AVALIAÇÃO DE SUBSTRATOS VEGETAIS DESTINADOS À ALIMENTAÇÃO ANIMAL COMO SUPORTES PARA A PRODUÇÃO DE OCHRATOXINA A POR ESPÉCIES DO GÊNERO Aspergillus FR.

Transcrição

1 64 Avaliação de substratos... AVALIAÇÃO DE SUBSTRATOS VEGETAIS DESTINADOS À ALIMENTAÇÃO ANIMAL COMO SUPORTES PARA A PRODUÇÃO DE OCHRATOXINA A POR ESPÉCIES DO GÊNERO Aspergillus FR. BEATRIZ DIAS QUEIROZ 1 KELLY MOURA KELLER 1 LUIZ ANTONIO MOURA KELLER 2 JESSIKA MARA MARTINS RIBEIRO 3 CARLOS ALBERTO DA ROCHA ROSA 4 1. Aluna de Iniciação Científica PIC/UFRuralRJ, Discente do Curso de Medicina Veterinária; 2. Discente do Curso de Medicina Veterinária da UFRuralRJ; 3. Mestranda em Microbiologia Veterinária pela UFRuralRJ; 4. Professor Titular do Instituto de Veterinária da UFRuralRJ. RESUMO: QUEIROZ, B. D.; KELLER, K. M.; KELLER, L. A. M.; RIBEIRO, J. M. M.; ROSA, C. A. da R. Avaliação de substratos vegetais destinados à alimentação animal como suportes para a produção de ochratoxina A por espécies do gênero Aspergillus Fr.: Fr. Revista Universidade Rural: Série Ciências da Vida, Seropédica, RJ: EDUR, v. 25, n.1, p , jan.-jun., Os objetivos deste trabalho foram o isolamento e identificação da micobiota contaminante em diferentes substratos vegetais: cevada, malte e radícula, fornecidos por uma malteria do Estado de São Paulo. Foram analisadas amostras de resíduos industriais primários verificando-se sua potencial capacidade de contaminação toxígena e os riscos de disseminação de micotoxinas em alimentos destinados a animais. Nenhum dos três substratos analisados ultrapassou o limite máximo permitido de 10 5 UFC.g -1. O gênero Aspergillus e seus teleomorfos foram os mais prevalentes (48,00%), seguidos pelos gêneros Cladosporium (34,00%) e Penicillium (6,80%), entre outros. Palavras-chave: micotoxinas, micobiota, cevada, radícula, malte. ABSTRACT: QUEIROZ, B. D.; KELLER, K. M.; KELLER, L. A. M.; RIBEIRO, J. M. M.; ROSA, C. A. da R. Evaluation of vegetable substrates from animal feed as support for ochratoxin A production by species of genus Aspergillus Fr.: Fr. Revista Universidade Rural: Série Ciências da Vida, Seropédica, RJ: EDUR, v. 25, n.1, p , jan.-jun., The aims of this work were the isolation and identification of the contaminant mycobiota in different vegetal substrates: barley, malt and radicule from a malt factory of São Paulo state. In this study, samples of primary industrial rejects were analyzed, verifying its potential capacity of toxigenic contamination and the risk of dissemination of mycotoxins in animal feed. Neither the radicule, malt or barley samples had total counts greater than the maximum limit permitted (10 5 CFU.g -1 ). Genus Aspergillus and its teleomorphs were the most prevalent (48.00%), followed by genus Cladosporium (34.00%) and Penicillium (6.80%), beside others. Key Words: mycotoxins, mycobiota, barley, barley rootlets, malt. INTRODUÇÃO Os fungos juntamente com outros microrganismos, têm grande relevância na decomposição da matéria orgânica na biosf era através de um conjunto de enzimas, sendo de suma importância na continuidade do ciclo vital. Entretanto, a deterioração que sofrem os alimentos, em virtude de seu crescimento e produção de micotoxinas, representa grande preocupação à indústria (BELÉM, 1994). O crescimento fúngico é dependente de uma série de fatores, tais como: atividade de água (Aa), temperatura, substrato e interações microbianas. A contaminação fúngica pode ocasionar redução na capacidade de germinação de grãos, redução no valor nutricional, além de poder produzir micotoxinas. Estas são substâncias tóxicas para o homem e os animais, produzidas durante o metabolismo secundário f úngico. Geralmente, as micotoxinas são encontradas em baixas concentrações e os índices muito elevados

