1 FISIOLOGIA VEGETAL

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1 FISIOLOGIA VEGETAL 1

2 2 BIOGRAFIA ROBERTO CEZAR LOBO DA COSTA, filho de José Cândido Filho e Maria Helena Lobo da Costa, nasceu em Limoeiro do Norte, Estado do Ceará, no dia 22 de setembro de Graduou-se em Ciências Biológicas (Biologia), em 1979, pela Universidade Federal do Pará (UFPa). Em março de 1980, ingressou na carreira do magistério superior, lecionando Fisiologia Vegetal para os cursos de Agronomia e Engenharia Florestal da Faculdade de Ciências Agrárias do Pará (FCAP), passando a fazer parte do quadro de professores efetivos do Departamento de Biologia Vegetal e Fitossanidade (DBVF), hoje, Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), Instituto de Ciências Agrárias (ICA). Em 1986, pós-graduou-se com o título de Magister Scientiae em Fisiologia Vegetal, pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), Minas Gerais, com a Tese: EFEITO DE NÍVEIS DE ÁGUA E DE DOSES DE NITROGÊNIO SOBRE O CRESCIMENTO, MORFOLOGIA, PARTIÇÃO DE ASSIMILADOS E TROCA DE CO 2 EM Phaseolus vulgaris L. Em março de 1999, obteve o Título de Doutor em Bioquímica, pela Universidade Federal do Ceará (UFC) com Distinção e Louvor, apresentando a Tese: ASSIMILAÇÃO DE NITROGÊNIO E AJUSTAMENTO OSMÓTICO EM PLANTAS NODULADAS DE FEIJÃO-DE-CORDA [Vigna unguiculata (L.) Walp] SUBMETIDAS AO ESTRESSE HÍDRICO. Belém-Pa, 30 de janeiro de 2006

3 3 METABOLISMO DO NITROGÊNIO 1. INTRODUÇÃO Nutrição mineral: solução do solo. macronutrientes : N, P, K, Ca, Mg, S. micronutrientes : B, Cl, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo, (Co). O N é de grande importância para as plantas: AA, Proteínas, Enzimas, Ács.Nucléicos (RNA, DNA), Clorofilas etc... Fonte de N: 1. Ar (solo): N 2 (plantas fixadoras) 2. solução do solo: NO 3 - e NH 4 + Amonificação: Liberação de NH 4 + para o meio ambiente. Nitrificação: formação de NO 3 - por ação de bactérias. 2 NH O 2 2 NO 2 - NITROSSOMONAS + 2 H H 2 O 2 NO O 2 2 NO 3 - NITROBACTER

4 4 2. CICLO DO NITROGÊNIO Fixação Não Simbiótica N 2 Desnitrificação N 2, NO 2,N 2 O Fixação Biológica ou Simbiótica N 2 Bactérias Rhizobium Ureídeos SOLO Amonificação Absorção Oxidação NH 3 /NH 4 + NO 2 - NO 3 - Nitrosomonas Nitrificação Oxidação Nitrobacter Lixiviação Lençol Freático

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6 6 3. ABSORÇÃO DE NITRATO Existe um sistema de EFLUXO e INFLUXO.

7 7 Em cevada o sistema de influxo de 13 NO 3 - apresenta modelo típico da cinética de Michaelis-Menten. O influxo depende do nível de nitrato (tratamento prévio) e o sistema de transporte de nitrato é induzido por nitrato e do TIPO COTRANSPORTE ANTIPORT NO 3 - / H +

8 8 4. REDUÇÃO DO NITRATO O nitrato é reduzido a amônia/amônio (NH 3 /NH 4 + ) por dois processos catalíticos: A) REDUTASE DO NITRATO. B) REDUTASE DO NITRITO. Esta redução pode ocorrer na raiz e/ou folha, dependendo da espécie, idade e suprimento de NO NO CITOSOL: RN NO H e - NO H 2 O. 2. NO CLOROPLASTO OU PLASTÍDEO: RNi NO H e - NH H 2 O.

