Universidade Federal do Triângulo Mineiro

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1 Universidade Federal do Triângulo Mineiro CÉLULAS ESCAMOSAS ATÍPICAS DE SIGNIFICADO INDETERMINADO: UTILIZAÇÃO DA CLASSIFICAÇÃO DE BETHESDA 2001, CONDUTA E ASSOCIAÇÃO COM INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO Ana Cristina Macêdo Barcelos Uberaba, MG, 2008

2 Ana Cristina Macêdo Barcelos CÉLULAS ESCAMOSAS ATÍPICAS DE SIGNIFICADO INDETERMINADO: UTILIZAÇÃO DA CLASSIFICAÇÃO DE BETHESDA 2001, CONDUTA E ASSOCIAÇÃO COM INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO Tese apresentada ao curso de pós-graduação em Patologia, área de concentração: Patologia Ginecológica e Obstétrica, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito Parcial para obtenção do Título de Doutor. Orientador: Professor Dr. Eddie Fernando Cândido Murta Co-Orientadora: Professora Dra. Sheila Jorge Adad Novembro, 2008

3 B218c Barcelos, Ana Cristina Macêdo. Células escamosas atípicas de significado indeterminado: Utilização da classificação de Bethesda 2001, conduta e associação com infecção por papilomavírus humano / Ana Cristina Macêdo Barcelos f..; + anexos. Tese (Doutorado) em Patologia Ginecológica e Obstétrica Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, Orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Cândido Murta. 1. Colo uterino. 2. ASCUS. 3. Colposcopia. 4. HPV I. Título. CDU

4 Aos meus pais Carlos Alberto e Mariza e minhas irmãs Adriana e Carolina com amor e admiração

5 Agradecimentos

6 Ao Professor Eddie Fernando Cândido Murta, exemplo de pesquisador responsável e dedicado, sempre em busca das mais atualizadas técnicas mundiais na pesquisa do trato genital inferior. Agradeço o incentivo oferecido na continuação da tese de mestrado, a orientação, confiança, estímulo e disponibilidade constante em me auxiliar. À Professora Sheila Jorge Adad pela co-orientação recebida durante o trabalho e a releitura das lâminas de citologia cérvico-vaginal. Durante os encontros e discussões, aprendi a importância do treinamento de profissionais médicos qualificados e com prática para um resultado satisfatório na avaliação dos esfregaços. À Professora Márcia Antoniazi Michelin pelo auxílio na leitura das amostras, através de técnicas biomoleculares e incentivo à pesquisa. Ao Sr. Celso Tadeu pelo apoio técnico no laboratório, preparação dos meios de cultura e interpretação dos resultados.

7 Às funcionárias do setor de Citologia Nilva Aparecida da Silva Aveiro, Dóris Lima Dayrell de Carvalho, Heloísa Helena Vieira e Zelma Rocha Camargos Pereira, pelo exemplo de carinho e preocupação com nossas pacientes, agradeço pelo auxílio na triagem de exames e pacientes que fizeram parte do trabalho. À colega de pós-graduação Marília de Carvalho Mardegan que, durante esses anos, dividiu comigo preocupações, expectativas, dificuldades e sonhos. À Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM) e à Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia da UFTM que me proporcionaram estrutura para a realização deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro ao desenvolvimento da pesquisa. À Sociedade de Medicina e Cirurgia de Uberaba (SMCU) pelo auxílio na aquisição do vídeo-colposcópico utilizado neste estudo.

8 SUMÁRIO LISTA DE TABELAS 01 LISTA DE FIGURAS 03 ABREVIATURAS 06 INTRODUÇÃO 07 OBJETIVOS 18 CASUÍSTICA E MÉTODOS Casuística Métodos Métodos Clínicos Métodos Microbiológicos e bioquímicos Captura híbrida Exame Colposcópico Avaliação citológica e histológica Análise estatística 28 RESULTADOS 29 DISCUSSÃO 43 CONCLUSÕES 58 RESUMO 60 ILUSTRAÇÕES 62 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69 ANEXOS 76

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Distribuição dos casos com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASCUS provável caráter reativo e ASCUS provável neoplasia, em relação à infecção. Tabela 2. Distribuição dos casos com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC- H, em relação à infecção. Tabela 3. Principais achados colposcópicos das pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASCUS provável reativo e ASCUS provável neoplasia. Tabela 4. Principais achados colposcópicos das pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC-H. Tabela 5. Resultado das biópsias realizadas nas pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASCUS provável reativo e ASCUS provável neoplasia, que apresentaram alterações durante o exame colposcópico. Tabela 6. Resultado das biópsias realizadas nas pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados segundo Regione Emilia Romagna em ASCUS 1, ASCUS 2, ASCUS 3,ASCUS 4 e ASCUS 5. Tabela 7. Resultado das biópsias realizadas no grupo total de pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC-H, que apresentaram

10 alterações durante o exame colposcópico. Tabela 8. Distribuição dos casos de NIC II/III à biópsia em relação ao diagnóstico citológico de ASCUS provável neoplasia, ASC-H e ASCUS 1 (Classificação de Regione Emilia Romagna). Tabela 9. Resultado da pesquisa de DNA/HPV de alto risco pela técnica de captura híbrida nas pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC- H. Tabela 10. Presença de lesão de alto grau na biópsia, em relação à positividade de HPV de alto risco à captura híbrida e reclassificação citológica de ASCUS segundo Bethesda 2001.

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Caso 1 Células superficiais e intermediárias com disceratose (ASCUS provável reativo pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-US pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 2. Caso 1 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Colposcopia normal. Aumento de 16x. Figura 3. Caso 2 Citologia inicial. Células metaplásicas com cariomegalia, hipercromasia nuclear e disceratose (ASCUS provável neoplásico pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-US pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 4. Caso 2 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Notar área de epitélio aceto-branco bem delimitada em lábio anterior e posterior, sem relevo. Achados colposcópicos menores. Aumento de 16x. Figura 5. Caso 2 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau I. Notar epitélio escamoso com núcleos hipercromáticos e aumentados de tamanho em toda a espessura e perda de maturação citoplasmática atingindo o terço inferior. Aumento de 400x. Figura 6. Caso 2 Citologia de retorno - Células superficiais e intermediárias com binucleação, hipercromasia, irregularidade da membrana celular e halo perinuclear (coilocitose) - Infecção por HPV. Aumento de 400x. Figura 7. Caso 3 Citologia inicial - Células superficiais, intermediárias e metaplásicas com hipercromasia e alteração da relação núcleocitoplasmática (ASCUS provável neoplasia pela classificação de Bethesda

12 1991 e ASC-H pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 8. Caso 3 Citologia inicial - Células metaplásicas com hipercromasia e alteração da relação núcleo-citoplasma (ASCUS provável neoplasia pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-H pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 9. Caso 3 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Notar área de epitélio aceto-branco bem delimitada e com relevo em lábio anterior. Achados colposcópicos maiores. Aumento de 16x. Figura 10. Caso 3 Coleta de biópsia de área atípica em lábio anterior de colo uterino com pinça de Gaylor. Aumento de 16x. Figura 11. Caso 3 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau III. Notar epitélio escamoso com núcleos aumentados de tamanho, hipercromáticos e perda de maturação em toda a espessura. Aumento de 100x. Figura 12. Caso 3 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau III. Notar epitélio escamoso com núcleos aumentados de tamanho, hipercromáticos e perda de maturação em toda a espessura. Aumento de 200x. Figura 13. Caso 4 Citologia inicial - Células superficiais, intermediárias e metaplásicas com hipercromasia, alteração da relação núcleocitoplasmática, contorno irregular da membrana nuclear e binucleação. (ASCUS provável neoplasia pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-H pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 14. Caso 4 Coleta de material endocervical com cito-brush para pesquisa de DNA de HPV por método de captura híbrida. Aumento de 10x.

13 Figura 15. Caso 4 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Notar área de epitélio aceto-branco bem delimitada com orifícios glandulares espessados em lábio posterior. Achados colposcópicos maiores. Aumento de 16x. Figura 16. Caso 4 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau II. Notar epitélio escamoso com núcleos hipercromáticos e aumentados de tamanho em toda a espessura e perda de maturação citoplasmática atingindo o terço médio. Aumento de 400x.

14 ABREVIATURAS AGUS = Células glandulares atípicas de significado indeterminado ASC = Células escamosas atípicas ASCUS = Células escamosas atípicas de significado indeterminado ASC-US = Células escamosas atípicas de significado indeterminado ASC-H = Células escamosas atípicas de significado indeterminado não se podendo excluir lesão de alto grau HPV = Papilomavírus humano HSIL = Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau LSIL = Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau NIC = Neoplasia intra-epitelial cervical NIC I = Neoplasia intra-epitelial cervical grau I NIC II = Neoplasia intra-epitelial cervical grau II NIC III = Neoplasia intra-epitelial cervical grau III PCR = Reação em cadeia de polimerase ph = Potencial hidrogeniônico SIL = Lesão intra-epitelial escamosa

15 INTRODUÇÃO

16 Sabe-se que programas nacionais de rastreamento de câncer de colo uterino reduzem a mortalidade de mulheres e estima-se que o exame de Papanicolaou tenha prevenido a morte de 1 em 65 mulheres desde 1950 (EVANS et al., 2006). Após a introdução da análise do esfregaço celular por Papanicolaou, em 1943, como método de detecção do câncer de colo uterino e suas lesões precursoras, diferentes terminologias têm sido utilizadas para descrever o diagnóstico citológico (MORIN et al., 2000). A classificação de Papanicolaou é baseada em critérios citológicos e divide, de acordo com a Associação Brasileira de Genitoscopia (2008), as alterações em cinco grupos: classe I (epitélio normal, ausência de atipias), classe II (células anormais sem malignidade, alterações inflamatórias), classe III (sugestiva, mas não conclusiva de malignidade), classe IV (fortemente sugestiva de malignidade) e classe V (conclusivo para malignidade). Em 1970 surgiu a classificação da Organização Mundial de Saúde para tentar corrigir as falhas da classificação de Papanicolaou. No entanto, também se baseava em critérios morfológicos e, assim, atendia bem ao patologista, porém, pouco se relacionava com o prognóstico da lesão, gerando dúvidas quanto à conduta clínica. Essa classificação se divide em: normal; com atipia; displasia leve/moderada/acentuada (de acordo com o grau de comprometimento do epitélio); carcinoma in situ; carcinoma escamoso ou adenocarcinoma (Associação Brasileira de Genitoscopia. 2008). Em 1986, Richart, acreditando serem as displasias parte de um processo contínuo que podem evoluir para o câncer (MAGGI et al., 1989), classificou-as em: neoplasia intraepitelial cervical grau I (NIC I), correspondente à displasia leve; neoplasia intra-epitelial cervical grau II (NIC II), referente à displasia moderada e, neoplasia intra-epitelial grau III (NIC III), correspondente à displasia severa e carcinoma in situ. Todas essas classificações

