possibilidade etiológica das leucoplasias por Sturgis & Lund 93 em 1934, quando observaram a transformação maligna de 6 casos. Fatores como consumo abusivo de álcool, sífilis, má higiene oral, próteses mal adaptadas, Síndrome de Plummer-Vinson, galvanismo e insuficiência renal ou hepática foram relacionados por Hobaek (1946/1947) 42 ao desenvolvimento de lesões leucoplásicas. Pindborg (1971) 69 igualmente associou o aparecimento de leucoplasias às condições sistêmicas da sífilis e disfagia sideropênica (caracterizada pela deficiência de ferro Síndrome de Plummer-Vinson), além da fibrose submucosa (associação a carcinógenos presentes no fumo e epitélio extremamente atrófico). Para Shafer et al. (1985) 86 a etiologia das leucoplasias era bastante variada, sendo o tabaco, álcool, irritação local, deficiências vitamínicas, distúrbios endócrinos e radiação ultravioleta os fatores mais responsabilizados pelo seu aparecimento. Gupta et al. (1992) 39 através de um trabalho de prevenção de câncer oral com moradores rurais na Índia, puderam perceber que a diminuição do uso de tabaco levou a uma taxa de incidência de leucoplasias significativamente menor e conseqüentemente à uma diminuição do risco de câncer oral, visto que tais doenças estariam

21 Revisão de Literatura 21 intimamente relacionadas segundo o autor. Do mesmo modo, van Der Waal et al. (1997) 101 afirmou que o abandono do hábito de fumar mostrou ser uma medida efetiva na diminuição da incidência de leucoplasias e conseqüentemente do câncer oral. Löning et al. (1984) 56 através de um estudo realizado com papilomas e leucoplasias orais puderam verificar a presença do papiloma vírus nessas lesões o que levou-os a sugerir que agentes virais estariam envolvidos na etiologia de parte das lesões epiteliais escamosas. Greer Junior et al. (1990) 36 estudaram a presença de DNA genômico do papilomavirus humano em lesões de boca através da hibridização in situ. Os autores encontraram presença maior do vírus nas lesões verrucosas benignas ou malignas e nas leucoplasias associadas ao fumo. Tais achados corroboram com aqueles obtidos por Lind et al. (1986) 54 e Löning et al. (1984) Associação com Candida sp. A candidose vem sendo associada ao desenvolvimento de lesões leucoplásicas há anos. Jepsen & Winther (1965) 44 identificaram a presença de Candida sp. em 91% das leucoplasias salpicadas, através de cultura e observação histopatológica. Após tratamento com antifúngico todas as lesões passaram a se apresentar como lesões esbranquiçadas, homogêneas com superfície ligeiramente enrugada.

22 Revisão de Literatura 22 Cawson (1966) 22 observou a presença de hifas de Candida sp. em 15 das 138 leucoplasias que estava acompanhando. Segundo o autor, o papel exato desse fungo na produção das lesões não pôde ser definido o que o fez sugerir três hipóteses: a primeira, na qual a presença da Candida sp. poderia ser coincidência, não apresentando papel relevante na natureza patológica da lesão; a segunda, na qual a Candida sp. poderia ser responsável em parte, pelas alterações vistas; e a terceira, na qual a Candida sp. poderia ser a causa única, e a lesão poderia ser, de fato, um exemplo de candidíase crônica. Roed-Petersen et al. (1970) 77 tentaram relacionar a presença de Candida sp. às leucoplasias com atipia epitelial. Os autores não encontraram esta associação embora tenham observado a presença desse fungo em 67% dos casos estudados. Pindborg (1971) 69 afirmou que as leucoplasias salpicadas ou nodulares poderiam estar associadas à infeção por Candida sp. Em um estudo a respeito das alterações progressivas e regressivas apresentadas pelas leucoplasias, Bánóczy & Sugar (1975) 9 encontraram altas taxas de mudanças entre os tipos clínicos naquelas lesões que apresentavam-se contaminas por Candida sp. Em um outro estudo, Bánóczy (1977) 5 encontrou 13,5% das lesões leucoplásicas contaminadas por Candida sp. Entre as lesões leucoplásicas erosivas, 61% apresentavam essa contaminação seguindo a mesma proporção apresentada pelo grupo de carcinomas. Esses achados confirmaram a

23 Revisão de Literatura 23 associação entre o tipo clínico da lesão e a contaminação por Candida sp. e ainda a relação com a displasia constatada através da análise histopatológica. 2.4 Epidemiologia Mehta et al. (1969) 60 realizaram um estudo com adultos habitantes rurais em quatro estados da Índia a fim de determinar as taxas de prevalência de câncer e leucoplasia nessa população. Segundo os autores, a prevalência das leucoplasias variou entre 0,2 a 4,9% entre os estados. Bouquot & Gorlin (1986) 15 realizaram um levantamento de lesões brancas queratóticas na população americana. Segundo os autores, as leucoplasias são as lesões normalmente mais diagnosticadas e as lesões queratóticas mais comuns, atingindo níveis de prevalência de 28,9/1.000 americanos com idade acima dos 35 anos e numa proporção de dois homens para cada mulher acometida. Axéll (1987) 1 avaliando a ocorrência de leucoplasias e outras lesões orais em adultos suíços encontraram uma prevalência de 3,6% de leucoplasias, predominantemente em homens na faixa etária de 55 a 64 anos.

24 Revisão de Literatura Aspectos Clínicos Hobaek (1946/1947) 42 descreveu dois tipos clínicos de leucoplasias chamados: leucoplasia simples e leucoplasia verrucosa, onde o segundo tipo era simplesmente o desenvolvimento do primeiro. As lesões planas apresentavam-se ao nível da mucosa, com coloração branco-acinzentada, não infiltrativas à palpação, algumas vezes com a superfície ligeiramente enrugada e assintomáticas. Esse tipo de lesão poderia permanecer sem alterações por anos ou sofrer transição para o tipo verrucoso de forma natural. Assim, se tornariam lesões espessas, infiltrativas, com fissuras ou pequenas ulcerações em sua superfície, a qual se apresentaria papilomatosa e algumas vezes sintomática. Seriam lesões freqüentemente de língua, lábios ou mucosa jugal e acometeriam principalmente homens com idade variando entre 50 e 70 anos. Sugár & Bánóczy (1969) 94 descreveram três tipos clínicos de leucoplasias: Tipo I - leucoplasia simples, apresentando-se histologicamente como mucosa queratinizada; Tipo II - leucoplasia verrucosa com proliferações verrucosas; Tipo III - leucoplasia erosiva, lesão branca com áreas eritematosas e erosivas. Em 1965, Baroncelli & Questa 11 descreveram as leucoplasias como lesões crônicas que poderiam aparecer em várias regiões da boca (bochecha, língua, lábio, palato) e que se manifestariam na forma de placas brancas de superfície irregular, consistência firme, algumas vezes

25 Revisão de Literatura 25 ulcerada, apresentando tendência a confluir com aspecto de carta geográfica. As leucoplasias foram descritas por Lemmer & Shear (1968) 52 como lesões específicas pré-malignas, usualmente indolores, que apareciam em qualquer parte da mucosa, em pessoas de meia idade ou idosos, normalmente sobre a língua ou mucosa jugal. Essas lesões caracterizavam-se por manchas brancas de várias espessuras, as quais poderiam elevar-se por cima da mucosa circundante e apresentar textura áspera. As manchas poderiam ser de qualquer tamanho e uniformemente brancas ou seriam representadas por áreas opacas, entre as quais se veria a cor vermelha do tecido vascular que as rodeava. Ocasionalmente poderiam haver ulcerações e os casos avançados teriam a aparência de manchas delgadas, com fissuras brancas e secas. Em 1971, Pindborg 69 subdividiu as leucoplasias em dois grupos: 1) leucoplasias homogêneas, que corresponderiam às lesões de aparência uniforme; 2) leucoplasias salpicadas, que corresponderiam às lesões caracterizadas pela ocorrência simultânea de placas brancas e vermelhas. As áreas vermelhas representariam regiões de atrofia epitelial, enquanto as áreas esbranquiçadas representariam regiões de hiperplasia epitelial. Silverman Junior et al. (1976) 92 acreditavam que a prevalência das leucoplasias aumentaria com a idade, estaria ligada ao hábito de fumar associado ou não ao consumo de outros produtos como pan ou supari

26 Revisão de Literatura 26 e era maior em homens devido à maior porcentagem de indivíduos desse sexo com hábitos orais de fumo. Além disso, a mucosa jugal foi o lugar de maior ocorrência das leucoplasias, seguida pela mucosa labial. Para a WHO (1978) 106 as leucoplasias poderiam apresenta-se de diversas formas, variando de placas pequenas e circunscritas a placas extensas, envolvendo boa parte da mucosa oral. Sua aparência poderia ser variável, com superfície lisa ou enrugada, e algumas vezes, lesões com superfície lisa poderiam ser cortadas por pequenas rachaduras adquirindo o aspecto de barro rachado. Quanto à coloração poderiam ser brancas, amarelo-esbranquiçadas, ou acinzentadas, e quanto à forma poderiam ser homogêneas ou nodulares, ou ainda pontilhadas, mostrando proliferações exofíticas brancas em uma base vermelha. Axéll et al. (1984) 2 classificaram as leucoplasias clinicamente em homogênea ou simples, nos casos de lesões uniformemente esbranquiçadas, com superfície lisa ou corrugada; e leucoplasias nãohomogêneas aquelas que envolviam as eritroleucoplasias, as leucoplasias nodulares e as verrucosas. As eritroleucoplasias (leucoplasias erosivas) se caracterizariam por lesões que incluiriam áreas eritematosas. As leucoplasias nodulares se apresentariam como lesões com projeções ligeiramente elevadas, arredondadas, esbranquiçadas ou vermelhas que poderiam ser descritas como grânulos ou nódulos. Já as leucoplasias verrucosas seriam lesões exofíticas com projeções irregulares, agudas e obtusas.

