Bioquímica sérica de cães infectados por Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Leishmania sp.

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1 Acta Scientiae Veterinariae, : RESEARCH ARTICLE Pub ISSN Bioquímica sérica de cães infectados por Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Leishmania sp. Serum Biochemistry in Dogs Infected with Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Leishmania sp. Mariana de Pádua Costa 1, Rodrigo dos Santos Horta 1, Fernanda Morcatti Coura 2, Juliana Pinto da Silva Mol 1, Pâmela Cristina Lopes Gurgel Valente 1 & Paulo Ricardo de Oliveira Paes 1 ABSTRACT Background: Hemoparasitoses have major importance in clinical diseases of small animals for infections are highly prevalent, easily transmitted and difficult to control. Clinical signs are nonspecific, but laboratory abnormalities are frequent, especially changes in serum biochemistry. In veterinary medicine, laboratorial findings may favor the diagnosis of hemoparasitoses and improve the quality of treatment given to these patients. The present study aimed at evaluating changes in serum biochemistry in dogs with molecular diagnosis of hemoparasites (Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Leishmania sp.). Materials, Methods & Results: Molecular diagnosis for Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Leishmania sp. were obtained in 26 dogs. A complete serum biochemical profile was determined in biochemical analyzer COBAS Mira. Biochemical analyzes, using commercial kits from Synermed, included total and partial protein by colorimetric method, creatinine by the kinetic method, urea, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotrasnferase (AST), gamma glutamyl transferase (GGT) and alkaline phosphatase by enzymatic method. Considering reference values for canine species, it was observed an increase in the average value for serum urea concentration in dogs with leishmaniasis. These dogs also presented higher globulin concentration, while presenting reduction in serum albumin concentration, also identified in animals infected only by E. canis. Higher values of ALT were observed in the group infected with Leishmania sp. and in co-infections with concurrent increase of AST and alkaline phosphatase. Significant differences were observed between dogs infected by Ehrlichia canis and Anaplasma platys, whereas animals infected by E. canis demonstrated lower values for albumin (P < 0,02), and higher ALT (P < 0,05) and alkaline phosphatase (P < 0,02). Discussion: Renal azotemia, as a result of glomerulonephritis and interstitial nephritis is extensively described in dogs with leishmaniasis, but may also occur in cases of ehrlichiosis, as evidenced in this study. Changes in serum albumin and globulin are frequent in hemoparasitoses, especially in the leishmaniasis and chronic phase of ehrlichiosis, as observed in this study. Changes in biochemical analytes were frequent in animals with hemoparasitoses, highlighting the values of urea and creatinine in dogs with leishmaniasis, that also presented decreased levels of albumin and increased levels of globulins. Although these findings are reported in dogs with anaplasmosis, hipoalbiminemia and hypergammaglobulinemia were not identified in animals infected only by A. platys in this study. The hypoalbuminemia occurs as a consequence of decreased protein intake caused by anorexia, decreased protein production due to liver damage or loss in urine due to the kidney damage (proteinuria) while hyperglobulinaemia is linked to the host s immune response against the parasite, exacerbated in co-infections, as identified in this study. Hepatocellular damage was demonstrated by increased values of alkaline phosphatase and alanine aminotransferase (ALT) in animals infected with Ehrlichia canis. Statistical differences allowed to infer higher pathogenicity of Ehrlichia canis despite Anaplasma platys, especially in relation to oxidative stress and hepatocellular injury, although the differences may be also attributable to the stage of the disease the dogs were in. Keywords: dogs, hemoparasitoses, albumin, leishmaniasis. Received: 18 September 2014 Accepted: 27 January 2015 Published: 13 February Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias. 2 Departamento Medicina Veterinária Preventiva Escola de Veterinária (EV), Universidade Federal de Minas (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brazil. CORRESPONDENCE: P.R.O. Paes [paulopaes@vet.ufmg.br]. Av. Antônio Carlos n. 6627, Bairro Pampulha. CEP Belo Horizonte, MG, Brazil. 1

