Otimização combinatória empregando algoritmo genético aplicada na análise multivariada de medicamentos manipulados
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- Talita Araújo Neves
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1 Otimização combinatória empregando algoritmo genético aplicada na análise multivariada de medicamentos manipulados Luiz Gustavo Neumann (UNISC) Tainá Flôres da Rosa (UNISC) Valdir Bruxel Junior (UNISC) Jorcem Simon de Souza (UNISC) Marco Flôres Ferrão (UNISC) João Carlos Furtado (UNISC) Resumo Este trabalho apresenta uma alternativa analítica para a caracterização de formulações contendo fármacos anti-inflamatórios, bem como das diferentes matérias-primas empregadas na manipulação de medicamentos. Em especial foi utilizada técnica espectroscópica baseada na radiação infravermelha, denominada reflexão difusa no infravermelho médio com transformada de Fourier (DRIFTS). Aliadas a esta técnica de análise, ferramentas quimiométricas de análise multivariada, como o método de agrupamento hierárquico (HCA) e métodos de otimização combinatória como algoritmos genéticos (AGs) foram utilizadas na construção de modelos para a identificação da presença de princípios ativos na amostras de medicamentos manipulados analisados. A seleção das variáveis (freqüências espectrais) foi realizada em ambiente MATLAB, empregando-se uma rotina de algoritmo genético e posteriormente utilizou-se o software Pirouette v.2.7 para a construção dos dendogramas (HCA). A redução no número de variáveis (freqüências do espectro) através do emprego do algoritmo genético resultou numa alternativa adequada para melhorar a similaridade entre as replicatas dos espectros. Em todos os modelos desenvolvidos sempre foram mantidas as duplicatas com boa similaridade, enquanto que os dendogramas empregando toda a região espectral não apresentou resultados satisfatórios. Palavras chave: Algoritmos genéticos, Análise multivariada, Reflexão no infravermelho, Medicamentos anti-inflamatórios. 1. Introdução Recentemente a aplicação da técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e de técnicas quimiométricas de análise multivariada possibilitaram a análise de misturas complexas, como fármacos, sem a necessidade de qualquer separação prévia de seus componentes (SABIN et al., 2003). As técnicas de reflexão no infravermelho vem sendo amplamente empregadas na análise de princípios ativos presentes em medicamentos, porém os estudos desenvolvidos nos últimos anos tem centrado os trabalhos na região do infravermelho próximo (NIR), sendo pouco explorada a região do infravermelho médio (PASQUINI, 2003). Neste sentido o presente trabalho tem o objetivo de empregar ferramentas analíticas para a caracterização de formulações contendo fármacos anti-inflamatórios, bem como das diferentes matérias-primas empregadas na manipulação de medicamentos. Em especial vêm sendo utilizadas técnicas espectroscópicas baseadas na radiação infravermelha, como por exemplo, a reflexão difusa no infravermelho médio com transformada de Fourier (DRIFTS). Aliadas a esta técnica de análise, ferramentas quimiométricas de análise exploratória, como o método de agrupamento hierárquico (HCA) empregado por Sabin et al. (2003) e métodos de otimização combinatória como algoritmos genéticos (AG) e busca tabu utilizados por Konzen et al. (2003). ENEGEP 2004 ABEPRO 3175
2 A utilização da espectroscopia no infravermelho médio em conjunto com a análise de agrupamento hierárquico permite construir uma estrutura de grupos e de relações entre os mesmos, seja com substâncias simples ou até com as mais complexas, como as diferentes formulações contendo fármacos. Todavia os espectros no infravemelho médio costumam ter valores de absorbância de cerca de 1800 freqüências (variáveis), cuja solução ótima não pode ser obtida de forma exata, em virtude do elevado tempo computacional necessário para gerar todas as soluções possíveis. Essas relações podem ser otimizadas aplicando-se uma rotina de algoritmo genético baseada na similaridade entre as amostras. Em particular, este trabalho propõe a implementação de um método de identificação de fármacos