ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE MICRORGANISMOS ISOLADOS DO JACATUPÉ (Pachyrhizus erosus L. Urban) 1

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1 ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE MICRORGANISMOS ISOLADOS DO JACATUPÉ (Pachyrhizus erosus L. Urban) 1 Tânia L. Montenegro STAMFORD 2,*, J. Magali ARAÚJO 3, N. Pereira STAMFORD 4 RESUMO O isolamento e a identificação de microrganismos produtores de enzimas de interesse comercial, utilizando tubérculos de jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban), foi o objetivo principal deste trabalho. Isolaram-se microrganismos endofíticos e epifíticos identificados por observação micromorfológica. A avaliação da atividade enzimática das linhagens foi determinada pelo método de difusão em ágar. As sessenta e oito linhagens isoladas dos tubérculos de jacatupé foram cultivadas em meio sólido específico para amilase, lipase, protease e celulase por 96h a 28 0 C. Os microrganismos epifíticos encontrados foram Pithomyces (7,3%), Aspergillus (19,2%), Fusarium (5,9%) e Trichoderma (5,8%), e os endofíticos foram Mucor (7,3%), Rhizopus (10,3%), Bacillus (19,0%), Staphylococcus (10,3%) e Nocardiopsis (15%). As linhagens de Nocardiopsis sp. apresentaram atividade lipolítica superior à do padrão, porém a atividade amilolítica não apresentou diferença significativa

2 comparada com o padrão. As linhagens de Mucor sp., Pithomyces sp. e Staphylococcus sp. produziram atividade proteolítica abaixo do padrão. Nenhum isolado apresentou atividade celulolítica. Palavras-chave: Jacatupé, endofíticos, epifíticos, isolamento de microrganismos. SUMMARY ENZYMATIC ACTIVITY OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM YAM BEAN LEGUME (Pachyrhizus erosus L. Urban). The isolation and identification of microorganisms that produce enzyme of commercial interest utilizing tubers of yam bean legume (Pachyrrizus erosus L. Urban) was the main objective of this work. Endophytic and epiphytic microorganisms were isolated by micromorphologyc observation. The agar diffusion method was used to determine the enzymatic activity. Sixty-eight isolates from yam bean tubers were cultured at 28 0 C in solid medium specific to amylase, lipase, protease and cellulase for 96h. The epiphytic microorganisms Pithomyces (7,3%), Aspergillus (19,2%), Fusarium (5,9%) and Trichoderma (5,8%) and the endophytic microorganisms Mucor (7,3%), Rhizopus (10,3%) Bacillus (19%), Staphylococcus (10,3%) and Nocardiopsis (15%) were isolated. Compared to the specific standard culture Nocardiopsis sp. showed higher lipolytic activity and similar amylolitic activity. Mucor sp., Pithomyces sp. and Staphylococcus sp, produced proteolytic activity lower than the standard culture. None isolate showed celulolytic activity.

3 Keywords: Yam bean, endophytic, epiphytic, microbial isolation. 1 INTRODUÇÃO Trabalhos de pesquisa relatando a ocorrência de microrganismos endofíticos, principalmente o isolamento e caracterização de fungos e bactérias, são relativamente recentes, constatando-se sua existência em gramíneas [2,27], ericaceas [17] araceas, bromeliaceas e orquidaceas [18], e em plantas herbáceas e arbustivas [24]. O termo endofítico refere-se a microrganismos que residem nos tecidos internos das plantas sem causar nenhum sintoma de doença [31]. Técnicas de incubação, de partes de plantas desinfetadas, em meio sólido são comumente usadas na fitopatologia. O uso dessas técnicas ajudam a confirmar a presença de microrganismos endofíticos [22]. O jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban) é uma leguminosa de raízes tuberosas, nativa do sul do México e da região Amazônica, pertence à família Fabaceae, sub família Papilionoideae [28]. As características principais da planta são a facilidade de cultivo e a baixa exigência nutricional em relação a outras culturas semelhantes, principalmente em função de realizar com grande eficácia o processo da fixação do nitrogênio atmosférico em simbiose com bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium [30]. Esta leguminosa produz tubérculos comestíveis e sementes com elevado teor de proteínas e lipídios [21]. Os tubérculos constituem fonte de amido de boa qualidade para diversos fins na indústria de alimentos, incluindo a produção de xarope de glicose, com grande aplicação tecnológica [12,13]. Muitos são os trabalhos relatando o potencial e aplicabilidade das enzimas amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas e proteolíticas na indústria farmacêutica, têxtil, couro, papel, mineral e alimentícia [4, 5, 8, 10, 14, 23].