9 9 REDUTASE DO NITRATO (RN) É dependente de NADH É formada de duas sub-unidades de KDa de massa molecular, com grupo prostético FAD, Heme(Fe), citocromo b 557 e cofator Mo. Os elétrons passam: NADH FAD CIT b 557 MoCo NO 3 -

10 10 A enzima pode conter reações parciais: redução do CIT, cujo papel fisiológico não é claro. A localização: no CITOSOL e pode estar próxima a membrana do cloroplasto durante o tempo de redução (facilita o rápido transporte de NO 2 - para dentro do cloroplasto, pois é um composto altamente tóxico).

11 11 LANÇADEIRAS FORMAÇÃO DO NADH 1. MITOCONDRIAL. 2. CLOROPLASTIDIAL.

12 12 REDUTASE DO NITRITO (RNi) É uma enzima dependente de FERREDOXINA (FD). É formada de uma sub-unidade de KDa de massa molecular e contém siro-heme como grupo prostético (4Fe-4S) no seu sítio ativo. Localização: cloroplastos

13 13 5. ASSIMILAÇÃO DA AMÔNIA 1. GLUTAMINA SINTETASE (GS) Enzima responsável pela assimilação do NH 4 + (NH 3 ), o qual é incorporado na forma orgânica pela aminação do 2-oxoglutarado catalisado pela glutamato desidrogenase e/ou pela produção do 2- oxoglutarato do ciclo de Krebs. A catálise da GS é dependente de ATP para converter Glu em Gln (Km 3-5 M) e está presente em todos os tecidos das plantas. Porta de entrada da amônia para a formação dos aminoácidos em plantas superiores. É uma proteína octamérica com massa molecular de KDa, com 12 sub-unidade. Níveis altos de GS têm sido isolados de nódulos de leguminosas que fixam nitrogênio (feijão isoenzimas GS n1 e GS n2 ) Localização: CITOSOL (GS 1 ) e CLOROPASTOS (GS 2 ) ou PLASTÍDIOS. GLUTAMATO + NH 3 ATP Mg +2 ADP + Pi GLUTAMINA

14 14 2. GLUTAMATO SINTASE (GOGAT). É a enzima responsável pela transferência do grupo amida da Gln para o 2-Oxoglutarato para produzir 2 moléculas de glutamato (Glu). Duas diferentes formas de GOGAT estão presentes em plantas superiores : Utiliza a Ferredoxina reduzida (FD) como fonte de poder redutor (FD dependente) 1. Está presente em altas concentrações nas folhas e está localizada nos cloroplastos 2. A enzima é uma flavoproteína Fe S com massa molecular de KDa Utiliza o NADH (NADH dependente) 1. Está presente em baixas concentrações nas folhas, mas tem um grande papel na fixação do N 2 pelos nódulos (apresenta massa molecular de 200 KDa ) 2. Está localizada nos plastídios de nódulos de Phaseolus 2H NH 2 NH 2 GLUTAMINA + 2-Oxoglutarato NH 2 Glu-sintase(GOGAT) 2 Glu

15 15 6. AMINOTRANSFERASES OU TRANSAMINASES 1. Aspartato amino transferase: Glu + Oxaloacetato 2-Oxoglutarato + Aspartato 2. Alanina amino transferase : Glu + piruvato 2-Oxoglutarato + alanina Obs. 1. Os dois oxoglutaratos formados por essas vias podem retornar ao ciclo GS/GOGAT. 2. As aminotransferases têm sido detectadas em plantas que podem sintetizar todos os aminoácidos (exceto prolina). 3. Desse modo, o NITROGÊNIO pode ser facilmente distribuído a partir do Glutamato, via Aspartato e Alanina, para todos os aminoácidos. 4. A aspartato aminotransferase pode estar envolvida no transporte do poder redutor (NADH, NADPH) da mitocôndria e cloroplasto para dentro do citosol, os NADH produzidos serão utilizados na redução do nitrato ou na redução do hidroxipiruvato no peroxisomo.

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17 17 7. PROLINA (Pro) A prolina é sintetizada da seguinte forma: ATP Mg +2 ADP + Pi ciclado Glu Glutamil semialdeído Pirrolina 5 - Carboxilato NADPH + H + NADP + PROLINA P5CR NADPH + H + NADP + A enzimiologia das reações não está bem esclarecida em plantas superiores, somente a última enzima do passo metabólico está bem caracterizada e localizada no cloroplasto: - Pirrolina 5 - carboxilato redutase. Há evidências de que a ORNITINA via ou - Pirrolina 5 - carboxilato ou - Pirrolina 2 - carboxilato pode também agir como precursor da PROLINA. A rota sob condições normais não está bem esclarecida.