2 QUEIROZ, B. D.; et al. 65 são raros, predominando as intoxicações crônicas. Estas, entretanto, por serem mais numerosas, determinam incalculáveis prejuízos à saúde animal e, conseqüentemente, à economia agropecuária (CRUZ, 1996). Dentre os gêneros capazes de produzir micotoxinas destacam-se o Aspergillus, Penicillium e Fusarium (PITT & HOCKING, 1997). As espécies de Aspergillus são as mais comuns nos trópicos (PITT & HOCKING, 1997; SANSON, 2000), onde a maioria é considerada saprófita e comumente encontrada no ar, na água, no solo, em vegetais em decomposição, em substratos v egetais para alimentação animal. Entretanto um grande número destas é capaz de produzir grande variedade de metabólitos secundários a partir de diversos tipos de substratos. As condições ambientais, principalmente a ampla faixa de temperatura, resulta em extensa relação de substratos vegetais e localizações geográficas em que se tem detectado a ocratoxina A (), produzida por uma variedade de espécies de Aspergillus e Penicillium. Assim, o A. ochraceus é considerado como a principal espécie produtora em climas tropicais úmidos (PITT & HOCKING, 1997; MANTLE & CHOW, 2000; ROSA, 2002). Para que se faça um monitoramento da contaminação dos alimentos por esta toxina é necessário dispor de padrão. A aquisição deste padrão tornou-se ainda mais difícil com a crise mundial e possíveis guerras biológicas, tornando necessária a sua produção. Uma adequada produção, realizada por laboratórios de referência, como este de nossa Univ ersidade, permitiria a continuidade dos trabalhos de controle de qualidade de matérias-primas, como também dos projetos de pesquisa. Estes são essenciais para o refinamento de metodologias analíticas, visando mais acurácia e sensibilidade na detecção e quantif icação das micotoxinas, possibilitando a implementação de medidas de controle mais eficazes. Por outro lado, a avaliação de substratos vegetais e produtos derivados de indústrias de transformação, quanto a sua capacidade de suportar o crescimento de cepas de espécies ocratoxígenas de Aspergillus também será de relevância. Estaremos avaliando os produtos de rejeito industrial primário e verificando a sua capacidade potencial de contaminação f úngica ocratoxígena e o risco de veiculação de suas toxinas produzidas à ração animal. Observa-se que, ao analisarmos a literatura nacional, não há estudos sobre a incidência da micobiota nestes grãos e seus produtos derivados produzidos em nosso país ou mesmo importados. MATERIAL E MÉTODOS As análises micotoxicológicas foram realizadas nos laboratórios do Núcleo de Pesquisas Micológicas e Micotoxicológicas do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, situado no Prédio do PSA, Conv ênio UFRRJ/Embrapa, Seropédica, RJ. Amostras de cevada, malte e radícula foram fornecidas por uma Malteria do Estado de São Paulo que mantêm convênio com o NPMM/UFRRJ. A enumeração quantitativa dos propágulos de fungos filamentosos foi realizada segundo metodologia de diluição seriada em placas. Homogeneizou-se 10 gramas da amostra em 90mL de água peptonada a 0,1% estéril. A partir desta diluição inicial (10-1 ) prepararam-se diluições decimais seriadas até Inocularam-se alíquotas de 0,1mL de cada uma das diluições nos meios de cultivo, tais como: dichloran rose bengal chloranphenicol (DRBC), utilizado para contagem geral (KING et al., 1979, modificado por PITT & HOCKING, 1985); dichloran 18% glicerol agar (DG18), um meio seletivo para fungos xerofílicos (HOCKING & PITT, 1980); dichloran chloranphenicol peptone agar (DCPA), para isolamento de espécies do gênero Rev. Univ. Rural, Sér. Ci. Vida. Seropédica, RJ, EDUR, v. 25, n. 1, Jan.-Jul., p , 2005.