4 O conhecimento de que os microrganismos usados em testes de produção de enzimas podem ser obtidos de coleções e/ou de fontes naturais ricas em substratos nos quais as enzimas desejadas devem atuar, motivou a realização deste trabalho, com tubérculos de jacatupé, com vistas a obter novas linhagens produtoras de enzimas. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Isolamento dos Microrganismos Os tubérculos de jacatupé foram colhidos na Estação Experimental da Universidade Federal Rural de Pernambuco, e sua superfície lavada com água e sabão, para retirada de impurezas. Com o auxílio de um furador de rolha de 6 mm de diâmetro, esterilizado, retiraramse discos a profundidade de 3 cm. Os discos utilizados no isolamento de microrganismos endofíticos foram desinfetados de acordo com a metodologia descrita por PETRINI & DREYFUSS [18]. Para isolamento de microrganismos epifíticos utilizou-se discos sem desinfecção. Os discos foram colocados em placas de Petri com o meio Batata Dextrose Ágar (BDA) para isolamento de fungos e, com Nutriente Ágar (NA) para isolamento de bactérias. As placas foram incubadas a 280 C durante 7 dias. As colônias foram retiradas das placas utilizando-se o meio BDA para manutenção dos fungos e os meios NA e ISP-2 para bactérias e actinomicetos [19]. Todas as linhagens foram conservadas a 40 C. 2.2 Identificação dos Microrganismos Os microrganismos foram identificados por suas características morfológicas e por microscopia ótica. A técnica de coloração de Gram aliada à observação de lâminas a fresco foram utilizadas para diferenciar os grupos de bactérias. A análise microscópica dos fungos filamentosos baseou-se na descrição macromorfológica das colônias em meios: Czapek, BDA, Extrato de malte, Saboraud, usados de acordo com as exigências nutricionais de cada grupo de fungos. A observação microscópica foi realizada pela descrição micromorfológica das estruturas, utilizando quando necessário, a técnica de cultura em lâmina [20].

5 2.3 Determinação da Atividade Enzimática Os microrganismos foram inoculados no centro da placa, e incubados a 280 C. As medições do diâmetro do halo produzido e da colônia foram feitas com uma régua, nos períodos de crescimento de 24, 48, 72 e 96 horas respectivamente. A atividade enzimática foi determinada pelo método de HANKIN & ANAGNOSTAKIS [6], através da relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia, expresso como Índice Enzimático [1]. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, com três repetições, e os dados obtidos foram analisados através de análise da variância. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de p 0,05 de probabilidade, usando-se o Sistema de Análise Estatística - SANEST. Atividade Amilolítica - A habilidade de degradar amido foi usada como critério para determinação da produção de enzimas amilolíticas. O meio usado foi o Nutriente-Ágar (NA) com 0,2% de amido solúvel, ph 6,0. Aspergillus oryzae NRLL 2022 foi considerado como microrganismo padrão. Após 96 h de incubação a 280 C, as placas foram reveladas com KI, e a atividade amilolítica avaliada pela zona clara ao redor da colônia [6]. Atividade Celulolítica Na determinação da atividade celulolítica foi usado um meio de ph 5,5, contendo: KH2PO4 7,0g; K2HPO4 2,0g; MgSO4. 7H2O 0,1g; (NH4)2 SO4 1,0g; extrato de levedura 0,6g; Avicel 10g e ágar 15g, por litro, respectivamente. Foi utilizado o Trichoderma viride ATCC 2820 como padrão. A incubação das placas foi realizada a 280 C, por 96h. Para melhor visualização da zona de clarificação [15] as placas foram estocadas a 500 C, por uma noite, após o período de incubação. Atividade Lipolítica - O meio descrito por ANDERSON [1] foi usado para determinar a atividade lipolítica. Após 96 h de incubação a 280 C o halo de degradação foi evidenciado, deixando-se as placas em refrigeração a 40 C, por 12 h. Bacillus subtilis ATCC 6633 foi considerado como padrão. Atividade Proteolítica - O meio descrito por HARRIGAN &