18 18 AcG ORNITINA OAT GLUTAMATO GSA P5C PROLINA P5CS P5CR P5CS = - Pirrolina 5 - carboxilato sintase P5CR = - Pirrolina 5 - carboxilato redutase OAT = Ornitina aminotransferase É o principal aminoácido componente de proteínas, particularmente nas sementes de cereais. A prolina pode também agir como protetor osmótico (ajustamento osmótico) nas plantas sujeitas ao déficit hídrico ou salino (aumento na síntese, possivelmente através da indução da - Pirrolina 5 - carboxilato redutase e/ou pelo decréscimo na taxa de oxidação mitocondrial da prolina).

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20 % de Prolina do total a.a livres % Prolina do total de a.a livres 20 % PROLINA - FOLHAS A % PROLINA - RAIZ B DIAS DE ESTRESSE

21 8. ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE DE NITROGÊNIO Há ocasiões em que as plantas necessitam transportar o nitrogênio de um órgão para outro: 1. Do nódulos para as folhas e fruto. 2. De folhas velhas para folhas jovens e frutos. 3. De cotilétones de sementes em germinação para as partes aéreas em expansão e ponta da raiz. Quando a disponibilidade de carbono é limitada, o N é transportado com alta razão N:C. A Asparagina é universalmente usada pelas plantas superiores como um componente de armazenamento e transporte. O N-amida é derivado diretamente do grupo amida da glutamina, sintetizada pela enzima asparagina sintetase. É uma reação dependente de glutamina e ATP. NH 2 ATP AMP + PPi Gln + Aspartato-NH 2 Glu-NH 2 + Asn-NH 2 21 NH 2 Asparagina Sintetase NH 2 Os cotilédones de sementes em germinação são as principais fontes de asparagina sintetase. Essa enzima requer Cl - para a atividade e é inibida na presença de Ca +2.

22 9. FORMAÇÃO DA AMÔNIA DURANTE O METABOLISMO DAS PLANTAS 22 A amônia é formada durante vários processos 1. Assimilação Inicial: produto da redução do nitrato e fixação de N Fotorrespiração: alta taxa liberada na conversão de Gly Ser 3. Metabolismo dos componentes de Transporte: É liberada durante a degradação da Asn, Arg e ureídeos. 4. Reações específicas dos aminoácidos: É liberada durante a conversão da Phe cinamato (produção de lignina); Cistationina Homoserina (na síntese da metionina); Treonina 2-oxobutirato (na biossíntese da Isoleucina) 5. Catabolismo de Proteínas: as proteínas são hidrolisadas durante a germinação das sementes e durante a senescência de folhas. Há evidências de que a amônia é formada pela ação da glutamato desidrogenase: Glu + NAD + + H 2 O 2-oxoglutarato+NH 3 + NADH +H + GDH

23 10. FOTOSSÍNTESE E O METABOLISMO DO NITROGÊNIO O NADPH e o ATP são gerados pelos dois fotossistemas (FS-I e FS-II) e podem ser utilizados para a síntese de outros compostos nitrogenados, tais como AMINOÁCIDOS e LIPÍDIOS. JUSTIFICATIVAS 1. O NO 2 - pode ser reduzido numa reação dependente da luz nos cloroplastos para formar glutamina e glutamato. 2. RNi, GS, GOGAT estão localizadas nos cloroplastos. 3. O caminho da fotorrespiração envolve a síntese de glicina pela transaminação do glioxilato. A NH 3 liberada pela reação da Gly Ser é reassimilada nos cloroplastos. 4. Nas C 4, o aspartato, a alanina e o glutamato estão envolvidos no transporte de metabólitos entre células da bainha vascular e células do mesófilo. 5. A aminotransferase do aspartato: 2-oxoglutarato estão envolvidas em transferir o poder redutor (NADPH) gerado no cloroplasto. 6. Os cloroplastos têm a capacidade de converter o Aspartato Lisina, Treonina, Isoleucina e Homocisteína em reações dependentes de LUZ. O piruvato leucina, valina e isoleucina, na sintese de aminoácidos aromáticos. 7. Todas as enzimas ou a maior parte delas necessárias para a síntese dos aminoácidos essenciais: Lisina, Treonina, Isoleucina, Homocisteína, Leucina, Valina, Triptofano, Fenilalanina e Tirosina, localiza-se nos cloroplastos, como também da sintese de arginina e prolina. 8. Os cloroplastos têm a capacidade de reduzir sulfato de cisteína, e as enzimas envolvidas nos passos metabólicos estão localizadas nos cloroplastos. A redução da gluationa, assim 23