17 eram consideradas confusas e apresentavam, na prática, pouca reprodutibilidade entre os observadores (SOLOMON et al., 2005). A classificação de Bethesda proposta em 1988 e revista em 1991 reflete o comportamento biológico das lesões intra-epiteliais escamosas do colo uterino (SIL), tentando estabelecer prognóstico (KURMAN et al., 1994). Essa classificação subdivide as células epiteliais escamosas anormais em 4 grupos: 1) células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS); 2) lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL), compreendendo displasia leve/nic I e alterações celulares associadas ao papilomavírus humano (HPV); 3) lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL) incluindo displasia moderada/nic II, displasia severa e carcinoma in situ/nic III; 4) carcinoma de células escamosas. Observa-se que na adoção do sistema de Bethesda surge uma nova definição da alteração citológica: ASCUS. Esse termo é utilizado para identificar processos inflamatórios, reativos ou reparativos, atípicos ou mais intensos, que qualitativa e quantitativamente não são suficientes para serem interpretados como displasia cervical (NIC) ou SIL (DAVEY et al., 1996; ERGENELI et al., 2001; GIUDICE et al., 2000; KATZ et al., 1997). O diagnóstico é feito pela presença de aumento do núcleo de 2,5 a 3 vezes em relação ao das células intermediárias, aumento discreto da relação núcleo-citoplasmática, bi ou multinucleação, discreta hipercromasia, contorno nuclear em geral liso e regular, anisocariose e pleomorfismo (MORIN et al., 2000). De todas as alterações introduzidas pelo Sistema de Bethesda, provavelmente nenhuma foi tão problemática como o termo ASCUS, pois reflete a incapacidade do citopatologista em estabelecer um diagnóstico definitivo em alguns casos (SOLOMON et al., 2005). O comitê do sistema de Bethesda propôs os critérios citológicos para o termo ASCUS, mas sua aplicação ainda era variável (DAVEY et al., 1994). Desde a sua inserção como termo citológico, o diagnóstico de ASCUS ocasionou confusão e controvérsias em relação ao seu significado e uso adequado e, por isso, várias pesquisas na área médica já foram publicadas sobre esse assunto (KATZ et al., 1997; SOLOMON et al., 2001; SODHANI et al., 2004). Embora esse termo deva ser utilizado nos casos em que um diagnóstico correto de benignidade ou de um processo neoplásico não pode ser feito, ele informa ao clínico o maior risco de subseqüente detecção de SIL (MALIK et al., 1999). Mais de 2 milhões de mulheres nos Estados Unidos recebem diagnóstico de ASCUS na citologia cérvico-vaginal a cada ano (SOLOMON et al., 2001; COX, 2005). O seguimento clínico ideal para essas

18 mulheres é muito controverso e persistem dúvidas sobre qual estratégia de controle e tratamento seriam mais apropriadas (KATZ et al., 1997; YARANDI et al., 2004). Comparações entre laboratórios têm demonstrado que a freqüência do diagnóstico de ASCUS varia de 1,6 a 9% (DAVEY et al., 1994). Gerber et al. (2001) detectaram ASCUS em 5% (1.387) de um total de pacientes de seu estudo. Lee et al. (2006) relataram diagnósticos de ASCUS, equivalendo a 2% do total de citologias oncológicas realizadas. Apesar dos esforços para estabelecer critérios específicos para a caracterização do ASCUS, o uso desse termo por vários patologistas pode variar (LEE et al., 2006). Em 1992, um encontro no Instituto Nacional do Câncer concluiu que o diagnóstico de ASCUS poderia ocorrer em no máximo 5% das pacientes da rotina de citologia e que a alta freqüência do diagnóstico poderia indicar emprego errado do termo (LEE et al., 2006). Os autores do sistema de Bethesda, reconhecendo o possível uso excessivo do ASCUS, recomendam que a sua freqüência não deva exceder 2 a 3 vezes a freqüência de LSIL (KURMAN et al., 1994; JUSKEVICIUS et al., 2001). Orientaram também a qualificação do diagnóstico de ASCUS, se possível, indicando se ele sugeria um provável processo reativo ou se possuía alterações sugestivas de lesões pré-neoplásicas (DAVEY et al., 1994; MALIK et al., 1999). Morin et al. (2000) tentaram identificar parâmetros citológicos em esfregaços de mulheres com diagnóstico de ASCUS que poderiam ajudar o citologista a demonstrar que alguns casos de ASCUS estariam mais provavelmente ligados ao diagnóstico de NIC I ou NIC II/III. Os resultados mostraram que halo perinuclear e atipia nuclear moderada foram os critérios citológicos mais associados à NIC I, enquanto hipercromasia, anisocariose, halo perinuclear e aumento do volume nuclear em células metaplásicas estão mais associados à NIC II/III.

19 Alguns autores sugerem que há valor significante na subclassificação do ASCUS baseada em critérios morfológicos definidos (SHEILS et al., 1996). Desde a subdivisão inicial em provável reativo ou provável neoplásico, o sistema de Bethesda descreve diferentes subgrupos para o termo ASCUS: a) esfregaço comprometido (por alteração na fixação e coloração ou por material prejudicado); b) citoplasma tipo maturo-intermediário; c) mulheres na pós-menopausa; d) metaplasia atípica; e) paraceratose atípica ou disceratose (CENCI et al., 2000). Baseados nesses grupos, Cenci et al. (2000) propuseram condutas para cada subtipo de ASCUS: a) pacientes com esfregaço comprometido devem ser submetidas à nova coleta; b) em citologia com ASCUS de células com citoplasma tipo maturo-intermediário ou paraceratose deve ser realizado seguimento citológico e colposcopia, se persistir o ASCUS, colposcopia imediata ou teste de HPV; c) ASCUS com metaplasia atípica deve ser submetido à conduta intervencionista, colposcopia e biópsia. Guerrini et al. (2000) tentaram definir melhor o diagnóstico de ASCUS através da utilização de critérios morfológicos recomendados por Regione Emilia Romagna Screening Protocol em Esses autores dividiram o termo ASCUS em: células escamosas atípicas com citoplasma tipo maduro-intermediário (ASCUS 1); células escamosas atípicas metaplásicas (ASCUS 2); células escamosas atípicas com paraceratose (ASCUS 3); células atípicas reativas (ASCUS 4); células escamosas atípicas com atrofia (ASCUS 5). Trabalho realizado por nosso grupo estudou pacientes com ASCUS e concluiu que a subdivisão do termo baseada em alterações morfológicas propostas por Regione Emilia Romagna Screening Protocol e colposcopia auxiliam na conduta, pois casos de ASCUS 1 e 3 com achados colposcópicos maiores estiveram relacionados com presença de NIC na biópsia (BARCELOS et al., 2006). Diferentes variantes morfológicas do ASCUS têm sido reconhecidas e bem descritas, no entanto, pouco se tem proposto sobre o prognóstico e verdadeiro significado dessas classificações (SHEILS et al., 1996).

20 Inicialmente acreditava-se que todos os graus de SIL eram precursores do carcinoma de colo, requerendo colposcopia e biópsia. As recomendações da classificação inicial de Bethesda com relação ao termo ASCUS foram desenvolvidas para a detecção mais precoce das SIL tanto de baixo como alto grau (DUNCAN et al., 2004). Porém estudos demonstraram que ocorreu regressão espontânea da maioria das infecções por HPV, particularmente aquelas associadas com LSIL em pacientes jovens; sendo assim, a subclassificação do termo ASCUS em uma categoria que permitisse a detecção de HSIL tornou-se necessária para facilitar a conduta clínica e diminuir os custos de exames complementares excessivos (DUNCAN et al., 2004). A nova classificação de Bethesda eliminou a categoria favorável reativo baseada em um número de observações, demonstrando que o risco de diagnosticar alterações de alto grau neste grupo de mulheres era baixo (COX, 2005). Sendo assim, em 2001, foi realizada revisão da classificação de Bethesda e alterações fundamentais foram instituídas (LEE et al., 2006). A principal modificação em relação às células escamosas alteradas ocorreu com a divisão do termo ASCUS. A categoria foi subdividida em duas subcategorias: ASC-US (atipias de células escamosas de significado indeterminado) que reflete dificuldades na distinção entre alterações reativas e LSIL e ASC- H (atipia de células escamosas não podendo excluir lesão de alto grau) que reflete o diagnóstico diferencial entre metaplasia reativa imatura e HSIL (SHERMAN et al., 2006; LEE et al., 2006). A subcategoria das células atípicas de significado indeterminado teria importância clínica quando seguida então da letra H, indicativa de suspeita de HSIL (SOUZA et al., 2004). Permaneceram os termos: LSIL (compreendendo displasia leve/nic I e alterações celulares associadas ao HPV) e HSIL (displasia moderada/nic II, displasia severa, carcinoma in situ/nic III).

21 Alguns autores afirmam que a freqüência de ASC-H deve permanecer em torno de 0,2% das citologias (SHERMAN et al., 2006). Estudos têm mostrado freqüência maior de diagnósticos de ASC-US do que ASC-H. Lee et al. (2006) encontraram 920 mulheres com diagnóstico de ASC-US representando 1,8% do total de pacientes com células escamosas atípicas (ASC). O número de mulheres com ASC-H foi de 115 (0,2%). Barreth et al. (2006) encontraram 727 (0,3%) de ASC-H em exames realizados. Estudos sobre aspectos colposcópicos relacionados com presença concomitante de SIL, em pacientes com diagnóstico citológico de ASCUS, são pouco encontrados na literatura. Sabemos, entretanto, da importância da colposcopia como exame complementar no diagnóstico do câncer de colo uterino, identificando áreas atípicas para realização de biópsia dirigida. Autores acreditam que, em pacientes submetidas a exame colposcópico por citologia cervical com atipia leve, freqüentemente são encontradas lesões mais severas que as citologicamente diagnosticadas (SOUTTER et al., 1986). Lima et al. (2002) estudaram 111 casos de pacientes com ASCUS, em que 80 (72%) apresentavam anormalidades no exame colposcópico, sendo realizadas 38 biópsias dirigidas (34%). O exame anatomopatológico demonstrou NIC em 61% das biópsias sendo 20 (52%) casos de NIC I e 3 (9%) de NIC II e III. Desde o início do uso do termo ASCUS verificou-se a presença freqüente de NIC na biópsia dessas pacientes. Morin et al. (1999) demonstraram a presença de NIC em 22,2% das biópsias de 360 mulheres com ASCUS, sendo 16,9% NIC I e 5,3% NIC II/III. Em estudo anterior feito por nosso grupo, avaliando pacientes com ASCUS, foi realizada biópsia dirigida por colposcopia em 42,4% dos casos e encontrou-se 18% de NIC sendo 9% de NIC I, 6% de NIC II e 3% de NIC III (BARCELOS et al., 2006). A quantidade de pacientes com neoplasias e a severidade das alterações neoplásicas encontradas no diagnóstico inicial de ASCUS são os fatores críticos que

22 determinam a necessidade de seguimento nas portadoras deste (KATZ et al., 1997). No entanto, a conduta correta sempre foi discordante entre os estudiosos. Cox (2005), analisando mulheres com ASC-H, encontrou 27,2% de NIC II/III na biópsia guiada por colposcopia. Alguns autores acreditam que, aproximadamente, metade das mulheres com Papanicolaou evidenciando ASC-H terá o diagnóstico de NIC II/III na biópsia durante o seguimento (HUITRON et al., 2008). Barreth et al. (2006) estudando 517 mulheres com ASC-H verificou a presença de NIC II/III em 339 (65,6%) delas, concluindo que o diagnóstico de ASC-H ao Papanicolaou está associado a risco aumentado de doença clinicamente significante. Com a nova subdivisão do termo ASCUS, verificou-se a maior presença de NIC II/III em mulheres com ASC-H e novas diretrizes e condutas vêm sendo discutidas. Cox (2005) determina que três diferentes opções para o seguimento de pacientes com ASC-US são seguras e efetivas: colposcopia, repetição de nova citologia ou realização de teste de HPV. O alto risco da presença de NIC II/III nas pacientes com ASC-H levou Sherman et al. (2006) a determinar a realização imediata de colposcopia e biópsia nestas pacientes. O teste de detecção de HPV como complemento à citologia cervical nos programas de rastreamento é baseado na captura híbrida e Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) (HALFON et al., 2007). A captura híbrida é um método largamente utilizado (MORIARTY et al., 2008) devido à alta sensibilidade, reprodutibilidade, objetividade, facilidade para a prática clínica de rotina (CUZICK et al., 1999; HUANG et al., 2006). Essa técnica é baseada na hibridização de DNA viral de único filamento com 2 cocktails de RNA probes que reconhecem 13 tipos de HPV de alto-risco e 5 tipos de HPV de baixorisco. RNA/DNA - híbridos são combinados com anticorpos anti-híbridos marcados e um substrato quimioluminescente, que emite luz medida por um luminômetro (NOMELINE et al., 2007). A presença ou ausência de DNA de HPV é definida de acordo com a força em