6 McCANOE [7] foi usado para avaliar a atividade proteolítica. Streptomyces fradiae NRLL 1195 foi utilizado como padrão. Para melhor visualização do halo, após 96 h de incubação, a superfície das placas foi coberta com solução de ácido acético 5%. Em todos os ensaios com o fungo Trichoderma sp adicionou-se citrato de sódio 10mM, com a finalidade de restringir o tamanho das colônias. As linhagens utilizadas como padrão no presente trabalho são originárias da American Culture Collection (ATCC) e Northern Regional Research Laboratory Collection (NRLL), sendo normalmente usadas para fins comparativos. As linhagens foram cedidas pelo Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, conservadas em meio sólido específico, com óleo mineral, através de renovação semestral. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Microflora Isolada Os microrganismos isolados dos tubérculos de jacatupé são apresentados na Tabela 1. Do total de 68 linhagens isoladas, nove tipos morfológicos distintos foram selecionados para identificação. Os microrganismos endofíticos representaram 62% dos isolados, predominando bactérias não filamentosas dos gêneros Bacillus e Staphylococcus (29,5%), actinomicetos do gênero Nocardiopsis (14,7%) e fungos filamentosos dos gêneros Mucor e Rhizopus (17,6%). A ocorrência de Mucor sp. e Rhizopus sp. como endofíticos do jacatupé constitui um relato importante, em decorrência de Mucor sp. não ter sido ainda registrado como endofítico, e Rhizopus sp. ter sido observado apenas em milho [26, 27]. TABELA 1. Ocorrência e Identificação dos microrganismos isolados de tubérculos do jacatupé (Pachyrhizus erosus).

7 Microrganismo N 0 de isolados Ocorrência (%) Endofíticos Mucor spp. 05 7,3 Rhizopus spp ,3 Bacillus spp ,2 Staphylococcus spp ,3 Nocardiopsis spp ,7 Sub Total 42 61,8 Epifíticos Pithomyces spp. 05 7,3 Aspergillus spp. 13 9,2 Fusarium spp. 04 5,9 Trichoderma spp. 04 5,8 Sub Total 26 38,2 Total 68 A flora epifítica compreendeu 26 dos microrganismos isolados (38%), sendo todos fungos filamentosos dos gêneros Pithomyces, Aspergillus, Fusarium e Trichoderma, distinta, portanto, da

8 endofítica. Os resultados encontrados reforçam que a associação entre microrganismos endofíticos e plantas é um fenômeno generalizado [25]. Microrganismos endofíticos foram isolados de diferentes tipos de plantas, como gramíneas [2, 27], ericaceas [17], araceas, bromeliaceas e orquidaceas [18], plantas herbáceas e arbustivas [24]; entretanto não se tem registro de que a leguminosa Pachyrhizus erosus tenha sido usada como planta teste para isolamento de endofíticos. Em experimentos conduzidos para obtenção de isolados em condições de campo, McINROY & KLOEPPER [11] e SOUZA [29] observaram bactérias endofíticas em sementes de milho (Zea mays) e de algodão (Gossipium hirsutum), corroborando com a afirmação de SIEBER et al. [25], de que a população de endofíticos é influenciada quantitativa e qualitativamente pelo local de coleta, provavelmente devido a solos, órgãos da planta, ambiente, período vegetativo e cultivar. É interessante observar que, embora seja expressivo o número de isolados constante na literatura especializada, nada foi registrado quanto ao isolamento de representantes dos gêneros Staphylococcus e Nocardiopsis, o que permite inferir que os mesmos ainda não foram estudados como endofíticos, integrando uma microflora específica. 3.2 Atividade Enzimática Do ponto de vista prático, existem várias propostas para determinar a atividade enzimática por difusão radial em meio sólido. Os fatores determinantes que viabilizam esta seleção incluem a correlação direta entre o tamanho do halo e a capacidade degradativa dos microrganismos [3, 9, 16]. LEALEM & GASHE [8] recomendam um valor do índice de atividade enzimática 2,0 para mostrar a habilidade do microrganismo em degradar amido em meio sólido. Observa-se na Tabela 2, que foi produzida atividade amilolítica por Aspergillus oryzae (NRLL 2022), Nocardiopsis sp., Bacillus sp., e Aspergillus sp.. Entretanto, verifica-se que a média do índice enzimático para a linhagem endofítica Nocardiopsis sp. não

9 apresentou diferença significativa ao nível de p 0,05 em relação à linhagem padrão (Aspergillus oryzae NRLL 2022), enquanto que para Bacillus sp. não se observou diferença em relação ao Aspergillus sp. que mostrou índice enzimático no limite mínimo para o microrganismo ser considerado como produtor de enzima em meio sólido. Os microrganismos Pithomyces sp., Rhizopus sp., Staphylococcus sp., Fusarium sp. e Trichoderma sp. não apresentaram atividade amilolítica. TABELA 2. Atividade amilolítica em meio sólido, dos microrganismos isolados de tubérculos do jacatupé Pachyrhizus erosus 1. Microrganismos Diâmetro do halo de degradação(cm) Diâmetro da Colônia (cm) Índice enzimático(i) 2 Aspergillus oryzae NRLL ,6 1,0 5,6 a Nocardiopsis sp. 2,5 0,6 4,4 a Bacillus sp. 3,6 1,0 3,6 ab Aspergillus sp. 3,0 1,5 2,0 bc Mucor sp. 4,0 3,0 1,3 c Rhizopus sp. 0,0 3,0 0,0 d Staphylococcus sp. 0,0 1,0 0,0 d Pithomyces sp. 0,0 2,5 0,0 d