27 Revisão de Literatura 27 No estudo de Bouquot & Gorlin (1986) 15, as leucoplasias atingiram principalmente o vermelhão do lábio e a mucosa jugal, e cerca de 7% das lesões apresentavam carcinoma invasivo inicial ou displasia severa microscopicamente. van Der Waal (1995) 99 descreveu as leucoplasias como as lesões pré-malignas mais comuns da cavidade bucal. Segundo o autor, a leucoplasia alcançaria sua incidência máxima em adultos acima dos 50 anos de idade, sendo os homens afetados geralmente antes das mulheres. Para Axéll et al. (1996) 3 as variantes clínicas da leucoplasia seriam apenas as lesões homogêneas e as não-homogêneas. As lesões homogêneas deveriam apresentar-se predominantemente brancas, com aspecto uniforme, aparência delgada podendo exibir fendas superficiais e ainda superfície plana, enrugada ou corrugada com textura consistente em toda sua extensão. Já as lesões não-homogêneas deveriam apresentar-se predominantemente brancas ou brancas e vermelhas e poderiam ser irregularmente planas, ondulares ou exofíticas. As lesões nodulares possuiriam projeções elevadas, arredondadas, vermelhas e/ou brancas e as lesões exofíticas, projeções irregulares rombas ou pontiagudas.

28 Revisão de Literatura Histopatologia Hobaek (1946/1947) 42 afirmou que os principais achados em uma lesão leucoplásica eram hiperplasia epitelial, acantose e um infiltrado inflamatório crônico no tecido conjuntivo subjacente, composto preferencialmente por plasmócitos e linfócitos. Para Lemmer & Shear (1968) 52 a presença de displasia de discreta a severa seria indispensável para o diagnóstico das leucoplasias. A análise histológica de 723 leucoplasias de aspecto salpicado, realizada por Mehta et al. (1969) 60 permitiu constatar a prevalência de atipia epitelial em 59,1% dessas lesões, o que levou-os a concluir que tais lesões teriam maior probabilidade de sofrer transformação maligna. Em 1971, Bánóczy 4 avaliou 150 esfregaços citológicos de pacientes com leucoplasia oral diagnosticadas clinicamente, a fim de comparar os achados citológicos aos dados histológicos das amostras correspondentes, além de estudar a correlação entre os padrões histológicos de queratinização e os tipos clínicos da leucoplasia. Dos casos avaliados, 67 apresentavam hiperortoqueratose, 56 hiperparaqueratose e 27 áreas de para e ortoqueratose entremeadas. Hiperplasia epitelial foi observada em 86% dos casos de hiperparaqueratose, 60% dos casos de hiperorto e hiperparaqueratose associadas e em 42% dos casos de hiperortoqueratose, enquanto disceratose foi encontrada em 10% das hiperortoqueratoses e em 50%

29 Revisão de Literatura 29 das hiperparaqueratoses. Os autores encontraram hiperortoqueratose citológica em 72% das leucoplasias simples e 58% das verrucosas e hiperparaqueratose citológica em 77% das leucoplasias erosivas. A partir desses dados os autores concluíram que o tipo de queratinização pode ser definido por métodos citológicos e que as hiperparaqueratoses são vistas predominantemente em leucoplasias erosivas. Além disso, puderam constatar que carcinomas se desenvolveram preferencialmente a partir de leucoplasias com hiperparaqueratose. Bánóczy & Csiba (1972) 6 realizaram um estudo comparativo entre tipos clínicos e a estrutura histológica de 324 leucoplasias orais, durante um período médio de 8,6 anos, a fim de estabelecer as alterações histológicas que ocorrem nos vários tipos clínicos de leucoplasias (com atenção especial para o padrão de queratinização) e a tendência de cura das várias alterações histológicas no curso dos subseqüentes controles. Os autores puderam observar que os tipos de queratinização variaram de acordo com os tipos clínicos, ocorrendo orto e hiperortoqueratinização na maioria dos casos de leucoplasia simples e verrucosa, e para e hiperparaqueratinização principalmente nos casos de leucoplasia erosiva. Além disso, os autores constataram que enquanto 27% das leucoplasias com orto ou hiperortoqueratinização não sofreram alterações ou aumentaram de tamanho, isso ocorreu em 52% das leucoplasias com para ou hiperparaqueratinização. A partir desses dados, os autores concluíram que há uma certa relação entre as características clínicas e

30 Revisão de Literatura 30 histológicas das leucoplasias e que as características peculiares das leucoplasias podem ter valor diagnóstico e influenciar a terapia a ser aplicada. Waldron & Shafer (1975) 103 através de um estudo longitudinal de espécimes diagnosticadas clinicamente como leucoplasias, puderam observar que 7,6% dos casos analisados histologicamente eram carcinoma espinocelular, carcinoma in situ ou displasia severa e que 12,2% dos casos apresentavam displasia discreta à moderada. Isso levou-os a afirmar que o aspecto clínico das leucoplasias não é um dado seguro para prever os achados microscópicos dessas lesões, tornando as biópsias altamente indicadas. A incidência de alterações, variando de displasia a carcinoma, foi de 42,9% nas lesões de assoalho bucal, 24,2% nas lesões de língua e 24% nas lesões de lábio. A partir desses achados os autores puderam afirmar que a prática da observação clínica das leucoplasias sem biópsia pode ser perigosa, especialmente em lesões de assoalho de boca e língua, onde um número considerável apresenta alterações epiteliais significantes. Bánóczy & Csiba (1976) 7 a fim de definirem a ocorrência de displasias epiteliais em leucoplasias orais, avaliaram 500 cortes histológicos classificados clinicamente como leucoplasias, durante um período de avaliação de 6,3 anos em média. Puderam observar a presença de displasia em 24% dos casos, sendo essa representada principalmente pela estratificação irregular do epitélio e pela presença de

31 Revisão de Literatura 31 cristas interpapilares em forma de gota. Taxa elevada de displasias ocorreu na faixa etária acima dos 50 anos (72,5%), principalmente em homens (86,7%), em língua e lábio inferior, e em leucoplasias do tipo erosivo (68%). Essa alta taxa de displasia foi relacionada a fatores geográficos, ao fumo e a diferentes tipos de tratamento. Para a WHO (1978) 106 as leucoplasias poderiam apresentar diversos aspectos histopatológicos, variando de discreta hiperqueratose associada a acantose até altos níveis de hiperqueratose associada a displasia. Nem sempre os achados histológicos podem ser associados aos achados clínicos. Bánóczy et al. 10, em 1980, correlacionaram as alterações ultraestruturais das leucoplasias com as variantes clínicas e microscópicas da lesão, constatando que as leucoplasias simples e verrucosas caracterizavam-se por abundante queratinização, aumento da quantidade de tonofibrilas, de grânulos de querato hialina e corpos de Odland, assim como sinais de disceratose. Em contraste, as lesões erosivas revelaram evidências de displasia como: defeitos na membrana basal, diminuição de hemidesmossomos, processos patológicos no citoplasma, perda de aderência intercelular, alterações do núcleo e nucléolo, mudanças degenerativas das mitocôndrias e arranjo característico dos ribossomos, assim como alterações características do carcinoma oral em algumas instâncias.

32 Revisão de Literatura 32 Fischman et al. (1982) 30 avaliando 153 leucoplasias diagnosticadas clinicamente constataram, através da biópsia, que 13% dos casos eram carcinomas. Entre os casos diagnosticados clinicamente como carcinoma constataram, através da biópsia, que 33% eram lesões benignas e 36% eram lesões pré-malignas, sugerindo que a biópsia fosse indispensável em todas as lesões suspeita. Pindborg et al. (1985) 70 realizaram um exercício para verificar a subjetividade na avaliação de displasias epiteliais, através da exposição de 9 pôsteres com fotomicrografias, para que patologistas sugerissem o diagnóstico. Os autores puderam encontrar um número amplo de sugestões diagnósticas o que levou-os a afirmar que existe muita subjetividade na definição dos diagnósticos e que seria necessário a criação de um critério internacional de classificação das displasias epiteliais. Para Axéll et al. (1996) 3 os achados histológicos nas leucoplasias consistiam de variados tipos e graus de hiperqueratose, podendo a displasia estar ou não presente e sua severidade ser amplamente variável. Ainda segundo o autor, em uma descrição histopatológica era necessário evidenciar a presença de displasia e sua severidade. van Der Wall et al. (2000) 100 criaram um novo método de classificação e sistema de estadiamento baseado apenas no tamanho das lesões e na histopatologia. Neste sistema focou-se a presença ou ausência de displasia, afim de promover relatos uniformes sobre

33 Revisão de Literatura 33 resultados de condutas e tratamentos de pacientes com leucoplasia oral. Nessa classificação as lesões foram separadas quanto ao tamanho em lesões de até 2 cm, de 2 a 4 cm e maiores do que 4 cm. Quanto ao aspecto histopatológico classificaram as lesões em: 1) lesões sem ou com discreta displasia, 2) lesões com displasia variando de discreta a moderada e 3) lesões com displasia de moderada a severa. Neste caso a biópsia seria indispensável para chegar ao resultado final. 2.7 Classificação de Grinspan Para Grinspan (1973) 37 as leucoplasias seriam definidas a partir de um critério clínico-histopatológico. Clinicamente, as leucoplasias poderiam apresentar-se como lesões brancas ou esbranquiçadas que, semiologicamente, poderiam ser manchas (mudança de coloração sem relevo), queratoses (lesões brancas elevadas, com espessura) ou verrucosidades (elementos elevados, irregulares, papilomatosos). Essas lesões representariam os graus de leucoplasia I, II e III respectivamente. Histologicamente o Grau I teria hiperqueratose ou hiperparaqueratose e acantose discretas, no Grau II a queratinização e a acantose seriam mais acentuadas e o Grau III apresentaria papilomatose e queratinização acentuadas. As lesões displásicas não seriam leucoplasias e sim estágios iniciais de carcinomas in situ.