anti-inflamatórios, a partir de dados de infravermelho, buscando determinar e otimizar o grau de similaridade entre as amostras estudadas. Para uma análise mais eficiente, foi empregado à matriz de dados a correção do espalhamento de luz (MSC) visando minimizar os efeitos causados pelas diferenças de granulometria e de empacotamento (OLINGER & GRIFFTHS, (1988); OLINGER & GRIFFTHS, (1993a); OLINGER & GRIFFTHS, (1993b); DEVAUX et al., (1995)) 2. Análise Multivariada A análise multivariada é a rigor qualquer abordagem analítica que considere o comportamento de duas ou mais variáveis simultaneamente, num vasto campo do conhecimento que envolve uma grande multiplicidade de conceitos estatísticos e matemáticos (PEREIRA, 1999). Assim, no caso em que empregamos análise multivariada associada a técnicas espectroscópicas no infravermelho, é possível manipular dados de absorbância espectral associados a mais de uma freqüência ao mesmo tempo. Williams (1987) apresenta aplicações destes métodos na modelagem de propriedades químicas e físicas de sistemas simples e complexos a partir de seus dados espectroscópicos. A proposta do HCA é agrupar dados em conjuntos que têm atributos similares, apresentandoos de uma maneira que enfatize os agrupamentos naturais, analogamente à classificação taxonômica realizada em ciências biológicas (VALENTIN, 2000). Para tanto, as distâncias entre pares de amostras são calculadas e comparadas. Quando as distâncias entre as amostras são relativamente pequenas, isto implica que as mesmas são similares; já amostras diferentes serão separadas por distâncias relativamente grandes. A apresentação dos resultados dessa classificação hierárquica se dá na forma de um gráfico denominado dendograma, facilitando o reconhecimento visual de tais categorias. Para efetuar este agrupamento é necessário definir matematicamente o conceito de similaridade, ou seja, a distância entre dois objetos. Entre as medidas mais usuais para estabelecer o conceito de distância entre duas amostras, destacam-se o coeficiente de correlação de Pearson, a distância Euclidiana e a distância de Manhattan. Neste trabalho, no entanto, foi utilizada somente a distância Euclidiana, que é matematicamente a maneira mais simples de realizar o cálculo, conforme a expressão 1, onde m=2.: d ab = m ( xai xbi ) Após as distâncias entre todos os pares das amostras terem sido calculadas, as duas amostras mais similares são ligadas para formar um novo ponto. Depois que as distâncias entre esse novo ponto e todos os outros existentes são determinadas, a menor distância entre pontos é novamente calculada e outra ligação é formada. Esse processo é repetido até que todos os pares de pontos tenham sido agrupados. i= 1 2 (1) ENEGEP 2004 ABEPRO 3176
3 Vários métodos são utilizados para calcular as distâncias entre as amostras e os agrupamentos hierárquicos. Porém, neste trabalho foi utilizado somente o método de conexão flexível, cuja distância pode ser calculada conforme expressão (,625d + 0,625d 0,25d ) 1/ 2 d + ab c = 0 ac bc ab (2) 3. Heurísticas Aplicadas em Seleção de Variáveis Na otimização combinatória estudam-se problemas que se caracterizam pelo número finito de soluções possíveis e embora, em princípio a solução ótima possa ser obtida através de uma simples enumeração, na prática, freqüentemente isto se torna inviável, devido ao número extremamente alto de soluções possíveis. Assim, estudando-se as propriedades estruturais dos problemas, métodos heurísticos têm sido apresentados pela comunidade científica para obter soluções exatas ou aproximadas. Heurística é qualquer método ou técnica criada ou desenvolvida, para resolver um determinado tipo de problema. Algumas heurísticas, denominadas meta-heurísticas, podem ser usadas na resolução de diversos problemas de otimização combinatória, através de uma representação adequada e adaptação de alguns parâmetros para cada problema específico. Podemos citar metaheurísticas de sucesso como os algoritmos genéticos (AG), busca tabu e simulated annealing Algoritmos Genéticos Algoritmo Genético (AG) é uma técnica de busca aleatória direcionada, desenvolvida por Holland (1975), capaz de