10 Fusarium sp. 0,0 3,5 0,0 d Trichoderma sp. 0,0 3,0 0,0 d 1 Médias de três repetições. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si (Tukey p 0,05). 2 O índice enzimático representa o diâmetro do halo de degradação/ diâmetro da colônia. Os resultados obtidos para atividade lipolítica (Tabela 3) indicam que Nocardiopsis sp. tem uma atividade enzimática superior à do padrão (Bacillus subtilis ATCC6633). Este fato é bastante interessante tendo em vista que não se encontra registro deste actinomiceto como produtor de enzimas lipolíticas. O gênero Bacillus mostrou atividade inferior ao padrão, com diferença significativa. As outras linhagens não cresceram neste meio de cultivo. TABELA 3. Atividade lipolítica e proteolítica em meio sólido, dos microrganismos isolados do jacatupé 1. Microrganismos Diâmetro do halo de degradação(cm) Diâmetro da colônia(cm) Índice enzimático(i) 2 Atividade lipolítica Nocardiopsis sp. 2,75 0,95 2,89 a Bacillus subtilis ATCC ,50 1,25 1,80 b Bacillus sp. 2,37 1,86 1,52 c

11 Atividade Proteolítica Streptomyces fradiae NRRL 1195 Staphylococcus sp 2,00 0,50 4,00 a 1,00 0,50 2,00 b Pithomyces sp. 5,40 4,20 1,30 c Mucor sp. 5,00 4,00 1,30 c 1 Médias de três repetições. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si (Tukey) p 0,05). 2 O índice enzimático representa o diâmetro do halo de degradação/ diâmetro da colônia. Os resultados da seleção dos microrganismos quanto à atividade proteolítica são apresentados na Tabela 3. Os fungos Rhizopus sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., e Trichoderma sp. não apresentaram atividade proteolítica. O índice de atividade proteolítica por Pithomyces sp. e Mucor sp. foi inferior a 2,0, logo não devem ser considerados como produtores de enzima proteolítica. Por outro lado, Staphylococcus sp. apresentou índice igual a 2,0 e pode ser considerado como produtor de enzima proteolítica, embora com resultados inferiores ao padrão (Streptomyces fradiae NRLL 1195). Com relação à produção de enzimas celulolíticas observou-se que os microrganismos isolados do jacatupé não apresentaram esta atividade. 4 CONCLUSÕES Os resultados obtidos no presente trabalho permitem inferir as seguintes conclusões:

12 Microrganismos endofíticos foram isolados de tubérculos de jacatupé, e apresentaram atividade enzimática em meio sólido. As linhagens endofíticas mais freqüentes foram: Mucor, Rhizopus, Bacillus, Staphylococcus e Nocardiopsis. A linhagem de Nocardiopsis apresentou atividade amilolítica e lipolítica; a linhagem de Staphylococcus apresentou atividade proteolítica, e nenhuma linhagem produziu atividade celulolítica. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ANDERSON, J. A. The use of tributyrinager in dairy bacteriology. Ber. 3 Int. Mikrobiol. Kongress v.3, p , CLAY, K. Fungal endophytes of grasses: a defensive mutualism between plants and fungi. Ecology v.69. p.10-16, CESKA, M. Enzyme catalysis of solidified media. European Journal Biochemistry v.22, p , CRUEGER, W., CRUEGER, A. Biotecnologia : Manual de Microbiologia Industrial. Zaragoza: Acribia, p. 5. GAMA, F. M., TEIXEIRA, J.A., MOTA, M. Direct determination of endoglucanase activity on cellulose insolubly fibres. Biotechnology Techniques v.5, p , HANKIN, L., ANAGNOSTAKIS, S. L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia v.67, p , HARRIGAN, W.F., McCANOE, M.E., Métodos de laboratório en Microbiologia de alimentos y productos lácteos. Academia, Leon, Spain LEALEM, F., GASHE, B. A. Amylase production by a grampositive bacterium isolated from fermenting tef (Eraglostis tef). Journal of Applied Bacteriology v.77.p , LIN, J.E., CHANG, D.C.N., SHEN, G.J. Correlations among several screening methods used for identifying wood-decay fungi that can degrade toxic chemicals. Biotechniques v. 5, n.4, p , MACEDO, G. A., PASTORE, G. M. Lipases microbianas na

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