34 Revisão de Literatura Pré-malignidade e Transformação Maligna Hobaek (1946/1947) 42 realizou um estudo com pacientes com câncer oral onde pôde constatar que 16% dessas lesões desenvolveram-se a partir de leucoplasias, sendo a língua e a região sublingual as áreas mais afetadas. Para o autor, as lesões leucoplásicas deveriam ser consideradas as condições pré-cancerosas mais comuns da cavidade bucal. Kollar et al. (1954) 48 estabeleceram a seguinte descrição histológica para as lesões pré-neoplásicas e neoplásicas de aspecto esbranquiçado: 1) hiperplasia para aquelas lesões que envolvessem apenas um crescimento tecidual representado por uma camada espinhosa com espessura aumentada; 2) hiperqueratose simples para aquelas lesões microscopicamente representadas por um aumento excessivo na espessura das camadas granulosa e córnea, com ou sem componente inflamatório; 3) hiperqueratose complexa para aquelas lesões com hiperqueratose acompanhada por componente inflamatório e disceratose a qual ocorre nas camadas espinhosa e basal do epitélio com presença de células queratóticas únicas, células gigantes e hipercromatismo nuclear na camada basal, 4) câncer intraepitelial representado por lesões com hiperqueratose e uma disceratose excessiva das camadas espinhosa e basal e 5) carcinoma epidermóide para aquelas lesões caracterizadas por uma invasão do tecido conjuntivo por

35 Revisão de Literatura 35 elementos epiteliais, hiperqueratose, disceratose acentuada e uma resposta inflamatória severa. Segundo Waldron & Shafer (1975) 103 a grande diferença existente na literatura quanto a freqüência de transformação malignas das leucoplasias era, em parte, devida a confusão existente na sua definição. Pindborg et al. (1963) 71 avaliaram alterações clínicas e histológicas de malignidade em 185 pacientes que apresentavam lesões leucoplásicas e constataram que das 35 lesões com aspecto clínico de leucoplasia salpicada, 51% apresentavam atipia epitelial e 14% eram carcinomas in situ. A maior incidência foi em homens numa idade média de 54 anos, em região de comissura labial. No mesmo ano, Renstrup (1963) 76 utilizando o conceito de leucoplasia de Pindborg et al. (1963) 71, avaliou a atividade mitótica das leucoplasias classificadas histologicamente como hiperortoqueratoses ou hiperparaqueratoses, através da contagem do número de figuras mitóticas por unidade de comprimento de membrana basal, constatando uma atividade mitótica média quatro vezes maior no grupo de lesões com hiperparaqueratose. Pindborg et al. (1968) 72 avaliaram por um período médio de 3,7 anos um grupo de 248 pacientes com leucoplasias orais a fim de determinar o período de prevalência de transformações malignas. Observaram recorrência em 9,5% dos pacientes que sofreram remoção cirúrgica de suas lesões, desaparecimento completo das lesões em 20,1% dos casos, ausência de alterações em 45,3% das lesões

36 Revisão de Literatura 36 leucoplásicas e transformação maligna em 4,4% dos casos. Os autores concluíram que as leucoplasias são lesões reversíveis, que podem diminuir de tamanho ou mesmo desaparecer completamente. Além disso, constataram que cerca de 70% dos casos que sofreram transformação maligna eram do tipo leucoplasia salpicada, todos apresentavam atipia epitelial e esse processo ocorreu num período de um ano para cerca de 45% dos casos. Assim, concluíram que as leucoplasias do tipo salpicada estão mais freqüentemente relacionadas a atipias epiteliais e conseqüentemente mais sujeitas à transformação maligna e que esse processo tem um curso acelerado. Silverman Junior & Rozen 90, em 1968, avaliaram 117 casos de leucoplasia a fim de relacionar os achados clínicos e histológicos com o desenvolvimento natural dessas lesões. Constataram que 10% dos casos diagnosticados clinicamente como leucoplasias eram carcinomas e 6% desenvolveram transformação maligna num período de até cinco anos. Segundo os autores, esses achados confirmaram o fato das lesões leucoplásicas poderem sofrer malignização. Para eles, o número de casos de transformação maligna poderia variar de acordo com a seleção dos pacientes e com o tempo de proservação, visto que diversos outros trabalhos apresentaram taxas de malignização diferentes. Os fatores que poderiam favorecer a transformação maligna das leucoplasias foram estudados por Bánóczy & Súgar (1972) 8 a partir da análise de 520 lesões orais durante um período médio de 8,7 anos.

37 Revisão de Literatura 37 Destas lesões 33,8% desapareceram, 25,3% aumentaram de tamanho, 26% não sofreram qualquer tipo de alteração, 9% espalharam-se e 5,9% sofreram transformação maligna. Os autores afirmaram que esses resultados poderiam ter sido influenciados pelo número de pacientes analisados, pelo período de observação e por fatores geográficos. Um maior risco para transformação maligna das leucoplasias parecia estar relacionado aos seguintes fatores: persistência das lesões, acometimento do sexo feminino, localização da lesão na margem ou base da língua, combinação de fatores irritantes como o tabaco, o uso excessivo de álcool, a diferença de potencial elétrico entre restaurações e o tipo da leucoplasia, sendo a lesão erosiva a que mais se relacionaria ao processo de malignização. Bánóczy & Súgar (1975) 9 a fim de avaliar a possibilidade e a freqüência de mudanças entre os tipos clínicos de leucoplasias, e estudar os fatores que poderiam influenciar essas mudanças, acompanharam 520 pacientes com leucoplasias durante um período médio de 8,7 anos. Os autores puderam observar alterações regressivas (alteração de um tipo clínico considerado mais agressivo para um menos perigoso) em 9% dos casos e alterações progressivas em 3,7%. A mucosa labial foi a região mais atingida, mas a língua e o assoalho bucal sofreram apenas alterações progressivas (alteração de um tipo clínico considerado menos agressivo para um mais perigoso), levando os autores a sugerirem que seriam áreas de maior tendência à malignização. Além disso, os autores

38 Revisão de Literatura 38 encontraram altas taxas de alterações entre os pacientes tabagistas e entre aqueles que apresentavam lesões contaminadas por Candida sp. A partir desses dados, os autores afirmam que as leucoplasias erosivas têm maior tendência a sofrerem alterações progressivas e desenvolverem um carcinoma oral. Contudo, acreditaram que o desenvolvimento de leucoplasias simples para leucoplasias erosivas e carcinoma poderia ocorrer. Bánóczy & Csiba (1976) 7 verificaram taxa de malignização em 13,2% dos casos e um maior risco desse processo ocorrer nas leucoplasias localizadas na língua. Silverman Junior et al. (1976) 92, em um estudo realizado com trabalhadores industriais em Gujarat na Índia, obtiveram uma taxa de malignização de leucoplasias de 0,13%. Desses casos nenhum apresentava displasia na biópsia inicial e 5 casos diagnosticados clinicamente como leucoplasias apresentaram-se como carcinomas na análise microscópica. Os autores afirmaram que as leucoplasias deveriam ser diagnosticadas microscopicamente e acompanhadas cuidadosamente. Bánóczy (1977) 5 realizou acompanhamento de 670 pacientes com leucoplasia oral e concluiu que a transformação maligna dessas lesões estaria associada a fatores como idade e sexo do paciente, extensão e localização da lesão, infecção por Candida sp., combinação entre fatores etiológicos, presença de displasia e métodos de tratamento.