3 66 Avaliação de substratos... Fusarium. As placas foram incubadas a 25ºC por cinco a sete dias. Todas as placas f oram observ adas diariamente, selecionando-se para a enumeração as placas contendo em torno de 10 a 100 UFC (DALCERO et al., 1997). A identificação das cepas fúngicas pertencentes ao gênero Aspergillus seguiram as chav es de identificação descritas por KLICH & PITT, e baseadas no cultivo em três meios de culturas básicos: malt extract agar (MEA), Czapek yeast extract agar (CYA) e Czapek yeast extract agar with 20% sucrose (CY20S). Preparou-se uma suspensão de conídios a partir de cada cepa, em 0,5 ml de meio constituído de 0,2% de agar-agar e 0,05% de Tween 80 TM, distribuído em tubos de hemólise e prev iamente esterilizados por autoclavação a 120ºC por 15 minutos (PITT & HOCKING, 1997). A seguir, introduziu-se uma alça de platina, em forma de agulha, na suspensão de conídios inoculando-a nos meios de cultivo. Cada cepa foi inoculada em três pontos eqüidistantes em placas contendo os meios de cult iv o. Estas f oram incubadas por sete dias a 25º C. Após o período de sete dias de incubação, observ ou-se as característi cas macroscópicas das colônias (diâmetro, textura, forma, aspecto da superfície e do reverso, pigmentação dos conídios e pigmento solúvel, produção e cor de exsudato) e determinaram-se as característi cas de suas estruturas micromorfológicas, visando a identificação das espécies. As cepas fúngicas que foram utilizadas são pertencentes ao gênero Aspergillus Fr.: Fr. das seções Circundati e Nigri, isto é A. ochraceus (NRRL 3174 e NPMM 1123), A. carbonarius (CMDB 0437), A. niger var niger (CMDB 0433). Todas as cepas utilizadas pertencem às col eções do NPMM/UF RRJ e do Departamento de Biologia (CMDB) do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro - RJ. As cepas foram inoculadas em meio agar leite de coco (CAM), vertido em placas de Petri de 90mm de diâmetro e incubadas a 28º C por sete dias. As metodologias utilizadas para estimar a concentração de foram as descritas por BRAGULAT et al. (1998 e 2001). Os substratos vegetais foram acondicionados (50 gramas cada) em frascos Erlenmeyer com capacidade para 500mL e, posteriormente foram submetidos a autoclavação a 121º C por 15 min. Quando a microbiota inicial foi eliminada. A atividade de água (Aa) do substrato foi ajustada para 0,82, 0,91 e 0,95 com água estéril e a temperatura de incubação usada foi de 25 e 30ºC, por três períodos (sete, catorze e vinte e um dias) em BODs. As amostras inoculadas com as cepas padrão, após passarem pelo período de incubação, foram analisadas através da cromatografia em camada delgada de sílica gel 60 G (Merck) através da metodologia descrita por SOARES & AMAYA (1989). Amostras suspeitas foram confirmadas e quantificadas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de acordo com a metodologia descrita por SCUDAMORE et al. (1998). RESULTADOS E DISCUSSÃO A avaliação do perfil toxígeno das cepas de referência em ágar coco (CAM) mostrou que o A. ochraceus e o A. niger produziram, enquanto o A. carbonarius (UFPE 1546) não se mostrou toxígeno (Tabela 1). Tabela 1. Teste de fluorescência em meio ágar coco e confirmação da produção de toxina pelas Fungos Fluorescência Toxina/ CCD A. carbonarius - - A. niger + (esverdeada) A. ochraceus + (esverdeada) cepas de referência por cromatografia em camada delgada (CCD). + positiva; - negativa ou não detectada. Os resultados de perfil toxígeno foram obtidos por fluorescência em CAM e por CCD. A necessidade de confirmação da

4 QUEIROZ, B. D.; et al. 67 toxina produzida no meio CAM, através de análises cromatográficas complementares foi relatada por GATTI et al. (2003), que verificaram que a ausência de fluorescência em CAM não indicava um caráter não toxígeno. O único fungo, neste estudo, a não apresentar fluorescência em CAM foi o A. carbonarius, a partir do qual também não foi detectada a toxina através da CCD. Desta forma, o A. carbonarius foi excluído do experimento de avaliação do substrato radícula para a produção das micotoxinas testadas. Entre o período de outubro de 2003 e junho de 2004, foram feitas pesquisas de micotoxinas na radícula. A partir de um total de 30 amostras analisadas apenas uma apresentou concentração traço de ocratoxina A (>0,7 ng.g -1 ), nas outras restantes não foram detectadas micotoxinas. Estas amostras vieram diretamente da malteria e encontravam-se armazenadas com baixa atividade de água (ao redor de 0,53). A grande importância e preocupação com este substrato é o período de armazenamento, ainda mais quando realizado nos estabelecimentos destinados à criação de bovinos e suínos, os quais podem não apresentar um controle adequado. No estudo para avaliar a capacidade da radícula como substrato para a produção de micotoxinas, foi constatada sua condição para a síntese de pela cepa de A. ochraceus (NRRL 3174). Os valores médios de produção encontram-se na Tabela 2. Tabela 2. Produção média de em radícula com diferentes atividades de água, inoculada com espécies de Aspergillus e incubada a 25 e 30ºC, após três períodos de incubação (7, 14 e 21 dias). ND. Não detectada Espécies de Aspergillus A. ochraceus (NRRL 3174) A. niger (ATCC 1004) Espécies de Aspergillus A. ochraceus (NRRL 3174) A. niger (ATCC 1004) Concentração da toxina Aa (ng toxina / g de radícula) 25ºC 7 dias 14 dias 21 dias 0, , , ,37 0, , , ,64 0, , , ,42 0,82 ND ND ND 0,91 ND ND ND 0,95 ND ND ND Concentração da toxina (ng toxina Aa / g de radícula) 30ºC 7 dias 14 dias 21 dias 0,82 683, , ,36 0, , , ,56 0, , , ,66 0,82 ND ND ND 0,91 ND ND ND 0,95 ND ND ND A produção de pela cepa de A. ochraceus foi avaliada sob diferentes condições de Aa e temperatura. Para esta toxina, a Aa inicial de 0,82 mostrou-se melhor para a produção, em ambas as temperaturas de incubação (25 e 30ºC). As maiores concentrações foram atingidas aos 14 dias após inoculação. As temperaturas de incubação utilizadas neste trabalho permitiram a produção de em concentrações de até quase ng.g -1 de radícula, ou seja, quase 30 ppm (partes Rev. Univ. Rural, Sér. Ci. Vida. Seropédica, RJ, EDUR, v. 25, n. 1, Jan.-Jul., p , 2005.