2 INTRODUÇÃO As hemoparasitoses são doenças de extrema importância na clínica de pequenos animais, por serem infecções de elevada prevalência, fácil transmissão e difícil controle. Os sinais clínicos são inespecíficos e extremamente variáveis, associados a diferentes taxas de morbidade e mortalidade [23]. A erliquiose monocítica canina e a trombocitopenia cíclica canina são denominações para afecções causadas pelas bactérias Ehrlichia canis e Anaplasma platys, respectivamente [9]. A leishmaniose visceral canina (LVC), associada às espécies de Leishmania sp., é transmitida por mosquitos flebotomíneos, sendo encontrada na América desde os Estados Unidos até o norte da Argentina. Trata-se de uma zoonose de grande importância, com casos humanos (leishmaniose visceral humana, LVH) frequentemente relatados na América Latina [18]. Na Medicina Veterinária, os achados patoclínicos podem favorecer o diagnóstico das hemoparasitoses e melhorar a qualidade do tratamento conferido a esses pacientes [23]. O presente estudo teve como objetivo avaliar alterações na bioquímica sérica de cães com infecções confirmadas, pela PCR, para hemoparasitas (Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Leishmania sp.). MATERIAIS E MÉTODOS Critérios de inclusão Foram incluídos, nesse estudo, cães de raças e idades variadas, com diagnóstico molecular de uma ou mais das seguintes hemoparasitoses: Ehrlichia sp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Babesia canis canis e Leishmania sp., provenientes, da rotina clínica no Hospital Veterinário da UFMG, do projeto de castração AGHA, realizado pela Escola de Veterinária da UFMG e de um canil comercial localizado na região norte de Belo Horizonte. Com exceção dos animais provenientes do projeto de castração AGHA, todos apresentavam suspeita clínica de hemoparasitose. Foram excluídos os animais que apresentaram reação positiva para Ehrlichia sp., sem confirmação na nested-pcr para Ehrlichia canis ou Anaplasma platys, e aqueles com diagnóstico molecular de Babesia canis canis. Coleta de amostras A partir da punção da veia jugular ou cefálica, foram obtidos 3,0 ml de sangue, de cada animal, com 2 armazenamento, sob refrigeração, por no máximo 24 h, em tubos estéreis contendo EDTA e tubos estéreis contendo ativador de coagulação. A punção de medula óssea, a partir do osso esternal, foi realizada, mediante anestesia local com lidocaína, sem vaso constritor, com posterior punção, utilizando agulha 40x12. O material obtido foi depositado em lâmina de vidro, para a confecção da lâmina pela técnica do esmagamento ( squash ). Após a secagem do material, foi utilizada a coloração de Romanowski (Panótico Rápido LB ) 1 com posterior avaliação em microscopia óptica. O restante do material coletado da medula óssea foi colocado imediatamente em tubos estéreis, contendo EDTA, e congelados para posterior análise molecular. As amostras de sangue total e medula ósseas em EDTA foram mantidas congeladas para realização do diagnóstico molecular, enquanto o soro foi utilizado para as análises bioquímicas. Diagnóstico molecular Amostras congeladas de sangue e medula óssea, em tubos contendo EDTA, foram utilizadas para o diagnóstico molecular de hemoparasitas, pela técnica da PCR. O DNA das amostras congeladas foi extraído através do reagente para purificação de DNA (Ilustra Blood Genomic Prep Mini Spin Kit ) 2. O produto da extração foi dosado quanto a sua concentração no aparelho NanoDrop ND-1000 por espectrofotometria. As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o kit para PCR (Gotaq Flexi DNA Polymerase 500U ) 3, sendo nested-pcr para identificação de Ehrlichia canis e Anaplasma platys (após reação comum para Erlichia spp.), semi-nested-pcr para a identificação de Babesia canis canis (após reação para Babesia spp.) e PCR simples para identificação de Leishmania sp. A nested-pcr para diagnóstico de Ehrlichia canis e Anaplasma platys consistiu, inicialmente na realização, de uma primeira reação para Ehrlichia sp., utilizando-se 3 μl de cada amostra de DNA extraído, 9,55 μl de água miliqué, 5 μl de solução tampão, 5 μl de MgCl2, 0,5 μl de dntp (solução contendo as bases nitrogenadas adenina, timina, citosina e guanina) e 2,5 μl dos oligonucleotídeos iniciadores (5 -CGTAT- TACCGCGGCTGCTGGC-3, senso e 5 -AGAACGA- ACGCTGGCGGCAAGCC-3, antisenso), totalizando uma mistura para reação de 25 μl, para cada amostra, submetida ao seguinte programa no termociclador:

3 94 C por três min, seguida de 40 ciclos de 94 C por um min, 60 C por um min e 72 C por um min, para finalmente ser mantido a 72 C por cinco min. A segunda reação (nested-pcr), contendo os iniciadores de Ehrlichia canis (5 -CAATTATTTATAGCCTCTGG- CTATAGGAA-3, senso e 5 -TATAGGTACCGTCAT- TATCTTCCCTAT-3, antisenso) ou Anaplasma platys (5 -TTTTTGTCGGAGCTTGCTATGATA-3, senso e 5 -TGTGGGTACCGTCATTATCTTCCCCA-3, antisenso), envolve a mesma quantidade dos reagentes da primeira reação, mas ao invés de 3 μl da amostra de DNA, é acrescentado 1 μl do produto da primeira amplificação, totalizando uma mistura para reação de 23 μl, que foi submetida ao mesmo ciclo anterior, no termociclador [5]. No diagnóstico de Babesia canis canis é realizado o semi-nested a primeira reação é idêntica à utilizada para Ehrlichia sp., substituindo apenas os iniciadores para aqueles referentes à Babesia sp. (5 -GTCTTGTAATTGGAATGATGGTGAC-3, senso e 5 -ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA-3, antisenso). A segunda reação (semi-nested-pcr) é idêntica à primeira, no entanto, inclui os iniciadores específicos para Babesia canis canis (5 -ATGCCCCCAACCG- TTCCTATTA-3, senso e 5 -TGCGTTGACGGTT- TGACC-3, antisenso) e apenas 1 μl do produto da amplificação para Babesia sp. [4]. As duas reações utilizam a mesma programação no termociclador, conforme utilizado para Ehrlichia sp. Para o diagnóstico de Leishmania sp., utilizou- -se 23 μl do PCR Supermix 4 que contém os reagentes necessários para a reação (água, dntp, MgCl 2, tampão e TAQ polymerase) acrescido de 1 μl do DNA extraído das amostras e 0,5 μl de cada oligonucleotídeo iniciador, específicos para este agente (5 -CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3, senso e 5 CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3, antisenso), totalizando 25 μl de volume para a reação. A programação no termociclador consistiu em 94ºC por quatro min, seguido de 49 ciclos de 94º por 30 s, 59º por 30 s, 72º por 30 s e, para finalizar a fase final de extensão do DNA, 72º por 10 min [8]. Os produtos da amplificação foram separados a partir da eletroforese em gel de agarose 2%, a 110 V e amperagem livre, por cerca de min, utilizando 10 μl de cada solução após amplificação. O produto gerado pelos pares de oligonucleotídeos iniciadores deve apresentar 478 pb para Ehrlichia sp., 389 pb para 3 Ehrlichia canis, 384 pb para Anaplama platys [5], 340 pb para Babesia sp., 198 pb para Babesia canis canis [4] e 145 pb para Leishmania sp. [8]. Todas as reações foram conduzidas utilizando um controle negativo (água miliqué) e um controle positivo (DNA de cada microorganismo). Análise bioquímica O perfil bioquímico foi realizado, a partir do soro obtido após a centrifugação do sangue armazenado em tubos contendo ativador de coagulação, em Analisador Bioquímico Cobas Mira 5. As análises bioquímicas, utilizando kits comerciais da Synermed, incluiram proteína total e frações, pelo método colorimétrico, creatinina, pelo método cinético, uréia, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotrasnferase (AST), gamaglutamiltransferase (GGT) e fosfatase alcalina (FA), pelo método enzimático. Os valores de referência seguem Kaneko et al. [14]. Análise estatística Foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado em que cada animal representou uma unidade experimental ou repetição e cada perfil infeccioso, considerando infecções isoladas ou associadas por hemoparasitas, representou uma parcela. Os dados foram analisados de forma descritiva, no entanto, para os infectados exclusivamente por E. canis ou A. platys, foi possível aplicar a inferência estatística. Os valores obtidos no perfil bioquímico foram testados quanto à normalidade (teste de Kolmogorov-Smirnov) e homocedasticidade. As respostas que apresentaram distribuição normal de probabilidades e homogênea de variâncias (concentração sérica de albumina e ALT) foram submetidas à análise de variância e teste de Fisher. As demais respostas, por não atenderem aos critérios de normalidade e homocedasticidade, foram avaliadas pelo teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Foram consideradas significativas as diferenças com P < 0,05. RESULTADOS Vinte e seis cães, de raças e idades variadas apresentaram diagnóstico molecular para Ehrlichia canis, Anaplasma platys e/ou Leishmania sp. Quatro cães foram excluídos, pois apresentaram reação positiva apenas para Ehrlichia sp., sem confirmação de Ehrlichia canis ou Anaplasma platys. Esses animais