obter a solução ótima global num espaço de busca complexo multidimensional. Os AGs usam operadores inspirados no processo da evolução natural das espécies que, segundo Darwin, se dá pela seleção dos indivíduos mais aptos ao ambiente em que vivem. Estes têm maiores chances de sobreviver e de gerar filhos, que herdam as características dos pais. É esta forma de otimização das espécies, através das gerações, que os AGs procuram imitar. Estes operadores, conhecidos como operadores genéticos, manipulam indivíduos de uma população, através de gerações, para melhorar (aperfeiçoar) a adaptação (fitness) gradativamente. Os indivíduos numa população, também denominados de cromossomos, são representados por cadeias (strings) de números binários. Os algoritmos genéticos não usam muito conhecimento a respeito do problema a ser otimizado e não manipulam os parâmetros do problema diretamente, mas operam sobre códigos que representam os parâmetros do problema. Então, o primeiro passo numa aplicação de AGs, é codificar o problema sob estudo, ou seja, representar os parâmetros do problema. O segundo passo é criar uma população de possíveis soluções. O passo seguinte é determinar um conjunto de operadores genéticos (seleção, recombinação e mutação). Finalmente, como em outros métodos de busca, os AGs precisam saber quantificar a qualidade das soluções obtidas, para posteriormente poder melhorá-las, o que é realizado através da determinação de uma função de avaliação (fitness) (GOLDBARG & LUNA, 2000). 4. Metodologia Para este trabalho foram adquiridas amostras de medicamentos manipulados contendo diclofenaco de sódio ou diclofenaco de potássio de três diferentes farmácias de manipulação da cidade de Santa Cruz do Sul - RS, podendo variar a concentração do fármaco em questão, bem como o excipiente utilizado. Para facilitar a visualização e compreensão dos ENEGEP 2004 ABEPRO 3177
4 dendogramas, adotou-se uma legenda para os compostos utilizados, conforme a procedência dos medicamentos e a dosagem do princípio ativo. Para a matriz de calibração foi adotada a legenda para as amostras em duplicata conforme Tabela 1. De forma análoga foram identificadas as amostras do conjunto de validação utilizando-se porém as letras c e d. Farmácia Excipiente Diclofenaco de Potássio Diclofenaco de Sódio 1 Ex1a / Ex1b D1a / D1b D4a / D4b 2 Ex2a / Ex2b D2a / D2b D5a / D5b 3 Ex3a / Ex3b D3a / D3b D6a / D6b Tabela 1 Legenda adotada para as amostras que compõe a matriz de calibração. A seleção das variáveis (freqüências espectrais) foi realizada em ambiente MATLAB, empregando-se uma rotina de algoritmo genético e posteriormente utilizou-se o software Pirouette para a aplicação do método de análise hierárquica de agrupamento (HCA). Primeiramente selecionou-se o conjunto de regiões do espectro com o maior número de informações de interesse, isto é, os números de onda que apresentam melhor correlação com a quantificação do princípio ativo em estudo. As regiões espectrais selecionadas foram de 801 a 1799 cm -1 e de 2801 a 3799 cm -1. Aplicou-se ao conjunto de dados uma rotina de algoritmo genético baseada na fitness que visa otimizar a similaridade entre as amostras, conforme a expressão 3, onde, d ab = distância entre as amostras a e b e d max = maior distância entre dois pontos no conjunto de dados. d ab Similaridadeab = 1 (3) d Após realizou-se a análise exploratória dos dados através da análise hierárquica de agrupamento, considerando-se as amostras otimizadas e também a matriz completa, com todos os números de onda. O pré-processamento utilizado foi o auto-escalonamento, que consiste em centrar os dados na média e dividi-los, um a um, pelo desvio-padrão, de forma que todos as variáveis passam a ter a mesma importância, ou seja, o mesmo peso. Além disso, apesar de terem sido testados os métodos de construção simples, incremental e flexível, selecionou-se somente o tipo de conexão flexível para aplicar a rotina de otimização via AG, empregando-se ainda, à matriz de dados, a correção do espalhamento de luz (MSC). 5. Resultados Inicialmente empregou-se uma rotina de algoritmo genético ao conjunto de dados visando à otimização da similaridade entre os mesmos. Como parâmetros de entrada da rotina AG foram empregados: a) Tamanho da população: 50 cromossomos b) Total de números de onda selecionados: 25, 50, 100 ou 200 c) Percentual de seleção na população: 25 d) Percentual de mutação na população: 5 e) Número de iterações: 500 ou 1000 max ENEGEP 2004 ABEPRO 3178