23 unidades relativas de luz (RLU) comparada com 1pg/ml de controle positivo de DNA de HPV (PRÉTET et al., 2004). A técnica de PCR permite a amplificação de seqüências de ácido nucléico específico. Para amplificar a fita de DNA viral, a seqüência de nucleotídeos deve ser conhecida. Com primers apropriados e condições de temperatura, a síntese de uma fita complementar procede automaticamente por ligação de nucleotídeos livres usando a enzima DNA-polimerase. Em cada ciclo há uma temperatura de desnaturação (94 o C), na qual a fita de DNA é aberta, para o próximo passo (segunda temperatura), no qual os primers específicos se ligam ao DNA e a terceira temperatura, para que a enzima DNA polimerase possa inserir os nucleotídeos e produzir uma nova seqüência de DNA desejado. Cada ciclo sucessivo dobrará a quantidade de DNA, produzindo 2 30 vezes DNA após 30 ciclos. Após poucas horas, pequenas quantidades de DNA (nanogramas) podem ser transformadas em grandes quantidades (miligramas), que podem ser facilmente manipuladas (HUBBARD, 2003). Para vários estudiosos, a pesquisa de HPV passou a fazer parte da conduta de pacientes com ASCUS e outras alterações citológicas e as técnicas biomoleculares passaram a ser muito estudadas (HUANG et al., 2006). Adicionar teste biomolecular para HPV, comparado com citologia repetida, aumenta a sensibilidade para a detecção de NIC em mulheres com ASCUS (BERGERON et al., 2000). Por outro lado, um teste negativo para HPV em mulheres com ASCUS poderia reduzir o número de encaminhamentos para a colposcopia e biópsias desnecessárias (OH et al., 2001; MORIN et al., 2001). Srodon et al. (2006) avaliaram a utilização do teste de HPV na triagem de pacientes com ASCUS para a colposcopia. Seus resultados mostraram que 18 (40%) pacientes, com ASC-H e HPV positivo e que fizeram biopsia, apresentaram NIC II/III e apenas 1 (4,5%) mulher com ASC-H e HPV negativo apresentou alterações de alto risco na biópsia. Os autores

24 concluíram que mesmo nas pacientes com ASC-H, o uso do teste de HPV na triagem reduz o número de colposcopias. Resultados de pesquisas mostram que os testes para HPV identificam um maior grupo de mulheres com risco de desenvolver câncer cervical em comparação com a citologia oncótica. Como o teste para HPV tem maior sensibilidade que a citologia, alguns autores sugerem que o teste de HPV, em conjunto com o diagnóstico citológico de ASCUS, pode ser empregado para selecionar, mais eficientemente, as mulheres que devem ter seguimento mais rigoroso (LANG et al., 2005). Estudo multicêntrico, o HART (HPV Testing in Addition to Routine Testing Study) relatou os resultados do reflexo dos testes para HPV em mulheres com idade entre 30 e 60 anos e indicou uma alta sensibilidade do teste, comparado com a repetição da citologia, para diagnóstico de NIC subjacente (CUZICK et al., 2003). Outro estudo, o ARTISTIC (A Randomized Trial in Screening to Improve Citology Study) mostra o impacto econômico da incorporação de testes para HPV à citologia cérvico-vaginal (NOMELINI et al., 2007). Adicionar o teste de biologia molecular como complemento da citologia, no entanto, não parece uma conduta financeiramente viável para alguns países. Na Europa a nova versão do Sistema de Bethesda foi recebida sem entusiasmo, pois há preocupação sobre os custos incluindo o teste de HPV em algumas categorias (PRANDI et al., 2006). No Brasil, os custos para testes biomoleculares de HPV são mais altos que a citologia oncótica e a colposcopia e, no momento, parece inviável financeiramente para o Sistema Único de Saúde a implantação de métodos de biologia molecular na conduta de pacientes com ASCUS, como prevenção do câncer de colo uterino. No entanto, considerando uma possível redução do custo para o uso em grande quantidade, o PCR deveria ser o método de escolha, por ser mais barato e sensível, e ter um alto valor preditivo negativo (NOMELINE et al., 2007). É importante ressaltar que, a partir do momento em que se

25 melhoram as ações preventivas, mesmo com um aparente aumento dos gastos iniciais, economizam-se grandes gastos posteriores com o tratamento de lesões precursoras e com câncer de colo uterino. Inclui-se nesta economia não só os gastos com a terapêutica, mas também dias perdidos de trabalho, o que, no final, além de representar economia para o sistema, traria melhor qualidade de vida para as mulheres (NOMELINI et al., 2007). Apesar de promissores, os estudos ainda são insuficientes para demonstrar qual a melhor conduta nas pacientes com ASCUS na citologia cérvico-vaginal e a importância desse diagnóstico na detecção de NIC e na prevenção do câncer de colo. Sendo assim, a proposta deste trabalho é estudar as alterações morfológicas do ASCUS, significado clínico e melhor conduta para as pacientes.

26 OBJETIVOS

27 ASCUS é um termo definido por critérios citológicos. A correta interpretação da intensidade das alterações morfológicas do ASCUS, relacionada ao prognóstico das pacientes, assim como a adequada conduta clínica e seu significado, ainda não estão bem esclarecidos. Estabelecemos como objetivos para este estudo: 1. Verificar a freqüência de ASCUS em nosso serviço. 2. Avaliar a variabilidade no diagnóstico de ASCUS na rotina do exame de Papanicolaou, comparado com uma leitura de revisão. 3. Avaliar se existe associação de ASCUS com agentes microbiológicos causadores de inflamação. 4. Analisar o uso do exame colposcópico nas pacientes com diagnóstico de ASCUS. 5. Comparar as classificações morfológicas do ASCUS para a definição daquela que melhor avalia o risco lesão clinicamente significante. 6. Avaliar a utilização do teste de HPV na triagem de pacientes com ASCUS para a colposcopia. 7. Propor uma conduta para pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS.

28 CASUÍSTICA E MÉTODOS

29 1. Casuística Foi realizado estudo prospectivo no Ambulatório da Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro entre os meses de Janeiro de 2003 e Dezembro de Na primeira parte do trabalho foram avaliadas mulheres com diagnóstico de ASCUS à citologia cérvico-vaginal, em exame realizado na rotina de quatro médicos citopatologistas. O laudo citológico foi utilizado para triagem e a ordem de entrada das pacientes obedeceu à seqüência crescente de registros dos exames de Papanicolaou do serviço de citopatologia da instituição. As pacientes que tiveram diagnóstico de ASCUS, encaminhadas ao serviço de colposcopia, foram informadas sobre a realização e os propósitos do estudo. Aquelas que concordaram e assinaram o termo de consentimento informado aprovado pelo comitê de ética da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, fizeram parte da pesquisa, quando preencheram os critérios de inclusão. Critérios de inclusão para o estudo: 1) Diagnóstico de ASCUS à citologia 2) Mulheres não gestantes 3) Idade entre 18 e 50 anos 4) Não menopausadas 5) Ausência de sangramento no momento do exame 6) Não ter feito uso de antibióticos orais, fungicidas e/ou cremes vaginais nos últimos 30 dias

30 7) Abstinência sexual de no mínimo dois dias 8) Pacientes sem história prévia de SIL ou procedimentos no colo uterino 2. Métodos 2.1. Métodos Clínicos Inicialmente foram coletadas informações (Anexo 1) sobre idade, hábitos e condições de vida (paridade, número de parceiros, idade da sexarca, idade da primeira gestação, tabagismo), métodos contraceptivos usados e história de doenças sexualmente transmissíveis Métodos microbiológicos e bioquímicos Após o preenchimento dos dados, todas as pacientes foram submetidas a exame ginecológico, colposcópico (Anexo 1) e coleta de material cérvico-vaginal para pesquisa de agentes microbiológicos e HPV pela técnica de captura híbrida (Anexo 2). Os procedimentos utilizados para coleta das amostras foram os seguintes: Para a pesquisa de Trichomonas vaginalis, foi coletado material dos fundos de saco vaginais com swab e a secreção foi colocada sobre uma lâmina de vidro. Após o gotejamento de soro fisiológico e a colocação de uma lamínula, a pesquisa foi feita pela visualização de microorganismos flagelados e móveis através do microscópico ótico (exame a fresco). Para a pesquisa de Candida SP, foi coletado material vaginal com swab e realizada semeadura em placa de Petri, contendo meio de cultura Ágar Saboraund onde foi verificado crescimento do fungo.

31 Para a pesquisa de vaginose bacteriana, foram utilizados critérios clínicos, largamente aceitos, originalmente propostos por Amsel et al. (1983): (1) secreção vaginal homogênea que adere às paredes vaginais; (2) ph vaginal acima de 4,5; (3) presença de odor característico após adição de solução de hidróxido de potássio 10% à secreção vaginal; (4) presença de clue cells no esfregaço corado por Gram. A presença de 3 dos 4 itens acima era suficiente para o estabelecimento do diagnóstico. A medida do ph foi realizada pela coleta de material vaginal. Após a coleta utilizando o swab, o mesmo foi introduzido em um tubo de ensaio estéril, contendo em seu interior 1ml de água destilada e deionizada. O material foi levado ao laboratório ao término da consulta e a aferição do ph vaginal foi realizada com aparelho denominado ph meter digital, marca Sentron, que utiliza escala de 0 a 14. Para essa determinação foi usado o conteúdo do tubo de ensaio. Após homogeneização em vortex por aproximadamente 10 segundos, o swab foi retirado e introduzido no interior do frasco ponteira do aparelho medidor de ph, com eletrodo localizado na sua extremidade. A quantificação do ph foi feita instantaneamente de forma digital. Esse procedimento ocorreu num intervalo de no máximo 1 hora após a coleta. Para a pesquisa do HPV humano, foi inicialmente coletado material endocervical e ectocervical com escova especial, componente do kit de captura híbrida da Digene, colocado em tubo próprio contendo material para conservação e mantido congelado em temperatura - 20 C. Ao final da coleta, após obtenção de um número suficiente de amostras, os tubos foram descongelados e analisados segundo as técnicas de captura híbrida.