39 Revisão de Literatura 39 Em um levantamento de 63 pacientes que apresentavam uma forma distinta de leucoplasia oral caracterizada por apresentar-se sempre em assoalho bucal ou ventre de língua, a fim de obter maiores informações sobre o risco de malignização desse tipo de queratose sublingual, Kramer et al. (1978) 49 constataram que 27% dos casos mostraram carcinoma na biópsia inicial e 15% sofreram transformação maligna num período de 1 a 19 anos. Os pacientes que apresentavam carcinoma na biópsia inicial estavam numa faixa etária de 40 a 74 anos (média 59,4 anos) e geralmente eram mulheres (1,3:1). Segundo os autores, alguns fatores clínicos observados como o aspecto nodular das lesões, poderiam indicar uma possível malignização e esse tipo de lesão deveria possuir um maior risco de sofrer transformação maligna. Para a WHO (1978) 106 a taxa de malignização das leucoplasias orais encontra-se entre 3 a 6% e vem diminuindo devido a fatores como a mudança nos padrões da doença. Antigamente, muitos casos de leucoplasia eram associados à glossite sifilítica, e essa combinação era freqüentemente seguida por transformações malignas. Contudo, atualmente, lesões sifilíticas em mucosa oral raramente são encontradas devido ao controle dessa doença. Além disso, para a WHO 106 a variação na definição do termo leucoplasia e na aplicação do mesmo com conotações variadas, segundo cada autor, também levava a diferentes níveis de prevalência de transformação maligna.

40 Revisão de Literatura 40 Segundo Gupta et al. (1980) 38 é necessário levar-se em consideração, quando se estuda a taxa de transformação maligna de leucoplasias, a extensão das lesões, o tipo de população estudada e a abordagem terapêutica utilizada. Para Axéll et al. (1984) 2, a localização das lesões é importante porque lesões aparentemente similares em locais diferentes da mucosa oral poderiam apresentar diferente risco de malignização. Duzentos e cinqüenta e sete pacientes foram acompanhados por Silverman Junior et al. (1984) 91 por um período médio de 7,2 anos, a fim de avaliar características clínicas e fatores associados à transformação maligna de leucoplasias orais. No diagnóstico inicial 235 lesões apresentavam hiperqueratose benigna e 22 apresentavam algum grau de displasia epitelial. Do total de casos, 17,5% sofreram um processo de malignização e 8 desses apresentavam displasia epitelial na biópsia inicial. A malignização foi observada em maior proporção nas mulheres, mas não apresentou relação com a idade dos pacientes. Além disso, algumas características pareciam aumentar o risco de malignização das lesões leucoplásicas, tais como componente eritematoso ou erosivo, aspecto verrucoso da lesão e a presença de displasia, devendo nestes casos serem submetidas a tratamento mais agressivo. Contudo, os autores acreditaram que lesões não displásicas também poderiam sofrer um processo de malignização.

41 Revisão de Literatura 41 Tommasi (1998) 95 relatou que a transformação maligna das leucoplasias, quando não removidas cirurgicamente, ocorreriam em 6% dos casos. Burkhardt (1985) 18 afirmou que o grau de displasia de lesões presumivelmente pré-malignas seria o mais importante indicador de potencial maligno de uma leucoplasia. Contudo, lesões com aspecto histológico aparentemente inofensivo poderiam sofrer malignização. Lind (1987) 53 através de um estudo retrospectivo sobre a incidência de transformação maligna em leucoplasias orais observou o desenvolvimento de carcinomas em 7% dos 157 casos de leucoplasias examinados. O autor afirmou que o exame histológico é indispensável, mas que o grau de displasia parece não ser confiável para servir como único parâmetro usado na previsão do desenvolvimento de um carcinoma. Regezi & Sciubba (2000) 74 relataram que o risco de transformação neoplásica teria importância considerável conforme a região da cavidade oral afetada. Os autores observaram que 50% das leucoplasias de assoalho de boca, quando examinadas microscopicamente, caracterizaram-se por lesões displásicas, carcinoma in situ ou invasivo. As lesões de lábio e língua apresentaram tais alterações em 25% dos casos e, na área retromolar, em 10% dos casos. Tyldesley (1995) 98 afirmou que o potencial de transformação maligna das leucoplasias não poderia ser visto com segurança. Todavia, o local e as características clinicas afetariam o prognóstico, enquanto as características histológicas seriam de suma importância para o

42 Revisão de Literatura 42 comportamento futuro das lesões. Para Castro et al. (2000) 21 as leucoplasias Grau III de Grinspan, especialmente quando exibissem úlceras ou fissuras, possuiriam maior potencial de transformação maligna. Segundo van Der Waal (1995) 99, a transformação maligna poderia ser prevista, até certo ponto, em função da aparência clínica, localização bucal e resultados histológicos da biópsia da lesão. O autor sugeriu que o tratamento deveria ser dirigido principalmente à eliminação dos possíveis fatores causais. No caso de lesões persistentes a remoção era o procedimento mais indicado, devendo os pacientes serem acompanhados durante toda a vida a fim de se detectar previamente possíveis recorrências. Karabulut et al. (1995) 46 comparando as análises histológicas de 100 leucoplasias realizada por quatro patologistas, sendo dois patologistas gerais e dois bucais, puderam verificar altas taxas de discordância nos diagnósticos das displasias epiteliais (55 a 73%), comprovando a subjetividade existente na gradação de displasia de uma lesão. Para Axéll et al. (1996) 3 os resultados histopatológico de biópsias de leucoplasias deveriam incluir a presença ou ausência de displasia e sua severidade, visto o alto risco de malignização de lesões leucoplásicas com displasia. Entretanto, os autores admitiram que leucoplasias que não apresentam displasia em sua biópsia inicial deveriam sofrer transformação maligna.

43 Revisão de Literatura 43 van Der Wall et al. (1997) 101 a partir de uma revisão de literatura sobre leucoplasias afirmaram que embora a displasia epitelial seja um fator importante no processo de malignização, deveria ser considerado que nem todas as lesões displásicas tornam-se malignas e que por outro lado lesões não displásicas poderiam sofrer malignização. A taxa anual de malignização das lesões leucoplásicas é variável nas diversas partes do mundo e o assoalho bucal e a língua são as áreas de maior potencial para sofrer um processo de malignização. Através de um estudo longitudinal de 116 pacientes com leucoplasia, durante um período médio de 29 meses, Schepman et al. (1998) 84, observaram transformação maligna em 20 casos. Desses, 6 casos não apresentavam alteração displásicas na biópsia inicial. A partir desses achados, concluíram que as transformações malignas podem ocorrer em lesões que não apresentam displasia, sem ignorar a subjetividade existente no processo de gradação das displasias. Wright (1998) 107 baseado em uma revisão sobre lesões prémalignas afirmou que seis a dez mutações genéticas devem ocorrer antes das células tornarem-se malignas e que esse processo poderia levar anos, sendo esse período chamado de pré-maligno. As alterações précancerosas à nível celular foram chamadas displasia, e essa displasia e a sua severidade foram considerados os fatores mais precisos para definir o potencial de malignidade de uma leucoplasia. O autor acreditava que lesões que não apresentavam evidência histológica de displasia poderiam

44 Revisão de Literatura 44 ser apenas observadas. Contudo, lesões não displásicas que persistiam por muito tempo deveriam ser consideradas pré-malignas e possuíam uma probabilidade maior de tornarem-se malignas do que a mucosa normal. Schepman et al. (1999) 83 a fim de determinar a presença de leucoplasias em pacientes com carcinoma espinocelular oral avaliaram 100 pacientes diagnosticados histologicamente. Quarenta e sete por cento dos pacientes apresentaram carcinoma concomitantemente com leucoplasias. Desses, 36 apresentavam leucoplasia adjacente ao carcinoma, 8 apresentavam também leucoplasias em outros locais da boca e 11 apresentavam leucoplasias somente em outros locais da boca. Visto que 59% dos carcinomas poderiam ser precedidos ou estavam associados à leucoplasias, os autores sugeriram que uma detecção precoce e um manejo ativo dos pacientes com leucoplasia oral poderiam prevenir o desenvolvimento do câncer oral. Para Warnakulasuriya (2000) 104 os métodos usados na avaliação de atipias e displasia são subjetivos, faltando-lhes sensibilidade para prever de maneira precisa quais lesões seriam potencialmente malignizáveis. Além disso, segundo ele, leucoplasias com displasia discreta ou sem evidências de displasia poderiam sofrer processo de malignização com o tempo.

45 Revisão de Literatura AgNOR As regiões nucleolares organizadoras (NORs) são alças de ácido desoxirribonucléico (DNA) encontradas no nucléolo que são transcritas para ácido ribonucléico (rrna) e estão envolvidas na síntese de ribossomos e de proteínas (Rüschoff et al., 1989). 79 Nos humanos, as NORs estão localizadas no braço curto dos cromossomos acrocêntricos 13,14,15,21 e 22 (Ferguson-Smith & Handmaker, 1961). 29 Goodpasture & Bloom (1975) 34 observaram que certas proteínas relacionadas as NORs podiam ser demonstradas com o uso de um método de coloração pela prata. Tal método foi posteriormente modificado e ficou conhecido como técnica AgNOR (Ploton et al., 1986), 73 onde as proteínas argirofílicas podem ser vistas como pontos escuros no núcleo ou no nucléolo das células. Segundo Fakan & Hernandez-Verdun (1986), 28 o número de AgNORs no núcleo pode refletir a proliferação celular, a transformação maligna, a gradação tumoral, metástases tumorais, recorrências tumorais e o prognóstico de várias neoplasias. Nunes (1991) 66 utilizando a contagem de NORs em leucoplasias orais, pôde observar pequenas variações nos diferentes diagnósticos histológicos. Segundo o autor uma possível explicação para esse fato, estaria na imprevisibilidade do comportamento biológico das leucoplasias. Assim, uma contagem maior ou menor de AgNORs poderia apontar para evolução ou regressão desta lesão, a despeito da graduação histológica.