24 24 como os mecanismos de desintoxificação de superóxidos são também dependentes da luz. 9. Uma grande quantidade de proteínas(p.ex. subunidades de RUBISCO, ATP-Sintetases e certos citocromos) são codificados pelo DNA cloroplástico e, portanto, dependentes da luz. 10. Os cloroplastos têm capacidade de sintetizar ácidos graxos, ácidos nucleicos e clorofilas, utilizando NADPH e ATP produzidos diretamente dos dois fotossistemas. OBS. Em locais não verdes como as raízes, os processos descritos podem ocorrer nos plastídios e a energia é dependente dos açúcares produzidos nas folhas.

25 25 METABOLISMO DA FIXAÇÃO DO N 2 1. FORMAÇÃO DOS NÓDULOS. 1 Crescimento dos pêlos radiculares. As raízes exsudam compostos orgânicos, tais como, açúcares, aminoácidos, etc. que irão atrair as bactérias rhizóbia (Quimiotactismo), formando uma rhizosfera microbiana. 2 Os pêlos radiculares eliminam exsudados específicos (flavanóides-antocianinas) para atrair as bactérias para as raízes e induzir especificidade através do gene nod da bactéria (nodulação). 3 A bactéria Rhizóbia atraca na superfície do pêlo radicular (provavelmente pela proteína específica - LECTINA-glicoproteína). 4 Em resposta ao sinal da Rhizóbia, o pêlo radicular curva com a mesma grudada. 5 A bactéria Rhizóbia digere a parede celular e forma o CORDÃO DE INFECÇÃO (forma de tubo) para dentro do córtex da raiz, onde penetram e se multiplicam intensamente, ocorrendo também intensa divisão celular das células corticais que se exteriorizam, formando o NÓDULO.

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29 29 Início da formação de nódulo radicular em uma planta leguminosa. 1. A região da córtex da raiz, com intensa divisão celular, recebe o nome de nódulo primário. 2. Ao chegar nas proximidades do nódulo primário, o cordão de infecção se ramifica para invadir as células vegetais. 3. Pequenos grupos de bactérias, contidas no interior de vesículas membranosas, são liberados dentro do citoplasma das células vegetais do nódulo primário. 4. O citoplasma da célula invadido conterá vários grupos de bactérias, individualizado por uma membrana derivada da membrana do cordão de infecção. 5. A partir desse início de estabelecimento do nódulo radicular, as bactérias, que se encontram dentro das células radiculares hospedeiras, param de se multiplicar, aumentam de tamanho e sofrem várias alterações bioquímicas para se transformarem em bactérias especializadas na fixação de nitrogênio, os bacterióides. 6. Para diferenciar as duas fases da vida desses microrganismos, convencionou-se que o nome bactéria seria utilizado enquanto não ocorressem as transformações bioquímicas que iniciam o processo de fixação de nitrogênio. Portanto, quando os microrganismos passam a fixar nitrogênio são chamados de bacterióides.

30 7. Os nódulos radiculares desenvolvidos possuem uma organização própria de tecidos. Eles apresentam um meristema responsável pela formação das células da região de invasão, uma região central e conexões vasculares com o xilema do cilindro central da raiz. Envolvendo e delimitando toda essa estrutura está o parênquima do nódulo. 30