32 2.3. Captura Híbrida Utilizou-se aparelho marca Captura Híbrida II System DML 2000 sistema de microplaca com amplificação de sinal por quimioluminescência. As informações e a metodologia abaixo descrita constam do manual de instrução fornecido pela Digene do Brasil, empresa que comercializa o equipamento e os kits utilizados, e seguem a técnica realizada por Silva et al. (2004). O kit utilizado para a detecção de HPV possui 18 tipos virais agrupados em dois pools de sondas. As sondas para os vírus de baixo risco incluem os tipos 6, 11, 42, 43 e 44, representando aproximadamente 70% desse grupo de vírus; em relação aos vírus de alto risco, o sistema contém as sondas com os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68, representando aproximadamente 99% desse grupo de vírus. Para o HPV, a sensibilidade em microplaca é de 1 pg/ml, equivalente a 0,1 cópia de vírus. A primeira etapa do teste consiste na realização de digestão e desnaturação que são feitas ao mesmo tempo no próprio tubo de coleta. Adiciona-se, nessa etapa, uma solução contendo hidróxido de sódio à amostra que, além de digerir qualquer outra estrutura, irá desnaturar o DNA, separando as pontes de hidrogênio que unem as bases nitrogenadas para facilitar a hibridização. Na etapa de desnaturação, o DNA é submetido a altas temperaturas e a ph alcalino, deixando as bases nitrogenadas livres para a hibridização. Esse procedimento necessita de banho-maria à 65º C durante uma hora. Após a digestão e a desnaturação, 75 µl da amostra são transferidos para os microtubos, a fim de que se processe a hibridização. Nessa etapa, as sondas de RNA são diluídas em diluente próprio e aliquotadas na quantidade de 25 µl nos microtubos. A hibridização requer banho-maria à 65º C durante uma hora. Depois de hibridizado, o material é transferido para uma microplaca que tem suas paredes recobertas por anticorpos monoclonais, a fim de eliminar possibilidade de reação

33 cruzada, anti-rna:dna, que irão reagir com os híbridos formados anteriormente. Essa etapa é denominada captura híbrida e se faz com um rotary-shaker à temperatura de C durante uma hora. A partir da captura, quando já se formou um complexo anti-rna:dna-híbrido, passa-se para a fase de detecção. Toda a solução contida na microplaca é desprezada, adicionando-se anti-anti-rna:dna conjugado a fosfatase alcalina, que irá reagir com o complexo ligado à parede da microplaca. Essa fase dura 30 minutos à temperatura de C. Após esse período, novamente despreza-se o material líquido da microplaca e faz-se uma única lavagem do ensaio, que pode ser manual ou automatizada. Por ela, retira-se o excesso de fosfatase alcalina que não formou complexo anticorpo-híbrido-anticorpo. Adiciona-se o substrato Emerald, que será degradado pela fosfatase alcalina durante 15 minutos. O grau de degradação do substrato depende da quantidade de enzima ligada ao complexo, o qual produzirá diferentes intensidades de cor, lido por quimioluminescência, em equipamento apropriado. Todo o teste de captura híbrida conta com controles negativos e positivos, que são testados em triplicata. O ensaio usa as leituras dos controles para validação e cálculo do cut off. A validação do teste e o cálculo de cut off são feitos baseados em alguns critérios: a) o coeficiente de variação das leituras entre os microwells dos controles negativos ou positivos não deve ultrapassar 25%; b) a divisão da média das leituras de RLU (unidade relativa de luz) dos controles positivos pelos negativos deve ser superior a 2; c) os controles negativos devem respeitar o limite máximo de background de 250 RLU;

34 d) o valor do cut off da reação é expresso pela média dos controles positivos. Há ainda dois outros controles intra-testes. O primeiro é realizado quando se faz a adição do reagente de desnaturação. Todas as amostras devem tornar-se de cor roxa, isso dá a certeza de que todas as amostras serão desnaturadas. O segundo, quando da adição das sondas. A coloração deve mudar de roxo para amarelo, assegurando que todas as amostras receberam a quantidade ideal de sonda. A leitura é totalmente automatizada; o quimioluminômetro é comandado por um software que analisa os números recebidos da leitura e faz todos os cálculos de validação do ensaio. O relatório final do teste é feito pelo software, não havendo margem de erro nos cálculos. As etapas de digestão e desnaturação são realizadas uma única vez. A partir daí, a detecção de HPV é feita individualmente através de kits próprios. O kit do HPV permite a realização de 96 testes: 42 testes para vírus de alto grau, 42 testes para vírus de baixo grau, 3 controles negativos e 3 controles positivos para vírus de baixo grau e 3 controles negativos e 3 controles positivos para vírus de alto grau Exame Colposcópico Após a coleta dos materiais, as pacientes foram submetidas a vídeo-colposcopia com captura de imagens (Anexo 1). A classificação utilizada para descrição dos achados foi a de Barcelona, proposta em 2002 (STAFL et al., 1991) que os dividia em: achados colposcópicos normais (epitélio escamoso original, epitélio colunar e zona de transformação normal) e anormais (epitélio aceto-branco, pontilhado, mosaico, leucoplasia, zona iodo-negativa e vasos atípicos), sendo esta última subdividida em alterações menores ou maiores dependendo da intensidade da alteração.

35 Para a realização da colposcopia foram utilizados os seguintes reagentes: solução aquosa de ácido acético glacial a 3%, solução de lugol e bissulfito de sódio. Na presença de alterações, as pacientes foram submetidas à biópsia dirigida utilizando pinça de Gaylor-Medina Avaliação citológica e histopatológica Em uma segunda etapa, os esfregaços das pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS, fornecido pelos citopatologistas, durante exame de rotina, foram revistos e reclassificados por um destes citopatologistas, em conjunto com o autor deste trabalho, em: citologia normal/inflamatório, ASCUS, LSIL e HSIL. Quando o diagnóstico de ASCUS foi confirmado na revisão, o caso foi subclassificado em provável reativo ou provável neoplásico (Bethesda ) e também de acordo com as normas de Bethesda 2001 em ASC-US e ASC-H (Anexo 3). Os casos de ASCUS foram novamente subclassificados seguindo recomendação do Protocolo de Screening de Regione Emilia Romagna (Anexo 3) (GUERRINI et al., 2000) em grupos de acordo com alterações morfológicas, da seguinte maneira: - Células escamosas atípicas com citoplasma tipo maduro-intermediário (ASCUS1) - Células escamosas atípicas metaplásicas (ASCUS 2) - Células escamosas atípicas com paraceratose (ASCUS 3) - Células atípicas reativas (ASCUS 4) - Células escamosas atípicas com atrofia (ASCUS 5) O esfregaço citológico foi corado pela técnica de Papanicolaou e avaliado segundo critérios morfológicos de anfofilia, halo perinuclear, disqueratose, critérios nucleares

36 (binucleação, multinucleação), aumento da relação núcleo/citoplasma, anisocariose, hipercromasia, atipias nucleares, cariorrexe. As biópsias realizadas também foram revistas e reclassificadas pelo mesmo patologista, em conjunto com o autor deste trabalho. As pacientes foram novamente avaliadas citológica e colposcopicamente em 6 meses (Anexo 4) Os resultados foram analisados comparando critérios citológicos e colposcópicos, presença de agentes microbiológicos causadores de infecção e HPV de pacientes com ASCUS provável caráter reativo e ASCUS provável caráter displásico, ASC-US e ASC-H Análise Estatística Para a análise estatística foi empregado o Programa GRAPHPAD INSTAT versão 3.0. Os resultados foram comparados utilizando-se o teste exato de Fisher, qui-quadrado e qui-quadrado com correção de Yates, com nível de significância menor que 5% (p< 0,05).

37 RESULTADOS

38 No período de 01 Janeiro de 2003 até 31 Dezembro de 2007 foram realizados exames de Papanicolaou no serviço de citopatologia da Disciplina de Ginecologia e Obstetrícia. Destes, (89,18%) tiveram citologia negativa para alterações oncológicas, (4,98%) de ASCUS, 265 (0,57%) de AGUS (alterações glandulares atípicas de caráter indeterminado), (3,79%) tiveram diagnóstico de LSIL, 551 (1,18%) de NIC II/III e 128 (0,27%) de carcinoma invasivo de colo uterino. Foram avaliadas 103 mulheres com diagnóstico inicial de ASCUS. A média de idade foi de 35,76 (variação de 18 a 50 anos). O tabagismo foi encontrado em 32 (31%) mulheres. Quanto ao uso de métodos contraceptivos, 40 (38,83%) foram submetidas à laqueadura tubária, 30 (29,12%) utilizavam métodos hormonais, 3 (2,91%) faziam uso de condom, 1 (0,97%) era usuária de dispositivo intra-uterino e 29 (28,15%) não utilizavam nenhum método anticoncepcional. Com relação ao número de parceiros, a média foi de 2,15 (variação de 1 a 10). A média de idade da primeira relação sexual foi de 17,62 anos (variação de 12 a 27 anos) e da primeira gestação foi de 19,67anos (variação de 12 a 31 anos). Dezesseis mulheres (15,53%) eram nulíparas, 60 (58,25%) tinham entre 1 e 3 filhos e 27 (26,21%) tinham mais de 3 filhos. Todas as lâminas desses 103 casos iniciais de ASCUS foram revistas pelo mesmo examinador em conjunto com o autor desta pesquisa, avaliando diversas alterações segundo protocolo (Anexo3). Dos 103 casos, 70 (67,96%) foram confirmados como ASCUS na segunda leitura; 30 (29,12%) foram reclassificados como esfregaço normal/inflamatório, 2 (1,94%) como LSIL e 1 (0,97%) como HSIL. Dos 70 casos de ASCUS, 38 (54,28%) foram reclassificados como ASCUS provável caráter reativo e 32 (45,71%) como ASCUS provável neoplásico (Bethesda, 1991); 62 (88,57%) foram reclassificados em ASC-US e 8

39 (11,41%) em ASC-H (Bethesda, 2001). Para a descrição dos resultados foram excluídas as pacientes que apresentaram diagnóstico de SIL após a revisão (3 pacientes). Os resultados dos exames microbiológicos para pesquisa de Candida sp, vaginose bacteriana e Trichomonas vaginalis das 100 pacientes reavaliadas neste estudo estão dispostos nas tabelas 1 e 2. Tabela 1. Distribuição dos casos com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASCUS provável caráter reativo e ASCUS provável neoplasia, em relação à infecção. Agente Normal/ Inflamatória Citologia ASCUS nº (%) Provável reativo Provável neoplasia Total nº (%) nº (%) Candida sp 4 (13,4) 9 (23,6) 4 (12,5) 17 Vaginose bacteriana 2 (6,6) 6 (15,8) 6 (18,7) 14 Trichomonas Vaginalis 0 2 (5,2) 0 2 Sem infecção 24 (80,0) 21 (55,2) 22 (68,7) 67 Total p = não significante; teste qui-quadrado Não encontramos diferença estatisticamente significante quando comparamos a presença de infecção (vaginose bacteriana, Candida sp e Trichomonas vaginalis) entre os grupos de ASCUS provável reativo e ASCUS provável neoplasia.

40 Tabela 2. Distribuição dos casos com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC-H, em relação à infecção. Agente Normal/ Inflamatória nº (%) Citologia ASCUS Total ASC-US ASC-H nº (%) nº (%) Candida sp 4 (13,4) 13 (21) 0 17 Vaginose bacteriana 2 (6,6) 12 (19,3) 0 14 Trichomonas Vaginalis 0 2 (3,2) 0 2 Sem infecção 24 (80,0) 35 (56,4) 8 (100) 67 Total Encontramos diferença estatisticamente significante (Teste qui-quadrado; p = 0,0172) em relação à presença de infecção, quando comparamos os grupos ASCU-US e ASC-H.

41 Os achados colposcópicos estão dispostos na tabela 3 e 4. A colposcopia foi considerada insatisfatória quando não foi possível a visualização da junção escamocolunar. Tabela 3. Principais achados colposcópicos das pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASCUS provável reativo e ASCUS provável neoplasia. Colposcopia Normal/ inflamatória nº (%) Citologia ASCUS Total Provável reativo Provável neoplasia nº (%) nº (%) Achados normais 17 (56,6) 23 (60,5) 9 (28,1) 49 Achados anormais Maiores (18,7) 6 Menores 8 (26,6) 9 (23,6) 15 (46,8) 32 Insatisfatória 5 (16,6) 6 (15,8) 2 (6,2) 13 Total Quando comparamos a presença de achados colposcópicos anormais entre os grupos provável reativo e provável neoplásico, encontramos diferença estatisticamente significante (Teste qui-quadrado; p= 0,0078) sendo maior no segundo grupo. Foi feita a comparação entre os mesmos grupos, porém avaliando apenas os achados colposcópicos maiores, a diferença também foi estatisticamente significante (Teste qui-quadrado; p= 0,001), sendo maior no grupo de alterações provavelmente neoplásicas.