46 Revisão de Literatura 46 Em 1993, Warnakulasuriya & Johnson 105 avaliaram a marcação de AgNORs em queratoses benignas, displasias epiteliais e carcinomas. Os autores encontraram diferenças expressivas no número médio de marcações entre os grupos de lesões, mas o mesmo não foi observado entre os grupos de lesões analisados individualmente. Em 1994, Pillai et al. 68 utilizando a técnica de AgNOR avaliaram o número de regiões organizadoras nucleares em tecido normal, lesões pré-malignas e malignas da cavidade oral a fim de verificar seu potencial como um marcador biológico para progressão tumoral. Os autores encontraram números maiores de AgNORs em carcinomas do que em leucoplasias e tecido normal. Entre os tipos clínicos de leucoplasias as marcações menos expressivas foram encontradas em lesões homogêneas, enquanto marcações mais expressivas foram encontradas nos casos de leucoplasias salpicadas. Não foram observadas diferenças nas marcações de leucoplasias displásicas e não displásicas, mas essas diferenças existiram entre as lesões displásicas e o epitélio normal. Segundo os autores, ainda que uma significante correlação entre o número de AgNORs e os vários estágios de progressão tumoral tenha sido observada, não foi observada diferença significante entre os estágios individualmente. Chattopadhyay et al. (1994) 24 avaliaram a reação da AgNOR em epitélio normal da mucosa jugal oral, leucoplasias orais e carcinomas espinocelulares. Os autores constataram um maior número de AgNORs

47 Revisão de Literatura 47 em leucoplasias, sendo as marcações menores e mais amplamente espalhadas nas lesões displásicas. Além disso, a marcação nos carcinomas também mostrou-se menor em tamanho, mais numerosa e dispersa pelo núcleo celular e com contorno mais irregular do que no epitélio normal. Os autores sugeriram que como as lesões tornam-se mais displásicas e em última instância malignas, o número de AgNORs tende a aumentar, as marcações tornarem-se mais amplamente dispersas pelo núcleo celular e seus tamanhos tendem a diminuir. Tucci & Crivelini* demonstraram em leucoplasias de mucosa jugal Graus I, II, III de Grinspan, que houve diferença estatisticamente significante entre o número de NORs encontrado nos casos de epitélio normal e leucoplasia Grau I, entre epitélio normal e leucoplasia Grau II e entre leucoplasia Grau III e as outras leucoplasias de Grinspan. As leucoplasias Grau I e II apresentaram maior atividade proliferativa comparando-se com o epitélio normal e leucoplasia Grau III, e a leucoplasia Grau III apresentou proliferação celular igual ao epitélio normal. 2.9 Imuno-histoquímica p53 O gene supressor de tumor p53 localiza-se no braço curto do cromossomo humano 17, na posição 17p13,1 e codifica uma proteína que está envolvida na síntese e reparo do DNA, na plasticidade genômica, na *TUCCI, R., CRIVELINI, M. M. AgNOR em leucoplasias de mucosa jugal grau I, II e III de Grinspan. (No Prelo)

48 visão de Literatura 48 morte celular programada e na regulação negativa do ciclo celular (Donehower & Bradley, 1993; 27 Greenblatt et al., 1994). 35 Nas células normais o gene p53 age como guardião do genoma, percebendo danos ao DNA e evocando uma resposta protetora tanto para bloquear o ciclo celular quanto para induzir apoptoses nas células afetadas (Lane, 1992). 51 Mutações no gene p53 estão entre as alterações genéticas mais freqüentes associadas com as neoplasias humanas (Greenblatt et al., 1994). 35 A proteína p53 tem uma curta vida-média e não pode ser detectada por métodos imuno-histoquímicos. Entretanto, as mutações no gene p53 freqüentemente resultam em um produto genético mais estável que pode ser facilmente detectado por imunocoloração, por isso coloração positiva para p53 tem sido proposta como um indicador indireto dessas mutações (Bennett et al., 1991). 12 Girod et al. (1993) 31 avaliaram 64 lesões pré-neoplásicas e 85 lesões neoplásicas a fim de determinar o papel do gene p53 na carcinogênese da mucosa oral. O grau de displasia das lesões foi relacionada à expressão de níveis detectáveis da proteína p53 mutada, visto que das 39 lesões não displásicas somente 21% mostraram expressão detectável da p53 enquanto 36% das lesões displásicas mostraram positividade para p53. Os autores concluíram que as mutações do p53 estão relacionadas com o aumento da displasia. Nishioka et al. (1993) 65 compararam a expressão da proteína p53 com a marcação para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)

49 Revisão de Literatura 49 em leucoplasias e carcinomas orais. Não encontraram expressão da proteína p53 em epitélio normal, contrastando com expressão positiva para p53 em menos de 10% das lesões leucoplásicas e em aproximadamente metade dos carcinomas. Encontraram também altas taxas de p53 em carcinomas com expressão de PCNA em mais de 40% das células e um ligeiro aumento na positividade da p53 em lesões mais indiferenciadas. Esses resultados indicaram uma possível relação entre a expressão da proteína p53, o crescimento celular e os achados histopatológicos de malignidade. Girod et al. (1994) 32 relacionaram a expressão da proteína p53 e do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) em 265 amostras de tecido de mucosa normal, potencialmente maligna, maligna e metastática da mucosa. Os dados apresentados sugeriram que a mutação do gene p53 é um evento inicial na carcinogênese da mucosa orofaringeana e que está correlacionada, assim como a expressão do PCNA, ao aumento da displasia e perda de diferenciação. Segundo os autores a expressão da p53 poderia ser melhor indicador de malignização, visto que a expressão do PCNA também estaria ligada o proliferação celular benigna induzida por inflamação, como constatado nos casos de líquen plano. Sauter et al. (1994) 82 através da detecção imuno-histoquímica da expressão aumentada da proteína p53 em tecido normal, lesões préinvasivas e invasivas do trato aerodigestivo superior, constataram que essa expressão elevada apareceu nas lesões iniciais e aumentou

50 Revisão de Literatura 50 gradualmente de acordo com o aumento do grau de atipia visto na progressão das neoplasias. Foi observado também que a expressão da proteína p53 em displasias discretas e moderadas estava limitada à camada basal, enquanto nas displasias severas e carcinomas invasivos a marcação nuclear era vista nas camadas mais superficiais do epitélio, as quais eram compostas por células atípicas. Para os autores estes resultados mostram que as alterações da proteína p53 estão associadas à transformação maligna e não necessariamente à progressão a um estágio mais avançado de malignidade. Shin et al. (1994) 88 com o objetivo de identificar um biomarcador para o processo de desenvolvimento do câncer de cabeça e pescoço, estudaram a expressão imuno-histoquímica da proteína p53 em carcinomas espinocelular e nos tecidos normais e lesões pré-malignas adjacentes à esses tumores. Além disso, procuraram determinar se a expressão da proteína p53 aumentava antes do desenvolvimento tumoral e como poderiam detectar essa expressão precocemente. Foi constatado um aumento progressivo na expressão da proteína p53 nas lesões prémalignas adjacentes aos tumores, acompanhando a progressão tecidual de normal para hiperplasia, displasia e carcinoma. Estes achados suportaram o conceito de processo seqüencial de tumorigênese de cabeça e pescoço e levaram os autores à concluir que alterações na expressão da proteína p53 podem ser úteis biomarcadores na avaliação

51 Revisão de Literatura 51 do risco de desenvolvimento do câncer em tecido normal ou lesões prémalignas expostos a agentes carcinogênicos. Regezi et al. (1995), 75 a fim de determinar a história natural da expressão da proteína p53 em displasias epiteliais e em carcinomas in situ, realizaram biópsias seqüenciais em pacientes que apresentaram lesões recorrentes. Foi constatada expressão positiva da p53 em 6 das 13 displasias analisadas, e destas, 3 progrediram para carcinomas invasivos p53 positivos. Dos 6 carcinomas iniciais, 4 eram p53 positivos. A partir destes resultados os autores sugeriram que a expressão da p53 parece ser persistente, servindo como um marcador de prognóstico para essas lesões. Caso essa super expressão seja reflexo de uma mutação genética, os autores acreditaram tratar-se de um evento irreversível. Além disso, o aparecimento de queratinócitos normais p53 positivos adjacentes à neoplasias mostrou que a expressão da p53 pode ocorrer antes das alterações morfológicas. Kannan et al. (1996) 45 estudaram a relação existente entre a expressão do p53 e do Ki67 em tecido normal, lesões leucoplásicas, displásicas ou não, e em neoplasias da mucosa oral. Foi constatada expressão intensa de Ki67 e p53 em 45% das lesões não displásicas. Contudo, houve uma alta expressão de Ki67 em 58% das lesões displásicas, enquanto houve expressão intensa de p53 em somente 14% das displasias. As lesões leucoplásicas não displásicas foram classificadas em não proliferativas (hiperqueratoses) e proliferativas

52 Revisão de Literatura 52 (hiperplásicas), sendo que entre as lesões não proliferativas mais de 25% das células foram Ki67 positivas em 35% dos casos e p53 positivas em 48% dos casos. Já entre as lesões proliferativas, 85% foram fortemente positivas para o Ki67 mas nenhuma das lesões mostrou expressão elevada para p53. A partir desses achados os autores concluíram que, os marcadores apresentaram uma relação inversa em relação a condição proliferativa das lesões leucoplásicas. Além disso, não foi possível determinar se a expressão positiva do p53 observada foi resultado da mutação do p53 ou do acúmulo de p53 normal induzido por carcinógenos presentes no tabaco, visto que todos os pacientes faziam uso desse produto. Em 1997, Rowley et al. 78 avaliaram a expressão da proteína p53 em lesões displásicas e carcinomas da cavidade oral. Positividade para proteína p53 foi encontrada em todos os graus histológicos do carcinoma assim como nos diferentes graus das displasias com freqüência similar. 71% dos casos de carcinoma invasivo que desenvolveram-se a partir de leucoplasias pré-existentes já apresentavam super expressão da proteína p53 no estágio de leucoplasia. De acordo com os resultados os autores sugeriram que a proteína p53 poderia ter um papel inicial no desenvolvimento do carcinoma oral. Contudo, acreditavam que o mecanismo pelo qual as leucoplasias se transformam em carcinomas não é inteiramente dependente das alterações genéticas do p53.