4 podem apresentar infecção por outra espécie do gênero Ehrlichia à exemplo da E. risticii e E. ewingii, que podem infectar naturalmente os cães. Foram excluídos também os pacientes que apresentaram diagnóstico molecular de babesiose isolado ou concomitante à outras infecções. A Tabela 1 contém a média e o desvio padrão para cada analito realizado nos diferentes grupos. Considerando-se os valores de referência para a espécie canina, observou-se aumento no valor médio para a concentração sérica de uréia nos cães com leishmaniose, exceto na coinfecção por Ehrlichia canis, com apenas um indivíduo. Aumento concomitante na concentração média de creatinina foi observada nos grupos LEISH e APA + LEISH. Foram observados valores médios acima da referência para a concentração de globulinas nos cães com leishmaniose (LEISH, ECA + LEISH, APA + LEISH, ECA + APA + LEISH), e também nas coinfecções, mesmo que a Leishmania sp. não estivesse envolvida (ECA + APA). Redução na concentração sérica média de albumina foi identificada também nas infecções mistas ou isoladas envolvendo Leishmania sp., mas também nos animais infectados exclusivamente por Ehrlichia canis (ECA). Nesse grupo, 62,5% (5/8) dos cães apresentaram diminuição nos níveis de albumina ou aumento da globulina, e três destes (37,5%) apresentaram as duas alterações. Médias elevadas, para a enzima ALT, foram observadas nos grupos infectados por Leishmania sp. (LEISH), E. canis e A. platys (ECA + APA) e Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Leishmania sp. (ECA + APA + LEISH). Observou-se aumento concomitante da média dos valores de AST no grupo ECA + APA, e aumento isolado de FA no grupo APA + LEISH. Foi possível aplicar a inferência estatística para comparação das médias obtidas para cada analito nos grupos infectados por E. canis (ECA) e A. platys (APA). Observou-se diferença nos valores de albumina (Fisher, P < 0,02), ALT (Fisher, P < 0,05) e fosfatase alcalina (Mann-Whitney P < 0,02), sendo que os animais infectados por E. canis apresentaram valores inferiores de para albumina, e superiores para ALT e fosfatase alcalina. Tabela 1. Média e desvio-padrão obtidos para cada analito, em bioquímica sérica, de 26 cães, nos sete grupos estudados, de acordo com o perfil infeccioso. Grupo ALT (U/L) AST (U/L) CREATINI- NA (mg/dl) PTNA (g/dl) ALB (g/ dl) GLOB (g/dl) GGT (U/L) FA (U/L) URÉIA (mg/ dl) ECA(n=8) 101,9±36,0 91,2±29,3 1,1±0,2 5,7±1,6 1,5±0,8 4,2±1,3 2,7±2,1 136,2±93,0 41,2±12,6 APA (n=5) 58,6±20,5 64,6±18,8 1,1±0,2 6,5±0,6 2,6±0,5 3,9±0,9 1,8±0,6 31,1±21,6 27,5±11,3 LEISH (n=4) 117,5±71,3 60,9±13,0 3,5±2,9 6,7±0,8 1,8±0,8 4,8±1,0 5,4±5,8 120,8±147,1 110,2±106,6 ECA + APA 140,4±139,5 109,6±99,7 1,2±0,1 7,8±0,7 2,4±0,5 5,3±0,6 4,2 35,0±14,4 27,6±4,1 (n=4) (n=1) ECA + LEISH 93,7 (n=1) 77,5 (n=1) 1,4 (n=1) 7,0 1,4 5,6-44,6 (n=1) 31,5 (n=1) (n=1) (n=1) (n=1) (n=1) APA + LEISH 97±21,5 85,5±11,6 1,9±0,7 6,5±0,4 1,8±0,7 4,7±0,3-232,5±192,5 104,9±69,8 (n=2) ECA + APA + 127,3±14,3 62,0±29,9 1,5±0,3 7,1±0,4 1,5±0,4 5,6±0,8-108,1±61,3 96,0±39,6 LEISH (n=2) VALORES DE REFERÊNCIA ,5-1,5 5,4-7,5 2,3-3,1 2,7-4, ECA: Ehlichia canis; APA: Anaplasma platys; LEISH: Leishmania complexo donovani; ALT: alanina aminotransferase; AST: aspartato aminotransferase; PTNA: proteína total; ALB: albumina; GLOB: globulina; GGT:gama glutamil-transferase; FA: fosfatase alcalina. Diferenças significativs para ALT (P < 0,05), ALB (P < 0,02) e FA (P < 0,02), entre os grupos ECA e APA. DISCUSSÃO O diagnóstico das hemoparasitoses representa um desafio para o clínico de pequenos animais, mas determinados achados pato-clínicos podem favorecer a identificação dessas infecções [23]. 4 A azotemia renal, em consequência da nefrite intersticial e glomerulonefrite, associadas ao depósito de imunocomplexos é amplamente descrita em cães com leishmaniose [6,7,24], podendo ocorrer também nos casos de erliquiose [20], conforme evidenciado