42 Tabela 4. Principais achados colposcópicos das pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC-H. Colposcopia Normal /inflamatória nº (%) Citologia ASCUS Total ASC-US ASC-H nº (%) nº (%) Achados normais 17 (56,6) 32 (51,6) 0 49 Achados anormais Maiores 0 1 (1,6) 5 (62,5) 6 Menores 8 (26,6) 21 (33,9) 3 (37,5) 32 Insatisfatória 5 (16,6) 8 (12,9) 0 13 Total Analisando os achados colposcópicos nas pacientes com citologia revista segundo classificação de Bethesda 2001, encontramos diferença estatisticamente significante (Teste qui-quadrado; p = 0,0017), quando comparamos a presença de achados colposcópicos anormais entre os grupos ASC-US e ASC-H, sendo maior no segundo grupo. A mesma comparação foi feita entre os achados colposcópicos maiores e houve diferença estatisticamente significante (Teste qui-quadrado; p = 0,0001) sendo também maior no grupo ASC-H.

43 Dentre as 70 pacientes com ASCUS após revisão citológica, 30 (42,8%) foram submetidas à biópsia. Cinco delas (16,6%) apresentaram infecção por HPV, 9 (30%) apresentaram casos de NIC (3 NIC I, 3 NIC II e 3 NIC III) e 16 (53,3%) tiveram biópsias normais. Os casos de HPV estavam presentes em 4 pacientes com ASCUS provável neoplasia e em uma paciente no grupo provável reativo; na classificação de Bethesda 2001 os cinco casos de HPV estavam presentes em biópsias de pacientes com ASC-US. Os três casos de NIC I estavam presentes em biópsias de pacientes com ASCUS provável reativo (Bethesda 1991) e ASC-US (Bethesda 2001). Os casos de NIC II estavam presentes em 1 paciente com ASCUS reativo e 2 com ASCUS provável neoplasia e na classificação de 2001 todos os casos de NIC II estavam presentes em biópsias de pacientes com ASC-H. Todos os 3 casos de NIC III foram diagnosticados em pacientes dos grupos ASCUS neoplásico e ASC-H. No grupo das 30 pacientes com citologia normal/inflamatória, 8 foram submetidas à biópsia tendo sido encontrado 1 caso de NIC I e 1 caso de HPV. Os resultados anatomopatológicos das biópsias das pacientes com alterações durante o exame colposcópico, estão dispostos nas tabelas 5 e 6.

44 Tabela 5 - Resultado das biópsias realizadas nas pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASCUS provável reativo e ASCUS provável neoplasia, que apresentaram alterações durante o exame colposcópico. Biópsia Normal/ inflamatória nº (%) Citologia ASCUS Total Provável reativo Provável neoplasia nº (%) nº (%) Normal 6 (20,0) 7 (18,4) 9 (28,1) 22 HPV/NIC I 2 (6,6) 1 (2,6) 7 (21,8) 10 NIC II/III 0 1 (2,6) 5 (15,6) 6 Não realizada 22 (73,3) 29 (76,3) 11 (34,3) 62 Total p = não significante; teste qui-quadrado com correção de Yates e teste exato de Fisher Não encontramos diferença estatisticamente significante quando comparamos a presença de alterações nas biópsias entre os grupos normal/inflamatório, ASCUS provável reativo e ASCUS provável neoplasia.

45 Os casos de ASCUS (n=70) reconfirmados foram posteriormente subclassificados seguindo as recomendações do Protocolo de Screening de Regione Emilia Romagna: 15 casos de ASCUS 1 (21,4%), 19 de ASCUS 2 (27,1%), 19 de ASCUS 3 (27,1%), 16 de ASCUS 4 (22,8%) e 1 caso de ASCUS 5 (1,42%). O resultado das biópsias demonstrou 3 casos de NIC II/III no ASCUS 1; 2 casos no ASCUS 2 e 1 no ASCUS 4. Não houve nenhum caso de NIC II/III nos ASCUS 3 e 5. (tabela 6). Tabela 6 - Resultado das biópsias realizadas nas pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados segundo Regione Emilia Romagna em ASCUS 1, ASCUS 2, ASCUS 3, ASCUS 4 e ASCUS 5. Biópsia Normal/ inflamatória nº (%) Citologia ASCUS Total ASCUS 1 ASCUS 2 ASCUS 3 ASCUS 4 ASCUS 5 nº (%) nº (%) nº (%) nº (%) nº (%) Normal 6 (20,0) 1 (6,6) 5 (26,3) 5 (26,3) 4 (25,0) 1 (100,0) 22 HPV/NIC I 2 (6,6) 2 (13,3) 4 (21,0) 2(10,5) NIC II/III 0 3 (20,0) 2 (10,5) 0 1 (6,25) 0 6 Não realizada 22 (73,3) 9 (60,0) 8 (42,1) 12 (63,1) 11(68,7) 0 62 Total p = não significante; teste exato de Fisher Quando analisamos os resultados dos achados colposcópicos classificados de acordo com Regione Emilia Romagna (tabela 6), não encontramos diferença estatisticamente significante entre os grupos.

46 Tabela 7 - Resultado das biópsias realizadas no grupo total de pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC-H, que apresentaram alterações durante o exame colposcópico. Biópsia Normal/ inflamatória nº (%) Citologia ASCUS Total ASC-US ASC-H nº (%) nº (%) Normal 6 (20,0) 13 (21,0) 3 (37,5) 22 HPV/NIC I 2 (6,6) 8 (13,0) 0 10 NIC II/III 0 1 (1,6) 5 (62,5) 6 Não realizada 22 (73,3) 40 (64,5) 0 62 Total Quando avaliamos os resultados das biópsias aos das citologias segundo Bethesda 2001, encontramos maior freqüência de NIC II/III no grupo das pacientes com ASC-H, comparado ao grupo com citologia normal/inflamatória (Teste exato de Fisher; p = 0,0025). Houve maior número de casos de NIC II/III nas biópsias das pacientes com ASC- H, em relação ao grupo de ASC-US e a diferença também foi estatisticamente significante (Teste qui-quadrado com correção de Yates; p = 0,0028).

47 A tabela 8 compara as classificações morfológicas de ASCUS para a definição da que melhor avalia o risco de lesão clinicamente significante. Tabela 8 - Distribuição dos casos de NIC II/III à biópsia em relação ao diagnóstico citológico de ASCUS provável neoplasia, ASC-H e ASCUS 1 (Classificação de Regione Emilia Romagna). Classificações Citológicas NIC II/III Bethesda 1991 ASCUS provável neoplasia Regione Emilia Romagna ASCUS 1 Bethesda 2001 ASC-H Total Ausente 27 (84,3%) 12 (80%) 3 (37,5%) 42 Presente 5 (15,6%) 3 (20%) 5 (62,5%) 13 Total Quando avaliamos os achados de NIC II/III entre os grupos morfológicos de ASCUS encontramos diferença estatisticamente significante, sendo maior no ASC-H comparado ao ASCUS 1 (qui-quadrado; p = 0,04) e ao ASCUS provável neoplasia (quiquadrado; p = 0,0062). As pranchas 1 e 2 ilustram imagens de colposcopia, citologias e biópsias comparando alguns dos casos estudados.

48 Com relação ao teste de captura híbrida nos 100 casos dom diagnóstico inicial de ASCUS, a presença de DNA de HPV de alto risco foi detectada em 19 (27,1%) mulheres com ASCUS reconfirmado e em 8 (26,6%) com citologia normal após revisão. Tabela 9 Resultado da pesquisa de DNA/HPV de alto risco pela técnica de captura híbrida nas pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS que após revisão foram reclassificados como citologia normal/inflamatória, ASC-US e ASC-H. Citologia Normal ASC-US ASC-H Total HPV alto risco nº (%) nº (%) nº (%) Negativo 22 (73,3) 48 (77,4) 3 (37,5) 73 HPV alto risco 8 (26,6) 14 (22,6) 5 (62,5) 27 Total Houve diferença estatisticamente significante quando comparamos a presença de HPV de alto risco entre os grupos de ASC-US e ASC-H (Teste qui-quadrado; p = 0,016), sendo maior no grupo ASC-H.

49 Dos 6 casos de NIC de alto grau, após biópsia guiada por colposcopia (dos 100 casos avaliados no trabalho), 5 (83,3%) foram positivos para HPV de alto risco pela técnica de captura híbrida. A tabela 10 mostra a correlação entre as citologias de ASC-US, ASC-H e normal/inflamatório com presença de HPV de alto risco e biópsia de lesão de alto grau. Tabela 10 - Presença de lesão de alto grau na biópsia, em relação à positividade de HPV de alto risco à captura híbrida e reclassificação citológica de ASCUS segundo Bethesda HPV alto risco Positivo Negativo Citologia Biópsia com NIC II/III nº (%) Biópsia Sem NIC II/III nº (%) Biópsia Não Realizada nº (%) Biópsia com NIC II/III nº (%) Biópsia sem NIC II/III nº (%) Biópsia Não Realizada nº (%) Total ASC-US 1 (20,0) 7 (70,0) 6 (50,0) 0 14 (63,6) 34 (68,0) 62 ASC-H 4 (80,0) 1 (10,0) 0 1 (100,0) 2 (9,0) 0 8 Normal 0 2 (20,0) 6 (50,0) 0 6 (27,3) 16 (32,0) 30 Total Quando avaliamos a presença de NIC II/III à biópsia das pacientes com positividade para HPV de alto risco, e comparamos os grupos ASC-US e ASC-H, encontramos diferença estatisticamente significante (Teste qui-quadrado; p = 0,031), sendo maior no segundo grupo.

50 De um total de 70 pacientes com diagnóstico de ASCUS, após revisão, 6 foram encaminhadas ao serviço de oncologia para tratamento devido à biópsia com NIC II ou III. Dos 64 casos restantes, 7 não compareceram para acompanhamento. Das 57 pacientes com diagnóstico de ASCUS, ao realizarem o controle semestral, 43 apresentaram citologia normal/inflamatória e colposcopia normal; 7 ASC-US e colposcopia normal; 7 LSIL (4 NIC I e 3 HPV) sendo que todos os casos de NIC I foram comprovados por biópsia dirigida. Desses casos de NIC I, 2 tinham sido diagnosticados na primeira biópsia. Dos 4 casos de NIC I, 3 pertenciam ao grupo inicial de ASCUS provável neoplasia e 1 ao grupo de ASCUS provável reativo; pela classificação de 2001 todos os casos de NIC I pertenciam ao grupo ASC-US. Dos 3 casos de HPV, 1 pertencia ao grupo inicial de ASCUS provável neoplasia e 2 ao grupo provável reativo; todos os 3 pertenciam ao grupo ASC-US. Das 30 pacientes em que o diagnóstico de ASCUS não foi confirmado na reclassificação citológica, 2 não realizaram seguimento. Vinte e cinco (83,3%) apresentaram exame colposcópico normal e citologia normal/inflamatória no primeiro retorno semestral, e 3 ASC-US. Não houve nenhum caso de NIC nas pacientes com diagnóstico de citologia normal/inflamatória à reclassificação, no seguimento semestral.