5 68 Avaliação de substratos... por milhão). O A. niger (ATCC 1004) não produziu na radícula, durante todo o período do estudo, apesar de ter apresentado excelente conidiogênese (crescimento) nas diferentes condições de Aa. O A. niger não sintetizou a toxina na radícula embora a tenha produzido no meio ágar coco. A contaminação dos alimentos por fungos toxígenos é preocupante, de tal forma que, medidas de controles em alimentos e rações animais tem sido implementadas. O fato de ter ocorrido a produção das micotoxinas na radícula em concentrações de até ppm, justifica a grande preocupação de que possa ocorrer a contaminação de todo um lote, quando for realizada a mistura do material. Os cuidados com a armazenagem dos alimentos destinados aos animais devem ser rigorosos mesmo para substratos inicialmente secos, tais como a radícula, uma vez que são necessários para se evitar surtos de micotoxicoses. Neste trabalho realizou-se a elevação da Aa inicial, buscando-se assim exemplificar de forma experimental algum momento do transporte ou armazenamento da radícula onde ocorra uma elevação da umidade, podendo esta favorecer a produção de micotoxinas, comprometendo a qualidade do alimento. O conhecimento da micobiota toma grande importância uma vez que a adição da radícula à alimentação animal passa a servir como inóculo. Deu-se início a um levantamento da micobiota contaminante da radícula, bem como de outros substratos como a cevada e o malte. Verificou-se que a radícula, a cevada e o malte forneceram condições para o desenvolvimento fúngico e a produção de aflatoxinas e sob condições de atividade de água (Aa) e temperatura controladas. Durante o período compreendido entre julho de 2003 e março de 2004, foram analisadas 15 das amostras de substratos vegetais quanto a sua micoflora. A carga fúngica contaminante, expressa através de unidades formadoras de colônia por grama (UFC/g) de amostra analisada está apresentada na tabela 3. Tabela 3. Média dos valores da contagem total dos fungos filamentosos isolados de amostras de substratos vegetais. Substratos vegetais DRBC DG18 DCPA UFC g -1 UFC g -1 UFC g -1 Cevada 8.9 x x x 10 2 Malte 2.6 x x x 10 2 Radícula 1.4 x x x 10 4 Os resultados mostraram as faixas de UFC g -1 e as suas respectivas médias obtidas nos meios DRBC, DG18 e DCPA a partir das amostras de substratos. Os resultados obtidos indicaram que as maiores cargas fúngicas foram obtidas a partir de amostras de radícula quando semeadas em meio DCPA, mantendo elevados níveis também nos meios DG18 e DRBC, obtendo-se UFCs da ordem de 10 4 neste substrato. Estes valores não ultrapassaram aqueles estabelecidos como limítrofes, isto é, da ordem de 10 5 UFC g -1. Nos demais substratos (cevada e malte) examinados, observaram-se que os valores obtidos para a carga fúngica contaminante também estiveram dentro dos limites tolerados. Observ ou-se uma maior ocorrência de fungos filamentosos, sendo isoladas 44 cepas pertencentes a quatro gêneros f úngicos, além da ordem Mucorales. (Tabela 4). Tabela 4. Fungos filamentosos isolados de amostras de substratos vegetais (radícula,cevada e malte) destinadas à alimentação animal. Gênero fúngico Número de isolados Ocorrência (%) Aspergillus spp. e teleomorfos 21 48,0 Penicillium spp. 3 6,8 Fusarium spp. 3 6,8 Cladosporium spp ,0 Mucorales 2 4,4 Total ,0

6 QUEIROZ, B. D.; et al. 69 As espécies prev alentes são pertencentes aos gêneros Aspergillus e seus teleomorfos (48,00%), seguido por Cladosporium (34,00%), e por Penicillium (6,80%), dentre outros. Vinte e uma cepas do gênero Aspergillus foram identificadas em nível de espécie, e foram predominantes as pertencentes a seção Flavi (33,3%). O Aspergillus flavus foi a espécie de maior prevalência (28,5%), entretanto outras espécies toxígenas importantes, como o Aspergillus ochraceus, e patogênicas, como o Aspergillus fumigatus foram isoladas em menor incidência (Tabela 5). Tabela 5. Espécies do gênero Aspergillus isoladas de amostras de substratos vegetais (radícula, cevada