53 Revisão de Literatura 53 A expressão da proteína p53 como um marcador para determinar o potencial de malignização foi avaliado por Murti et al. 63 em 1998, através da análise de 90 casos de lesões pré malignas de pacientes que faziam uso de betel ou tabaco. Os autores sugeriram que a expressão da proteína p53 em lesões associadas ao uso do tabaco não teve relação significativa com sua provável transformação, visto que não houve como determinar se a imuno-reatividade encontrada nas amostras refletia a presença da proteína p53 mutante estável ou a estabilização do tipo selvagem da proteína através da ligação com produtos de outros genes, como o MDM2. Para os autores não foi possível concluir que a expressão da p53 sirva como um biomarcador de risco para o desenvolvimento do câncer. Cruz et al. (1998) 26 avaliaram a expressão suprabasal da proteína p53 em lesões bucais potencialmente malignas e carcinomas que se desenvolveram a partir delas em um período de 16 anos. A expressão da proteína p53 em mucosa normal e lesões benignas ficou restrita a camada basal e foi relacionada a resposta fisiológica das células a estresses genotóxicos. Foi encontrada marcação suprabasal em lesões potencialmente malignas e houve transformação maligna em 6 dos 7 casos que apresentavam esse tipo de marcação. Esse dados podem refletir um processo irreversível na carcinogênese. Além disso, duas lesões negativas para p53 desenvolveram carcinoma no período de acompanhamento o que levou os autores a sugerir que o padrão de

54 Revisão de Literatura 54 expressão do p53 era importante para determinação do prognóstico de lesões pré-malignas, contudo a ausência de níveis detectáveis de p53 não excluia a possibilidade da transformação maligna. Saranath et al. (1999), 81 estudando a mutação do p53 em câncer e leucoplasias orais induzidos pelo hábito de mascar fumo, constataram que 27% das leucoplasias mostraram aumento de expressão do p53, o que caracterizou essa proteína como um valioso biomarcador na identificação do potencial de malignização dessas lesões. Saito et al. (1999) 80 estudaram as proteínas associadas ao ciclo celular p16, p27, prb, p53 e Ki67, em lesões malignas e pré-malignas a fim de identificar anormalidades no ciclo celular associadas à expressão dessas proteínas. Os autores constataram aumento no número de células p53 positivas das lesões hiperplásicas para displásicas até carcinomas ou seja, com a progressão da carcinogênese oral, embora essa positividade nem sempre indicasse uma mutação genética. Chiang et al. (2000) 25 avaliaram a expressão do p53 em lesões prémalignas associadas ao fumo e ao hábito de mascar Areca. Foi encontrada positividade para p53 em 60% dos casos de fibrose submucosa, 40% das hiperqueratoses e 70% das displasias. Em 8% das fibroses submucosa, 25% dos queratinócitos apresentavam-se corados, enquanto em 40% das displasias mais de 50% dos queratinócitos mostravam-se corados. Nenhuma das hiperqueratoses mostrou mais de 25% dos queratinócitos corados. Tais resultados sugeriram ligação entre

55 Revisão de Literatura 55 o aumento da expressão do p53 com as alterações displásicas das células epiteliais, evidenciando o papel do p53 na carcinogênese oral. Para os autores a super expressão da proteína p53 poderia representar a presença de mutações do gene p53, ou ser uma resposta à danos não específicos causados por agentes danosos ao DNA presentes na noz Areca ou no cigarro ou em ambos. Segundo Warnakulasuriya (2000) 104 o p53, quando usado como único marcador, foi ineficiente para predizer o desenvolvimento de um tumor em indivíduos com alto risco de malignização PCNA O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma proteína nuclear ácida de 36-KD, associada ao ciclo celular, agindo como um cofator da DNA polimerase delta (Bravo et al., 1987). 17 Sua distribuição no ciclo celular aumenta durante a fase G1, alcançando um pico na interface entre as fases G1 e S, diminuindo durante a fase G2, e alcançando níveis baixos na fase M e em células inativas, níveis esses detectáveis para a imuno-histoquímica, o que o torna um marcador útil para células em proliferação (Celis & Celis, 1985; 23 Kurki et al., 1988; 50 Tsai & Jin, 1995). 96 Segundo Mathews et al. (1984) 58 os níveis de PCNA foram particularmente proeminentes em células alteradas ou tumorais e diminuiram acentuadamente em células inativas. Em seu estudo os autores puderam constatar que a síntese máxima do PCNA parece

56 Revisão de Literatura 56 coincidir com seu acúmulo no nucléolo, precedendo o pico de síntese do DNA. Ainda segundo eles, a disponibilidade de anticorpos monoespecíficos para o PCNA poderia facilitar a exploração dessa conexão com o nucléolo, com a divisão e transformação celular. Bravo et al. (1987) 17 verificaram, em um estudo sobre a distribuição nuclear do PCNA, que essa proteína era firmemente regulada durante o ciclo celular com um aumento claro no final da fase G1 e início da fase S, e que poderia ser um importante componente de eventos que levariam à replicação do DNA e/ou divisão celular. McCormick & Hall (1992) 59 avaliando o comportamento do PCNA como um marcador da proliferação celular afirmaram que seu uso exige uma análise cuidadosa em função de alguns fatores que poderiam influenciar no seu padrão de marcação como fatores técnicos como o tipo de fixação, a associação do PCNA com o processo de reparo do DNA e a expressão do PCNA devido a ação de fatores de crescimento em células que não estão em ciclo. Mittal et al. (1993) 61 avaliaram a expressão basal e suprabasal do PCNA em 20 casos de epitélio escamoso ectocervical normal, 11 casos de metaplasia escamosa e 5 casos de atrofia epitelial. Segundo os autores, a porcentagem de células coradas da camada basal aumentou progressivamente das lesões atróficas para o epitélio normal, condilomatoso e displásico, o que os fez sugerir que essa avaliação poderia ser de valor para o diagnóstico de casos complexos.

57 Revisão de Literatura 57 Shin et al. (1993) 87 avaliaram o padrão de expressão do PCNA em tumores de cabeça e pescoço e em epitélio normal, hiperplásico e displásico adjacente à esses tumores, utilizando epitélio normal como controle. Os autores observaram um aumento do número de células positivas para PCNA com a progressão de epitélio normal para maligno. Além disso, observaram uma heterogeneidade na expressão do PCNA em lesões do mesmo subgrupo histológico, sugerindo que a expressão da proteína poderia adicionar informações biológicas à avaliação histológica de rotina. Os autores encontraram ainda, marcação suprabasal do PCNA principalmente em lesões displásicas, carcinomas in situ e carcinomas invasivos. A partir desses achados, os autores sugeriram que as lesões pré-malignas, particularmente as displásicas, têm praticamente o mesmo grau de atividade proliferativa que o tumor adjacente, o que levaria a crer que muitas das alterações deveriam ocorrer antes do desenvolvimento do tumor. Assim, os autores concluíram que o PCNA poderia ser um biomarcador útil para melhor entender os vários estágios da carcinogênese dos tumores de cabeça e pescoço. Huang et al. (1994) 43 a fim de determinar se existia relação entre a expressão suprabasal do PCNA com características iniciais de prémalignidade, avaliaram 169 lesões orais, incluindo 28 carcinomas in situ, 82 displasias epiteliais, 21 atipias epiteliais e 38 hiperplasias epiteliais típicas. Foi observada expressão suprabasal do PCNA em 40% das lesões reativas hiperplásicas benignas, 56,25% das atipias, 61,64% das