5 neste estudo. Essa alteração pode ser observada em até 45% dos animais com LCV, mas apenas 38% apresentam aumento no nível sérico de creatinina [20], no entanto, apenas 10,7% dos cães infectados por L. infantum, desenvolvem azotemia [6]. Valores elevados de uréia e creatinina podem ser observados em cães com diagnóstico parasitológico de erliquiose [20], no entanto, assim como no presente estudo, animais coinfectados por Ehrlichia canis e Leishmania sp. podem não apresentar alterações nesses analitos [24]. Alterações nas concentrações séricas de albumina e globulina são frequentes nas hemoparasitoses, principalmente na leishmaniose [17] e na fase crônica da infecção por E. canis, conforme observado neste estudo [16,22]. No entanto, nesses casos, a proteína total pode se encontrar dentro da faixa de normalidade, pois a hipoalbuminemia é acompanhada por hipergamaglobulinemia que ocorre principalmente na fase crônica da infecção [13,16]. Essa alteração é consistente, podendo ocorrer em todos os cães sorologicamente positivos para Leishmania sp. [18]. Em um estudo realizado no Mato Grosso, região centro-oeste do país, hipoalbuminemia e hiperglobulinemia foi um achado frequente, também, em cães com diagnóstico molecular de Ehrlichia canis [22]. Embora essas alterações sejam relatadas em cães com anaplasmose [2,3], hipoalbiminemia e hipergamaglobulinemia não foram identificadas nos animais infectados isoladamente por A. platys, neste estudo. A hipoalbuminemia ocorre em consequência da diminuição na ingestão de proteínas causada pela anorexia, diminuição na produção de proteínas causadas por danos hepáticos ou perda na urina devido à lesão renal (proteinúria), enquanto a hiperglobulinemia encontra-se associada à resposta imune do hospedeiro em relação ao parasita, com agravamento nas coinfecções, conforme identificado nesse estudo [11,17]. As hemoparasitoses podem provocar lesão hepatocelular ou estresse oxidativo sistêmico, com consequente aumento das enzimas ALT, AST e FA [1]. Neste estudo, com exceção das infecções isoladas por E. canis (ECA) ou A. platys (APA) e no grupo com infecção mista por E. canis e Leishmania sp. (ECA + LEISH), todos os grupos apresentaram alterações nas médias de ALT, AST e/ou FA, mas apenas o grupo ECA + APA + LEISH apresentou aumento concomitante de AST e ALT. No entanto, o aumento de ALT é descrito também em cães infectados isoladamente por A. platys [20]. Em cães com LVC ocorre aumento das enzimas hepáticas em apenas 16% dos animais [6], mas existem relatos de coinfecções por Ehrlichia canis e Leishmania sp. apresentando a média desses analitos dentro dos parâmetros estabelecidos [24]. As diferenças estatísticas observadas nas médias dos analitos entre os grupos ECA e APA permitem inferir maior patogenicidade da Ehrlichia canis em relação ao Anaplasma platys, principalmente em relação ao estresse oxidativo e lesão hepatocelular, embora as diferenças possam ser atribuídas, também, ao estágio da doença em que os animais se encontravam [10]. CONCLUSÕES Alterações nos analitos bioquímicos são frequentes em animais com erliquiose, anaplasmose e leishmaniose, com destaque para os valores de albumina, fosfatase alcalina e ALT, nos animais infectados por Ehrlichia canis. As alterações encontradas indicam que essas hemoparasitoses provocam danos renais e hepáticos. A infecção por Leishmania sp. encontra-se associada à redução dos teores de albumina e aumento de globulina. MANUFACTURERS 1 Laborclin. Pinhais, PR, Brazil. 2 GE Healthcare. São Paulo, SP, Brazil. 3 Promega. São Paulo, SP, Brazil. 4 Invitrogen. São Paulo, SP, Brazil. 5 Roche. São Paulo, SP, Brazil. Ethical approval. Esse estudo foi aprovado (Protocolo n 175/2010) e conduzido conforme as recomendações do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais. Os tutores dos animais que participaram do experimento assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido atestando ciência dos termos do estudo e autorizando a participação. Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper. 5

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