5 Na Tabela 2 são apresentados os resultados da otimização empregando algoritmo genético. Teste Fitness Total n onda sel. Iterações A 0, B 0, C 0, D 0, E 0, F 0, G 0, H 0, Tabela 2 Valores dos parâmetros na otimização dos dados DRIFTS. Selecionou-se, então, o teste F para a construção dos dendogramas (Figuras 1, 2, 3 e 4) uma vez que a redução muito elevada no número de freqüências modeladas pode implicar em alta colinearidade. Construiu-se os dendogramas das matrizes de dados não otimizadas (sem seleção via AG), tanto do conjunto de calibração quanto de validação, com MSC, uma vez que testes anteriores confirmaram a necessidade de aplicação da correção do espalhamento multiplicativo. O estudo dos dendogramas das Figuras 1 (conjunto de calibração) e 3 (conjunto de validação), indicam a presença de ruído experimental no espetro já que nem todas as duplicatas estão relacionadas entre si. Os dendogramas também revelam a existência de distintos tipos de excipientes. Por outro lado, os dendogramas referentes aos conjuntos de espectros otimizados (Figuras 2 e 4) indicam a existência de dois tipos de excipientes entre as três amostras estudadas, um primeiro contemplando as amostras das farmácias 1 e 3 (que empregam apenas amido) e outro formado pelas amostras da farmácia 2 (que emprega um excipiente composto). Figura 1: Dendograma obtido a partir dos espectros DRIFT de amostras da matriz de calibração não otimizado. ENEGEP 2004 ABEPRO 3179
6 Figura 2: Dendograma obtido a partir dos espectros DRIFT de amostras da matriz de calibração otimizado com algoritmo genético selecionando 50 variáveis. Figura 3: Dendograma obtido a partir dos espectros DRIFT de amostras da matriz de validação não otimizado. Figura 4: Dendograma obtido a partir dos espectros DRIFT de amostras da matriz de validação otimizado com algoritmo genético selecionando 50 variáveis. ENEGEP 2004 ABEPRO 3180
7 Comparando-se os dendogramas das Figuras 1 e 3 que se referem aos modelos não otimizados com aqueles das Figuras 2 e 4 otimizados (com AG), observa-se que de uma forma geral as similaridades entre as duplicatas são melhoradas para os dendogramas onde foi aplicada a otimização. O conjunto destes dendogramas sugerem que de uma forma geral que o excipiente é o principal responsável pela formação dos agregados. Porém é possível identificar as amostras que contém o fármaco em questão, daquelas constituídas apenas pelo excipiente. Pode-se também ressaltar que os medicamentos manipulados distribuem-se em três grupos (Figuras 2 e 4). Um formado pelas amostras D1, D3 e D6, outro pela amostra D4 e os excipientes Ex1 e Ex2 e um terceiro formado pelas amostras D2 e D5 e pelo excipiente Ex2. Neste caso observa-se que o excipiente composto foi decisivo na separação das amostras da farmácia 2 (terceiro grupo formado na figura 4). Para os demais grupos observa-se que, no caso do primeiro temos D1 e D3 mais semelhantes em função de serem formadas pela diluição do mesmo fármaco (diclofenaco de potássio) em amido. Já o segundo grupo, que apresenta as duas amostras de excipente amido referentes a farmácia 1 e 3, também agrupou a amostra D4. Esta aparente contradição pode ser explicada pela maior diluição desta amostra em relação as demais, isto é maior quantidade de amido em relação a uma quantidade fixa de princípio ativo (todas amostras aqui estudadas contém 50 mg de fármaco), tornado-se mais semelhante as amostras de excipiente do que as amostras mais concentradas com princípios ativos. 6. Conclusões De uma forma geral a aplicação da seleção de variáveis através do algoritmo genético melhorou os resultados dos dendogramas, não apenas pela melhora da similaridade entre as duplicatas, mas também pela maior discriminação entre os diferentes grupos formados, facilitando a interpretação dos resultados obtidos. Com relação ao número de iterações empregados nas rotinas de seleção de variáveis (otimização) através dos algoritmos genéticos, pode-se observar que o aumento de 500 para 1000 pouco contribuiu para a redução do fitness. Este resultado sugere que para problemas de mesma natureza sejam suficientes 500 iterações para atingir uma boa aproximação para a solução do problema de otimização aqui estudado. Outra importante constatação com base nos resultados encontrados trata-se do número adequado variáveis (comprimentos de onda) selecionados para a adequada modelagem dos dados. De uma forma geral, quando utilizamos de variáveis a fitness apresenta-se melhor do que para os casos onde foram utilizadas de variáveis. Este indicativo reforça a idéia de redução do número de variáveis para a modelagem HCA aqui proposta, pois na medida que utilizamos muita informação dos espectros estamos modelando ruídos ou sinais que não tem relação direta com a discriminação dos diferentes compostos químicos presentes nas amostras estudadas. Adicionalmente podemos afirmar que a metodologia aqui empregada serve como excelente alternativa para refinar (otimizar) o estudo quimiométrico de medicamentos, sejam eles manipulados ou industrializados, visando um controle de qualidade através de métodos não destrutivos e não geradores de resíduos nocivos tanto ao ambiente industrial quanto ao meio ambiente. ENEGEP 2004 ABEPRO 3181
8 7. Referências DEVAUX, M.F.; DUFOUR, N.N.; ROBERT, P. & BERTRAND, D. (1995) - Effects of Particle Size on the Near-Infrared Reflectance Spectra of Wheat and Rape Seed Meal Mixtures Appl. Spectrosc., Vol.49, p FERRÃO, M.F. (2001) - Técnicas de Reflexão no Infravermelho Aplicadas na Análise de Alimentos. Tecno- Lógica, Vol. 5, n.1, p GOLDBARG, M.C. & LUNA, H.P.L. (2000) - Otimização Combinatória e Programação Linear: Modelos e Algoritmos, Rio de Janeiro: Campus. HIBBERT, D.B. (1993) - Genetic Algorithms in Chemistry. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, Vol.19, p HOLLAND, J.H. (1975) Adaptation in Natural and Artificial Systems. MIT Press, p KONZEN, P.H.A.; FURTADO, J.C.; CARVALHO, C.W.; FERRÃO, M.F.; MOLZ, R.F.; BASSANI, I.A. & HÜNING, S.L. (2003) - Otimização de Métodos de Controle de Qualidade de Fármacos Usando Algoritmo Genético e Busca Tabu. Pesquisa Operacional, Vol. 23, n. 1, p OLINGER, J.M. & GRIFFITHS, P.R. (1988) - Quantitative Effects of an Absorbing Matrix on Near-Infrared Diffuse Reflectance Spectra. Anal. Chem., Vol.60, p OLINGER, J.M. & GRIFFITHS, P.R. (1993) - Effects of Sample Dilution and Particle Size/Morphology on Diffuse Reflection Spectra of Carbohydrate Systems in the Near- and Mid-infrared. Part I: Single Analytes. Appl. Spectrosc., Vol.47, p OLINGER, J.M. & GRIFFITHS, P.R. (1993) - Effects of Sample Dilution and Particle Size/Morphology on Diffuse Reflection Spectra of Carbohydrates Systems in the Near- and Mid-infrared. Part II: Durum Wheat. Appl. Spectrosc., Vol.47, p PASQUINI, C. (2003) - Near Infrared Spectroscopy: Fundamentals, Practical Aspects and Analytical Applications. Journal of Brazilian Chemical Society, Vol.14, n.2, p PEREIRA, J.C. (1999) - Análise de Dados Qualitativos: Estratégias Metodológicas para as Ciências da Saúde, Humanas e Sociais. 2. ed. São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo. SABIN, J.G.; BANET, E.V. & FERRÃO, M.F. (2003) - Análise Exploratória Aplicada na Identificação de Fármacos Antidepressivos. Parte I: Análise Hierárquica de Agrupamentos. Tecno-Lógica, Vol. 7, n.1, p VALENTIN, J.L. (2000) - Ecologia Numérica: Uma Introdução à Análise Multivariada de Dados Ecológicos. Rio de Janeiro: Interciência. WILLIAMS, P.C. (1987) - Commercial Near-infrared Reflectance Analyzers. In: Near-infrared Technology in the Agricultural and Food Industries, by Phil Williams & Karl Norris. American Association of Cereals Chemists, Saint Paul. 8. Agradecimentos Os autores agradecem a Central Analítica da UNISC pela colaboração e à Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Sul e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pelas bolsas concedidas. ENEGEP 2004 ABEPRO 3182
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