58 Revisão de Literatura 58 displasias e 64% dos carcinomas in situ. Esses dados levaram os autores à sugerir que lesões com padrão de expressão basal do PCNA têm maior probabilidade de serem benignas, enquanto aquelas com padrão de expressão suprabasal têm maior chances de serem pré-malignas, sendo por isso o padrão de expressão do PCNA de valor na determinação do potencial de malignização das lesões leucoplásicas. Tsuji et al. (1995) 97 através do estudo de 75 lesões bucais, sendo 50 carcinomas espinocelulares, 14 leucoplasias e 11 adenomas pleomórficos, avaliaram a relação entre a expressão do PCNA e do p53. Os autores encontraram discreta expressão do PCNA e do p53 em leucoplasias e uma maior expressividade dessas proteínas nos carcinomas. A partir desses achados, os autores sugeriram que haveria uma relação estreita entre as proteínas PCNA e p53 e que ambas poderiam ser indicadores do potencial maligno da mucosa oral. Kobayashi et al. (1995) 47 avaliaram a atividade proliferativa de leucoplasias não displásicas, displasias epiteliais e carcinomas através da expressão do PCNA, da expressão de AgNORs e da freqüência de figuras mitóticas. Os autores encontraram padrões variados de expressão do PCNA nas lesões displásicas; correlação entre os índices de expressão do PCNA e os índices mitóticos confirmando a diferença entre as frações de proliferação celular existentes entre as diferentes amostras de displasia. Não encontraram significantes diferenças entre o número de AgNORs entre as lesões displásicas e não displásicas. A partir desses

59 Revisão de Literatura 59 achados, os autores afirmaram que a atividade proliferativa é intensificada com o aumento do grau de displasia das lesões. Comparando esses resultados com critérios histológicos estabelecidos pela OMS os autores puderam afirmar que a atividade proliferativa está relacionada a severidade das lesões displásicas. Martinez-Lara et al. (1996) 57 a fim de observar a expressão do PCNA em mucosa normal, lesões orais benignas, displasias epiteliais e em epitélio adjacente à tumores, assim como avaliar a relação entre a expressão suprabasal do PCNA e seu aparecimento em displasias epiteliais, selecionou 43 amostras teciduais de diferentes locais da cavidade oral. Encontraram expressão exclusivamente basal em todos os casos de mucosa normal e em 13 casos de hiperplasia benigna. Expressão basal e suprabasal do PCNA foi observada em 4 casos de hiperplasia e em todos os casos diagnosticados histologicamente como displasias e todos os casos de epitélio displásico adjacente à tumor. A partir desses achados, os autores concluíram que a expressão suprabasal do PCNA poderia ser um marcador em displasias epiteliais iniciais sem sinais histopatológicos. Birchall et al. (1997) 14 avaliaram a presença de apoptose, mitose e a marcação de bcl-2 e PCNA em amostras de epitélio bucal normal, hiperplásico, displasias e carcinomas. Constataram um aumento progressivo do número de mitoses nos casos de displasia e carcinomas. Entretanto, encontraram dissociação da expressão do PCNA com o

60 Revisão de Literatura 60 número de mitoses, sugerindo que essa expressão poderia ser devido ao envolvimento da proteína no reparo do DNA. Observaram uma maior expressão de PCNA em lesões hiperplásicas o que levou-os a sugerir um aumento nas taxas de reparação do DNA nesse tipo de lesões. Liu & Klein-Szanto (2000) 55 através da análise da expressão do PCNA, Ki-67 e ciclina D1, observaram um aumento da proliferação celular em leucoplasias orais relacionado ao grau de displasia. Segundo os autores, displasias severas poderiam ser claramente diferenciadas de displasias discretas e epitélio oral normal pela presença de células proliferativas nas camadas celulares superficiais, acima ou superficiais à camada parabasal. Todos os biomarcadores foram considerados satisfatórios, mas o Ki-67 foi visto como o mais indicado para esse tipo de estudo devido a sua marcação intensa e seu uso generalizado na coloração de cortes histológicos de lesões de outros locais do corpo.

61 PROPOSIÇÃO Proposição

62 Proposição 62 3 PROPOSIÇÃO A literatura tem evidenciado que o tecido epitelial componente das leucoplasias possui maior risco de transformação maligna e maior atividade proliferativa conforme apresente displasia ou esteja localizado em regiões de risco como o assoalho bucal e língua. No entanto, lesões histologicamente inocentes também podem sofrer esta transformação independente de suas localizações. A proposta dessa pesquisa é avaliar através da detecção imuno-histoquímica do PCNA e p53, a atividade proliferativa epitelial das leucoplasias sem displasia, e fora das áreas de maior risco, correlacionando os resultados com a quantidade de queratina produzida na lesão.

63 MATERIAL E MÉTODO Material e Método

64 Material e Método 64 4 Material e Método 4.1 Seleção dos casos e análise morfológica Os casos estudados foram dos arquivos do Serviço de Histopatologia, do Departamento de Patologia e Propedêutica Clínica da Faculdade de Odontologia Campus de Araçatuba - UNESP. Selecionouse 24 lâminas de hiperparaqueratose e hiperortoqueratose, as quais haviam recebido diagnóstico de leucoplasia, sendo 8 casos de leucoplasia Grau I, 8 casos de leucoplasia Grau II e 8 casos de leucoplasia Grau III, segundo Grinspan (1973). 37 A seleção procurou reunir amostras exclusivamente de mucosa jugal, sem displasia epitelial. As lâminas coradas pelo método hematoxilina e eosina (H&E) foram submetidas a estudo histológico em microscopia de luz. Dois examinadores avaliaram os cortes seguindo os critérios histológicos definidos por Grinspan.(1973) 37 para o diagnóstico das lesões. São eles: Grau I: ortoqueratose e/ou paraqueratose e acantose; Grau II: maior grau de queratinização; Grau III: queratose acentuada e papilomatoses. Foi realizada coloração de Metanamina prata para verificar a presença de Candida sp. nas amostras.

65 Material e Método Imuno-histoquímica Em todos os casos a avaliação das proteínas p53 e PCNA foi feita com a técnica imuno-histoquímica pelo método da Streptavidina-Biotina (SABC, do inglês Streptavidina-Biotin Complex), acompanhada por análise qualitativa dos resultados através da microscopia de luz. Todas as amostras foram fixadas em formol 10% e emblocadas em parafina. A reação foi realizada em secções teciduais de 4 micrômetros de espessura estendidas em lâminas de vidro previamente limpas, preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltriethoxy-silano (Organosilano). Em seguida os cortes foram submetidos aos seguintes passos: 1) desparafinização em xilol à 60 C por 30 minutos; 2) desparafinização em xilol à temperatura ambiente por 20 minutos; 3) hidratação em cadeia descendente de etanol, a partir de 3 passagens em etanol absoluto, seguido por etanol 95, 80 e 70, durante 5 minutos cada; 4) remoção do pigmento formólico através de imersão em solução de hidróxido de amônio a 10% por 10 minutos; 5) lavagem em água corrente por 10 minutos; 6) duas passagens em água destilada; 7) recuperação antigênica, através de tratamento dos cortes em microondas. As amostras foram colocadas em cubas contendo solução de ácido cítrico 10 mm (ph 6,0) e levadas no forno de

66 Material e Método 66 microondas durante 12 minutos (ciclos de 4minutos) em potência de 900W, completando a solução tampão quando necessário; 8) resfriamento do material; 9) lavagem em água corrente por 10 minutos; 10) duas passagens em água destilada; 11) bloqueio da peroxidase endógena tecidual, através de duas passagens de 5 minutos em solução de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) 20 volumes em metanol (1:1, v/v); 12) lavagem em água corrente por 10 minutos; 13) duas passagens em água destilada; 14) duas lavagens em solução tampão Tris-HCl, ph 7,4 (Tris-hidroxi-metilaminometano); 15) incubação dos anticorpos primários à 4 C, nas condições especificadas na Tabela 1, diluídos em tampão Tris-HCl, ph 7,4, contendo 1% de albumina sérica bovina, acrescida de azida sódica a 0,1% (BSA); 16) duas lavagens em tampão Tris-HCl, por 5 minutos cada; 17) incubação com anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos à temperatura ambiente, diluído em tampão Tris-HCl, ph 7,4; 18) lavagem em solução tampão Tris-HCl ph 7,4 por 10 minutos com duas trocas; 19) incubação com complexo Streptavidina-Biotina por 30 minutos à temperatura ambiente, diluído em tampão Tris-HCl, ph 7,4;

67 Material e Método 67 20) lavagem em solução tampão Tris-HCl ph 7,4 por 10 minutos com duas trocas; 21) revelação da reação com solução cromógena de diaminobenzidina (3,3 -diaminobenzidina) a 0,03% adicionada de 0,6 ml de H 2 O 2 (20 volumes) por 3 minutos em câmara escura; 22) lavagem em água corrente por 10 minutos; 23) duas passagens em água destilada; 24) contra coloração com hematoxilina de Mayer por 5 minutos; 25) lavagem em água corrente por 10 minutos; 26) duas passagens em água destilada; 27) desidratação com etanol em cadeia ascendente; 28) diafanização em xilol; 29) montagem em resina Permont Utilizou-se como controle positivo das reações o carcinoma espinocelular com padrão de marcação já conhecido. No controle negativo o anticorpo primário foi substituído por solução BSA a 1%, diluída em tampão TRIS, ph 7,4. Foi realizada contagem das células coradas utilizando-se o programa Leica Qwin (Image Processing and Analysis System), em uma área selecionada aleatoriamente, com extensão epitelial de aproximadamente µm, sempre no aumento de 400 vezes para ambos os marcadores. Esses dados foram submetidos à análise estatística.