e malte) destinadas à alimentação animal. Seção Número de isolados Prevalência (%) Seção Fumigati A. fumigatus 01 4,8 Seção Versicolores A. versicolor 03 14,3 Seção Aspergillus E. chevalieri 03 14,3 E. amstelodami 02 9,5 Seção Flavi A. flavus 06 28,5 A. tamarii 01 4,8 Seção Nigri A. niger 03 14,3 Seção Circundati A. ochraceus 02 9,5 Total ,0 A presença de espécies aflatoxígenas e ochratoxígenas evidencia a necessidade de serem aprofundadas as pesquisas, e ainda do estabelecimento da capacidade toxígena das cepas isoladas. CONCLUSÕES Neste trabalho ev idenciou-se a prev alência de espécies de f ungos toxígenos em cevada e seus produtos derivados. A identificação e a determinação da micobiota contaminante e de suas características fisiológicas, nutricionais e toxígenas rev estem-se de grande importância para o estabelecimento e a análise do risco de exposição do homem e dos animais de criação à estes fungos, e suas potenciais micotoxinas. AGRADECIMENTOS Às doutoras Ana Maria Dalcero e Carina Magnoli, do Deptº. de Microbiologia da Universidade Federal de Rio Cuarto - Rio Cuarto, Córdoba Argentina, que cooperaram na identificação de cepas isoladas do gênero Fusarium spp., bem como cepas de outros gêneros e espécies que não puderam ser identificadas em nossa Instituição. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BELÉM, P.A.D. Introdução ao estudo das micotoxinas de interesse em Medicina Veterinária. Viçosa: Imprensa Universitária - UFV,1994, 18p. BRAGULAT, M.R.; ABARCA, M.L.; ACCENSI, F. & CABAÑEZ, F.J. New screening method for ochratoxicogenic molds in pure cultures. Revue. Med. Vet., v. 149, f. 6, p. 515, BRAGULAT, M.R.; ABARCA, M.L. & CABANES, F.J. An easy screening method for fungi producing ochratoxin A in pure culture. Intern. Jour of Food Microbiology, v. 71, p , CRUZ, L.C.H. Micotoxinas são tão importantes. In: Micotoxinas: Perspectiva Latinoamericana. Rio de Janeiro: Editora Universidade Rural, Rev. Univ. Rural, Sér. Ci. Vida. Seropédica, RJ, EDUR, v. 25, n. 1, Jan.-Jul., p , 2005.

7 70 Avaliação de substratos... DALCERO, A.; MAGNOLI, C.; CHIACCHIERA, S.; PALACIOS, G. & REYNOSO, M. Mycoflora and incidence of af latoxin B1, zearalenone and deoxynivalenol in poultry feeds in Argentina. Mycopathology, v. 137, p , GATTI, M.J.A.; ROSA, C.A.R.; MAGNOLI, C.; FRAGA, M.E.; DALCERO, A.M. Mycological aspects and identification of potential af latoxins and ochratoxins producers in harvested Brazilian black pepper. Food Additives and Contaminants, v. 20, f. 12, p , HOCKING, A.D & PITT, J.I. Dichloran- Glycerol media for enumeration xerophilic fungi from low moisture foods. Appl. Environm. Microbiology, v. 39, p , KLICH, M.A.; PITT, J.I. A laboratory guide to the common Aspergillus species and their teleomorphs. CSIRO - Division of Food Processing, Australia, 116p. SAMSON, R.A. List of names of Trichocomaceae published between 1992 and In: Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification. Amsterdam: Harwood Academic Publishers, p , SCUDAMORE, K.A. & MACDONALD, S.J. A collaborative study of an HPLC method for determination of ochratoxin A In: Wheat using immunoafinity colunm clean-up. Food Additives and Contaminants, v. 15, f. 4, p , SOARES, L.M.V. & RODRIGUES-AMAYA, D. Survey of Aflatoxins, Ochratoxin A, Zearalenone, and Sterigmatocystin in some Braziliam Foods by using Multi-toxin Thin- Layer Chromatographic Method. J. Assoc. Off. Anal. Qhem., v. 72, f. 1, p , MANTLE, P.M. & CHOW, A.M. Ochratoxin formation in Aspergillus ochraceus with particular reference to spoilage of coffee. International Jour Food Microbiology, v. 56, p , PITT, J.I & HOCKING, A.D. Fungi and Food Spoilage. First edition. Sidney: Academic Press, PITT, J.I & HOCKING, A.D. Fungi and Food Spoilage. Second edition. London: Black Academic & Professional - Chapman & Hall, 1997, 593p. ROSA, C.A.R. Micobiota toxígena e ocratoxinas em matérias primas vegetais e rações destinadas à alimentação animal. Seropédica, RJ, p. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.