31 31 2. A NITROGENASE E A REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO A reação de fixação do nitrogênio caracteriza-se pela redução do N 2 à NH 3 (NH 4 + ). A NITROGENASE E A REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO N 2 NH 3 (NH 4 + ) Nase Para que a reação ocorra, é necessário que haja um transporte de elétrons, mediado por moléculas aptas a realizá-lo. A enzima nitrogenase é formada por duas unidades protéicas, a Ferro-proteína (Fe-proteína) e a Molibdênio-Ferro-proteína (MoFeproteína), ambas capazes de transportar elétrons. Durante a reação de redução do N 2, a nitrogenase é auxiliada por uma terceira molécula transportadora de elétrons, a ferridoxina. O modelo proposto para a evolução da reação pode ser entendido do seguinte modo: A ferridoxina, na sua forma reduzida, transfere um elétron para a unidade Fe-proteína da nitrogenase. A Fe-proteína, então reduzida, doa o elétron recebido para a MoFe-proteína. A MoFe-proteína acumula os elétrons. Após 8 transferências, essa unidade terá acumulado 8 elétrons e, então, fará a redução do N 2 à NH 3. Para cada elétron transferido da Fe-proteína para a MoFeproteína são consumidos 2 ATPs. Para reduzir uma molécula de N 2 são necessários 8 (oito) elétrons e, portanto, 16 ATPs.

32 32 3. A LEGHEMOGLOBINA 1. As células das raízes da planta, bem como os próprios bacterióides, precisam de O 2 para a respiração celular. Mas o oxigênio (O 2 ) é altamente inibitório para a atividade da Nitrogenase (Nase). O QUE AS PLANTAS FAZEM???? 2. As estratégias desenvolvidas para evitar o excesso de O 2 nos nódulos radiculares, prevenindo contra a conseqüente inibição da nitrogenase, foram duas:

33 33 Estratégia anatômica: o parênquima do nódulo funciona como uma barreira de difusão do O 2. Os espaços intercelulares são pequenos e pouco numerosos, podendo ser preenchidos com água. Logo, a entrada de O 2 no interior do nódulo é muito dificultada. Estratégia bioquímica: as células vegetais da região central do nódulo produzem a leghemoglobina (hemoglobina das leguminosas). Essa molécula é um carregador de O 2, que garante que os bacterióides recebam o O 2 necessário para sua respiração, evitando que o gás circule livremente no nódulo.

34 34 4. GENES ENVOLVIDOS NA FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO 1. NAS BACTÉRIAS: Família Rhizobiaceae. A) Genes nif, aparentemente estão envolvidos com a síntese da nitrogenase. B) Genes fix produzem as moléculas que regulam o processo de fixação. Por exemplo, sabe-se que o gene fix X codifica a ferridoxina nessas bactérias. 2. FORMAÇÃO DOS NÓDULOS X BACTÉRIAS Família Rhizobiaceae. A) Genes nod (nodulação) são encontrados na bactéria, sendo responsáveis pela produção da proteína que recebe o sinal químico da planta hospedeira (os flavonóides-antocianinas) e pela produção das enzimas que sintetizam o fator de nodulação. B) Genes NOD são encontrados na planta leguminosa, sendo responsáveis pela síntese de proteínas denominadas nodulinas. As nodulinas (p. ex. a LEGHEMOGLOBINA) desempenham papel importante na formação e manutenção do nódulo radicular.

35 5. BIOQUÍMICA DA FIXAÇÃO 35

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37 37 6. FORMAÇÃO DOS UREÍDEOS São compostos resultantes da fixação do N 2 e baseados na estrutura da uréia. Os principais compostos são: Alantoínas, Ác. Alantóico e a Citrulina, sendo que os dois primeiros correspondem a 50 90% do nitrogênio orgânico encontrado no xilema de várias leguminosas tropicais (soja, caupi, feijão). Há boas evidências de que os ureídeos são sintetizados como produtos da fixação do nitrogênio nos nódulos das plantas leguminosas tropicais. Exemplos: Em soja, após 10 minutos de aplicação de 13 N 2, 40% da radioatividade foi encontrado no ác.alantóico. Em caupi, 90% do exudato do xilema (após 2 horas de exposição do nódulo ao 13 N 2 ) foi de ácido alantóico. Alantoína e Ác.Alantóico são derivados da purina INOSINA MONOFOSFATO, que é sintetizada da RIBOSE-5-FOSFATO e requer nitrogênio da Gutamina, Aspartato e Glicina.

38 mmoles N-ureideo/L seiva mmoles N-ureídico / L seiva 38 UREÍDEOS X ESTRESSE HÍDRICO UREIDEOS - XILEMA A DIAS DE ESTRESSE UREIDEOS NO XILEMA A controle 80 estresse DIAS APÓS A REHIDRATAÇÃO

39 39 OBRIGADO! Prof. Dr. Roberto Cezar Lobo da Costa