68 Material e Método 68 Tabela 1 Anticorpos empregados Especificidade Clone Diluição Tempo de Incubação PCNA* PC-10 1:600 Overnight p53* DO-7 1:75 Overnight * Dako Corporation, Carpinteria,

69 RESULTADO Resultado

70 Resultado 70 5 RESULTADO A relação entre o diagnóstico histológico, o sexo e a idade do paciente está descrita na Tabela 2. Houve uma predominância do sexo masculino em nossa amostragem (59%) sobre o feminino (41%). A idade dos pacientes variou entre 22 a 69 anos com uma média de 47,8 anos (47,9 para as mulheres e 47,8 para os homens). Entre os três Graus a média de idade foi de 48,7 anos no Grau I, 44,5 anos no Grau II e 50,2 anos no Grau III. As lesões ocorreram em 92% dos casos em indivíduos da raça branca. 5.1 Morfologia Na microscopia de luz as hiperqueratoses das leucoplasias, coradas em H.E., foram separadas em Grau I, II e III de acordo com os critérios estabelecidos por Grinspan (1973). 37 Assim, as oito manchas brancas que compunham o Grau I apresentavam-se histologicamente como epitélio estratificado pavimentoso com hiperortoqueratinização ou hiperparaqueratinização discretas (Figura 1). O Grau II correspondeu a oito lesões papulares exibindo epitélio com hiperqueratinização mais acentuada (Figura 2). E por último, no Grau III observavam-se oito lesões verrucosas com hiperqueratinização acentuada e papilomatose nas características histopatológicas (Figura 3).

71 Resultado p53 A marcação da proteína p53 foi variável nas leucoplasias com diferentes graus de queratinização. No Grau I foi observada marcação nas camadas basal e parabasal do epitélio em cinco amostras e três foram negativas para o p53. Apenas uma amostra apresentou quantidade maior de células da camada parabasal positivas (Figura 4). As leucoplasias que formavam o Grau II apresentaram epitélio com marcação muito semelhante às lesões do Grau I, com positividade em camada basal e parabasal em seis das oito amostras (Figura 5). As duas outras amostras apresentaram marcação apenas na camada basal. Dentre as lesões que compunham o Grau III, duas apresentaram epitélio com marcação expressiva nas células da camada basal e parabasal, assemelhando-se às lesões dos Graus I e II. Em quatro amostras houve marcação discreta de poucas células da camada basal em áreas dispersas do epitélio (Figura 6), enquanto outras duas foram negativas para o p53. Subjetivamente o p53 teve menor expressão no Grau III em relação aos Graus I e II. Os núcleos celulares apresentavam-se corados em castanho quando marcados pela proteína p53, com dispersão variável pelas camadas inferiores do epitélio. A contagem das células foi realizada utilizando-se o programa Leica Qwin (Image Processing and Analysis System), em uma área

72 Resultado 72 selecionada aleatoriamente, com extensão epitelial de aproximadamente µm, sempre no aumento de 400 vezes (Figura 7). A contagem de núcleos corados pelo p53 está expressa na Tabela 3. Esses dados foram submetidos a análise de variância para detectar diferenças entre os Graus I, II e III (Tabela 5). 5.3 PCNA A proteína PCNA foi observada nos três graus de leucoplasia. A marcação foi expressiva nas camadas basal e parabasal nos oito espécimes de leucoplasia do Grau I, sendo que sete apresentaram também diversas células da camada espinhosa alta (próximas à superfície) com marcação positiva (Figura 8). As lesões do Grau II apresentaram marcação semelhante às lesões de Grau I, com expressividade para a proteína nas camadas basal, parabasal e espinhosa em todas as amostras. Três dessas amostras apresentavam marcação na camada espinhosa praticamente até a superfície do epitélio, algumas vezes envolvendo a camada granulosa (Figura 9). Já a maior parte das leucoplasias do Grau III apresentavam marcação nas camada basal e parabasal e em poucas células da camada espinhosa (Figura 10). Apenas uma das oito amostras apresentou marcação em várias células da camada espinhosa.

73 Resultado 73 A marcação da proteína PCNA foi observada nos núcleos celulares como coloração castanha, e também apresentou dispersão variável pelas camadas do epitélio. À semelhança da expressão do p53, subjetivamente o PCNA apresentou-se menos freqüente no Grau III em relação aos Graus I e II. A contagem das células foi realizada utilizando-se o programa Leica Qwin (Image Processing and Analysis System), em uma área selecionada aleatoriamente, com extensão epitelial de aproximadamente µm, sempre no aumento de 400 vezes (Figura 11). A contagem de núcleos corados está expressa na Tabela 4. Esses dados foram submetidos a análise de variância para detectar diferenças entre os Graus I, II e III (Tabela 6). 5.4 Análise Estatística Os dados originais das tabelas 3 e 4 foram submetidos à uma bateria de testes preliminares através do programa estatístico GMC 7,07 elaborado pelo Prof. Titular Dr. Geraldo Maia Campos, da disciplina de Patologia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP, com a finalidade de decidir sobre que tipo de estatística deveria ser empregada, paramétrica ou não paramétrica.

74 Resultado 74 Para o p53 os testes de normalidade realizados com os dados originais de número de células coradas indicam tratar-se de uma distribuição não normal. Realizou-se, então a transformação dos dados em Raiz quadrada (dado+1/2), e testou-se novamente a normalidade da distribuição amostral. A análise do conjunto de resultados obtidos nesses testes preliminares levou à conclusão de que a Raiz quadrada (dado+1/2), passa a ser normal, o que autoriza aplicação da estatística paramétrica. Dos testes paramétricos, o que melhor se adequa ao nosso modelo matemático é a Análise de Variância a um fator de variação, o número de células coradas que pode ser visto na Tabela 5. Através da Análise de Variância não foi constada diferença estatística entre o número de células coradas (P = 12,713%) para os três graus da lesão. Para o PCNA a análise dos dados originais mostrou tratar-se de uma distribuição amostral normal, o que nos levou a aplicação da estatística paramétrica através da Análise de Variância a um fator de variação, o número de células coradas que pode ser visto na Tabela 6. Através da Análise de Variância não foi constada diferença estatística entre o número de células coradas (P = 5,599%) Em função da grande diferença apresentada entre as médias do número de células coradas nos Graus I e III, realizou o teste de Tukey onde chegou-se a um valor crítico para a diferença ao nível de 5% de 136,89. Como a diferença entre as médias do número de células coradas é de 130,37, pode-se inferir que há uma tendência do Grau I apresentar

75 Resultado 75 um maior número de células coradas que o Grau III caso a amostra seja maior. 5.5 TABELAS Tabela 2 Dados clínicos referentes as lesões estudadas Amostra Idade Sexo Raça 1 50 F B 2 33 M B 3 56 M B 4 44 F B 5 44 F B 6 52 F B 7 64 M B 8 47 M B 9 46 F B F B M N M B M B F B F B M B M N M B M B F B M B F B M B M B

76 Resultado 76 Tabela 3 Número de células coradas (p53) em extensão epitelial de aproximadamente µm (Aumento de 400X) Amostra Grau I Grau II Grau III Tabela 4 - Número de células coradas (PCNA) em extensão epitelial de aproximadamente µm (Aumento de 400X) Amostra Grau I Grau II Grau III Tabela 5 Análise de variância do número de células coradas (p53) Fonte de G.L. Soma dos Quadrado F Prob.(HO) variação quadrados médio Entre Graus 2 14,8041 7,4020 2,26 12,713% Resíduo 21 68,6385 3,2685 Variação total 23 83,4426

77 Resultado 77 Tabela 6 Análise de variância do número de células coradas (PCNA) Fonte de G.L. Soma dos Quadrado F Prob.(HO) variação quadrados médio Entre Graus , ,3125 3,29 5,599% Resíduo , ,0176 Variação total ,0000 -

78 Resultado FIGURAS FIGURA 1 Hiperqueratose em leucoplasia Grau I de Grinspan. H.E. 200x. FIGURA 2 Hiperqueratose em leucoplasia Grau II de Grinspan. H.E. 200x.

79 Resultado 79 FIGURA 3 - Hiperparaqueratose e papilomatose em leucoplasia Grau III de Grinspan. H.E. 50x. FIGURA 4 Expressão basal e parabasal do p53.leucoplasia Grau I de Grinspan 400X.

80 Resultado 80 FIGURA 5 - Expressão basal e parabasal do p53. Leucoplasia Grau II de Grinspan. 400x. FIGURA 6 - Expressão basal do p53. Leucoplasia Grau III de Grinspan. 400x.

81 Resultado 81 FIGURA 7 - Marcação utilizada na contagem de células no epitélio de uma das leucoplasias (Grau I de Grinspan) com expressão do p x. FIGURA 8 - Expressão do PCNA nas camadas basal, parabasal e espinhosa de leucoplasia Grau I de Grinspan. 200x.

82 Resultado 82 FIGURA 9 - Expressão do PCNA nas camadas basal, parabasal e espinhosa de leucoplasia Grau II de Grinspan. 200x. FIGURA 10 - Expressão do PCNA restringindo-se às camadas basal e parabasal em leucoplasia Grau III de Grinspan. 100x.

83 FIGURA 11 - Marcação utilizada na contagem de células no epitélio de uma das leucoplasias (Grau I de Grinspan) com expressão do PCNA. 200x. Resultado 83