51 DISCUSSÃO

52 O termo ASCUS é utilizado pela maioria dos laboratórios de citopatologia. Essa denominação é recomendada pelo sistema de Bethesda, mas sua freqüência é difícil de ser estimada, pois a interpretação dos achados é diferente entre os citologistas. A freqüência dos laudos de ASCUS após a análise do esfregaço é normalmente vista como indicador de qualidade dos exames de um laboratório (SOUZA et al., 2004). Observamos que o número de diagnósticos citológicos de ASCUS em nosso serviço equivale a 1,3x a freqüência de LSIL ou a 4,98% do total das citologias realizadas. Muitos estudos têm demonstrado grande variabilidade nas taxas de ASCUS dependendo dos diferentes usos do termo pelos laboratórios. Lee et al. (2006) encontraram uma freqüência de ASCUS de 2%, Schnatz et al. (2008) demonstraram que o número de ASCUS é 4,5% do total de citologias e Emerson et al. (2002) encontraram 7% de diagnóstico de ASCUS, em um total de citologias realizadas. A falta de critérios específicos para a determinação correta do esfregaço com ASCUS faz com que sua freqüência tenha variações de acordo com cada serviço. No entanto, devem-se observar as recomendações de Bethesda (não exceder 2 a 3 vezes os valores das LSIL). Os resultados do nosso serviço demonstram uma freqüência de ASCUS compatível com as recomendações de Bethesda. O diagnóstico de ASCUS não depende apenas de padrões citológicos bem definidos, mas também de muitos critérios subjetivos (GUERRINI et al., 2000; COX, 2005), fato realçado pelas diferenças nas taxas reportadas por cada laboratório. Variações das taxas de ASCUS podem ocorrer entre vários patologistas e também entre o mesmo observador em momentos diferentes. Estudos têm mostrado que a reprodutibilidade da interpretação do ASCUS é menor que 50% (COX, 2005). Souza et al. (2004), através de revisão de lâminas de colpocitologia oncótica, previamente diagnosticadas como ASCUS,

53 realizaram comparação interensaio e interobservadores e confirmaram a existência de subjetividade nos laudos citopatológicos de ASCUS, além de critérios imprecisos empregados pelo mesmo observador para a obtenção desses resultados. Os autores observaram graus bastante distantes de concordância entre diferentes análises do mesmo citopatologista, variando de 7,8 a 74,4%. Em nosso trabalho foi feita a revisão de 103 diagnósticos de ASCUS, havendo confirmação na reanálise em 67,96% dos casos, resultado semelhante ao de Guerrini et al. (2000) que, realizando revisão de 187 casos iniciais de ASCUS encontraram 57,2% de confirmação. Diversas condições não neoplásicas não relacionadas com a infecção pelo HPV podem produzir alterações similares citológicas classificadas como ASCUS, inclusive inflamação (SOLOMON et al., 2005), que é uma das dificuldades da interpretação do exame citológico. Sabe-se que a presença de agentes infecciosos no esfregaço cérvicovaginal pode levar a alterações celulares importantes. Quadro citológico de hipercromasia focal e alterações citoplasmáticas como orangiofilia e halos perinucleares, relacionados à infecção por Candida sp, podem simular alterações compatíveis com ASCUS (LIMA et al., 2002). Miguel et al. (1996) analisaram 50 esfregaços cérvico-vaginais dos quais 16 foram inicialmente interpretados como ASCUS e 34 como normais. Após revisão utilizando critérios de Bethesda para ASCUS e conhecendo as mudanças associadas à presença de Candida sp, 10 dos 16 casos de ASCUS foram reclassificados como normais. Nossos achados não demonstraram que os agentes causadores de infecção possam ter influência na interpretação dos tipos de ASCUS classificados por Bethesda 1991, já que a freqüência foi semelhante entre os ASCUS de provável reativo e provável neoplásico. Todavia, quando analisamos a presença de infecções nas citologias classificadas por Bethesda 2001, observamos que, os casos de ASC-H não apresentaram relação com agentes infecciosos. Houve diferença estatisticamente significante em relação à presença

54 de infecção quando comparamos os grupos ASCU-US e ASC-H. Conhecemos as dificuldades na interpretação das atipias em esfregaços com infecção e o impacto causado pelo diagnóstico de ASC-H, além das orientações para realização imediata de colposcopia e biópsia dirigida, recomendadas atualmente. Sendo assim, na vigência de infecção, devese considerar a amostra limitada para fins diagnósticos, sendo sugerida a repetição do exame após tratamento da infecção, para avaliação oncológica adequada (LIMA et al., 2002). O sistema de Bethesda para descrição do esfregaço cérvico-vaginal estabeleceu o diagnóstico da categoria ASCUS acreditando que uma significante porcentagem das citologias não poderia ser definida como normal, células benignas ou SIL (LEE et al., 2006). A conduta clínica frente a uma paciente com diagnóstico de ASCUS sempre foi muito discutida, visto que esse grupo apresenta um risco maior de concomitância com SIL (SHEILS et al., 1996; BOERNER et al., 1997; EMERSON et al., 2002; LIMA et al., 2002; SODHANI et al., 2004). Alguns autores orientam o acompanhamento citológico de 4 a 6 meses e, se persistirem as alterações, o exame colposcópico é então realizado (GERBER et al., 2001; SIMSIR et al., 2001). Nas pacientes com ASCUS, os resultados das biópsias dirigidas mostraram LSIL na maioria dos casos, no entanto, alguns investigadores mostraram lesões significantes nesse grupo de pacientes (SODHANI et al., 2004). Sendo assim, a tradicional prática de repetir a citologia na avaliação da mulher com ASCUS foi questionada e descartada em favor de condutas mais agressivas, incluindo exame colposcópico e biópsia (SHEILS et al., 1996, FERRIS et al., 1998, MCKEE et al., 2001). Segundo Fallani et al. (2001), o exame colposcópico é recomendado para todas as mulheres com diagnóstico citológico de ASCUS, devido à freqüência de SIL. Em nosso estudo, o exame colposcópico foi feito em todas as pacientes

55 com diagnóstico inicial de ASCUS e a biópsia foi realizada quando encontradas áreas atípicas. Alguns trabalhos mostraram uma alta incidência de NIC em mulheres com ASCUS, quando realizada biópsia dirigida por colposcopia indicada imediatamente após o diagnóstico citológico (SLAWSON et al., 1994). Sabemos a importância da colposcopia como exame complementar e de seguimento nas citologias com ASCUS; todavia, pouco tem sido descrito a respeito dos achados colposcópicos dessas pacientes. Lima et al. (2002) evidenciaram achados colposcópicos anormais em 72% das pacientes com ASCUS; em 16% a colposcopia foi considerada normal e, em 12%, insatisfatória. Em nosso estudo, do total de 70 mulheres com ASCUS à revisão citológica, encontramos 38 (54,2%) casos com achados colposcópicos anormais. Encontramos diferença estatisticamente significante quando comparamos os achados colposcópicos maiores entre os grupos ASCUS reativo e neoplásico e entre ASC-US e ASC-H. Sabemos que a colposcopia não fornece diagnóstico definitivo, porém, a imagem, além de determinar o melhor local para a realização da biópsia, pode sugerir o diagnóstico com base na intensidade dos achados. Esses dados apontam para o valioso papel exercido pela citologia e pela colposcopia integradas, um método complementando as limitações do outro (LIMA et al., 2002). Naquelas mulheres com confirmação do diagnóstico de ASCUS foram encontrados 20% de casos com biópsias alteradas, sendo 11,4% de HPV/NIC I e 8,6% de NIC II/III. A freqüência das alterações neoplásicas nas pacientes com ASCUS é muito variável na literatura. Alguns trabalhos reportam a concomitância de NIC II/III em 5 a 10% das pacientes com ASCUS (MORIN et al., 2001), resultado semelhante ao do nosso trabalho. Roche et al. (2001), realizando seguimento das pacientes com ASCUS por dois anos, encontraram 18% de casos de HPV/NIC I e 15% de NIC II/III. Eltabbakh et al. (2000) encontraram uma prevalência de neoplasia de 15,9% em pacientes com ASCUS e, Roche

56 et al. (2001), reportaram taxas de 25 a 60% de NIC em biópsia de pacientes com ASCUS, sendo que 15 a 30% delas representavam NIC II ou NIC III. Outro trabalho realizado por nosso grupo avaliou mulheres com ASCUS e encontrou NIC I em 60,3%, NIC II/III em 17,46% e neoplasia invasiva em 6,3% dos casos (MURTA et al., 2007). Os autores concluíram que NIC ou lesões invasivas podem ocorrer em mulheres com ASCUS, portanto nova citologia ou colposcopia e seguimento rigoroso devem ser considerados nessas pacientes Para auxiliar o clínico na melhor conduta para uma mulher com diagnóstico de ASCUS, uma descrição das células atípicas deveria ser incluída, além de recomendações sobre futuras avaliações que poderiam ajudar a determinar o significado das atipias (LUNDBERG et al., 1989). Com base nessas orientações, a classificação de Bethesda em 1991 recomendou qualificar o diagnóstico de ASCUS indicando quando ele é um processo provavelmente reativo ou se possui alterações sugestivas de lesões pré-neoplásicas (DAVEY et al., 1994). Dessa forma, todas as pacientes do nosso estudo com diagnóstico de ASCUS, após revisão, foram reclassificadas como de provável caráter neoplásico (45,7%) ou de provável caráter reativo (54,2%), resultado muito similar ao trabalho anterior de nosso grupo (45,4% de ASCUS provável neoplasia e 54,5% de ASCUS provável reativo após revisão de citologias de ASCUS - BARCELOS et al., 2006). Outros trabalhos da literatura também realizaram essa subdivisão. Guerrini et al. (2000) reclassificaram 107 pacientes com diagnóstico de ASCUS e encontraram 78,5% como de provável reativo e 21,5% como de provável caráter neoplásico. Como já foi dito, a ausência de critérios bem definidos, assim como a subjetividade do diagnóstico, pode justificar tal variação. Mesmo após subdivisão do ASCUS em provável caráter reativo ou neoplásico, a conduta clínica permaneceu discordante. Estudos concluíram que não há

57 valor na subcategorização do ASCUS, pois, em alguns grupos de pacientes com ASCUS de provável caráter reativo foram encontrados SIL e câncer no seguimento (SOLOMON et al., 1998). Alguns autores preconizam a realização de colposcopia apenas nas pacientes com ASCUS provável neoplasia, enquanto aquelas com ASCUS provável reativo poderiam ser acompanhadas (MALIK et al., 1999). Malik et al. (1999) reportam a presença de NIC em 48% das biópsias de pacientes com ASCUS de provável caráter reativo. Em outro estudo, Gonzalez et al. (1996) encontraram NIC em 8,6% dos casos de ASCUS classificados como provável reativo. No nosso estudo encontramos 2,63% de NIC de alto grau na biópsia das pacientes com ASCUS provável reativo e em 15,6% nas mulheres com ASCUS provável neoplasia. A comparação da presença de NIC entre os casos de ASCUS provável reativo e provável neoplasia não foi estatisticamente significante, no entanto, a sua freqüência foi maior no segundo grupo. Esses dados confirmam que a qualificação do ASCUS em provável neoplasia ou de caráter reativo não é suficiente para definir prognóstico ou conduta adequada; entretanto, pode sugerir maior freqüência de NIC na biópsia dos casos de ASCUS provável neoplasia. Variantes do termo ASCUS baseadas em critérios morfológicos têm sido descritas. No entanto o significado e o prognóstico para cada uma dessas classificações e estudos sobre a utilização destes dados no auxílio à conduta clínica têm sido pouco relatados. Procurando uma melhor maneira de qualificar as citologias com ASCUS, realizamos a subdivisão desse grupo de acordo com o tipo de células encontradas no esfregaço, seguindo recomendações do Protocolo de Screening de Regione Emilia Romagna (GUERRINI et al., 2000). Esses autores, realizando a mesma metodologia que empregamos, encontraram NIC II/III em 14,2% de ASCUS 1, 2,1% dos ASCUS 3 e 6,6% dos ASCUS 5. Não houve casos de NIC II/III nos ASCUS 2 e 4. Nossos achados mostraram a presença de NIC II/III em 20% dos ASCUS 1, 10,5% dos ASCUS 2, 1% no

58 ASCUS 4 e nenhum caso nos ASCUS 3 e 5. Observamos maior freqüência de NIC II/III na biópsia de pacientes com ASCUS 1, achado semelhante ao dos autores do Protocolo de Regione Emilia Romagna; contudo, a diferença não foi estatisticamente significante entre os grupos. O número de pacientes é pequeno e mais estudos nesse sentido deverão ser futuramente realizados. Tentando distinguir entre as mulheres com citologia atípica atribuída a caráter reativo ou inflamatório e entre aquelas que têm propensão à progressão para NIC II/III, várias dificuldades econômicas e práticas têm surgido. Isso se deve principalmente à imediata indicação da colposcopia para todas as mulheres com células atípicas no esfregaço (SHEILS et al., 1996). Tentando resolver essa questão, o Sistema de Bethesda 2001 eliminou o termo ASCUS provável reativo, limitando o diagnóstico ao ASC-US e ASC-H (SODHANI et al., 2004, PIROG et al., 2004). Mesmo após a revisão da classificação, a conduta nas pacientes com ASCUS permanece discordante. Para mulheres com ASC-US podem ser realizados o seguimento citológico semestral, colposcopia imediata ou colposcopia dependente do teste de HPV (LEE et al., 2006; SHERMAN et al., 2006). A conduta nas mulheres com ASC-H para a maioria dos autores é a realização imediata do exame colposcópico (SHERMAN et al., 2006, EVANS et al., 2006, LEE et al., 2006). Trabalhos têm demonstrado que as mulheres com diagnóstico citológico de ASC-H apresentam maior associação com NIC II/III quando comparado com ASC-US (SHERMAN et al., 2006). Barreth et al. (2006) estudando 517 mulheres com citologia de ASC-H, mostrou a presença de 2,9% de câncer cervical, 1,7% de adenocarcinoma in situ e 65,6% de NIC II/III. Em outro trabalho, 85 mulheres com ASC-H foram submetidas à colposcopia e análise histológica de biópsia das áreas alteradas, tendo-se encontrado NIC II e III em 52 (61,2%) e câncer invasivo em 7 (8,2%) (KIETPEERAKOOL et al., 2008).

59 Resultados semelhantes foram encontrados em nosso estudo, no qual verificamos a presença de 62,6% de NIC II/III nas pacientes classificadas como ASC-H. A análise mostrou diferença estatisticamente significante com relação à presença de NIC II/III nos casos de ASC-H quando comparado aos de ASC-US. O diagnóstico de ASC-H no exame de Papanicolaou está associado ao risco de doença clinicamente significante e a biópsia dirigida por colposcopia deve ser considerada uma boa conduta. Desde a revisão do Sistema de Bethesda em 1991, muitos estudos têm mostrado a importância clínica da divisão do termo ASCUS na tentativa de diagnosticar um possível resultado de HSIL (DUNCAN et al., 2004). Realizamos a comparação das classificações de Bethesda 1991, Bethesda 2001 e Regione Emilia Romagna para o melhor diagnóstico de NIC II/III. Não encontramos na literatura nenhum trabalho que faça a comparação destas três classificações. Quando realizamos a análise, observamos maior freqüência estatisticamente significante de NIC II/III nos casos de ASC-H quando comparado ao ASCUS provável neoplasia e ASCUS 1. Concluímos que a classificação de Bethesda 2001, através do termo ASC-H, é a que melhor identifica as pacientes com provável doença clinicamente significante. Após a introdução do termo ASCUS em 1991 pelo Sistema de Bethesda, várias condutas para pacientes com esse diagnóstico foram descritas e estudadas. A alta prevalência de colposcopia normal nas mulheres com ASCUS levou alguns autores a concluírem que o risco de lesões era baixo e elas poderiam ser tratadas com controle citológico. Posteriormente, relatos de pacientes com ASCUS que apresentaram NIC II/III e câncer cervical no seguimento continuaram a gerar ansiedade no clínico e dúvidas quanto à conduta ainda persistiam (COX, 2005). Atualmente vários estudos avaliando a relação entre os achados citológicos e testes para HPV têm sido realizados (LANG et al., 2005). Teste para identificação do DNA desse vírus, na triagem de citologias mostrando ASCUS,

60 tem se tornado padrão na prática médica atual (LAYFIELD et al., 2005). Acredita-se que a detecção de DNA de HPV de alto risco é útil no complemento de um resultado citológico anormal (HANTZ et al., 2008) e que nas mulheres com ASCUS, a presença desse grupo de HPV aumenta substancialmente a chance de encontrar NIC II/III e câncer de colo, ainda que na maioria delas não sejam encontradas lesões significantes (COX, 2005). Assim, alguns autores orientam a realização de pesquisa para DNA de HPV nas mulheres com ASCUS (HERBST et al., 2001; HUANG et al., 2006) enquanto a biópsia guiada por colposcopia apenas é recomendada se estiver presente HPV de alto risco, sendo as outras mulheres tratadas de modo conservador (SODHANI et al., 2004). Em nosso estudo, todas as mulheres com diagnóstico inicial de ASCUS foram submetidas à pesquisa de DNA de HPV utilizando como método de biologia molecular a captura híbrida. A freqüência de HPV em mulheres com citologia de ASCUS é muito variável na literatura e depende da técnica utilizada e da população estudada. Boardman et al. (2005) mostraram a presença de HPV de alto risco em 68% de um total de 527 adolescentes com ASCUS. Huang et al. (2006) avaliaram a presença de HPV oncogênico pela técnica de captura híbrida e encontraram vírus de alto risco em 36,2% de um total de 105 mulheres com ASCUS. Resultados semelhantes foram encontrados em nosso trabalho. Evidenciamos, pela técnica de captura híbrida, a presença de DNA de HPV em 34,3% das 70 pacientes com citologia de ASCUS após revisão, sendo que em 27,1 % foi detectado DNA de HPV de alto risco. Quando comparamos a presença de HPV nos casos de ASCUS e de citologia normal, após revisão, não encontramos diferença significativa. Isso pode ter ocorrido por termos um número pequeno de casos, além do fato de que todas as citologias revistas tiveram um diagnóstico inicial de ASCUS; portanto com alguma anormalidade que à revisão foi considerada apenas reativa.

61 Vários trabalhos na literatura demonstram diferença na presença de DNA de HPV quando comparamos citologia de ASC-US e ASC-H. Srodon et al. (2006) estudando pacientes com ASCUS classificados pelo Sistema de Bethesda 2001 encontraram a presença de HPV em 67% das mulheres com ASC-H e em 45% com ASC-US. Kurman et al. (2007) avaliando a presença de HPV alto risco por captura híbrida entre ASC-US e ASC-H relataram 14,2% no primeiro grupo e 66,6% no segundo. Em nosso trabalho encontramos a freqüência de HPV de alto risco em 22,5% das pacientes com ASC-US e em 62,5% com ASC-H. Esses achados estão de acordo com os dados da literatura. Quando foi feita a comparação entre as citologias de ASC-US e ASC-H, a presença de DNA de HPV de alto risco foi estatisticamente maior no segundo grupo, mostrando a importância da divisão do termo para a detecção de doença clinicamente significante. Sabemos que a presença de HPV de alto risco é muito prevalente na população sexualmente ativa (HO et al., 1998), e não é a única variante relacionada à presença de NIC. Outros fatores como tabagismo e imunidade são importantes para o desenvolvimento de NIC nas mulheres com HPV de alto risco (NOMELINE et al., 2007). A infecção persistente do trato genital feminino por subtipos oncogênicos de HPV é a principal causa de SIL e carcinoma invasivo (HO et al., 1995; NOBBENHUIS et al., 1999). Dos 6 casos de biópsia com NIC de alto grau descritos no trabalho (incluindo todas as 100 mulheres que participaram do estudo), 5 (83,3%) foram positivos para HPV de alto risco pela técnica de captura híbrida. As pesquisas descrevem a detecção do HPV em aproximadamente 90 a 98% dos casos de NIC (MUÑOZ. et al 2003). Os casos negativos podem ocorrer por novos tipos de vírus não incluídos nos testes. No caso da captura híbrida, pode decorrer pela presença de lesões com poucas cópias de vírus, ainda não detectadas por esse método (NOMELINE et al., 2007).

62 Srodon et al. (2006) avaliaram a presença de HPV e de NIC de alto grau em pacientes com ASC-US e ASC-H; encontrou NIC II/III em 10,2% das pacientes com ASC-US HPV positivo e em 5,9% daquelas com ASC-US HPV negativo. Com relação à presença de NIC II/III em ASC-US HPV positivo, nossos achados são semelhantes ao deste último autor. Encontramos 7,14% casos de NIC de alto grau em mulheres com ASC- US HPV positivo. Quando avaliamos a presença de NIC II/III em mulheres com teste de HPV positivo e negativo e estudamos o grupo ASC-US, observamos maior freqüência de NIC II/III em pacientes ASC-US com HPV positivo; quando se compara com o grupo ASC-US HPV negativo (nenhum caso de NIC alto grau); porém, a diferença não foi estatisticamente significativa. O número de pacientes do trabalho é pequeno e a presença de NIC II/III em 7,14% das mulheres com ASC-US e HPV positivo sugere que o teste para HPV pode ser utilizado na triagem de pacientes com ASC-US para a colposcopia e a positividade do mesmo pode estar associada ao aumento da probabilidade de ocorrência de NIC. Quando comparamos a presença de NIC II/III em mulheres com HPV alto risco e citologia de ASC-US e ASC-H, encontramos diferença estatisticamente significante, sendo maior no segundo grupo. Portanto, o diagnóstico de ASC-H parece estar associado ao aumento de risco de lesão clinicamente significante, principalmente quando associado ao HPV oncogênico. Apesar das controvérsias da utilização do ASCUS, principalmente com relação à conduta e prognóstico, acreditamos que a eliminação do termo diminuiria a sensibilidade do exame citológico, deixando de detectar alterações que levariam a um diagnóstico de NIC. Do total de 32 pacientes classificadas como ASCUS provável neoplasia pelo Sistema de Bethesda de 1991, 5 apresentaram NIC II/III na biópsia dirigida. Na classificação de Bethesda 2001 o grupo ASC-H diagnosticou as mesmas cinco mulheres com NIC, descritas no ASCUS provável neoplasia. Houve também maior número de diagnósticos de

63 HPV e NIC I nas mulheres com ASCUS provável neoplasia. Entretanto, sabemos que existe uma alta taxa de involução espontânea das lesões de baixo grau e que o custo do exame de colposcopia e de biópsia são elevados. O único caso de NIC II/III no ASC-US ocorreu em paciente com HPV de alto risco oncogênico. Sendo assim, com a utilização da classificação de Bethesda 2001 e indicação de exame colposcópico imediato apenas para as mulheres do grupo ASC-H, reduzimos custos de colposcopia e outros procedimentos desnecessários (esquema 1). Nas pacientes com ASC-US duas estratégias poderiam ser seguidas: 1 - realização de teste para HPV e, colposcopia se positivo para HPV alto risco ou 2 - controle semestral com citologia (esquema 2). Durante o seguimento semestral das 70 pacientes reclassificadas como ASCUS, encontramos 7 casos (10%) de LSIL à citologia, 5 deles não detectadas na primeira consulta, sendo que três deles foram obtidos de pacientes classificadas como ASCUS provável caráter reativo (Bethesda, 1991); pela classificação de 2001 todos foram diagnosticados em citologias classificadas como ASC-US. Slawson et al. (1994) mostraram que em mulheres com atipia cervical, apenas o seguimento com citologia não detectou cerca de 1/3 dos casos de NIC II/III. Mostramos neste estudo a importância do seguimento rigoroso das pacientes com ASCUS através da citologia e colposcopia, mesmo naquelas com alterações favoráveis a caráter reativo. No subgrupo das pacientes em que a citologia inicial de ASCUS foi reclassificada como normal/inflamatória neste estudo, a grande maioria (83,3%) teve citologia normal no primeiro retorno semestral, e nelas nessas pacientes não foi encontrado nenhum caso de NIC. Assim sugerimos que, se na revisão citológica do ASC-US, o diagnóstico for negativo, um controle citológico após seis meses poderá ser realizado antes da colposcopia, evitando assim propedêuticas excessivas.

64 Acreditamos que os dados obtidos neste estudo foram importantes para confirmar a utilidade da subdivisão de ASCUS segundo Bethesda 2001 e através das comparações com o teste de captura híbrida e biópsia propomos os esquemas 1 e 2.

65 Esquema 1. Proposta de conduta para pacientes com diagnóstico de ASC-H. ASC-H Colposcopia com biópsia NORMAL ALTERADA Controle com cito e colpo em seis meses Tratamento Específico

66 Esquema 2. Proposta de conduta para pacientes com diagnóstico de ASC-US. ASC-US REVISÃO NORMAL ASC-US Citologia em 6 meses Teste para HPV de alto risco Citologia em 6 meses HPV + HPV -

67 COLPOSCOPIA Citologia em 6 meses

68 CONCLUSÕES Este estudo permite-nos concluir que: 1. A freqüência de ASCUS no nosso serviço foi de 4,98%. 2. A concordância do diagnóstico de ASCUS entre os observadores após revisão foi de 67,96%. 3. A freqüência de infecção nas pacientes com ASC-US foi maior quando comparada ao grupo ASC-H. 4. A freqüência de achados colposcópicos anormais foi maior nos grupos ASCUS neoplásico e ASC-H quando comparados aos grupos ASCUS reativo e ASC- US, respectivamente. 5. O diagnóstico de ASC-H na citologia está associado ao risco de doença clinicamente significante. 6. A positividade do teste para HPV utilizado na triagem de pacientes com ASC- US para a colposcopia parece estar associada ao aumento de chance de detecção de NIC. 7. Propomos que a citologia inicial de ASC-US seja revista para confirmação do diagnóstico e, se este persistir, duas estratégias podem ser seguidas: realização

69 de teste para HPV e colposcopia se HPV alto risco positivo ou controle semestral com citologia. Nos casos classificados desde o início em ASC-H deve ser realizada colposcopia imediata. Nos casos classificados como normais à revisão do ASC-US, sugere-se realizar nova citologia em 6 meses.

70 RESUMO INTRODUÇÃO: ASCUS é um termo utilizado para descrever alterações citológicas que não são suficientes para serem interpretados como processos displásicos ou inflamação. A correta interpretação das alterações morfológicas do ASCUS, relacionada ao prognóstico, assim como a conduta clínica e seu significado, ainda não foram bem esclarecidos. OBJETIVOS: Propor conduta para pacientes com diagnóstico inicial de ASCUS através da revisão das citologias, exame ginecológico para a avaliação de agentes microbiológicos e presença de HPV, colposcopia e seguimento semestral. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Esfregaços de 103 mulheres com ASCUS foram revistos e reclassificados em: normal/inflamatório, ASCUS, LSIL e HSIL; se o diagnóstico de ASCUS foi confirmado, o caso foi subclassificado em provável reativo ou provável neoplásico, ASC-US e ASC-H e também em grupos de acordo recomendação do Protocolo de Screening de Regione Emilia Romagna. Pacientes foram submetidas a exame colposcópico e coleta de material cérvico-vaginal para as pesquisa Candida sp, vaginose bacteriana, Trichomonas vaginalis e HPV. RESULTADOS: Freqüência de ASCUS foi de 4,98%. Dos 103 casos, 70 (67,9%) foram diagnosticados como ASCUS na revisão 38 (54,2%) foram reclassificados como ASCUS provável caráter reativo e 32 (45,71%) como ASCUS provável neoplásico (Bethesda 1991); 62 (88,5%) foram reclassificados em ASC- US e 8 (11,41%) em ASC-H (Bethesda 2001). A distribuição dos ASCUS seguindo Protocolo de Regione foi: 15 casos de ASCUS 1 (21,4%), 19 de ASCUS 2 (27,1%), 19 de ASCUS 3 (27,1%), 16 de ASCUS 4 (22,8%) e 1 caso de ASCUS 5 (1,4%). Houve maior número de casos de NIC II/III nas biópsias das pacientes com ASC-H, em relação ao grupo de ASC-US (p = 0,0028). Houve diferença estatisticamente significante quando comparamos a presença de HPV de alto risco entre os grupos de ASC-US e ASC-H. Quando avaliamos a presença de NIC II/III nas pacientes com positividade para o HPV de alto risco e comparamos os grupos ASC-US e ASC-H encontramos diferença (p = 0,031), sendo maior no segundo grupo. Não houve nenhum caso de NIC nas pacientes com revisão normal/inflamatória no seguimento semestral. CONCLUSÕES: O diagnóstico de ASC-H na citologia está associado ao risco de doença clinicamente significante. A positividade do teste para HPV utilizado na triagem de pacientes

71 com ASC-US para a colposcopia parece estar associada ao aumento de chance de detecção de NIC. Propomos que a citologia inicial de ASC-US seja revista e, se confirmado, duas estratégias podem ser seguidas: realização de teste para HPV e colposcopia se HPV alto risco positivo ou controle semestral com citologia. Nos casos classificados desde o início em ASC-H deve ser realizada colposcopia imediata. Nos casos classificados como normais à revisão do ASC-US, sugere-se realizar nova citológica em 6 meses ILUSTRAÇÕES

72 PRANCHA 1 Figuras 1, 3, 6, 7 e 8 Fotomicrografias de esfregaços cérvico-vaginais corados pela técnica de Papanicolaou. Figuras 2 e 4 Imagens do colo uterino capturadas através de vídeo-colposcópico. Figura 5 Corte histológico corado por Hematoxilina-Eosina Figura 1. Caso 1 Células superficiais e intermediárias com disceratose (ASCUS provável reativo pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-US pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 2. Caso 1 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Colposcopia normal. Aumento de 16x. Figura 3. Caso 2 Citologia inicial. Células metaplásicas com cariomegalia, hipercromasia nuclear e disceratose (ASCUS provável neoplásico pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-US pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 4. Caso 2 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Notar área de epitélio aceto-branco bem delimitada em lábio anterior e posterior, sem relevo. Achados colposcópicos menores. Aumento de 16x.

73 Figura 5. Caso 2 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau I. Notar epitélio escamoso com núcleos hipercromáticos e aumentados de tamanho em toda a espessura e perda de maturação citoplasmática atingindo o terço inferior. Aumento de 400x. Figura 6. Caso 2 Citologia de retorno - Células superficiais e intermediárias com binucleação, hipercromasia, irregularidade da membrana celular e halo perinuclear (coilocitose) - Infecção por HPV. Aumento de 400x. Figura 7. Caso 3 Citologia inicial - Células superficiais, intermediárias e metaplásicas com hipercromasia e alteração da relação núcleocitoplasmática (ASCUS provável neoplasia pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-H pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 8. Caso 3 Citologia inicial - Células metaplásicas com hipercromasia e alteração da relação núcleo-citoplasma (ASCUS provável neoplasia pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-H pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x.

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76 PRANCHA 2 Figuras 9, 10, 14 e 15 Imagens do colo uterino capturadas através de aparelho de vídeo-colposcópico. Figura 11, 12 e 16 Cortes histológicos corados por Hematoxilina-Eosina. Figura 13 Fotomicrografia de esfregaço cérvico-vaginal corado pela técnica de Papanicolaou. Figura 9. Caso 3 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Notar área de epitélio aceto-branco bem delimitada e com relevo em lábio anterior. Achados colposcópicos maiores. Aumento de 16x. Figura 10. Caso 3 Coleta de biópsia de área atípica em lábio anterior de colo uterino com pinça de Gaylor. Aumento de 16x. Figura 11. Caso 3 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau III. Notar epitélio escamoso com núcleos aumentados de tamanho, hipercromáticos e perda de maturação em toda a espessura. Aumento de 100x. Figura 12. Caso 3 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau III. Notar epitélio escamoso com núcleos aumentados de tamanho, hipercromáticos e perda de maturação em toda a espessura. Aumento de 200x. Figura 13. Caso 4 Citologia inicial - Células superficiais, intermediárias e metaplásicas com hipercromasia, alteração da relação núcleocitoplasmática, contorno irregular da membrana nuclear e binucleação

77 (ASCUS provável neoplasia pela classificação de Bethesda 1991 e ASC-H pela classificação de Bethesda 2001). Aumento de 400x. Figura 14. Caso 4 Coleta de material endocervical com cito-brush para pesquisa de DNA de HPV por método de captura híbrida. Aumento de 10x. Figura 15. Caso 4 Colo uterino após aplicação de solução de ácido acético a 3%. Notar área de epitélio aceto-branco bem delimitada com orifícios glandulares espessados em lábio posterior. Achados colposcópicos maiores. Aumento de 16x. Figura 16. Caso 4 Biópsia de colo uterino com neoplasia intra-epitelial grau II. Notar epitélio escamoso com núcleos hipercromáticos e aumentados de tamanho em toda a espessura e perda de maturação citoplasmática atingindo o terço médio. Aumento de 400x.

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79 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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85 ANEXOS

86 ANEXO 1 Protocolo de Pesquisa Células escamosas atípicas de significado indeterminado: utilização da Classificação de Bethesda 2001, conduta e associação com infecção por papilomavírus humano Paciente n o Nome: RG: Idade: Paridade: G P N C A Colpo n o : n o parceiros: 1 a relação: 1 a gestação: Contracepção: Tabagismo: ( ) Sim ( ) Não História de DST: ( ) Sim ( ) Não Citologia : ( CP - ) - data: / / Colposcopia : data: / / Macro: Descrição: Achados colposcópicos normais: - epitélio escamoso original ( ) - epitélio colunar ( ) - zona transformação normal ( ) Achados colposcópicos anormais alterações maiores menores - epitélio aceto branco ( ) ( ) - pontilhado ( ) ( ) - mosaico ( ) ( ) - leucoplasia ( ) ( ) - zona iodo-negativa ( ) ( ) - vasos atípicos ( ) ( ) JEC : PS:

87 Biópsia : ( ) Não ( ) Sim B: Data: Diagnóstico: ANEXO 2 Avaliação Microbiológica, Bioquímica e pesquisa de HPV. Paciente n o Avaliação da Microflora Vaginal Candida sp Cultura placa Petri: ( ) positivo ( ) negativo Vaginose bacteriana a) aspecto da secreção vaginal: b) ph vaginal: ( ) > 4,5 c) teste das aminas: ( ) positivo ( ) negativo d) coloração Gram (presença clue cells ) ( ) positivo ( ) negativo Trichomonas vaginalis Teste a fresco: ( ) positivo ( ) negativo Captura Híbrida HPV ( ) Negativo ( ) HPV de baixo grau ( ) HPV de alto grau

88 ANEXO 3 Revisão da Citologia Paciente n o Citologia CP ( ) normal/inflamatório ( ) LSIL ( ) HPV ( ) NIC I ( ) HSIL ( ) NIC II ( ) NIC III ( ) ASCUS Bethesda 1991 ( ) ASCUS provável reativo ( ) ASCUS provável neoplasia Bethesda 2001 ( ) ASC-US ( ) ASC-H Regione Emilia Romagna ( ) ASCUS 1 Células escamosas atípicas com citoplasma tipo maduro-intermediário ( ) ASCUS 2 Células escamosas atípicas metaplásicas ( ) ASCUS 3 Células escamosas atípicas com paraceratose ( ) ASCUS 4 Células atípicas reativas ( ) ASCUS 5 - Células escamosas atípicas com atrofia

89 ANEXO 4 Protocolo de Pesquisa Consulta de Retorno Paciente n o Data do retorno / / Citologia : ( - ) - data: / / Colposcopia : Biópsia : B data: Diagnóstico: