Avaliação biofarmacêutica do diazepam visando subsidiar discussão sobre bioisenção

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Área de concentração: Fármacos e Medicamentos Sub-área: Análise e Controle de Medicamentos Universidade Federal de Ouro Preto Lorena Barbosa Arrunátegui Avaliação biofarmacêutica do diazepam visando subsidiar discussão sobre bioisenção Ouro Preto 2013

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Área de concentração: Fármacos e Medicamentos Sub-área: Análise e Controle de Medicamentos Lorena Barbosa Arrunátegui Avaliação biofarmacêutica do diazepam visando subsidiar discussão sobre bioisenção Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Ouro Preto para obtenção do grau de Mestre Orientadora: Profa. Dra. Jacqueline de Souza Co-orientadora: Profa. Dra. Neila Márcia Silva Barcellos Ouro Preto 2013

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5 Dedico este trabalho... Aos meus pais, que me deram apoio e ensinaram o valor do conhecimento Ao meu querido Lucas que me ajudou a percorrer o caminho Aos familiares que de alguma forma estiveram ao meu lado

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por ter me ajudado a chegar até aqui. Aos meus pais, familiares e ao meu querido Lucas pelo carinho, incentivo e companheirismo. Ao Programa de Ciências Farmacêuticas (CiPharma) pela oportunidade. À professora Dra. Jacqueline de Souza, minha orientadora, pela oportunidade, amizade, e paciência. Ao meu lado eu tive não só uma madrinha nas Ciências Farmacêuticas, mas também uma amiga. À professora Neila Márcia Silva Barcellos, minha co-orientadora, pelas contribuições no trabalho e experiências sugeridas que colaboraram para meu direcionamento e formação profissional. À aluna de iniciação científica Gabriella Gonzaga Dutra que, além de ter sido uma grande amiga, contribuiu ativamente para a obtenção dos resultados, com muita competência. Aos professores Carmen Aparecida de Paula, Dênia Antunes Saúde Guimarães, Gerson Antônio Pianetti, José Mário Barrichelo, Márcio Galvão, Mônica Cristina Teixeira e Orlando David Henrique dos Santos, que de alguma forma colaboraram. À Patrícia Capelari, Patrícia Monteiro, Thaïs Certo, Pollyana Rodrigues e Karime Bellavinha, que além dos bons momentos, ofereceram contribuições para meu conhecimento técnicocientífico e aos demais amigos e funcionários do CiPharma que fizeram parte desta trajetória. Aos mestres que, ao longo da minha vida escolar e acadêmica, foram uma inspiração para o aprimoramento do conhecimento. À Fundação Ezequiel Dias na pessoa da Farmacêutica Amália pela doação de matéria prima utilizada nos experimentos. À FAPEMIG, ANVISA/MS, CAPES e UFOP pelo apoio financeiro

7 RESUMO ARRUNÁTEGUI, L.B. Avaliação biofarmacêutica do diazepam visando subsidiar discussão sobre bioisenção p. Dissertação (Mestrado). Escola de Farmácia. Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, A Biofarmácia é a ciência que estuda como as características físico-químicas de fármacos e formas farmacêuticas influenciam nos efeitos dos medicamentos. A bioisenção é um assunto inserido nessa ciência e pode ser entendida como a isenção ou substituição do estudo in vivo de bioequivalência por testes in vitro, quando determinados medicamentos atendem a parâmetros pré-estabelecidos em legislações e/ou regulamentações. Para que seja possível bioisentar um fármaco veiculado em formas farmacêuticas sólidas orais de liberação imediata (FFSOLI) é necessário pesquisar o comportamento do mesmo em relação à solubilidade, permeabilidade intestinal e dissolução a partir da FFSOLI. Uma ferramenta muito utilizada para as discussões de bioisenção é o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) que correlaciona a velocidade e a extensão da absorção de fármacos, biodisponibilidade, contidos em FFSOLI, às características de solubilidade e permeabilidade intestinal. Dados controversos sobre a solubilidade do diazepam são encontrados na literatura, assim, a elucidação da classificação biofarmacêutica deste fármaco foi o objetivo central deste trabalho. Um método analítico para a quantificação do diazepam foi desenvolvido e validado para possibilitar a realização de estudos de solubilidade e dissolução. O método por cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) apresentou-se adequado para o objetivo, sendo linear, preciso e exato na faixa de concentração aplicada aos referidos estudos. Visando inferir sobre a permeabilidade intestinal do composto, foram avaliados dados na literatura os quais sugerem alta permeabilidade do diazepam. Os estudos de solubilidade apontaram o diazepam como um fármaco de alta solubilidade. Em contrapartida, o estudo de dissolução esclareceu que os três produtos avaliados apresentam uma dissolução insatisfatória em relação aos parâmetros de dissolução exigidos em bioisenção. Assim, embora o diazepam tenha sido classificado como pertencente à classe I no SCB, quanto à bioisenção, é necessário avaliar o risco da recomendação de acordo com a velocidade de dissolução da forma farmacêutica, uma vez que nos lotes avaliados não foram cumpridos os parâmetros recomendados. Palavras-chave: diazepam, bioisenção, SCB, solubilidade, dissolução, permeabilidade.

8 ABSTRACT ARRUNÁTEGUI, L.B. Biopharmaceutical evaluation of diazepam aiming to support biowaiver discussion p. [Master s Degree Dissertation]. School of Pharmacy. Federal University of Ouro Preto, Ouro Preto, Biopharmaceutics is the science that studies how physical and chemical characteristics of drugs and dosage forms influence the effects of drugs. The biowaiver is a subject inserted in this science and can be understood as the exemption or replacement of in vivo bioequivalence tests for in vitro evaluation when certain drugs meet pre-established parameters in legislation. To be possible to biowaive one drug employed in immediate release solid oral dosage forms is necessary to investigate the behavior of the same with respect to solubility and intestinal permeability of the drug and dissolution of the tablets. A very useful tool for the discussion of biowaiver is the Biopharmaceutics Classification System (BCS) that correlates the rate and extent of absorption of drug, bioavailability, contained in the oral solid dosage forms with solubility characteristics and intestinal permeability. There are controversial results in the literature about its solubility, so the elucidation of the biopharmaceutical classification of diazepam was part of that work. An analytical method for the quantification of diazepam was developed and validated to enable studies of solubility and dissolution. A High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) method showed to be adequate for the purpose, being linear, precise and accurate in a concentration range suitable for such studies. In order to infer the intestinal permeability of the compound were evaluated data in the literature which suggest a high permeability of diazepam. The solubility studies showed diazepam as a high solubility drug. In contrast, the dissolution study stated that all three evaluated products have a poor dissolution compared with the parameters required for biowaiver. Therefore, diazepam drug was classified as belonging to class I on the BCS. Regarding biowaiver, is necessary to evaluate the risk of recommendation according to the dissolution rate of the dosage form, since the products evaluated have not met the recommended parameters. Keywords: diazepam, biowaiver, BSC, solubility, dissolution, permeability

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Estrutura molecular do diazepam Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Diazepam - suas principais vias metabólicas e produtos ativos com respectivos tempos de meia-vida de eliminação Gráfico de absorbância (Abs.) versus concentração do diazepam: 0,11 a 13,0 µg/ml nos meios ph 1,2 (a), ph 4,5 (b) e ph 6,8 (c), obtidos por leitura espectrofotométrica a 284 nm Gráfico de absorbância (Abs.) versus concentração do diazepam: 13,0 a 150,0 µg/ml em meio ph 1,2 (a), 13,0 a 80 µg/ml em meio ph 4,5 (b) e 13,0 a 50,0 µg/ml em meio ph 6,8 (c), obtidos por leitura espectrofotométrica a 284 nm Gráficos de Absorbância em função do tempo para amostras contendo diazepam em tampões: ph 1,2 comprimentos de onda 240 nm (a) e 285 nm (b); ph 4,5 (c) e ph 6,8 (d) em comprimento de onda 230 nm com e sem exposição à luz Cromatograma do fármaco diazepam na concentração de 15,0 µg/ml em (a) suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2, (b) tampão ph 4,5, (c) tampão ph 6,8, obtido por meio de detector DAD em 254nm Comparação dos gráficos das amostras de 0 e 24 horas e 0 e 48 horas apresentando a área versus concentração do diazepam na faixa de 0,5 a 170,0 µg/ml nos meios ph 1,2, (a) e (b), ph 4,5 (c) e (d) e ph 6,8 (e) e (f), obtidos por leitura em detector DAD em 254 nm Cromatograma da mistura de excipientes comumente utilizados nas unidades de diazepam, diluídos em a) suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2; b) meio acetato ph 4,5; c) meio fosfato ph 6,8, pesquisado em 254 nm em detector DAD Cromatogramas das amostras elaboradas com solução estoque submetida a diferentes condições de estresse, diluídas em meio ph 1,2. a) SE submetida à presença de luz; b) calor a 45 C; c) presença de ácido clorídrico 0,2M; d) presença de hidróxido de sódio 0,2 M; e) amostra de SE recém preparada, sem condição de estresse Curva analítica obtida por meio da média de três determinações de soluções na faixa de concentração de 0,3 a 15,0 µg/ml de diazepam em meio fluido gástrico simulado sem enzimas (a); 0,3 a 15,0 µg/ml em meio acetato ph 4,5 (b) e 0,3 a 30,0 µg/ml em meio fosfato ph 6,8 (c); quantificadas por CLAE-DAD em 254nm... 72

10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Gráficos de resíduos obtidos por meio dos resultados da linearidade em meios fluido gástrico simulado sem enzimas (a); acetato ph 4,5 (b) e fosfato ph 6,8 (c) Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades do produto referência (a), genérico (b) e similar (c) em cada um dos meios, suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2, tampão acetato ph 4,5 e tampão fosfato ph 6, Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em meio suco gástrico simulado sem enzimas ph 1, Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em meio tampão acetato ph 4, Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em meio tampão fosfato ph 6, Gráficos apresentando estatística descritiva (Box Plot) para dissolução dos produtos em cada um dos meios: suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 (a), tampão acetato ph 4,5 (b) e tampão fosfato ph 6, Média da solubilidade do fármaco diazepam (n=3, em cada meio) nos meios ph 1,2, ph 4,5 e ph 6, Gráficos de concentração versus tempo obtido no estudo de solubilidade de diazepam em suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 (a), acetato ph 4,5 (b) e fosfato ph 6,8 (c) e a comparação entre o perfil de solubilidade e o limite entre alta e baixa solubilidade em cada um dos meios... 92

11 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Descrição do modo de preparo dos meios biorrelevantes suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2; tampão acetato 4,5 e tampão fosfato 6,8 (UNITED, 2010) Quadro 2 Condições analíticas relativas ao experimento de especificidade Quadro 3 Quadro 4 Excipientes presentes nos produtos A (referência), B (genérico) e C (similar) Resultados dos medicamentos referência (A), genérico (B) e similar(c) após ensaios farmacopéicos... 80

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Principais requisitos exigidos pra obtenção da bioisenção baseada no SCB Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Solubilidade do diazepam encontrada na literatura em diferentes meios mantidos a temperatura de 37 C Dados da literatura sobre a permeabilidade do diazepam, obtidos por diferentes autores e métodos com valores limites de alta permeabilidade distintos Excipientes presentes em FFSOLI contendo diazepam (10mg) no Brasil e as quantidades mínimas e máximas dos excipientes presentes em forma farmacêutica sólida oral com Autorização de Comercialização (AC) nos EUA a Intervalos de concentração de diazepam em µg/ml visando avaliar a linearidade do método espectrofotométrico para sua quantificação nos tampões ph 1,2; 4,5 e 6, Tabela 6 Concentrações estabelecidas para triagem do intervalo adequado Tabela 7 Volumes de solução estoque (SE), 1000 µg/ml, diluídos em tampão ph 1,2; 4,5 e 6,8, para a obtenção das concentrações da curva analítica Tabela 8 Massa de fármaco adicionada a um volume de 50 ml de cada meio para realização do teste de solubilidade Tabela 9 Dados de diluição das amostras obtidas durante o estudo de solubilidade Tabela 10 Concentrações estabelecidas para o intervalo validado Tabela 11 Equação da reta, coeficiente de determinação (R 2 ) e coeficiente de correlação (r), para as retas obtidas na determinação da linearidade do método nos três meios avaliados Tabela 12 Valores de concentração teórica (CT), concentração média experimental (CME) e desvio padrão relativo (DPR), referentes à determinação da repetibilidade do método para a quantificação do diazepam nos três meios Tabela 13 Valores de concentração teórica (CT), concentração média experimental (CME) e desvio padrão relativo (DPR), referentes à determinação em três dias, da precisão intermediária do método, para a quantificação do diazepam nos três meios Tabela 14 Valores de concentração teórica (CT), concentração média experimental (CME) e exatidão, expressa em porcentagem, referentes à exatidão do método para a quantificação do diazepam nos três meios, utilizando triplicata em três concentrações... 76

13 Tabela 15 Resultado do perfil de dissolução em suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2: média da porcentagem dissolvida de 12 unidades de cada um dos três medicamentos avaliados (Referência, Genérico e Similar), o desvio padrão (DP) e a eficiência de dissolução (ED%) Tabela 16 Resultado do perfil de dissolução em meio acetato ph 4,5: média da porcentagem dissolvida de 12 unidades de cada um dos três medicamentos avaliados (Referência, Genérico e Similar), o desvio padrão (DP) e a eficiência de dissolução (ED%) Tabela 17 Resultado do perfil de dissolução em meio fosfato ph 6,8: média da porcentagem dissolvida de 12 unidades de cada um dos três medicamentos avaliados (Referência, Genérico e Similar), o desvio padrão (DP) e a eficiência de dissolução (ED%) Tabela 18 Eficiência de dissolução (ED%) de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em cada um dos meios: ph1,2, ph 4,5 e ph 6, Tabela 19 Valores de concentração (µg/ml) obtidos, em triplicata, para o fármaco diazepam, em diferentes tempos (t) de coleta em horas (h), no meio fluido gástrico simulado sem adição de enzima ph 1, Tabela 20 Valores de concentração (µg/ml) obtidos, em triplicata, para o fármaco diazepam, em diferentes tempos (t) de coleta em horas (h), no meio acetato ph 4, Tabela 21 Valores de concentração (µg/ml) obtidos, em triplicata, para o fármaco diazepam, em diferentes tempos (t) de coleta em horas (h), no meio fosfato ph 6,

14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Abs. AC ANOVA ANVISA ASC BDDCS CONCIFOP BZDs Caco-2 CIVIV CLAE CLogP C max CMD CME CT CV DAD DCB DCI DP DPR ED EMA/EMEA FA FaSSIF FaSSIFc FDA FeSSIF FeSSIFc FFSOLI absorbância autorização de Comercialização análise de variância Agência Nacional de Vigilância Sanitária área Sob a Curva de concentração plasmática em função do tempo Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System (Sistema de Classificação Biofarmacêutica Baseado na Disposição dos Farmácos) Congresso de Ciências Farmacêuticas de Ouro Preto benzodiazepínicos células de adenocarcinoma de cólon humano correlação in vivo-in vitro cromatografia a Líquido de Alta Eficiência coeficiente de partição óleo/água calculado concentração plasmática máxima do fármaco concentração média determinada concentração média experimental concentração teórica coeficiente de variação detector de arranjo de diodos denominação comum brasileira denominação comum internacional desvio padrão desvio padrão relativo Eficiência de Dissolução European Medicines Agency (Agência Europeia de Medicamentos) fração absorvida suco intestinal em jejum simulado suco intestinal em jejum simulado com adição de taurocolato Food and Drug Administration suco intestinal em estado pós-prandial simulado suco intestinal em estado pós-prandial simulado com adição de taurocolato Formas Farmacêuticas Sólidas Orais de Liberação Imediata

15 FIH FIP GABA HPLC IUPAC LogD LogP MDCK ND NQ OMS OPAS P-gp ph r R 2 RENAME rpm SCB SE SGFsp SIG SINPOSPq SQR t TGI suco intestinal humano International Pharmaceutical Federation (Federação Farmacêutica Internacional) ácido gama aminobutírico high pressure liquid chromatography International Union of Pure and Applied Chemistry coeficiente de partição óleo/tampão aquoso coeficiente de partição óleo/água Madin-Darbey Canine Kidney (cells) não declarado não quantificável Organização Mundial de Saúde Organização Pan-americana da Saúde glicoproteína P potencial hidrogeniônico coeficiente de correlação linear coeficiente de determinação Relação Nacional de Medicamentos Essenciais rotações por minuto Sistema de Classificação Biofarmacêutica solução estoque suco gastrintestinal simulado sem pepsina Special Interest Group (Grupo de Interesse Especial) V Simpósio Internacional de Pós-graduação e pesquisa Substância Química de Referência tempo trato gastrintestinal T máx. TMD TMR tempo que marca a obtenção de C max. tempo médio de dissolução tempo médio de residência TPGS D-α-tocoferol polietilenoglicol 1000 USP United States Pharmacopeia UV ultravioleta WHO World Health Organization

16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Biofarmácia Conceitos gerais Equivalência terapêutica Equivalência Farmacêutica Biodisponibilidade absoluta Biodisponibilidade relativa / Bioequivalência Medicamentos genéricos Sistema de Classificação Biofarmacêutica Bioisenção SCB e a pesquisa científica Dissolução Solubilidade Permeabilidade intestinal Diazepam Mecanismo de ação Características físico-químicas Farmacocinética Estudos de bioequivalência Estudos de dissolução Estudos de solubilidade Permeabilidade do diazepam Formas Farmacêuticas Sólidas Orais de Liberação Imediata (FFSOLI) contendo diazepam na dosagem de 10 mg OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos... 47

17 4 MATERIAIS E MÉTODOS Materiais Substância Química de Referência (SQR) Medicamentos Matéria - prima Solventes e reagentes Equipamentos Métodos Desenvolvimento de método para a quantificação de diazepam Método Espectrofotométrico Método Cromatográfico Validação de método cromatográfico para a quantificação de diazepam Especificidade e seletividade Linearidade Precisão Exatidão Avaliação dos medicamentos contendo diazepam e seus excipientes Ensaios Farmacopéicos Estudo de dissolução da forma farmacêutica comprimidos Estudo de solubilidade do fármaco diazepam Coleta de dados bibliográficos sobre a permeabilidade intestinal do diazepam RESULTADOS E DISCUSSÃO Desenvolvimento de método para a quantificação de diazepam Método Espectrofotométrico Método Cromatográfico Validação de método cromatográfico para a quantificação de diazepam Especificidade e seletividade Linearidade... 72

18 5.2.3 Precisão Exatidão Avaliação dos medicamentos contendo diazepam e seus excipientes Ensaios Farmacopéicos Estudo de dissolução da forma farmacêutica comprimidos Estudo de solubilidade do fármaco diazepam Discussão sobre a permeabilidade intestinal do diazepam CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE Apêndice A Apêndice B Apêndice C Resultado do teste de uniformidade de conteúdo do diazepam em dez unidades de cada produto Teor de diazepam nos produtos A, B e C, obtidos por CLAE, com detecção no DAD a 254 nm Determinação de peso de 20 unidades de cada produto (A, B e C), peso médio e desvios porcentuais em relação à média Apêndice D Resultado do teste de friabilidade (n=20, 20 rpm, t=5 minutos) Apêndice E Resultado do teste de dureza com resultados em Newtons (N) realizado com 10 unidades de cada produto ANEXOS Anexo A Resumo submetido ao Simpósio Internacional de Pós-graduação pesquisa (SINPOSPq) Anexo B Resumo de resultados parciais apresentado em IV CONCIFOP Anexo C Submissão do artigo científico intitulado Sistema de Classificação Biofarmacêutica: Importância e Inclusão nas Legislações sobre Bioisenção à Revista Panamericana de Salud Pública

19 17 1 INTRODUÇÃO A Biofarmácia é uma ciência que estuda como as características físico-químicas dos fármacos e formas farmacêuticas influenciam nos efeitos dos medicamentos. A atividade intrínseca do fármaco é fator fundamental para a ação terapêutica, porém não é o único, sendo o desenvolvimento farmacotécnico igualmente essencial (STORPIRTIS; GAI, 2009). A ocorrência de ineficácia clínica e toxicidade são preocupações das entidades regulatórias que ganharam amplo espaço no âmbito científico. Isto pode ser exemplificado pela importância dada aos estudos de segurança, eficácia e bioequivalência, e pela elaboração de guias, criação de grupos de estudo e entidades regulatórias pelos Estados Unidos desde 1938 e no Brasil, a partir de Estas ações deram origem à inclusão de estudos de bioequivalência e biodisponibilidade relativa às regulamentações para registro de genéricos e adequação de similares (STORPIRTIS; GAI, 2009). A Biofarmácia, como um segmento dos estudos farmacêuticos que estão intimamente ligados à segurança dos medicamentos, esteve presente neste processo e nos últimos anos colabora com as entidades regulatórias visando o desenvolvimento de normas de registro por meio dos seus parâmetros auxiliares (OLIVEIRA; MANZO, 2009). Paralelamente ao desenvolvimento dos guias que definem os critérios de aceitação de genéricos, similares e modificação de registros, se desenvolveram importantes conceitos, correlacionados e inseridos nas questões biofarmacêuticas, como o de Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) e o de bioisenção. O SCB consiste em um esquema científico elaborado por Amidon e colaboradores (1995), que divide os fármacos em quatro classes, de acordo com a sua solubilidade e permeabilidade. De acordo com o guia Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System da Agência Regulatória Americana (Food and Drug Administration FDA), o SCB considera dissolução, solubilidade e permeação intestinal como sendo três fatores que possibilitam a previsão da velocidade e extensão da absorção de Formas Farmacêuticas Sólidas Orais de Liberação Imediata (FFSOLI) (FDA, 2000). Logo, esses parâmetros podem prever a biodisponibilidade e os efeitos farmacológicos. A bioisenção pode ser definida como a isenção ou substituição de testes in vivo de bioequivalência por avaliação in vitro da equivalência farmacêutica, quando determinados medicamentos atendem a parâmetros pré-estabelecidos (BRASIL, 2003a). Bioisentar um fármaco acarreta em alguns benefícios, como se pode observar no ramo industrial, por meio da simplificação no registro de novos produtos, além dos benefícios para a sociedade em geral

20 18 ocasionando menor demanda por ensaios em voluntários humanos, menor número de análises laboratoriais e diminuição dos custos que seriam repassados à população (LENNERNÄS; ABRAHAMSSON, 2005; COOK et al., 2010). Apesar dessas várias vantagens, a avaliação dos riscos inerentes a bioisenção deve ser conduzida com responsabilidade, avaliando-se os resultados e relevância dos dados, visto ser um risco bioisentar um produto que não cumpre criteriosamente os requisitos. A correlação entre o Sistema de Classificação Biofarmacêutica e a bioisenção ocorre na medida em que o SCB agrupa os fármacos em classes que, devido às suas características, poderiam apresentar um perfil farmacocinético em avaliações in vivo comparáveis ao perfil in vitro e desta forma poderia indicar aqueles passíveis de bioisenção. A Organização Mundial de Saúde (OMS) divulga a listagem de medicamentos essenciais para cuidados básicos da saúde. O Grupo de Interesse Especial (SIG), que pertence à Federação Farmacêutica Internacional (FIP) criou a partir desta listagem, edição de 2010, uma relação de fármacos veiculados nas formas farmacêuticas sólidas orais, possíveis candidatos à bioisenção. A partir desta lista o SIG visa realizar estudos biofarmacêuticos ou compilar informações científicas que possibilitem a redação de monografias para os referidos fármacos visando subsidiar a decisões de bioisenção ou não de novos produtos. O fármaco diazepam foi sugerido por este grupo como fármaco que necessita de estudos que subsidiem decisão segura de bioisenção. No Brasil, de maneira semelhante à OMS, o Ministério da Saúde publica uma Relação Nacional de Medicamentos Essenciais (Rename), contendo os fármacos que são mais utilizados pela população do país para combater as doenças comuns, sendo fonte de informação para que os estados elaborem suas listas de assistência farmacêutica básica (BRASIL, 2010d). O fármaco diazepam, além de estar presente na lista de medicamentos essenciais da OMS e do SIG, se encontra incluído na Rename. O diazepam é um fármaco da classe dos benzodiazepínicos, amplamente consumido em todo o mundo, com importante aplicação terapêutica. É mais utilizado como ansiolítico, relaxante muscular e anticonvulsivante (CORREIA; ALVES, 2010), sendo também útil para controlar insônia e aliviar alucinações (RIBEIRO et al., 2010). Neste contexto buscou-se, com esse trabalho, a elucidação das características biofarmacêuticas do diazepam, bem como, avaliar os impactos que os excipientes comumente utilizados nos comprimidos podem ocasionar na sua absorção, com o objetivo de gerar informações que pudessem corroborar para uma decisão segura em se considerar novos medicamentos contendo este fármaco, como bioisentos.

21 REVISÃO DA LITERATURA 2.1- Biofarmácia A Biofarmácia ou Biofarmacotécnica é um ramo dos estudos farmacêuticos que investiga a influência dos constituintes da formulação nos efeitos farmacológicos. Os estudos biofarmacêuticos revelam que a qualidade de um medicamento está relacionada não só às características técnicas fundamentais como teor, pureza, potência e identidade, mas também aos excipientes, de forma quantitativa e qualitativa, e ao perfil de liberação de fármacos a partir da forma farmacêutica. As características biofarmacêuticas revelaram-se parâmetros de comprovação de equivalência farmacêutica, biodisponibilidade relativa, bioequivalência e consequentemente, equivalência terapêutica (STORPIRTIS; GAI, 2009). No caso de formas farmacêuticas sólidas orais, as características dos processos de desintegração, dissolução e liberação do fármaco geram impacto relevante sobre a absorção (LANGENBUCHER, 1978 apud PORTA et al., 2002). Um exemplo de como a formulação é diretamente relacionável à biodisponibilidade é o caso de intoxicação por fenitoína na Austrália, em Pacientes epiléticos apresentaram sintomas de intoxicação submetidos ao tratamento com cápsulas de 100 mg. Primeiramente, foi sugerido que houve erro da empresa quanto ao teor do medicamento, porém, após uma pesquisa acerca de outros fatores, foi verificado que a troca do excipiente sulfato de cálcio por lactose interferiu drasticamente no processo de biodisponibilidade (TYRER et al., 1970). Esse foi um caso enquadrado dentro dos estudos biofarmacêuticos devido à modificação na constituição da formulação alterar o efeito medicamentoso Conceitos gerais Equivalência terapêutica Dois medicamentos são equivalentes terapêuticos quando são equivalentes farmacêuticos e após a administração na mesma dose molar, seus efeitos são semelhantes quanto à segurança e eficácia (STORPIRTIS; GAI, 2009).

22 Equivalência farmacêutica Equivalentes farmacêuticos são medicamentos apresentando a mesma forma farmacêutica e dose, que são administrados pela mesma via e contém o mesmo fármaco, isto é, mesmo sal ou éster da mesma substância ativa, podendo ou não conter excipientes idênticos, desde que os mesmos estejam bem estabelecidos para a função. Os equivalentes farmacêuticos devem cumprir as especificações das monografias farmacopéicas e, na ausência dessas, devem cumprir as especificações de outros compêndios oficiais (MARQUES, 2009; BRASIL, 2010b) Biodisponibilidade absoluta A biodisponibilidade absoluta é o cálculo da comparação da área sob a curva da dose do fármaco após a administração extravascular de um medicamento e a administração do mesmo fármaco por via intravascular, que possui por definição, a biodisponibilidade igual a 100%. (BRASIL, 2002; ARAÚJO et al., 2010) Biodisponibilidade relativa / Bioequivalência Os estudos de biodisponibilidade relativa e bioequivalência atestam a segurança e qualidade terapêutica dos medicamentos (TAKAGI et al., 2006). O estudo para medicamentos administrados pela mesma via extravascular deve ser conduzido pela comparação de parâmetros farmacocinéticos entre os medicamentos referência e teste, visando verificar a semelhança da biodisponibilidade, ou seja, a intensidade e velocidade de absorção entre eles (BRASIL, 2002; FDA, 2003). Primeiramente, para os medicamentos serem considerados bioequivalentes, devem ser equivalentes farmacêuticos, ou seja, apresentarem a mesma forma farmacêutica a mesma quantidade e princípio ativo. Quando administrados na mesma dose molar e nas mesmas condições experimentais, não devem apresentar diferenças estatísticas significativas referentes à biodisponibilidade (BRASIL, 2002). Quando a biodisponibilidade relativa é igual a 1 significa que a biodisponibilidade da produto A é 100% igual ao produto B e implica que os dois medicamentos foram absorvidos

23 21 na mesma extensão. Porém não indica uma absorção sistêmica completa (ARAÚJO et al., 2010). Isso porque a biodisponibilidade relativa de 100 % é referente à comparação de dois produtos equivalentes farmacêuticos administrados pela mesma via extravascular obtendo a mesma extensão e intensidade de absorção, diferentemente do valor de 100% da biodisponibilidade absoluta que significa a semelhança estatística entre administração extravascular e intravascular do mesmo produto e, portanto, indicando absorção sistêmica completa do produto administrado por via extravascular. Os estudos de biodisponibilidade relativa e bioequivalência são úteis em casos de alteração de formulações e processos de fabricação e desenvolvimento de produtos genéricos (TAKAGI et al., 2006) Medicamentos genéricos A implantação dos medicamentos genéricos ocorreu no Brasil em 1999, inserida na política nacional de medicamentos, em um cenário de reorganização da saúde pública promovida pelo Ministério da Saúde e foi uma das primeiras iniciativas da ANVISA, criada nesse mesmo ano com o objetivo de proporcionar essa organização. Logo, poderiam ser geradas maiores garantias de qualidade e segurança para a população (STORPIRTIS; BUENO, 2008). Objetivou-se, com essa política, estimular a concorrência comercial, melhorar a qualidade dos medicamentos e facilitar o acesso da população ao tratamento medicamentoso devido à ampliação das opções de compra do paciente (BRASIL, 1999; STORPIRTIS; BUENO, 2008). A resposta foi positiva e apresentou benefícios notáveis para a população. Após três anos dos primeiro registros de genéricos, o preço do medicamento genérico se apresentava por volta de 40% menor que o preço do medicamento referência e houve redução de 37 a 65% dos custos para o tratamento de patologias comuns, como por exemplo, hipertensão, diabetes e colesterol alto (HASENCLAVER, 2004). Medicamentos genéricos devem ser bioequivalentes ao medicamento referência ou inovador, ou seja, devem ser equivalentes farmacêuticos e apresentar biodisponibilidade semelhante a estes, para que possam ser intercambiáveis, com comprovada eficácia e segurança. É designado pela DCB ou, na sua ausência, pela DCI e geralmente produzido após expiração ou renúncia da proteção patentária. O medicamento referência é, geralmente, o inovador que, durante o desenvolvimento, foi submetido a ensaios clínicos que atestaram sua eficácia e segurança para que lhe fosse concedido o registro (BRASIL, 2001; BRASIL, 2002).

24 22 Quando um medicamento inovador é desenvolvido, os estudos clínicos que se seguem durante o processo de pesquisa da nova substância com atividade farmacológica descoberta envolvem um expressivo tempo de realização, grande número de voluntários e alto investimento financeiro. De acordo com o Manual de Boas Práticas em Biodisponibilidade e Bioequivalência, os estudos clínicos de biodisponibilidade são divididos em quatro fases e contam com a avaliação do medicamento em um somatório de 320 a 4350 voluntários nas fases I, II e III. A fase IV não apresenta um número determinado de pacientes tratados, pois se enquadra após a obtenção do registro, ou seja, quando o novo medicamento já está disponível no comércio (BRASIL, 2002). No processo de desenvolvimento de um medicamento genérico há maior simplicidade. Estudos de bioequivalência necessitam menos tempo, voluntários e recursos financeiros em comparação aos estudos clínicos referentes ao lançamento de um medicamento inovador, porém, ainda assim, continuam representando um grande investimento. Em geral, o período médio de tempo em que as empresas recebem o resultado do estudo de bioequivalência pode levar de 3 a 7 meses (MELO, 2005). São necessários um mínimo de 12 voluntários dentro dos padrões da legislação (BRASIL, 2006). No Brasil, em 2008, foi determinada uma média anual de 400 estudos de bioequivalência para o registro de genéricos, envolvendo um número mínimo de voluntários (CRISTOFOLETTI, 2012) Sistema de Classificação Biofarmacêutica O Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) é um esquema científico, proposto em 1995 por Amidon e colaboradores, no qual a classificação dos fármacos é dependente dos parâmetros de solubilidade e permeabilidade, sendo possível separá-los em quatros classes. As classes de fármacos segundo o SCB se dividem da seguinte forma: Classe I: Fármacos altamente solúveis; altamente permeáveis; Classe II: Fármacos pouco solúveis; altamente permeáveis; Classe III: Fármacos altamente solúveis; pouco permeáveis; Classe IV: Fármacos pouco solúveis; pouco permeáveis; A velocidade e a extensão da absorção, biodisponibilidade, são dependentes das características físico-químicas do fármaco, uma vez que este, normalmente só é absorvido se for capaz de permear através do lúmen intestinal, o que acontece apenas se estiver

25 23 solubilizado. Assim, os principais parâmetros limitantes da absorção do fármaco são a sua solubilidade aquosa e a permeabilidade intestinal. Além desses, fatores como a desintegração e dissolução da forma farmacêutica sólida também estão relacionados à biodisponibilidade, conseqüentemente, gerando impacto sobre os efeitos farmacológicos (BALIMANE et al.,2000; MARTINEZ; AMIDON, 2002; SOUZA et al., 2007). Portanto, conhecendo as características biofarmacêuticas do medicamento, é possível classificá-lo e saber o que esperar do seu comportamento referente à biodisponibilidade. A importância do SCB é evidentemente notável já que sua aplicação se estende aos guias de algumas das agências regulatórias mais importantes em âmbito mundial, como o FDA (2000), EMEA (2008) e WHO (2006) e tem beneficiado às indústrias por meio da concessão de bioisenção a novos produtos. Além disso, sua aplicação tem se mostrado útil em momentos prévios ao produto final, como no período do estudo da formulação, colaborando para a otimização da mesma (COOK et al, 2008). Um dos objetivos com o SCB é auxiliar as decisões regulatórias quanto à substituição dos estudos de bioequivalência por testes in vitro. Os benefícios incluem a diminuição da exposição de voluntários, redução da demanda de tempo e custo no desenvolvimento de um novo medicamento (LENNERNÄS; ABRAHAMSSON, 2005). O uso do SCB como ferramenta para bioisenção vem sendo de grande utilidade na oferta de medicamentos de qualidade em países em desenvolvimento, visto que, para realizar um estudo de bioequivalência é necessária infra-estrutura, muitas vezes, não disponíveis nos referidos locais (BENET et al, 2008). Wu e Benet (2005) propuseram o Sistema de Classificação Biofarmacêutica baseado na Disposição dos Farmácos (BDDCS Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System), uma versão modificada do SCB que além de considerar solubilidade e permeabilidade, também se preocupa com o comportamento metabólico do fármaco, como as vias de eliminação e efeitos de transportadores de efluxo e influxo. O BDDCS não é ainda válido para fins regulatórios, porém é uma proposta sob avaliação, não como uma substituição ao SCB e sim, como uma adição aos requisitos visando estabelecer informações mais fidedígnas sobre os fármacos (BENET et al., 2008). A classificação de fármacos pelo BDDCS pode representar um grande avanço, uma vez que o fato de desconsiderar o metabolismo dos fármacos pode gerar falsos dados, por exemplo, um fármaco pode ser classificado como altamente permeável no SCB, mas seu metabolismo pode não corresponder às expectativas e isso ocorre principalmente devido às características de hidrofilicidade, peso molecular e o tipo

26 24 de transporte através de membranas, características intrínsicas ao fármaco (CHEN; YU, 2008) Bioisenção Bioisenção é a isenção ou substituição de estudos in vivo de bioequivalência/biodisponibilidade relativa para regularizar o registro de medicamentos, quando um ensaio in vitro é capaz de substituir o ensaio in vivo de maneira confiável (STORPIRTIS; GAI, 2009; ARAÚJO et al., 2010). Para considerar um fármaco como candidato à bioisenção deve-se levar em conta não apenas as propriedades físicas, químicas e de absorção, mas executar uma análise de riscobenefício do uso de cada produto (WHO, 2006). A bioisenção colabora com o lançamento de medicamentos genéricos e similares. Dentro da política de medicamentos vigente no País, as regulamentações sobre genéricos, similares e os estudos de bioisenção têm como meta final o aumento das opções terapêuticas disponíveis, com menor custo e segurança comprovada (ARAÚJO et al., 2010). A diminuição dos investimentos necessários ao desenvolvimento de um novo produto, sendo este um genérico ou similar, e a menor demanda de tempo devido a não realização dos estudos in vivo são um incentivo para as indústrias lançarem medicamentos. A economia que pode ser gerada com a isenção dos estudos in vivo é significativa. De acordo com as estimativas de Cook e colaboradores em 2010, a cada ano, seria possível economizar cerca de 66 a 76 milhões de dólares caso compostos classe I (alta solubilidade e alta permeabilidade) fossem bioisentos e 62 a 71 milhões de dólares caso a bioisenção se estendesse à fármacos pertencentes à classe III (alta solubilidade e baixa permeabilidade). E além desse alívio econômico, os medicamentos aprovados por este processo oferecem um alto padrão de qualidade, apresentando vantagem para o consumidor e para a saúde pública e possibilitando eliminar a exposição desnecessária de indivíduos saudáveis aos fármacos por não requerer voluntários para os estudos in vivo (LENNERNÄS; ABRAHAMSSON, 2005; COOK et al., 2010). Uma vez que o medicamento referência, quando inovador, foi submetido a uma extensa avaliação nos estudos clínicos para atestar sua eficácia e segurança, é compreensível que sejam adotados métodos para a isenção de estudos in vivo, uma vez que o medicamento teste apresente o mesmo fármaco, dose e forma farmacêutica e não apresente excipientes que

27 25 possam gerar impacto sobre a sua absorção. Vale ressaltar que os estudos in vitro devem oferecer um perfil de comportamento do medicamento fidedigno ao observado in vivo. Cook e colaboradores (2010) inclusive relatam indícios de que os testes in vitro têm se mostrado tão bons quanto testes in vivo para determinar a bioequivalência de formas farmacêuticas sólidas orais de liberação imediata. A bioisenção baseada no SCB e nos estudos de dissolução tem sido reconhecida por algumas agências regulatórias como FDA (2000), EMEA (2008), WHO (2006), ANVISA (BRASIL, 2011a). Porém é um assunto ainda polêmico e outras agências não a reconhecem, como por exemplo, a agência regulatória japonesa (YAMASHITA; TACHIKI, 2008). No Brasil, a bioisenção começou a ser discutida por meio da Resolução nº 897 de 2003, que declara as formas farmacêuticas que podem ser bioisentas e aquelas nas quais é admitida a substituição de testes in vivo nas menores dosagens por teste in vitro de equivalência farmacêutica (BRASIL, 2003a). Em 2010 foi iniciada uma discussão, por meio da consulta pública nº91 de agosto de 2010, sobre possível aplicação do Sistema de Classificação Biofarmacêutica para subsidiar decisões de bioisenção (BRASIL, 2010c) e em 2011, a RDC nº 37 de 3 de agosto foi instituída trazendo os critérios de bioisenção baseados no SCB. De acordo com o Guia para isenção e substituição de estudos de biodisponibilidade relativa/bioequivalência, pertencente à legislação brasileira, a possibilidade da bioisenção está ligada a três diferentes abordagens. Primeiramente, a bioisenção pode ser concedida de acordo com a forma farmacêutica. Um exemplo seria a concessão para soluções aquosas caracterizadas como equivalentes farmacêuticos ao medicamento de referência, que apresentam excipientes de mesma função e que devem ser bem estabelecidos para a forma farmacêutica em questão, via de administração e em concentrações adequadas à função pretendida. O segundo tipo de concessão de bioisenção seria a isenção de estudos in vivo para formas farmacêuticas sólidas orais de liberação imediata (FFSOLI) em dosagens menores de um mesmo produto cuja maior dosagem, apresentou-se bioequivalente ao referência, desde que os perfis de dissolução dos fármacos, entre todas as dosagens, sejam semelhantes. Cabe ressaltar que as formulações devem apresentar quantidade de excipientes proporcionais e produzidos pelo mesmo fabricante, e farmacocinética linear. E por fim, a terceira possibilidade que é baseada no Sistema de Classificação Biofarmacêutica, sendo possível realizar estudos para fármacos candidatos inclusos na Instrução Normativa nº 2 de 14 de março de 2013 (BRASIL, 2013), que revoga a instrução normativa nº 4 de 3 de agosto de 2011 (BRASIL, 2011b), exigindo formulações com excipientes que não apresentem impacto sobre a biodisponibilidade, estudos de solubilidade do fármaco, comparação do perfil de

28 26 dissolução entre medicamento teste e referência, devendo estes perfis apresentarem rápida dissolução in vitro (BRASIL, 2011a; BRASIL, 2011b; BRASIL, 2013). Nos guias publicados pelo FDA (2000) e EMEA (2008) é aplicado o critério de bioisenção para formas farmacêuticas de liberação imediata para fármacos pertencentes à classe I, que apresentam alta solubilidade e alta permeabilidade e características de dissolução in vitro rápida (85% em 30 minutos) e os excipientes não ocasionam impacto sobre a biodisponibilidade. A EMA considera também a bioisenção baseada no SCB para fármacos classe III (alta solubilidade e baixa permeabilidade) se apresentarem características de dissolução in vitro muito rápida (85% em 15 minutos) e que possuam excipientes qualitativamente e quantitativamente similares. Na Tabela 1 estão descritos, resumidamente, os requisitos exigidos pela ANVISA, FDA, EMA e OMS para a obtenção da bioisenção baseada no SCB. Para minimizar os riscos de uma decisão incorreta de bioisenção é necessário responsabilidade e atenção aos detalhes. O SCB deve ser seletivamente utilizado, considerando cuidadosamente os riscos de uma decisão equivocada versus os benefícios inerentes ao desenvolvimento de cada projeto (COOK et al., 2008). A aceitação da bioisenção se depara com certa resistência por parte das indústrias farmacêuticas. Há relutância histórica pelas companhias farmacêuticas para prosseguir com a bioisenção devido à incerteza da aceitação de suas petições pelas agências regulatórias. Isto é decorrente da ausência de harmonia entre estas o que prejudica a aceitação pelos laboratórios farmacêuticos (COOK et al., 2010). As agências regulatórias devem universalizar seus critérios e avaliar as petições rapidamente para possibilitar maior aceitação pelas indústrias farmacêuticas. O tempo entre a apresentação de um requerimento de bioisenção e o recebimento de uma aprovação formal não deve demorar.

29 27 Tabela 1 -Principais requisitos exigidos pra obtenção da bioisenção baseada no SCB REQUISITOS Candidatos segundo SCB AGÊNCIA REGULATÓRIA ANVISA FDA EMA OMS Classe I Classe I Classe I e III Classe I, II e III Características para classificação de fármacos de alta solubilidade Maior dose solúvel em volume 250 ml, ph 1,2-6,8, 37⁰C. Maior dose solúvel em volume 250 ml, ph 1-7,5, 37⁰C. Maior dose solúvel em volume 250 ml, ph 1-6,8, 37⁰C. Maior dose solúvel em volume 250 ml, ph 1,2-6,8, 37⁰C. Classificação de fármacos de alta permeabilidade Absorção 85% Absorção 90 % Absorção 85% Absorção 85% Meios de dissolução Volume de meio tampão ph 1,2, 4,5 e 6,8; 37⁰C 900 ml 900 ml 500 ml 900 ml Aparato e agitação Pá: 50 rpm/ cesto: 100 rpm Pá: 50 rpm/ cesto: 100 rpm Pá: 50 rpm/ cesto: 100 rpm Pá: 75 rpm/ cesto: 100 rpm Perfil de dissolução Dissolução rápida Fonte: adaptado de BELLAVINHA (2012) Dissolução rápida I: dissolução rápida III: dissolução muito rápida I: dissolução rápida II: dissolução rápida em ph 6,8 III: dissolução muito rápida

30 SCB e a pesquisa científica A partir da criação do Sistema de Classificação Biofarmacêutica e a proposta de bioisenção, se tornou fundamental na área biofarmacêutica a pesquisa capaz de elucidar as características dos fármacos visando à criação desse conhecimento que, como relatado nesse trabalho, fornece apoio ético e econômico justificado pela não requisição dos voluntários, geração de produto de qualidade em pouco tempo e menor demanda de recurso financeiro. A necessidade da pesquisa científica pode ser exemplificada pelas atividades da Federação Farmacêutica Internacional (FIP), onde está inserido o Grupo de Interesse Especial (SIG). Este visa realizar estudos biofarmacêuticos ou compilar informações científicas que possibilitem a redação de monografias para os fármacos contidos nesta listagem que subsidiem a indicação para a bioisenção. Vários pesquisadores de diferentes instituições de pesquisa ao redor do mundo já colaboraram na criação de dados para compor essas monografias e essas participações são apresentadas no site da FIP. Outras informações, as monografias já publicadas e os fármacos que requerem mais informações estão disponíveis em Existem trabalhos científicos que objetivam a avaliação do perfil de vários fármacos disponíveis no comércio. Dentre estes pode-se citar o artigo elaborado por Kasim e colaboradores no qual foram classificados, provisoriamente, 123 fármacos integrantes de Formas Farmacêuticas Sólidas de Liberação Imediata, relatados na 12ª lista de medicamentos essenciais da Organização Mundial de Saúde. Uma parcela de 67% apresentou alta solubilidade. Quanto à permeabilidade foram sugeridos que 43,1% (valor obtido por LogP) ou 50,4% (valor obtido por CLogP) apresentam alta permeabilidade. A classificação provisória indica que a porcentagem de fármacos pertencentes à classe I do SCB pode chegar a 23,6% (baseado em LogP) ou 28,5% (baseado em CLogP). Os fármacos classe III, que são outra classe com possibilidade de bioisenção, no caso da EMA, apresentaram valores de: 31,7% (baseado em LogP) ou 35% (baseado em CLogP) (KASIM et al., 2004). Lindenberg e colaboradores, em 2004, realizaram um estudo com o mesmo objetivo, a partir da mesma edição da lista de medicamentos essenciais da OMS. Um total de 130 fármacos foi selecionado. Uma parcela de 61 foi classificada com certeza. A divisão desses 61 fármacos entre as classes do SCB se deu da seguinte forma: Classe I: 34%; Classe II: 17%; classe III: 39%, classe IV: 10% (LINDENBERG et al., 2004). Também com o objetivo de gerar uma classificação provisória, Takagi e colaboradores, em 2006, coletaram a informação dos 200 medicamentos mais vendidos nos Estados Unidos, Espanha, Grã-Bretanha e Japão e

31 29 os classificaram segundo o SCB. Identificaram que cerca de 55% desses medicamentos continham fármacos que se comportavam como altamente solúveis (classe I e classe III). Outro dado relevante obtido foi que aproximadamente 30% de todos os fármacos contidos em Formas Farmacêuticas Sólidas de Liberação Imediata podem ser classificados como altamente solúveis e altamente permeáveis (classe I) (TAKAGI et al., 2006) Dissolução A dissolução é um ensaio físico que prevê a quantidade da liberação do fármaco a partir da forma farmacêutica e o tempo necessário para que isto ocorra (MANADAS et al., 2002). O resultado é expresso em porcentagem da quantidade declarada no rótulo do produto (BRASIL, 2010a). Esse ensaio é útil no desenvolvimento e otimização das formulações, controle de etapas críticas da produção, controle de qualidade do produto final e estabelecimento de correlações in vivo - in vitro (MANADAS et al., 2002). O estudo de dissolução de medicamentos de liberação imediata se subdivide em três tipos: (a) coleta em um único tempo (utilizado em controle de qualidade rotineiro), (b) coleta em dois tempos distintos (aplicado em teste de rotina de controle de qualidade para certos tipos de medicamentos, por exemplo, medicamentos que apresentam dissolução lenta ou que são pouco solúveis, como a carbamazepina), (c) perfil de dissolução, que inclui vários pontos temporais (utilizado para comparar os perfis de liberação dos fármacos sendo aceito como parte dos requisitos em estudos de bioisenção e alteração pós-registro) (FDA, 1997; BRASIL, 2010b). A legislação determina que as condições do ensaio devem incluir utilização do Aparelho I (cesta) em 100 rpm ou aparelho II (pá) em 50 rpm em um volume de 900mL em cada um dos seguintes meios: (1) HCl 0,1M ou suco gástrico simulado sem enzimas, (2) tampão ph 4,5; e (3) tampão ph 6,8 ou suco intestinal simulado sem enzimas, na temperatura de 37 ± 1ºC. Para que o resultado do ensaio colabore com a decisão de bioisenção, os medicamentos teste e referência devem demonstrar semelhança no perfil de dissolução (FDA, 2000; BRASIL, 2011a). O valor de ph deve ser registrado no início e no final do experimento (BRASIL, 2011a). O medicamento classificado como de rápida dissolução é aquele que apresenta quantidade dissolvida superior a 85% da quantidade declarada do fármaco, dentro de 30 minutos. O medicamento de dissolução muito rápida é aquele em que 85% do fármaco se

32 30 dissolve em até 15 minutos usando os três meios de dissolução biorrelevantes e neste caso, a comparação do perfil usando o fator de semelhança F2, nem mesmo é necessária (FDA, 2000) Solubilidade Para que ocorra a absorção do fármaco, o mesmo deve se encontrar em solução no sítio ativo, independente do mecanismo de transporte. A solubilidade é uma característica que impacta diretamente a biodisponibilidade, uma vez que a liberação do fármaco é dependente deste parâmetro (PANCHAGNULA; THOMAS, 2000). É interessante que o fármaco seja solúvel em água, porém não em excesso. Se ele apresenta alta solubilidade, caso a formulação não prejudique, apresentará boa dissolução. No entanto, a alta solubilidade pode gerar baixa permeabilidade, devido à alta polaridade da molécula e pobre lipofilicidade. Uma característica que permite que o fármaco tenha a tendência de ser mais solúvel em água é o perfil ionizado, em vez de não ionizado (MARTINEZ; AMIDON, 2002). O fármaco é considerado altamente solúvel quando a maior dose administrada em uma única vez é solúvel em 250 ml ou menos de meio aquoso com faixa de ph entre 1 7,5 em 37 C (FDA, 2000). EMA (2008), ANVISA (2011) e WHO (2006) apresentam os mesmos parâmetros, com exceção da faixa de ph 1-6,8. Um procedimento referencial para a determinação da solubilidade é realizado por meio do método que engloba adição de um excesso do fármaco ao meio biorrelevante, agitação durante um determinado período, filtração ou centrifugação da suspensão e quantificação da parcela dissolvida (ROY et al., 2001 apud MANADAS, 2002) Permeabilidade intestinal Para atingir concentrações terapêuticas adequadas, um dos fatores que devem ser levados em conta quando se administra um fármaco por via oral é sua capacidade de apresentar boa permeabilidade intestinal. A absorção de fármacos é um processo dinâmico e complexo onde se deve considerar, além das características intrínsecas do fármaco como peso e tamanho molecular, pka, lipofilicidade (logp/ logd), carga/ionização e solubilidade, também

33 31 a capacidade de absorção por mecanismos de transporte ativo ou passivo, a ocorrência de influxo e efluxo das substâncias (BALIMANE et al., 2000) e as condições fisiológicas do indivíduo (MARTINEZ; AMIDON, 2002). É necessário lembrar que solubilidade, permeabilidade e dissolução estão correlacionadas. Um exemplo disso é que no caso de um fármaco altamente solúvel e altamente permeável, o aumento da dose pode gerar maior absorção. Entretanto, se o fármaco for pouco solúvel, o aumento da dose não ocasionará maior absorção, podendo inclusive prejudicá-la (MARTINEZ; AMIDON, 2002). Existem diferentes modelos desenvolvidos para a determinação da permeabilidade, os quais podem ser classificados como in vivo, in situ, in vitro e in silico (BALIMANE et al.,2000; SOUZA et al.,2007). O uso de células em monocamada Caco-2, gera resultados in vitro mais aceitos hoje em dia no meio científico e são muito utilizadas devido à similaridade com as células intestinais, capacidade de expressar alguns transportadores (JUNG et al, 2006) e por ser proveniente de célula humana (BALIMANE et al., 2000). Conforme citado anteriormente, os estudos de biodisponibilidade apresentam como ponto negativo o custo de realização (MELO, 2005) e por isso, os métodos que estabelecem correlações in vivo - in vitro confiáveis são uma alternativa significativamente apreciável para determinação das características do fármaco Diazepam Os benzodiazepínicos (BZDs) lançados no mercado na década de 1960 apresentam uma contribuição significativa para a farmacoterapia da população mundial, principalmente nos transtornos da ansiedade e do sono. Dentre outras propriedades farmacológicas é possível incluir efeitos sedativos, de relaxamento muscular, hipnóticos e anticonvulsivantes. Dentre as maiores vantagens clínicas dos BZDs estão à elevada eficácia clínica, rápido início de ação e toxicidade reduzida, atributos estes comparáveis a poucos fármacos (RISS et al., 2008). O diazepam é um fármaco da classe dos benzodiazepínicos, sendo uma substância psicotrópica pertencente à lista B1 da Portaria 344/98 (BRASIL, 1998). É mais utilizado como ansiolítico, relaxante muscular e anticonvulsivante que propriamente como hipnótico (CORREIA; ALVES, 2010) e também é útil no controle de insônia e alívio de alucinações. Pode ser usado para aliviar a agitação, tremores e alucinações durante a abstinência ao álcool.

34 32 Atualmente compõe medicamentos amplamente consumidos em todo o mundo (RIBEIRO et al., 2010). Seus efeitos adversos mais comuns são sedação, sonolência, ataxia, vertigem, dor de cabeça e confusão (RANG et al., 2001). Pode causar dependência e por isso recomenda-se que a dosagem seja a menor possível, com uma redução gradual ao término do tratamento. Em caso de abstinência, os efeitos mais comuns incluem ansiedade, insônia, dor de cabeça, zumbido, perda de apetite, tremor, vertigem, irritabilidade, distúrbios tais como hipersensibilidade visual e auditiva, dentre outros (MARTINDALE, 1993). O diazepam é um fármaco que está no mercado há muitos anos, uma vez que sua síntese se deu por volta de 1961 e sua comercialização iniciou-se em 1963 nos Estados Unidos. Sua utilização pela população foi ampla e continua até os dias atuais. De 1990 a 1995 apresentava altas taxas de vendas principalmente nos Estados Unidos, Brasil, Japão, Itália, Espanha e Reino Unido (IARC, 1996). No ano de 2012, foram encontrados cerca de 580 produtos contendo diazepam comercializados ao redor do mundo (ILAE). Ele é distribuído pela rede pública de saúde no Brasil. Pertence à Relação Nacional de Medicamentos Essenciais (Rename) do Brasil (BRASIL, 2010d), assim como a lista de medicamentos essenciais da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2010). Além disso, o Grupo de Interesse Especial (SIG), que pertence à Federação Farmacêutica Internacional (FIP) criou a partir da listagem da WHO, edição de 2010, uma relação de fármacos veiculados nas formas farmacêuticas sólidas orais, possíveis candidatos à bioisenção, incluindo-se o diazepam Mecanismo de ação Sendo um benzodiazepínico, o diazepam age no organismo atuando sobre o GABA, principal neurotransmissor inibitório no cérebro, localizado nas membranas neuronais do sistema nervoso central. Benzodiazepínicos se ligam com elevada afinidade a um sítio acessório sobre o receptor GABA A das células de modo que a ligação do GABA fica facilitada e o efeito do neurotransmissor inibitório é potencializado. Sua ligação a uma das subunidades do complexo, afeta a condutância de cloreto para dentro de fibras longas dos neurônios e inter-neurônios no sistema nervoso central, aumentando a eficiência da transmissão GABAérgica (RISS et al., 2008).

35 Características físico-químicas As características físico-químicas de um fármaco são importantes, pois exercem influência sobre seus efeitos farmacológicos e parâmetros farmacocinéticos, uma vez que é possível prever a velocidade de absorção e eliminação, tempo para atingir a concentração plasmática máxima, biodisponibilidade e tempo de permanência no organismo, dentre outros fatores, por meio da comparação de características físico-químicas entre fármacos novos e fármacos análogos, que apresentam dados farmacocinéticos e farmacológicos conhecidos (LITVIN et al., 2004). O diazepam é um benzodiazepínico de ação longa. Sua fórmula química é C 16 H 13 ClN 2 O, denominada (7-cloro-1,3-dihidro-1-metil-S-fenil-2H-1,4-benzodiazepin-2- ona). Sua estrutura molecular está representada na Figura 1. O fármaco pode ser considerado uma molécula pequena, cujo peso corresponde a 284,7 Da. Seu ponto de fusão está entre 125 e 126 ºC (MARTINDALE, 1993) e o pka é 3,4 sendo o LogP (log D) em ph 7,4 é 2,58. (LINDENBERG, 2006). O logp também pode ser encontrado como 3,2 (ZAKI et al., 2010). O diazepam apresenta lipofilicidade intermediária, visto que é solubilizado em solventes como metanol e etanol. É praticamente insolúvel em água, solúvel em álcool e livremente solúvel em clorofórmio, da seguinte forma: a 25 C, 1g diazepam é solúvel em 333 ml de água, 2 ml de clorofórmio, 16 ml de etanol e 39 ml de éter (MARTINDALE, 1993; GENNARO, 1995). O fármaco, em sua forma de matéria-prima, pode ser encontrado como um pó cristalino amarelo ou branco, sem odor ou com mínimo odor. Deve ser armazenado em recipiente hermético e protegido da luz (MARTINDALE, 1993). Possui sabor ligeiramente amargo (GENNARO, 1995). Figura 1 - Estrutura molecular do diazepam Fonte: ROUINI et al., 2008

36 Farmacocinética Compostos altamente lipofilicos, como o diazepam, possuem rápido inicio de ação. Quando administrado por via oral e por via intravenosa, seus efeitos iniciam-se em torno de minutos e 8 minutos, respectivamente. Ele apresenta modelo de distribuição bicompartimental, com rápida distribuição pelo sangue e perfusão pelos tecidos. Uma longa fase de eliminação é observada para esse fármaco (HORN; NESBIT, 2004). O diazepam apresenta rápida e completa absorção no trato gastrintestinal (TGI) quando administrado por via oral, sendo esta influenciada por fatores inter-individuais, como por exemplo, a idade, que reduz a sua biodisponibilidade (HORN; NESBIT, 2004). Por essa via, o fármaco é rapidamente absorvido apresentando picos de concentração de 30 a 90 minutos após administração (RISS et al., 2008). O diazepam é um fármaco lipofílico que atua no sistema nervoso central, apresentando uma considerável capacidade de passagem através da barreira hematoencefálica (RISS et al., 2008). Considerando a existência de elevada expressão de P-gp, que são transportadores de efluxo, modulando essa passagem na barreira hematoencefálica, Feng e colaboradores (2007) avaliaram a interação de fármacos com P-gp. Para tal foram utilizados modelos contendo células MDCK, MDR1-MDCK humano e Mdr1a-MDCK de rato. Foram obtidos resultados de que o uso de Mdr1a-MDCK é confiável para prever a absorção de diazepam em humanos uma vez que este não é substrato da P-gp. Zhao e colaboradores (2009) realizaram uma avaliação da permeabilidade do diazepam através da barreira hematoencefálica usando técnica in situ de perfusão em cérebro de ratos para verificar a diferença provocada pela P-gp, usando modelos animais com e sem expressão do referido transportador. Os autores encontraram o mesmo valor de permeabilidade entre os grupos mostrando que a influência de P-gp foi inexistente. O volume de distribuição do diazepam é 0,95 2,0 l/kg (RISS et al. 2008). Apresenta alta ligação às proteínas plasmáticas, sendo descritos valores em torno de 96-99% (HORN; NESBIT, 2004). O principal métabólito do diazepam, o N-desmetildiazepam (nordiazepam) é menos ativo que o diazepam e pode comportar-se como agonista parcial (MCNAMARA, 2010). Os efeitos do diazepam são atribuídos também a outros metabólitos, como o 3-hidroxidiazepam (temazepam) e oxazepam (RISS, 2008). Se sabe que seus metabólitos são excretados no leite materno (HORN; NESBIT, 2004). O tempo de meia vida de eliminação do diazepam é por

37 35 volta de 20 a 50 horas, podendo chegar até 100 horas e de seu principal metabólito, 36 a 40 horas, podendo chegar a 200 horas (ASHTON, 1994; RISS et al., 2008). Figura 2- Diazepam - suas principais vias metabólicas e produtos ativos com respectivos tempos de meia-vida de eliminação (Adaptado de RISS et al., 2008) Fonte: adaptado de RISS et al., 2008 Interações medicamentosas potencialmente relevantes entre diazepam e compostos que inibem ou induzem as enzimas hepáticas do citocromo P450, CYP3A4 e CYP2C19 devem ser consideradas. Efeitos de natureza farmacodinâmica, farmacocinética ou combinadas do diazepam são influenciados diretamente por esses compostos. Devido à possibilidade de consequências decorrentes de interações medicamentosas devem ser tomados cuidados quando se torna necessária a administração conjunta de diazepam com outros fármacos. Alguns medicamentos atuam como inibidores do metabolismo do diazepam, como a cimetidina, diltiazem, fluvoxamina, omeprazol, oxcarbazepina, ticlopidina e topiramato. Exemplos de indutores do seu metabolismo são a carbamazepina, fenobarbital e rifampicina (FLOCKAHART, 2007).

38 36 Os parâmetros farmacocinéticos observados durante administração aguda do diazepam podem ser diferentes e determinantes nos efeitos clínicos comparados com o tratamento a longo prazo, uma vez que a biotransformação parece ser mais expressiva em pacientes submetido ao tratamento por mais de três anos (GREENBLATT et al., 1981). O diazepam e seus metabólitos são eliminados principalmente pela urina (cerca de 70%), predominantemente sob a forma conjugada (HORN; NESBIT, 2004). A via de eliminação principal é a excreção renal, sendo 75% do fármaco eliminado dessa forma (RISS,2008) Estudos de bioequivalência Um pequeno número de trabalhos sobre estudos de bioequivalência do diazepam está presente na literatura e conclusões de bioequivalência e bioinequivalência foram encontradas. Locniskar e colaboradores, em 1989, realizaram um estudo de bioequivalência entre o medicamento referência (Valium ) e um medicamento genérico, na dosagem de 10 mg/comprimido com a participação de 26 homens adultos saudáveis. A dosagem foi única e a quantificação de diazepam e desmetildiazepam se deu até 264 horas após a administração, em cada período. Os valores de ASC e Cmax do medicamento referência foram significativamente maiores em relação ao medicamento teste. Foi concluída a bioinequivalência entre ambos. Nesse mesmo experimento foi realizado teste de dissolução em Ácido Clorídrico 0,1N e tampão acetato ph 4,5. O resultado da dissolução em ph ácido foi satisfatório, porém em ph 4,5 a dissolução do medicamento genérico obteve um perfil de dissolução mais lento em relação ao medicamento referência. Portanto é possível sugerir que a bioinequivalência possa ter sido causada devido às características da formulação do genérico que podem ter ocasionado dissolução lenta em determinados locais do TGI com ph próximo a 4,5. Os excipientes usados nos medicamentos referência e genérico podem ter sido diferentes (BORGHERINI, 2003), o que pode ter ocasionado o perfil de liberação diferenciado, e consequentemente, comprometer a segurança e eficácia do medicamento teste. Outro estudo de bioequivalência foi realizado por Domínguez e colaboradores (1994) utilizando três produtos diferentes na forma de comprimidos de 5 mg, comparando com o medicamento referência (Valium ). O estudo contou com a participação de 8 pacientes psiquiátricos em um estudo cruzado, com múltiplas doses. Amostras de sangue foram coletadas após o fármaco ter alcançado o estado de equilíbrio. Não foram encontradas diferenças estatísticas nas concentrações plasmáticas dos indivíduos com a administração das

39 37 quatro formulações no regime de múltipla doses, confirmando equivalência entre os tratamentos (DOMÍNGUEZ et al., 1994) Estudos de dissolução Os métodos e objetivos de estudos de dissolução encontrados para o diazepam são variáveis. Alguns artigos abordam o desenvolvimento farmacotécnico com a preocupação em detectar a influência de variáveis críticas de fabricação, seja a respeito dos excipientes na formulação ou na técnica de compressão empregada, bem como os efeitos que diferentes meios de dissolução podem provocar no perfil de liberação do fármaco (VRANIC et al., 2002; SEO et al., 2003; DOKOUMETZIDIS; MACHERAS, 2006). O número de dados relativos a estudos de dissolução realizados em meios biorrelevantes com o objetivo de avaliar a equivalência entre uma formulação já estabelecida e um medicamento genérico é pequeno, visto que os trabalhos publicados se concentram mais na avaliação das variáveis farmacotécnicas. Locniskar e colaboradores (1989) e Domínguez e colaboradores (1994) tiveram como objetivo, avaliar a formulação já presente do mercado por métodos farmacopéicos e com o uso de meios convencionais. Nos estudos referentes às diferentes formulações genéricas e o medicamento referência houve um bom resultado de dissolução em tampão ph 1,2 (LOKNISKAR et al.,1989; DOMÍNGUEZ et al., 1994) e resultado de dissolução insatisfatório em tampão ph 4,5 quanto a um genérico selecionado (LOKNISKAR et al., 1989). Um trabalho com parâmetros mais próximos aos necessários em bioisenção foi realizado por Bonissatto (2010) que avaliou o perfil de dissolução de comprimidos de diazepam, medicamento referência, similar e genérico, em ácido clorídrico ph 1,2, tampões acetato ph 4,4 e fosfato ph 6,8, visando avaliar a classificação biofarmacêutica, porém usando o aparato cesta a 100 rpm conforme a monografia da farmacopeia americana 27ª ed.. Foi identificado que a velocidade de dissolução em ph 1,2 foi satisfatória conforme os guias de bioisenção, uma vez que todas as marcas atingiram mais de 85% em menos de 30 minutos e também conforme a monografia farmacopéica (mais de 75% em até 45 minutos). Nos demais meios se apresentou lenta e dependendo do produto farmacêutico, insatisfatória, pois em meio acetato ph 4,4 e fosfato ph 6,8, nenhum medicamento atingiu 85% em até 30 minutos, enquanto no ponto de vista farmacopéico, o medicamento genérico não atingiu 75%

40 38 de dissolução em até 45 minutos nos meios ph 4,4 e 6,8 e o medicamento similar não atingiu a referida cedência em ph 6,8. Para enquadrar as expectativas da dissolução nas requisições da bioisenção seriam necessários mais dados e ensaios em meios biorrelevantes, para que a equivalência farmacêutica pudesse ser prevista em ao menos três meios com diferentes valores de ph considerados para o TGI e nas devidas condições. O perfil de dissolução de um fármaco de baixa solubilidade e alta permeabilidade pode ser um passo limitante para a absorção do fármaco (FDA, 1997). Como existia a probabilidade do diazepam apresentar esse comportamento, foi muito importante que a dissolução da forma farmacêutica fosse bem avaliada. Um perfil de dissolução de múltiplos pontos é recomendado para medicamentos nesta categoria (FDA, 1997) Estudos de solubilidade Os resultados controversos sobre a solubilidade do diazepam geram dúvidas sobre sua classificação, sendo encontrada de forma variada nos artigos científicos. A revisão da literatura retrata a incerteza se o fármaco diazepam é classe I (alta solubilidade e alta permeabilidade) ou classe II (baixa solubilidade e alta permeabilidade). É possível encontrar o diazepam classificado como classe I SCB (LINDENBERG et al., 2004; KORTEJARVI et al., 2010; RAVINDRAN, 2011) e classe II (KASIM et al., 2004; WILSON et al.,2005; CLARYSSE et al., 2009; ANNAERT et al., 2010). No BDDCS, o diazepam foi classificado como classe I, apresentando alta solubilidade e metabolismo elevado (WU; BENET, 2005). Lindenberg e colaboradores (2006) comentam que, de acordo com a literatura, o diazepam em suas formulações com dosagem de 2 e 5 mg é considerado altamente solúvel, pertencendo a classe I (LINDENBERG, 2006). Na avaliação experimental da solubilidade, Lindenberg considera a dose máxima conforme a Organização Mudial de Saúde, ou seja, 10 mg, em diferentes meios. O diazepam apresentou maior solubilidade nos meios SGFsp (suco gastrintestinal simulado sem pepsina) USP 1,2, FeSSIF(suco intestinal em estado pós-prandial simulado) e FaSSIF(suco intestinal em jejum simulado), sendo a condição de temperatura do teste 37 ºC. Um detalhe foi a diminuição na solubilidade após duas horas em meio ácido SGFsp USP ph 1,2, que pode ser explicada pela hidrólise ácida do diazepam. Portanto, o fármaco se comportou como altamente solúvel, se mantendo na classe I do SCB (LINDENBERG, 2006).

41 39 Annaert e colaboradores (2010) realizaram aspiração e caracterização de suco intestinal humano de jovens e idosos afim de aplicá-lo em estudo de solubilidade de fármacos para verificar a depêndencia da solubilidade em relação à idade do indivíduo. Esse experimento foi realizado, por haver indícios de absorção e permeação intestinal diferenciadas e relacionadas à idade, o que pode ser explicado por alteração na atividade ou expressão da glicoproteína P e constituição dos líquidos corpóreos. O diazepam não apresentou diferenças estatísticas na solubilidade nas diferentes faixas etárias. Além dessa avaliação, o ensaio de solubilidade do diazepam foi realizado sob a temperatura de 37 ºC em meio FaSSIF, onde o valor encontrado foi de 369 ± 2 µm e em FaSSIF (branco) isento de sais biliares e fosfolipídios, com valor de 242 ± 11 µm. Dentre 10 fármacos considerados pouco solúveis, o diazepam se apresentou como um dos mais solúveis no suco intestinal humano (ANNAERT et al., 2010). Zaki e colaboradores (2010) encontraram o resultado de que o diazepam, se considerando a dose máxima como 10 mg, se comportou como classe I no SCB empregando os meios tampão FaSSIF ph 6,5 e FeSSIF ph 5,0 e como classe II no SCB utilizando tampão fosfato 6,5 nos estudos de solubilidade realizados a 37 ºC (330 rpm). Logo, percebe-se que a predictibilidade pode não ser fidedigna se o meio mimetizar apenas o valor de ph de determinado trecho do TGI, como um tampão fosfato 6,5. A exposição do fármaco ao FaSSIF (suco intestinal em jejum simulado) e ao FeSSIF (suco intestinal em estado pós-prandial simulado) pode mimetizar o TGI de forma diferenciada. Diante dessa informação, é possível refletir que, para tais compostos, os guias referentes à isenção dos estudos de bioequivalência podem ser considerados demasiadamente rígidos. Embora o guia FDA considere o ph gradiente no trato gastrintestinal, a capacidade de solubilização no suco intestinal é negligenciada (ZAKI et al, 2010). Clarysse e colaboradores (2011) avaliaram a solubilidade do diazepam sob a condição de 37 ºC (130 rpm), considerando-o como fármaco classe II (altamente permeável e com baixa solubilidade), avaliando o perfil de solubilização nos meios com objetivo de se aproximar do observado in vivo. O suco intestinal humano (FIH) sob estado de jejum e pósprandial foi usado como referência, e os meios adicionais nos quais a solubilidade foi avaliada foram o tampão fosfato com diferentes proporções de succinato de D-α-tocoferol polietilenoglicol 1000 (TPGS), FaSSIF e FeSSIF branco, FaSSIFc e FeSSIFc (adição de taurocolato). Tampão com TPGS, FaSSIFc e FeSSIFc foram considerados biorrelevantes. O diazepam se solubilizou com maior sucesso nos meios contendo maior proporção de surfactante e meios com taurocolato (CLARYSSE et al., 2011).

42 40 O diazepam é relatado como fármaco significativamente lipofílico na literatura. Na comparação da solubilidade do diazepam a 25 ºC em água e meio lipídico, Sila-on e colaboradores (2008) descreveram que, considerando as estruturas moleculares e coeficientes de partição, na comparação de quatro fármacos lipossolúveis, a lipossolubilidade do diazepam foi de aproximadamente 13, 20, e 35 vezes maior do que de lorazepam, alprazolam e clonazepam, respectivamente. Os trabalhos da área farmacotécnica com o objetivo de melhorar a capacidade de solubilização do diazepam para a forma farmacêutica oral expõem uso de sistemas de micelas mistas e/ou a presença de surfactantes (HAMMAD; MULLER, 1998; ASHOK et al., 2004; CWIERTNIA, 2006; RUPP, et al., 2010; CLARYSSE et al., 2011). Entretanto é necessário lembrar que uma grande quantidade de surfactante pode modificar significativamente a biodisponibilidade, podendo inclusive prejudicar a requisição de bioisenção (FDA, 2000). Uma vez que as condições de rotação, meios e método de agitação foram diferentes entre os trabalhos e não foi encontrada uma diversidade de dados sob as condições estabelecidas pelos guias referentes a bioisenção, foi considerada relevante a proposta de um estudo que avaliasse as corretas características do diazepam em um estudo de solubilidade sob parâmetros definidos conforme a bioisenção. Na Tabela 2 estão resumidos os dados obtidos em ensaios de solubilidade do diazepam em diferentes meios.

43 41 Tabela 2 - Solubilidade do diazepam encontrada na literatura em diferentes meios mantidos a temperatura de 37 C Referência Clarysse et al., 2011 Zaki et al., 2010 Annaert et al., 2010 Clarysse et al., 2009 Sila-on et al., 2008 Lindenberg, 2006 Meio Fluído intestinal humano (FIH) sob jejum Fluído intestinal humano (FIH) pós- prandial Dados de solubilidade 520 µm 1687 µm Tampão fosfato + TPGS (0,02%) 163 µm Tampão fosfato + TPGS (0,1%) 219 µm Tampão fosfato + TPGS (0,5%) 687 µm Tampão fosfato + TGPS (1%) 965 µm Tampão fosfato + TGPS (2%) 2621 µm Tampão fosfato + TGPS (5%) 6331 µm Tampão FaSSIF branco 114 µm Tampão FeSSIF branco 123 µm FaSSIF c (com taurocolato) 195 µm SIF FeSSIF c (com taurocolato) 727 µm Fosfato ph 6, /- 20 µm FaSSIF /- 100 µm FeSSIF 443 +/- 59 µm FaSSIF 369 ± 2 µm FaSSIF branco 242 ± 11 µm FaSSIF branco 272 ± 6 µm FaSSIF 355 ± 4 µm FeSSIF 909 ± 4 µm Água Meio lipídico SGFsp USP ph 1,2 Tampão fosfato ph 4,5 (Farm.Européia) SIFsp USP ph 6.8 Água deionizada FaSSIF FeSSIF 0.05 ±0.00mg/mL ± 0.05 mg/g 0.25 mg/ml 0.06 mg/ml 0.06 mg/ml 0.05 mg/ml 0,085 mg/ml 0,188 mg/ml Rotação 130 rpm 330 rpm NI NI NI NI NI não informada Fonte: elaborada pela autora

44 Permeabilidade do diazepam Alguns estudos envolvendo a determinação da permeabilidade intestinal do diazepam foram encontrados na literatura. Há dados da utilização dos modelos celulares Caco-2 (YEE, 1997; YAZDANIAN et al.,1998; NORDQVIST et al., 2004; THOMAS et al., 2008; HASLAM et al., 2011), Caco-2/TC7 (TURCO et al, 2011), células 2/4/A1 (ZAKI et al., 2010), células LLC-PK1, utilização de segmentos jejunal de ratos e humano (segmento humano proveniente de pancreatoduodenectomia) (HASLAM et al., 2011) e perfusão intestinal in situ (ADACHI et al., 2003). O diazepam foi empregado no desenvolvimento de métodos de previsão da permeabilidade por modelos matemáticos computadorizados (PALM et al., 1997; STENBERG et al., 2001; HOU et al., 2004; CASTILLO-GARIT et al., 2007; PAIXÃO et al., 2010) onde se mostra importante para o desenvolvimento, na maior parte das vezes, constituindo um conjunto de compostos de treinamento ( compound in the Training Set ). O composto de treinamento é usado para construir o modelo apresentando sua permeabilidade experimental e o conjunto de teste avalia a capacidade de previsão, colaborando para o desenvolvimento, validação e confiabilidade do modelo matemático. O número encontrado de dados de permeabilidade intestinal do diazepam foi pequeno e os valores são divergentes. Um motivo para esta variabilidade poderia ser a falta de padronização entre os métodos e o recente desenvolvimento e aperfeiçoamento das técnicas (MIRET et al., 2004). Por outro lado, os valores entre diferentes técnicas podem não ser comparáveis, visto que cada uma delas obtém a linearidade relacionando a fração absorvida conhecida com os valores obtidos pelo método, porém estes são discrepantes em relação a outros métodos ou utilizando outras unidades de medida (MATSSON et al., 2005). Além do mais, é necessário refletir o impacto das diferenças morfológicas e funcionais do modelo em relação aos enterócitos (BALIMANE et al., 2000; PUTNAM et al., 2002; MIRET et al., 2004). Os dados obtidos demonstraram que o diazepam tem pouca influência do mecanismo de efluxo via glicoproteína-p, apresentando-se como um substrato fraco, com valores estatisticamente semelhantes entre grupos com e sem expressão de P-gp, por métodos de perfusão intestinal in situ em camundongos normais e MDR1a/1b (-/-) e in vitro através de células em monocamadas do tipo LLC-PK1 (ADACHI et al., 2003). Em um estudo de permeabilidade por meio do uso de intestinos de ratos, Genty e colaboradores (2001) relataram que a permeabilidade do diazepam não se dá por transporte ativo e sim, passivo, uma vez que os transportadores estão presentes no lado da mucosa da membrana intestinal e a

45 43 passagem desse fármaco se apresenta indiferente à inversão ou não do intestino, na técnica do intestino invertido. Haslam e colaboradores (2011) avaliaram a permeabilidade aparente, encontrando para o diazepam valores de 127,9 cm/s x 10-6 através do segmento jejunal de ratos e 89,0 para o segmento jejunal humano proveniente de pancreatoduodenectomia e 27,0 cm/s x 10-6 obtido em células Caco-2. No estudo foi possível notar que os valores de permeabilidade gerados em jejuno de ratos e humanos se correlacionam bem e a relação entre a permeabilidade no segmento humano e células Caco-2 foi comparativamente fracas (R 2 = 0,58). Entretanto, mesmo com essa divergência na correlação dos métodos, todos os dados apontam a alta permeabilidade do diazepam (HASLAM et al., 2011). Usando o modelo de monocamadas de células Caco-2/TC7, Turco e colaboradores (2011) avaliaram a correlação dos dados de fração absorvida encontrados na literatura e permeabilidade aparente com o objetivo de verificar se o modelo é confiável, obtendo boa correlação entre a maioria dos dados. O diazepam apresentou permeabilidade igual a 16,98 ± 1,58 x 10-6 cm/s. Esse valor de Papp foi bem correlacionado com o dado de FA de 100%, utilizado pelos autores, informando alta permeabilidade (TURCO et al., 2011). Thomas e colaboradores (2008), também objetivando avaliar um modelo de previsão de absorção intestinal para fármacos em desenvolvimento, realizaram ensaios de permeabilidade de diversas moléculas já conhecidas por meio de cultura de células Caco-2, dentre elas, o diazepam. Foi encontrado o valor de 97,6 x 10-6 cm/s e apesar do estudo de permeabilidade não ter apresentado referência entre alta e baixa permeabilidade, o diazepam foi um dos fármacos que apresentou valores altos de permeabilidade em um grupo contendo cerca de 80 fármacos. Yazdanian e colaboradores (1998), Yee (1997) e Nordqvist e colaboradores (2004) encontraram valores condizentes com fármaco altamente permeável, também usando cultura de células Caco-2. Os dados relativos à permeabilidade do diazepam obtidos por diferentes modelos estão sumarizados na Tabela 3.

46 44 Tabela 3 - Dados da literatura sobre a permeabilidade do diazepam, obtidos por diferentes autores e métodos com valores limites de alta permeabilidade distintos Valores referência de Referência Método Peff (10-6 cm/s) alta permeabilidade (10-6 cm/s) Permeabilidade Segmento jejunal de 127,9 - Alta ratos Haslam et Segmento jejunal al., ,0 - Alta humano Caco -2 27,0 - Alta Turco et al., 2011 Caco 2/TC7 16,98 ± 1,58 - Alta Zaki et al., /4/A1 229,0+/- 7,8 >55,0 Alta Thomas et al.,2008 Caco-2 97,6 - Alta Nordqvist et al., 2004 Caco-2 48,0 ± 8,0 > 12,0 Alta Yazdanian et al., 1998 Caco-2 33,4 ± 2,5 > 7,0 Alta Yee, 1997 Caco-2 70,79 > 10,0 Alta Fonte: elaborada pela autora Formas Farmacêuticas Sólidas Orais de Liberação Imediata (FFSOLI) contendo diazepam na dosagem de 10 mg O diazepam, na forma farmacêutica comprimido, está disponível para ser comercializado no Brasil nas concentrações de 5 e 10 mg (BRASIL, 2011c). Já em outros países pode ser encontrado em outras concentrações. Um exemplo é o registro das formas farmacêuticas de 2, 5 e 10 mg segundo o Aproved Drug Products, comumente conhecido como o Orange Book, que apresenta a lista do FDA de todos os medicamentos aprovados nos Estados Unidos como seguros e eficazes (FDA, 2012a, FDA, 2012b). Para esse estudo, é interessante avaliar a maior concentração do fármaco disponível no comércio uma vez que, se seus resultados de perfil de dissolução e solubilidade forem

47 45 favoráveis, o emprego de concentrações dos excipientes dentro da faixa pré estabelecida não apresenta risco para o paciente. Os excipientes apresentam diversas propriedades e aplicações, por exemplo, podem proporcionar o aumento da compressibilidade do fármaco, proteção do ativo, prevenção de irritação do estômago, controle de velocidade de absorção e o local da mesma, etc. (CRISTOFOLETTI, 2012). Existem excipientes que afetam a biodisponibilidade de fármacos e/ou as características de solubilidade que devem ser destacados e discutidos, definindo-se a função, quantidade e necessidade para a via de administração, dentro da faixa considerada permitida (EMEA, 2008; BRASIL, 2011a). O guia da EMEA expõe o problema do impacto que determinados excipientes podem causar na absorção por meio de influência na motilidade gastrintestinal, na permeabilidade do fármaco, interação com os transportadores e susceptibilidade de interação envolvendo o fármaco (ex.: complexação). Esses excipientes são chamados de excipientes ativos e alguns exemplos são: sorbitol, manitol, laurilsulfato de sódio e surfactantes em geral. Quando a presença de um excipiente ativo é indispensável, recomenda-se que o medicamento teste apresente o componente na mesma proporção que o medicamento referência (EMEA, 2008). Na Tabela 4 está a lista dos excipientes identificados como presentes em medicamentos sob Formas Farmacêuticas Sólidas Orais de Liberação Imediata (FFSOLI) contendo diazepam na dosagem de 10 mg com Autorização de Comercialização (AC) no Brasil, cujas formulações foram encontradas. Também são apresentados os valores do banco de dados americano das quantidades mínimas e máximas dos excipientes presentes por unidade de dosagem em forma farmacêutica sólida oral com AC nos Estados Unidos (EUA) a, como uma referência para os constituintes dos medicamentos encontrados.

48 46 Tabela 4 - Excipientes presentes em FFSOLI contendo diazepam (10mg) no Brasil e as quantidades mínimas e máximas dos excipientes presentes em forma farmacêutica sólida oral com Autorização de Comercialização (AC) nos EUA a Excipientes Medicamento contendo estes excipientes com AC concedida pelo Brasil Faixa Presente nas FFSO com AC nos EUA (mg) Água deionizada (4) ND Álcool Etílico (10) 4,4-792 Amido (1, 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14) 0, Celulose Microcristalina (1, 3, 4, 5, 6, 7, 13, 14) 4, Croscarmelose Sódica (1, 3, 5, 7, 13) 2,0-180 Dióxido de Silício (1, 2, 3, 5, 6, 7 13) 0,65-99 Estearato de Magnésio (TODOS) 0, Fosfato de Cálcio Dibásico (3, 5, 13) ND Fosfato de Cálcio Tribásico (2) ND Glicolato Sódico de Amido (2,6) Goma Arábica (11) ND Indigocarmin* (10) - Lactose (3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13) Lactose Monoidratada (1) 35,2-587 Laurilsulfato de Sódio (1) 0,65 52 Manitol (2, 4) Polissorbato 80 (2) 2,2 418 Polividona 30 (10) 0,17-75 Sacarose (2) Talco (1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 13, 14) 0, Nome fantasia do medicamento (Laboratório) (1) Calmociteno (Medley) (2) Compaz (Cristália) (3) Diazepam (Legrand) (4) Diazepam (Indústria Química do Estado de Goiás) (5) Diazepam NQ (EMS Sigma Pharma) (6) Dienzepax (Neo química) (7) Uni Diazepax (União Química) (8) Valium (Roche) (9) Dienpax (Sanofi aventis) (10) Kiatrium (Gross) (11) Noan (Farmasa) (12) Dienpax (SanofisSynthelabor) (13) Diazepam (Germed) (14) Diazepam (FURP) a Banco de dados dos excipientes (FDA, 2010) ND não declarado Fonte: elaborada pela autora

49 47 3 OBJETIVOS Objetivo geral Avaliação biofarmacêutica do fármaco diazepam veiculado em formas farmacêuticas sólidas orais de liberação imediata visando gerar dados que possam subsidiar uma discussão segura sobre sua bioisenção. 3.2 Objetivos específicos Desenvolver e validar método analítico para quantificação do diazepam; realizar estudo sobre os medicamentos contendo diazepam comercializados no Brasil e os excipientes empregados; realizar estudo da solubilidade do fármaco em meios suco gástrico simulado ph 1,2, tampão acetato ph 4,5 e tampão fosfato ph6,8; realizar estudos de dissolução do diazepam a partir de medicamentos sob a forma farmacêutica sólida oral de liberação imediata; discutir os dados de permeabilidade intestinal e biodisponibilidade do diazepam encontrados na literatura; elucidar a classificação biofarmacêutica do diazepam visando subsidiar a decisão sobre bioisenção de novos produtos.

50 MATERIAIS E MÉTODOS Materiais Substância Química de Referência (SQR) Diazepam FB (Farmacopeia Brasileira) (99,9%) Lote: 1044 Ministério da Saúde/ANVISA Farmacopeia Brasileira Fiocruz / INCQS Medicamentos Valium Produto A Fabricante: Produtos Roche Químicos e Farmacêuticos S.A. Apresentação: embalagem com 30 comprimidos Lote: RJ0412 Data de fabricação: 11/2012 Data de validade: 11/2017 Diazepam Produto B Fabricante: GERMED FARMACÊUTICA LTDA. Apresentação: embalagem com 30 comprimidos Lote: Data de fabricação: 06/2012 Data de validade: 06/2014 Dienpax Produto C Fabricante: Sanofi-Aventis Farmacêutica Ltda. Apresentação: embalagem com 20 comprimidos Lote: Data de fabricação: 07/2012 Data de validade: 06/2015

51 Matéria-prima Diazepam MP Globe Química S.A. Lote 10G5008 Data de validade: 31/07/ Solventes e reagentes Acetato de sódio triidratado grau analítico Vetec Acetonitrila grau HPLC J. T. Baker Ácido acético glacial grau analítico Impex Ácido clorídrico grau analítico ISOFAR Cloreto de sódio grau analítico Sulfal química limitada Fosfato de potássio monobásico grau analítico Vetec Hidróxido de sódio grau analítico Vetec Metanol grau HPLC J. T. Baker Equipamentos EspectrofotômetroVarian Cary 50 UV-Vis. HPLC Waters Alliance e2695, com detector arranjos de fotodiodos Coluna C18 Macherey-Nagel (150 x 4,6mm; 3um) Coluna C18 Macherey-Nagel (150 x 4,6mm; 5um) Pré-coluna C18 Macherey-Nagel (8 x 4 mm; 5 µm) Balança analítica Shimadzu AUX 220 Lavadora ultra-sônica UNIQUE phmetro HANNA Bomba de vácuo Marconi MA057/2 Incubadora Shaker SPLabor SP-222-CF-135 Dissolutor Nova Ética 299 Durômetro 298/DGP Friabilômetro Ética modelo 3001 Desintegrador Ética modelo 0120

52 Métodos Desenvolvimento de método para a quantificação de diazepam Compêndios oficiais e artigos foram investigados com o objetivo de avaliar um método analítico apropriado para a adaptação da quantificação do fármaco nos meios biorrelevantes aplicados nos ensaios de solubilidade e dissolução. No Quadro 1 estão descritos os modos de preparo dos meios utilizados. Quadro 1 - Descrição do modo de preparo dos meios biorrelevantes suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2; tampão acetato 4,5 e tampão fosfato 6,8 (UNITED, 2010). Tampão ph 1,2 ph 4,5 ph 6,8-2,0g de cloreto de sódio foram pesados -adicionaram-se 7,0 ml de ácido clorídrico. -transferiu-se para balão volumétrico de 1L. -completou-se o volume com água ultrapurificada e a solução foi homogeneizada -2,99g de acetato de sódio triidratado foram pesados e transferidos para um balão volumétrico de 1L -adicionaram-se 14,0 ml de ácido acético 2N -completou-se o volume com água ultrapurificada e a solução foi homogeneizada -250 ml de uma solução de fosfato de potássio monobásico 0,2M foram preparados e vertidos em um balão volumétrico de 1L -adicionaram-se 112 ml de uma solução de hidróxido de sódio 0,2M -completou-se o volume com água ultrapurificada e a solução foi homogeneizada Fonte: adaptado da Farmacopeia USP, p (UNITED, 2010). A escolha das concentrações inseridas em todos os intervalos considerou os resultados previstos para os ensaios de dissolução, visando monitorar a dissolução de 10 a 100% de cedência e a solubilidade prevista de acordo com a revisão da literatura.

53 Método Espectrofotométrico A triagem no método espectrofotométrico adaptado da Farmacopeia Brasileira 5ªed., foi realizada, primeiramente, por meio da avaliação da linearidade com leitura a 284 nm. A solução estoque 1 (SE1) de diazepam foi preparada diluindo a SQR em solução de HCl 0,1 M, e alíquotas foram transferidas para balões volumétricos sendo o volume final ajustado com os tampões ph 1,2; 4,5 e 6,8, sendo estas, as soluções estoque 2 (SE2). Alíquotas de SE2 foram transferidas para balões volumétricos, compondo as amostras com as concentrações de acordo com a Tabela 5. Nela são apresentados dois intervalos de concentração, com valores menores adequando ao estudo de dissolução e valores mais elevados adequando ao estudo de solubilidade. O intervalo 2 possui valores diferentes de concentração de diazepam para cada um dos meios. Essas concentrações foram estabelecidas de acordo com os valores de solubilidade esperados para o diazepam a partir dos dados presentes na literatura informando uma probabilidade de o fármaco ser mais solúvel no suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2, em seguida em tampão acetato ph 4,5 e tampão fosfato ph 6,8. Tabela 5 Intervalos de concentração de diazepam em µg/ml visando avaliar a linearidade do método espectrofotométrico para sua quantificação nos tampões ph 1,2; 4,5 e 6,8 Intervalo 1 Intervalo 2 Tampão Concentração em µg/ml Concentração em µg/ml ph 1,2 0,11 1,1 4,4 7,7 11,0 13,0 30,0 60,0 90,0 120,0 150,0 ph 4,5 0,11 1,1 4,4 7,7 11,0 13,0 10,0 20,0 40,0 60,0 80,0 ph 6,8 0,11 1,1 4,4 7,7 11,0 13,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 Fonte: elaborada pela autora A verificação da interferência de possíveis produtos de degradação no método espectrofotométrico foi pesquisada por meio da exposição das SE2 à luz, por até 50 horas, e leitura das amostras preparadas a partir das SE2, contendo 11 µg/ml de diazepam em cada um dos meios. Esse ponto foi selecionado aleatoriamente a partir do primeiro intervalo. As amostras compostas de alíquotas das soluções estoque 2, expostas a luz foram comparadas a amostras compostas de SE2 recém preparadas. Foi realizada uma varredura na faixa de 200 a

54 nm, conforme apresentado no Quadro 2, e comprimentos de onda que representaram máximos de absorção foram selecionados para se comparar absorbância versus tempo. Quadro 2 - Condições analíticas relativas ao experimento de especificidade Tempo de exposição (horas) Tampão ph Condição da SE2 1,2 Protegida da luz Exposta à luz ,5 Protegida da luz Exposta à luz 6,8 Protegida da luz Exposta à luz Fonte: elaborado pela autora Método Cromatográfico Posteriormente, um método adaptado da Farmacopeia Brasileira 5ªed., por Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE) foi aplicado. Sendo utilizados os parâmetros temperatura para a coluna de 30 ºC, detector de arranjos de fotodiodos, fase móvel composta por água, acetonitrila e metanol (40:40:20) e fluxo de 0,8 ml/ minuto. Os cromatogramas foram extraídos em 254 nm. A SE proposta foi feita pesando-se 25 mg de diazepam e transferindo para balão volumétrico de 25 ml completando o volume com metanol. Logo, a concentração da SE foi 1000 µg/ml. As amostras foram preparadas diluindo alíquotas da SE nos meios biorrelevantes contendo os tampões ph 1,2; 4,5 e 6,8, em balões volumétricos de 5 ou 10 ml. No guia para validação é recomendado que a curva analítica deve conter no mínimo 5 concentrações. A triagem inicial partiu de um número maior de pontos visando obter o intervalo linear. Duas triagens de intervalos foram avaliadas visando verificar qual seria o mais confiável, por meio da avaliação das equações das retas, desvio entre concentração teórica e experimental fornecido pelas referentes retas, valores de linearidade, exatidão, precisão e estabilidade da amostra final pela comparação das leituras de amostras recém preparadas e amostras preparadas 24 horas e 48 horas antes da leitura. Na primeira triagem de intervalo foi utilizada uma coluna C18 Macherey-Nagel (150 x 4,6mm; 3um) e as seguintes

55 53 concentrações: 0,5; 1,0; 7,5; 15,0; 30,0; 70,0; 110,0; 170,0 µg/ml. Para o segundo, foi utilizada a coluna C18 Macherey-Nagel (150 x 4,6mm; 5um) e o intervalo de: 3,0; 5,0; 8,0; 10,0; 12,0; 15,0; 30,0 µg/ml para os tampões ph 1,2, 4,5 e 6,8. Esses diferentes intervalos se devem ao fato de que primeiramente foi analisada a qualidade do método em intervalo amplo (0,5 a 170,0 µg/ml) empregando uma coluna com tamanho de partícula menor e posteriormente um intervalo com pontos mais próximos entre si e partículas de 5 um. Colunas de tamanho de partícula menor apresentam maior eficiência no processo de separação dos analitos e maior resistência à vazão. O método e os intervalos de concentração que apresentaram melhores resultados foram encaminhados para a fase de validação. Tabela 6- Concentrações estabelecidas para triagem do intervalo adequado Tampões ph 1,2; 4,5; 6,8 Concentração (µg/ml) Primeira triagem Segunda triagem 0,5 3,0 1,0 5,0 7,5 8,0 15,0 10,0 30,0 12,0 70,0 15,0 110,0 30,0 170,0 - Fonte: elaborada pela autora Validação de método cromatográfico para a quantificação de diazepam O objetivo com a validação é o de demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise (BRASIL, 2003b).

56 54 De acordo com a RE 899, de 29 de maio de 2003, Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, a classificação do método proposto remete à categoria de testes quantitativos para a determinação do fármaco em produtos farmacêuticos ou matérias primas. Nesse caso em questão, devem ser avaliados: especificidade, seletividade, linearidade, intervalo, precisão e exatidão Especificidade e seletividade Em um primeiro momento, as recomendações de como verificar a seletividade foram realizadas. Uma das formas de se avaliar a seletividade é pela comparação do resultado da amostra contendo a substância de interesse e amostra isenta da mesma, verificando se não há interferência do meio (RIBANI et al., 2004, BRASIL, 2003b). Portanto, os cromatogramas de amostras contendo meio, analito e matriz em meios biorrelevantes foram comparados. O mesmo teste foi realizado para verificar a influência de excipientes comuns da forma farmacêutica, com o objetivo de verificar a ausência de interferência no pico do fármaco diazepam. A interferência dos excipientes foi avaliada por meio da seleção dos adjuvantes comuns determinados no tópico 5.3 Avaliação dos medicamentos contendo diazepam e seus excipientes. Os excipientes amido, celulose microcristalina, estearato de magnésio, lactose monoidratada, lactose, talco, sacarose foram analisados empregando o método desenvolvido. Quantidades dos excipientes referentes a uma unidade na FFSOLI foram pesadas (conforme a faixa apresentada na Tabela 4), reunidas, transferidas para um balão de 50 ml, completando o volume com fase móvel. A solução foi filtrada e alíquotas de 5 ml foram transferidas para balões de 5 ml e os volumes completados com os meios biorrelevantes, ph 1,2, ph 4,5 e ph 6,8. Na ausência de padrões disponíveis de produtos de degradação, a especificidade foi avaliada por meio da comparação do cromatograma da amostra preparada na concentração de 10,0 µg/ml, com solução estoque da SQR 1000 µg/ml, recém-preparada, e amostras preparadas com soluções estoque submetidas a diferentes condições de estresse causadoras de produtos de degradação, em um período de 24 horas:

57 55 a) SE submetida à presença de luz b) presença de calor em uma temperatura de 45 C c) presença de ácido - ácido clorídrico 0,2 M na SE (1:2) d) presença de base - hidróxido de sódio 0,2 M na SE (1:2) As condições de ácido e base passaram por um procedimento de diluição diferenciado, sendo: 1 ml de substância ácida a 2 ml de SE, mais 1 ml de substância básica minutos antes de compor a amostra para a leitura ou 1 ml de substância básica a 2 ml de SE, mais 1 ml de substância ácida minutos antes de compor a amostra e leitura. Esse procedimento teve por objetivo retornar ao ph inicial da amostra. Como conseqüência, a concentração das SEs, analisadas, nas condições ácido e base foi 5,0 µg/ml Linearidade Foram obtidos resultados da curva analítica em triplicata. Para se determinar o intervalo em que foi obtida uma relação linear, foram considerados os resultados esperados para os estudos de dissolução e solubilidade. O intervalo selecionado para a validação é apresentado na Tabela 7. Tabela 7 - Volumes de solução estoque (SE), 1000 µg/ml, diluídos em tampão ph 1,2; 4,5 e 6,8, para a obtenção das concentrações da curva analítica Concentração final obtida (µg/ml) ph 1,2 e 4,5 ph 6,8 Volume de SE 1 (µl) Volume do balão volumétrico (ml) 3,0 3, ,0 5, ,0 8, ,0 10, , ,0 15, , Fonte: elaborada pela autora

58 Precisão Nesse experimento foram avaliadas a precisão no nível de repetibilidade e precisão intermediária. Repetibilidade (precisão intra-corrida): Foi verificada por 9 determinações, sendo 3 na concentração baixa, 3 na concentração média e 3 na concentração alta do intervalo escolhido. Precisão intermediária (precisão inter-corridas): As determinações se referem à quantificação das concentrações baixa, média e alta, sendo uma triplicata para cada concentração. Foi avaliada por meio da análise da concordância entre os resultados obtidos em três dias diferentes. Onde, DPR: desvio padrão relativo DP: desvio padrão CMD: concentração média determinada Valor máximo aceitável para o DPR: 5% Exatidão Foi verificada por 9 determinações, sendo 3 na concentração baixa, 3 na concentração média, e 3 na concentração alta do intervalo escolhido.

59 57 A exatidão foi calculada pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente (BRASIL, 2003b): Onde, CME: concentração média experimental CT: Concentração teórica Intervalo aceitável para a exatidão: 95%-105% Avaliação dos medicamentos contendo diazepam e seus excipientes Foi feita uma pesquisa dos medicamentos disponíveis no comércio que apresentam apenas o diazepam como substância ativa, na forma farmacêutica de comprimidos de 10 mg. Àqueles cujos excipientes das formulações estavam disponibilizados em meio eletrônico ou com o acesso à bula foram listados e os excipientes foram discutidos, destacando-se representantes críticos, inertes, função na formulação, a existência de relatos sobre o impacto na absorção de fármacos além da inclusão das concentrações preconizadas dos constituintes, para utilização em formas farmacêuticas comprimidos Ensaios Farmacopéicos A avaliação da qualidade dos três produtos contendo diazepam 10mg/comprimido utilizados neste trabalho foi efetuada conforme a Farmacopeia Brasileira 5ª edição. Para tal, foram realizados os ensaios: determinação de peso, teste de dureza, teste de friabilidade, teste de desintegração, uniformidade de doses unitárias e doseamento.

60 Estudo de dissolução da forma farmacêutica comprimidos Nesse estudo, os perfis de dissolução de três produtos de diferentes laboratórios do comércio nacional, sob a forma de comprimidos contendo 10 mg de diazepam, foram avaliados. As condições do perfil de dissolução dos medicamentos foram estabelecidas conforme os ensaios propostos pela legislação (FDA, 2000; BRASIL, 2011a). O estudo foi realizado com o uso do aparato pá sob velocidade de 50 rpm e volume de meio de 900 ml (FDA, 2000; Brasil, 2011a) e coleta de alíquotas de 5 ml dos meios de dissolução. Os tempos de coleta selecionados foram: 1, 5, 10, 15, 30, 45, 65 minutos em todos os meios. Um ponto adicional aos 95 minutos, sob a condição de 150 rpm foi adicionado, visando verificar a dissolução sob o tempo infinito, que é descrito nos capítulos gerais da Farmacopeia americana, na sessão The dissolution procedure: development and validation, <1092>. O perfil de dissolução foi estabelecido a partir da análise de doze unidades farmacotécnicas de cada produto, em cada meio de dissolução. A amostra coletada foi filtrada e quantificada por CLAE, método validado neste trabalho. As porcentagens de fármaco dissolvido foram encontradas a partir do emprego de balanço de massas nas concentrações encontradas a partir das áreas geradas pelas amostras. A avaliação do perfil de dissolução prosseguiu com a análise da eficiência de dissolução (ED). A ED é a razão entre a área sob a curva de dissolução do fármaco (A 1 ) obtida no tempo t, e a área do retângulo traçado ligando a linha correspondente a 100% de dissolução ao tempo t correspondente (A R ). A ED expressa em porcentagem pode ser definida por: % ED = (A1/AR) x 100 Os tempos utilizados para o cálculo da ED foram distintos entre os meios, sendo em meio ph 1,2: 10 minutos para o produto A (t=10), 15 minutos para o produto B (t=15), 30 minutos para o produto C e 95 minutos para os meios ph 4,5 e 6,8 (t=95) em todos os produtos. Os resultados obtidos para os produtos foram comparados por análise de variância (ANOVA) (comparação dos perfis de dissolução entre os produtos em cada um dos meios), através do programa GraphPad Prism versão 6.0, em um intervalo de confiança de 95% e valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

61 Estudo de solubilidade do fármaco diazepam Os guias do FDA, Brasil, EMA e WHO recomendam que a solubilidade da substância seja determinada empregando técnica da solubilidade em equilíbrio (método da agitação orbital em frasco - shake-flask ou diagrama de fases) em meios biorrelevantes, ou seja, meios capazes de mimetizar condições fisiológicas. Os tampões utilizados foram o ácido clorídrico ph 1,2, acetato ph 4,5 e fosfato ph 6,8 (WHO, 2006; EMEA, 2008; BRASIL, 2011a). O procedimento foi realizado por meio da adição do diazepam matéria-prima aos meios, agitados em Incubadora com agitação orbital (tipo Shaker), na temperatura de 37⁰C ± 1⁰C e 50 rpm, por 54 horas. Em um primeiro momento, o cálculo da quantidade de diazepam foi estabelecido a partir do maior dado de solubilidade encontrado na literatura, independentemente do meio, que seria 0,25 mg/ml (LINDENBERG, 2006). Esse valor recebeu uma adição de 10% de excesso do fármaco, obtendo uma concentração de 0,275mg/mL. Por conseguinte, em 50 ml deveriam ser adicionados 13,75 mg de fármaco. Entretanto, durante a realização do procedimento em tampão fosfato, apesar dos resultados condizentes, verificou-se que seria prudente diminuir o excesso na etapa seguinte, que seria o ensaio em tampão acetato. Os cálculos foram realizados com o mesmo raciocínio que o valor anterior, porém com um dado de solubilidade menor. As massas adicionadas nos três meios empregados no estudo de solubilidade estão apresentadas na Tabela 8. Tabela 8 - Massa de fármaco adicionada a um volume de 50 ml de cada meio para realização do teste de solubilidade Meio Massa de fármaco (mg) Fluido Gástrico Simulado ph 1,2 13,75 Tampão acetato ph 4,5 3,3 Tampão fosfato ph 6,8 13,75 Fonte: elaborada pela autora As alíquotas (2 ml) foram coletadas em suco gástrico simulado nos intervalos de tempo 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 e 20 horas e nos demais meios em 0, 1, 2, 4, 8, 20, 32, 44 e 56 horas. Foram filtradas com auxílio de unidades filtrantes Millex com poro de 0,45 µm. O meio foi reposto imediatamente. As amostras coletadas foram diluídas para emprego do método cromatográfico desenvolvido.

62 60 Tabela 9 Dados de diluição das amostras obtidas durante o estudo de solubilidade Meio Fluido Gástrico Simulado sem adição de enzima ph 1,2 Tampão acetato ph 4,5 Tampão fosfato ph 6,8 Fonte: elaborada pela autora Tempo (horas) Volume de amostra (ml) Volume de meio (ml) 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 20 0,1 1,9 0 2,0-2,4 0,5 1,5 8, 20, 32, 44, 56 0,4 1,6 0 2,0-2, 4 0,5 1,5 8, 20, 32, 44, 56 0,4 1,6 Para cada meio, devem ser usadas, no mínimo três replicatas e o coeficiente de variação (CV%) deve ser menor que 5% (cinco por cento). O ph foi registrado no início e no final do experimento (BRASIL, 2011a). diazepam Coleta de dados bibliográficos sobre a permeabilidade intestinal do A discussão sobre a permeabilidade intestinal é diferenciada nesse trabalho uma vez que, a permeabilidade é uma das três características fundamentais para se subsidiar a bioisenção, colaborando como uma pesquisa especial para atender o objetivo. Os dados de permeabilidade encontrados na literatura e expostos no tópico , Permeabilidade do diazepam são comentados. As informações no referido tópico foram coletadas por meio de busca nas seguintes bases de dados bibliográficos: Periódicos Capes ( PubMed ( Scopus ( e SciELO ( bem como consulta a legislações e compêndios oficiais, no período de março de 2011 à junho de 2013, utilizando os seguintes termos de busca: bioisenção, diazepam, SCB, permeabilidade, solubilidade, dissolução.

63 61 5- RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1-Desenvolvimento de método para a quantificação de diazepam O desenvolvimento de um método analítico visa selecionar as melhores condições para a análise inequívoca de um composto, visando maior rapidez, menor custo e geração de resíduos (CAUSON, 1997). Primeiramente, foi realizada a pesquisa dos métodos para quantificação do diazepam em compêndios oficiais: Farmacopeia Brasileira 5ª ed. (2010), United States Pharmacopeia 33ª ed. (2010), Farmacopeia Japonesa 16ª ed. (2011). Posteriormente, os métodos por espectrofotometria UV e cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) presentes na Farmacopeia Brasileira 5 edição, foram submetidos à avaliação após as adaptações necessárias à quantificação do analito diluído nos meios biorrelevantes: tampões ácido clorídrico ph 1,2, acetato ph 4,5 e fosfato ph, 6,8. Estes meios são aplicados nos estudos de solubilidade e dissolução exigidos nas legislações, em vez dos meios descritos nos métodos oficiais, que não são satisfatórios para o presente estudo. Sendo assim, se tornou necessário o desenvolvimento de um método que atendesse essa necessidade seguida da validação que gera confiabilidade para a determinação quantitativa do diazepam. Os métodos espectrofotométrico e cromatográfico foram avaliados Método Espectrofotométrico Alguns autores utilizaram a espectrofotometria UV para realizar a quantificação do diazepam em meios biorrelevantes como Lindenberg (2006), que realizou um estudo de solubilidade com leituras em 276 nm e Domínguez e colaboradores (1994) que avaliaram a dissolução de formas farmacêuticas submetendo as amostras à análise em leitura de 242 nm. Já Américo e colaboradores (2008), encontraram em varredura de 190 a 400 nm, um pico de absorbância em 207,8 nm, afirmando ser a espectrofotometria uma técnica simples e rápida, quando não há necessidade de grande de seletividade. A Farmacopeia Brasileira 5ª edição apresenta um método espectrofotométrico, entretanto, o mesmo não descreve a quantificação do analito em meios biorrelevantes, com diferentes valores de ph, os quais são requeridos nas legislações vigentes para estudos de bioisenção. Portanto, o método farmacopéico foi

64 62 adaptado e submetido à experiência para esse estudo. Na triagem do método de quantificação, foi utilizado um espectrofotômetro Varian Cary 50 UV-Vis. Nas Figuras 3 e 4 estão os gráficos de absorbância versus concentração nos intervalos 0,11 a 13,0 µg/ml em todos os meios (Figura 3) e em intervalos de concentração específicos: 13,0 a 150,0 µg/ml (ph 1,2) ; 13,0 a 80 µg/ml (ph 4,5) e 13,0 a 50,0 µg/ml (ph 6,8) (Figura 4). Os coeficientes de determinação se apresentaram com valores superiores a 0,996, com exceção da linearidade em ph 4,5 no intervalo 0,11 a 13,0 µg/ml, que apontou R 2 igual a 0,987. Entretanto, todos os coeficientes de determinação (R 2 ) se mostraram satisfatórios, uma vez que proporcionam um coeficiente de correlação (r) adequado, superior a 0,99, conforme o que recomenda o Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Figura 3 - Gráfico de absorbância (Abs.) versus concentração do diazepam: 0,11 a 13,0 µg/ml nos meios ph 1,2 (a), ph 4,5 (b) e ph 6,8 (c), obtidos por leitura espectrofotométrica a 284 nm Abs. 0.8 R² = 0,999 (a) Abs. R² = 0, (b) Concentração (µg/ml) Concentração (µg / ml) 0.4 Abs. R² = 0,999 (c) Concentração (µg/ml) Fonte: elaborada pela autora

65 63 Figura 4 - Gráfico de absorbância (Abs.) versus concentração do diazepam: 13,0 a 150,0 µg/ml em meio ph 1,2 (a), 13,0 a 80 µg/ml em meio ph 4,5 (b) e 13,0 a 50,0 µg/ml em meio ph 6,8 (c), obtidos por leitura espectrofotométrica a 284 nm 0.3 Abs. (a) R² = 0,999 Abs (b) R² = Concentração (µg/ml) Concentração (µg/ml) Abs (c) R² = 0, Concentração (µg/ml) Fonte: elaborada pela autora Para dar início à verificação da especificidade, foi realizada a varredura no intervalo de 200 a 400 nm de amostras, na concentração de 11 µg/ml, preparadas com alíquotas de diazepam SE (diazepam em meio HCl) diluídas nos três meios. Essas soluções se dividiram entre expostas e não expostas à luz. Na Figura 5 estão apresentados os gráficos de variação da absorbância em função do tempo elaborados a partir dos comprimentos de onda que apresentaram maior absorbância (240 e 285 nm para tampão ph 1,2 e 230 nm para ph 4,5 e 6,8). Nos gráficos a e b, referentes à amostra em meio ácido seria esperado o aparecimento de produtos de degradação, pois de acordo com Lindenberg (2006), o diazepam é passível de hidrólise ácida. Nos experimentos de solubilidade realizados observou-se um pequeno decaimento da concentração do fármaco após duas horas de exposição ao meio ácido. Lindenberg (2006) informa ainda que essa situação foi encontrada com o estudo de solubilidade do diazepam em meio ácido (suco gástrico simulado ph 1,2) e a mesma queda nas concentrações quantificadas não ocorreram em meios tampão fosfato ph 4,5, água deionizada e suco intestinal simulado ph 6,8. Entretanto, pôde-se observar que em torno de 18 horas após o preparo das soluções em ambas as condições de exposição foram evidenciados sinais de degradação significativa do diazepam em todos os meios. Vale

66 64 ressaltar que, nessa etapa de desenvolvimento de método analítico, a SE1 foi composta de fármaco e HCl 0,1M, conforme a solução estoque do método espectrofotométrico farmacopéico. Portanto, como as SE2 foram compostas de alíquotas de SE1, todas as amostras detiveram uma porcentagem de solução ácida. Logo, foi inferido que a SE1 preparada conforme o método espectrofotométrico sequer seria adequada para realizar este estudo de especificidade. Figura 5 Gráficos de Absorbância em função do tempo para amostras contendo diazepam em tampões: ph 1,2 comprimentos de onda 240 nm (a) e 285 nm (b); ph 4,5 (c) e ph 6,8 (d) em comprimento de onda 230 nm com e sem exposição à luz Abs. 1.4 (a) Abs. 1.4 (b) Tempo (h) Tempo (h) Abs. 1.4 (c) Abs. 1.4 (d) Tempo (h) Tempo (h) Protegida da luz Exposta à luz Fonte: elaborada pela autora É sabido que o diazepam pode sofrer degradação por exposição à luz, com formação de benzofenonas (ALBINI; FASANI, 1998, GÖRÖG, 2000). Nos gráficos a e b da Figura 5 ainda é possível observar pequena acentuação da degradação em decorrência da exposição das amostras à luz, o que não é detectado nos demais meios. Nesta etapa do trabalho ficou

67 65 caracterizado que houve aparecimento de produtos de degradação, provavelmente por colaboração do modo de preparo da solução estoque recomendada pelo método espectrofotométrico e este, não foi seletivo para o diazepam na presença dos prováveis produtos de degradação. Sendo esta a técnica indicada no estudo de dissolução contido na monografia para diazepam comprimidos da Farmacopeia Brasileira 5 edição (BRASIL, 2010a) é necessário salientar que seu emprego na rotina de controle de qualidade e em experimentos de curto prazo pode se justificar, mas que a espectrofotometria na região do UV não pode ser empregada para quantificação do fármaco em estudos de solubilidade que demandam maior tempo de contato entre o analito e os diferentes meios. Logo, apesar do método ter apresentado coeficientes de correlação (r) adequados, sugerindo boa linearidade, não possibilitou a quantificação do analito de interesse em detrimento dos produtos de degradação. Esses resultados parciais permitiram a elaboração do resumo, ANEXO 1, apresentado no evento SINPOSPq Método Cromatográfico Para desenvolver um método cromatográfico confiável e capaz de quantificar o diazepam solubilizado em meios biorrelevantes específicos, as informações da literatura foram consultadas. Foram consultados três trabalhos que descrevem a quantificação do diazepam nos referidos meios, por CLAE. Sendo um utilizando CLAE acoplada a detector de massas e fase móvel composta por água e acetonitrila (ZAKI et al.,2010), outro CLAE-UV e fase móvel composta por tampão acetato de sódio ph 3,5/acetonitrila (50:50 v/v) (CLARYSSE et al., 2009) e CLAE-UV e fase móvel composta por tampão fosfato ph 6,0 (45:55 v/v) (ANNAERT et al., 2010). A monografia do diazepam na Farmacopeia Brasileira 5ª ed. (2010) apresenta um método de quantificação por CLAE, com detector UV, fase móvel composta de água, acetonitrila e metanol e solução estoque de diazepam diluído em metanol. Optou-se por avaliar a resposta do método sob as condições farmacopéicas (com exceção do detector UV, que foi substituído por DAD com o sinal extraído no comprimento de onda referente ao método UV), como o ponto inicial para o planejamento de um novo método. O perfil dos cromatogramas apresentou resultados satisfatórios quanto à forma do pico e o tempo de retenção do diazepam, que se apresentou por volta de 8,0 minutos (suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2), 8,1 minutos (meio acetato ph 4,5) e 8,2 minutos

68 AU AU AU 66 (meio fosfato ph 6,8) conforme Figura 6. Prosseguiu-se com testes de linearidade do método em diferentes intervalos de concentração do analito. O intervalo 1 proposto (concentrações de 0,5 a 170,0 µg/ml) apresentou linearidade, porém as equações geradas forneceram valores reais das concentrações com um grande desvio em relação à teórica, além de não haver precisão e exatidão nas concentrações 0,5 e 1,0µg/mL. A conclusão alcançada foi que as equações geradas pelos pontos desse intervalo não foram representativas e que os pontos citados eram detectáveis, porém estavam abaixo do limite de quantificação. Figura 6 - Cromatograma do fármaco diazepam na concentração de 15,0 µg/ml em (a) suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2, (b) tampão ph 4,5, (c) tampão ph 6,8, obtido por meio de detector DAD em 254nm (a) Minutes (b) Minutes (c) Minutes Fonte: elaborada pela autora O dado relevante das análises realizadas no intervalo 1 foi referente à estabilidade da amostra final. Na Figura 7 estão ilustrados os gráficos de área do cromatograma versus concentração analítica de amostras recém-preparadas e amostras preparadas 24 e 48 horas antes da quantificação.

69 67 Figura 7 - Comparação dos gráficos das amostras de 0 e 24 horas e 0 e 48 horas apresentando a área versus concentração do diazepam na faixa de 0,5 a 170,0 µg/ml nos meios ph 1,2, (a) e (b), ph 4,5 (c) e (d) e ph 6,8 (e) e (f), obtidos por leitura em detector DAD em 254 nm Área (a) Área (b) hora 24 horas hora 48 horas Concentração (µg/ml) Concentração (µg/ml) Área (c) Área (d) hora 24 horas hora 48 horas Concentração (µg/ml) Concentração (µg/ml) Área (e) Área (f) hora 24 horas hora 48 horas Concentração (µg/ml) Concentração (µg/ml) Fonte: elaborada pela autora Avaliando a Figura 7 é possível notar que nos tampões ph 4,5 e 6,8 os perfis das amostras preparadas e recentemente e após 24 e 48 horas antes da leitura não apresentam divergência de valores das áreas tão intensa quanto a diferença entre as áreas das leituras das amostras no meio ph 1,2. Um motivo para essa observação seria a hidrólise ácida do

70 68 diazepam que gera produtos de degradação como 2-metilamino-5-cloro-benzofenona e glicina (NUDELMAN; WAISBAUM, 1995; LINDENBERG, 2006). Por meio dos resultados obtidos nesse ensaio é possível notar que a amostra não apresenta estabilidade após 24 ou 48 horas, delimitando assim o tempo do ensaio. Cabe ressaltar também que pelo método cromatográfico foi possível identificar o decaimento do sinal em relação ao tempo. No método espectrofotométrico houve queda da resposta, seguido pelo aumento da mesma após algumas horas indicando a não diferenciação entre o analito e os produtos de degradação, o que não foi observado no método por CLAE resguardando-o da não diferenciação entre o analito e os produtos. A respeito da segunda triagem para estabelecimento das curvas analíticas (concentrações variando de 5,0 a 30,0 µg/ml em meios ph 1,2 e 6,8 e 5,0 a 15,0 µg/ml em meio ph 4,5), foram encontrados indícios satisfatórios de linearidade, precisão e exatidão no método para quantificação do diazepam, com equações representativas e desvio pequeno entre a concentração real e teórica, por meio da utilização das concentrações conforme Tabela 10. Devido ao fato de quanto menor o tamanho de partícula da coluna maior é a resistência à vazão, optou-se por utilizar na validação a coluna com partículas maiores (5µm) que gerou pressão compatível com a vazão e os limites do cromatógrafo, uma vez que o cromatograma gerado por ambas as colunas apresentaram qualidade similar. Tabela 10- Concentrações estabelecidas para o intervalo validado Concentração (µg/ml) Tampão ph 1,2 Tampão ph 4,5 Tampão ph 6,8 3,0 3,0 3,0 5,0 5,0 5,0 8,0 8,0 8,0 10,0 10,0 10, ,0 15,0 15,0 15, ,0 Fonte: elaborada pela autora Durante o desenvolvimento de método, os resultados obtidos com a cromatografia apresentaram bons indícios de conformidade em relação aos parâmetros de validação, prosseguindo-se com as etapas de validação, que originaram resultados parciais apresentados no evento IV CONCIFOP, conforme o ANEXO 2.

71 AU AU AU Validação de método cromatográfico para a quantificação de diazepam Especificidade e seletividade A seletividade foi avaliada por meio da comparação entre os cromatogramas de amostras compostas de meio e analito e amostra com apenas meio em sua composição. Nos cromatogramas de amostras contendo meio fluido gástrico simulado sem enzimas ph1,2, acetato ph4,5 e fosfato não houve indício relevante de interferente no tempo de retenção relativo ao diazepam. Os cromatogramas de 11 minutos de corrida da Figura 8 mostram que no ensaio estabelecido para avaliar a influência dos excipientes não há picos que poderiam prejudicar a quantificação do fármaco. Figura 8: Cromatograma da mistura de excipientes comumente utilizados nas unidades de diazepam, diluídos em a) suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2; b) meio acetato ph 4,5; c) meio fosfato ph 6,8, pesquisado em 254 nm em detector DAD (a) Minutes (b) Minutes (c) Minutes Fonte: elaborada pela autora

72 70 O início da avaliação da especificidade se deu pela submissão da amostra à variável tempo conforme demonstrado na Figura 7, em desenvolvimento de método. O método analítico foi melhor avaliado, para a confirmação da especificidade do método em quantificar o analito na presença de produtos de degradação gerados por calor, tempo, presença de ácido e base. Não houve aparecimento de outros picos ou diferenças nas áreas obtidas entre amostras constituídas de SE sob estresse e SE recém preparada. Sugere-se que não houve aparecimento de produtos de degradação na SE sob essas condições. A Figura 9 apresenta os cromatogramas obtidos pelo analito em fluido gástrico simulado sem enzimas ph 1,2. O padrão apresentado se extende aos resultados encontrados nos demais meios, tampão acetato ph 4,5 e tampão fosfato ph 6,8. É possível observar que as áreas do analito submetido a exposição a luz e calor se mantiveram próximas a área da amostra recém preparada. As amostras submetidas a estresse ácido e alcalino foram condizentes porque os valores das áreas dos picos representaram a metade da concentração da amostra sem estresse, situação essa causada pela diluição, aplicada primeiramente pela adição de substância degradante e uma segunda solução para neutralizar o ph da primeira, antes da leitura. Embora seja uma via comum ao diazepam transformar-se em 2-amino(n-metil)-clorobenzofenona ou 2-amino-clorobenzofenona quando submetido a meio ácido, esta observação só foi realizada por Gomes (1997) quando associou-se a condição de 100 ºC e o contato com HCl 6mol/L. Mas, uma vez sendo submetido ao contato com suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2, separadamente de calor de 45ºC, os cromatogramas não se mostraram diferentes dos referentes às amostras não submetidas ao estresse. Todas essas observações estiveram de acordo nos meios acetato ph 4,5 e fosfato ph 6,8, como no suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2.

73 AU AU AU AU AU 71 Figura 9 - Cromatogramas das amostras elaboradas com solução estoque submetida a diferentes condições de estresse, diluídas em meio ph 1,2. a) SE submetida à presença de luz; b) calor a 45 C; c) presença de ácido clorídrico 0,2M; d) presença de hidróxido de sódio 0,2 M; e) amostra de SE recém preparada, sem condição de estresse 0.06 (a) Minutes (b) Minutes (c) Minutes 0.06 (d) Minutes 0.06 (e) Minutes Fonte: elaborada pela autora

74 Linearidade Para avaliar a linearidade foram preparadas diluições a partir da solução estoque diazepam SQR. Os resultados dos testes devem ser tratados por métodos estatísticos apropriados para determinação do coeficiente de correlação, interseção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. O coeficiente de correlação (r) deve ser, no mínimo 0,99 (BRASIL, 2003b). Os resultados da linearidade obtidos estão apresentados na Figura 10 e Tabela 11. Figura 10 - Curva analítica obtida por meio da média de três determinações de soluções na faixa de concentração de 0,3 a 15,0 µg/ml de diazepam em meio fluido gástrico simulado sem enzimas (a); 0,3 a 15,0 µg/ml em meio acetato ph 4,5 (b) e 0,3 a 30,0 µg/ml em meio fosfato ph 6,8 (c); quantificadas por CLAE-DAD em 254nm Fonte: elaborada pela autora

75 73 A reta representa a média de três determinações em cada ponto. Foi satisfatória devido ao coeficiente de correlação (r) maior que 0,99, assim como exige a legislação. Os valores de inclinação e interseção estão presentes na Tabela 11, implícitos na equação da reta. O desvio foi calculado a partir da obtenção da diferença, em porcentagem, entre as concentrações teóricas e as concentrações experimentais encontradas pelas equações das retas geradas. Tabela 11 - Equação da reta, coeficiente de determinação (R 2 ) e coeficiente de correlação (r), para as retas obtidas na determinação da linearidade do método nos três meios avaliados Tampão Equação da reta Coeficiente de determinação (R 2 ) Coeficiente de correlação (r) ph 1,2 y = 87996x ,999 0,999 ph 4,5 y = 86745x ,999 0,999 ph 6,8 y = 90018x ,999 0,999 O método dos quadrados mínimos foi utilizado para estabelecer os resíduos da regressão linear. Gráficos exploratórios de resíduo foram elaborados no programa GraphPadPrism 6.0 a partir dos dados da triplicata da curva analítica em cada um dos meios. Na figura 11 estão apresentados os resíduos devido à linearidade nos meios: suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 (a), tampão acetato ph 4,5 (b) e tampão fosfato ph 6,8. Os resíduos se apresentaram aleatórios e bem distribuídos nos três gráficos indicando não haver tendência para o cálculo da linearidade.

76 74 Figura 11 Gráficos de resíduos obtidos por meio dos resultados da linearidade em meios fluido gástrico simulado sem enzimas (a); acetato ph 4,5 (b) e fosfato ph 6,8 (c) Fonte: elaborada pela autora Precisão Repetibilidade O método apresentou repetibilidade adequada devido aos valores inferiores a 5% no desvio padrão relativo em concentração baixa (CB), concentração média (CM) e concentração alta (CA).

77 75 Tabela 12- Valores de concentração teórica (CT), concentração média experimental (CME) e desvio padrão relativo (DPR), referentes à determinação da repetibilidade do método para a quantificação do diazepam nos três meios Tampão Concentração CT(µg/mL) CME (µg/ml) DPR(%) ph 1,2 ph 4,5 ph 6,8 Fonte: elaborada pela autora CB 3,0 3,00 2,59 CM 10,0 9,98 2,03 CA 15,0 14,84 3,08 CB 3,0 3,03 2,11 CM 10,0 10,27 2,91 CA 15,0 15,23 1,84 CB 3,0 2,90 1,03 CM 15,0 14,90 3,47 CA 30,0 30,07 0,10 Precisão Intermediária O método apresentou repetibilidade devido aos valores inferiores a 5% no desvio padrão relativo em concentração baixa (CB), concentração média (CM) e concentração alta (CA). Tabela 13 - Valores de concentração teórica (CT), concentração média experimental (CME) e desvio padrão relativo (DPR), referentes à determinação em três dias, da precisão intermediária do método, para a quantificação do diazepam nos três meios Tampão Concentração CT(µg/mL) CME (µg/ml) DPR(%) ph 1,2 ph 4,5 ph 6,8 Fonte: elaborada pela autora CB 3,0 3,07 3,45 CM 10,0 9,85 2,80 CA 15,0 14,88 0,69 CB 3,0 3,02 0,91 CM 10,0 10,22 3,00 CA 15,0 15,39 2,43 CB 3,0 3,04 4,06 CM 15,0 15,16 3,37 CA 30,0 30,33 2,38

78 Exatidão O método mostrou-se exato na faixa de concentração avaliada indicando que os resultados experimentais oscilam em relação ao valor real em porcentagem inferior a 5%, ou seja, com exatidão entre 95,0 e 105,0%. Tabela 14 - Valores de concentração teórica (CT), concentração média experimental (CME) e exatidão, expressa em porcentagem, referentes à exatidão do método para a quantificação do diazepam nos três meios, utilizando triplicata em três concentrações Tampão Concentração CT (µg/ml) CME (µg/ml) DPR (%) ph 1,2 ph 4,5 ph 6,8 Fonte: elaborada pela autora CB 3,0 3,00 100,26 CM 10,0 9,98 99,82 CA 15,0 14,84 98,97 CB 3,0 3,03 101,00 CM 10,0 10,27 102,68 CA 15,0 15,23 101,54 CB 3,0 2,90 96,74 CM 15,0 14,90 99,37 CA 30,0 30,07 100,23 De acordo com os dados experimentais encontrados nos parâmetros da validação, é possível verificar que todos eles se enquadraram nos respectivos limites e demonstram-se adequados como um método confiável para a quantificação de diazepam em meios biorrelevantes por CLAE-DAD, apresentando linearidade, especificidade, exatidão e precisão Avaliação dos medicamentos contendo diazepam e seus excipientes Para que sejam bioisentos novos produtos baseando-se no SCB, estes devem conter fármacos com alta permeabilidade intestinal (fração de dose absorvida 85% da dose administrada, demonstrada com base em dados provenientes de estudos em seres humanos), ampla faixa terapêutica e ausência de evidências documentadas de bioinequivalência ou problemas de biodisponibilidade devido à formulação. Recomenda-se ainda que, para o

79 77 pedido de bioisenção, a formulação teste empregue os mesmos excipientes presentes na formulação do medicamento de referência (BRASIL, 2011a). Visto que é de suma importância avaliar a formulação, verificou-se na relação de excipientes dos medicamentos contendo diazepam (Tabela 4 tópico ), que o medicamento referência no mercado brasileiro, produto 8, não apresenta excipientes considerados ativos em sua composição. No entanto, na composição dos outros medicamentos, há a presença de laurilsulfato de sódio, manitol e polissorbato 80 em três produtos, sendo que o medicamento 2 apresenta dois dos excipientes ativos. O laurilsulfato de sódio e polissorbato 80 são sustâncias tensoativas e sabe-se que esses compostos são componentes críticos tanto em baixa concentração como em alta, uma vez que em pequena quantidade podem diminuir a tensão superficial do meio de dissolução aumentando a velocidade de dissolução do fármaco e em grandes quantidades podem formar micelas com o fármaco, dificultando a dissolução (SHARGEL et al., 2005). Em geral, a função primária do manitol é como composto diluente. Este não é absorvido significativamente no trato gastrintestinal, mas em doses elevadas, interfere na motilidade intestinal, podendo inclusive causar diarréia osmótica (ROWE et al., 2009). Uma vez que vários produtos encontrados no mercado nacional não apresentam excipientes ativos, podemos supor que não são substâncias indispensáveis e já que o produto referência não apresenta nenhum deles, um novo produto candidato à bioisenção não deve conter esses componentes críticos. No quadro 3 é apresentada a lista de excipientes dos três medicamentos selecionados nesse estudo, bem como a faixa usual dos excipientes de acordo com o banco de dados do FDA e tendo clara a função na forma farmacêutica. É possível notar que em termos de tipos de excipientes usados, o produto A (referência) faz uso de apenas 4 compostos além do princípio ativo, em seguida o produto C (similar) apresenta um número maior de excipientes e, por final, o produto B (genérico) se destaca na variedade dos mesmos. Dentre as funções encontramos lubrificante, corante, diluente, agludinante, desintegrante, espessante e antiaderente. Assim como o tipo do excipiente pode influenciar na absorção do fármaco, a quantidade de excipientes inertes, da mesma forma, pode modificá-la. Um exemplo disso é o fato de que lubrificantes em grandes quantidades podem apresentar um comportamento hidrofóbico e prejudicar a dissolução (SHARGEL et al., 2005). Portanto, a quantidade de estearato de magnésio e talco nos produtos avaliados deve respeitar os limites para beneficiar a dissolução. Para o estearato de magnésio, é inclusive recomendado que seja usada a menor quantidade possível na formulação, devido à sua natureza hidrofóbica que

80 78 pode retardar a dissolução, além de formar camadas hidrofóbicas que não se dispersam após dissolução. O talco não é tão comumente utilizado atualmente, entretanto o seu uso é amplo no desenvolvimento de produtos de liberação controlada, uma vez que é capaz de retardar a dissolução (ROWE et al., 2009). De acordo com resultados obtidos em ensaio de dissolução, é possível supor se algum excipiente, tido como inerte, estaria alterando a velocidade de dissolução e consequentemente, a absorção. O estearato de magnésio está presente nos três medicamentos e o produto B apresenta um lubrificante adicional, o talco. A composição das formulações não é acessível em dados quantitativos, mas pode-se sugerir que, se algum medicamento apresentasse velocidade de dissolução lenta, ou seja, não atingir 85% do declarado em até 30 minutos, os lubrificantes poderiam estar em quantidades maiores que a necessária, mesmo dentro da faixa usual (inclusa na Tabela 4), que pode ser ampla. Quadro 3 Excipientes presentes nos produtos A (referência), B (genérico) e C (similar) Excipientes Produtos A (Referência) B (Genérico) C (Similar) Amido de milho x x Estearato de magnésio x x x Indigocarmin x Lactose x x Celulose microcristalina x Corante alumínio laca vermelho eritrozina 3 x Croscarmelose sódica x Dióxido de silício x Fosfato de cálcio dibásico x Lactose monoidratada x Talco x Amido de milho pré-gelatinizado x Corante amarelo tartrazina x Fonte: elaborado pela autora De acordo com Rowe e colaboradores (2009), o amido de milho é usado como um desintegrante, diluente e espessante e geralmente se usa na formulação de comprimidos 3-20% p/p (5-10%, dependendo do tipo de amido) como um aglutinante para granulação a

81 79 úmido e testes de friabilidade, dureza, desintegração e dissolução colaboram verificando se a quantidade deste excipiente está apropriada para a devida liberação do fármaco. Logo caso as velocidades de dissolução dos produtos A e C se apresentassem diferentes da velocidade de dissolução de B, poderia ser atribuído à presença do amido, ou sua quantidade, que não está incluído na formulação B. O amido de milho pre-gelatinizado é empregado também como aglutinante e autolubrificante. Porém, quando é usado com outros excipientes, pode ser necessário adicionar um lubrificante à formulação. Embora o estearato de magnésio 0,25% p/p seja comumente utilizado para este fim, as concentrações superiores a essa podem ter efeitos prejudiciais sobre a dissolução do fármaco. No caso de se utilizar um lubrificante com o amido de milho pregelatinizado, uma boa alternativa seria não usar o estearato de magnésio, como é o caso do produto C, e sim, o ácido esteárico (ROWE et al., 2009). A celulose microcristalina e croscarmelose sódica podem em grandes quantidades, ter um efeito laxativo. Entretanto, é pouco provável a intercorrência de um problema no TGI quando usada como excipiente em formulações farmacêuticas, em quantidades usuais para as formas farmacêuticas sólidas orais (ROWE et al., 2009). Quanto à formulação, a presença da celulose microcristalina desempenha um papel importante como um diluente, mas também como um modificador da liberação. A ausência ou quantidade inferior à necessária pode prejudicar a liberação do fármaco, uma vez que facilita a penetração do meio aquoso (BRAVO et al., 2002). Apenas o produto B apresenta celulose microcristalina e sua presença poderia causar maior liberação e dissolução do fármaco e consequentemente divergências entre os resultados dos três produtos estudo de dissolução. A lactose é um composto comumente utilizado como diluente em cápsulas e comprimidos. No estado sólido pode ser encontrada em diferentes formas isoméricas. Diferentes qualidades de lactose, que variam nas suas propriedades físicas, estão disponíveis no comércio, em suas várias formas cristalinas e amorfas. O tamanho da partícula influencia a velocidade de dissolução. Cristais grosseiros se dissolvem mais lentamente que finas partículas de lactose (ROWE et al., 2009, DFE PHARMA, 2011). 5.4 Ensaios Farmacopéicos Os ensaios farmacopéicos tiveram por objetivo avaliar se as especialidades farmacêuticas empregadas nos ensaios de dissolução apresentavam qualidade, conforme as

82 80 especificações. Os procedimentos foram realizados conforme os métodos da Farmacopeia brasileira 5ªed. Como exposto no Quadro 4, os três produtos apresentaram resultados conformes. Testes de friabilidade, dureza e desintegração são fundamentais para verificar se o produto tem uma formulação de qualidade, uma vez que quantidades inadequadas de excipientes podem ser avaliadas por esses experimentos (ROWE et al., 2009). Quadro 4 Resultados dos medicamentos referência (A), genérico (B) e similar(c) nos ensaios farmacopeicos Teste Produto A B C Parâmetro de aceitação Resultado Uniformidade de doses unitárias (valor de aceitação) 5,0 6,3 11,5 <15 Cumpre o teste Determinação de peso ± 7,5% Cumpre o teste Teste de friabilidade (%) 0,42 0,40 0,18 <1,5% Cumpre o teste Doseamento (%) 106,2 99,3 96,6 92,5% a 107,5% Cumpre o teste Teste de dureza (N) 39,7 37,4 29,0 - Informativo Teste de desintegração desintegração em até 30 minutos (água a 37 C) Cumpre o teste Apesar de todos os resultados expressos no Quadro 4 (dados na íntegra expostos nos APÊNDICES, A a E) cumprirem os requisitos foi possível isolar algumas características diferentes entre eles. O doseamento informa que há maior quantidade de diazepam no medicamento referência, seguido pelo genérico e por fim o similar, sendo a diferença de teores superior a 5% entre os produtos similar e genérico comparativamente ao referência e de acordo com a RDC nº 31 (BRASIL, 2010b), para as formas farmacêuticas não isentas do estudo de biodisponibilidade relativa/bioequivalência, a diferença de teor da substância ativa entre os medicamentos teste e referência não deve ser superior a 5%.

83 81 A dureza é maior no referência em relação aos demais e a friabilidade inferior no similar em relação aos outros, ou seja, há uma diferença física entre eles. O estudo de dissolução é capaz de avaliar o impacto dessa diferença física na liberação do fármaco Estudo de dissolução da forma farmacêutica comprimidos Para que os resultados corroborem um parecer favorável à bioisenção, os guias da ANVISA (BRASIL, 2011a) e FDA (2000) esclarecem que 85% do fármaco deve se dissolver em até 30 minutos, sob as condições de uso do aparato II a 50 rpm (ou aparato I a 100 rpm), em um volume de 900 ml nos meios Fluido Gástrico Simulado sem enzimas ph 1,2, tampões acetato ph 4,5 e fosfato ph 6,8. De acordo com as Figuras 12, 13, 14 e 15 e as Tabelas 16, 17 e 18 verificou-se que nenhum dos produtos avaliados apresentou a rápida dissolução, ou seja, dissolução de 85% em até 30 minutos (BRASIL, 2011a). Logo, o resultado obtido com esses medicamentos não leva a um parecer favorável sobre a bioisenção, conforme os guias. Foi possível verificar que, até mesmo nos tempos que excedem o parâmetro de 30 minutos, não houve liberação de 85% do fármaco declarado, a partir da forma farmacêutica. Vale ressaltar que, nesse experimento despertou-se o interesse de avaliar o resultado da dissolução sob uma condição mais extrema, que seria o tempo infinito, além do resultado sob as condições padrão para a bioisenção. O ponto infinito se refere a uma condição mais extrema ao final do estudo de dissolução, onde é utilizada uma rotação do aparato, superior a condição estabelecida para os primeiros pontos do perfil (comumente 150 ou 200 rpm de 15 a 60 minutos) para se obter uma informação complementar sobre a uniformidade de distribuição da dose e desempenho da formulação (UNITED, 2010). Nesse trabalho, estabeleceu-se para o último ponto do perfil, referente a 95 minutos, 150 rpm por 30 minutos e ainda sim, não foi possível encontrar dissolução superior a 85%. Nas Figuras 13, 14 e 15, é demonstrado nos gráficos que a velocidade de liberação do fármaco nos primeiros 30 minutos no medicamento referência, é maior em relação aos outros produtos em todos os meios, sendo que logo em seguida estão as velocidades de dissolução do medicamento genérico e por fim o medicamento similar, com dissolução menor em todos os meios, mas principalmente em tampão acetato ph 4,5 e fosfato ph 6,8. Os valores médios da porcentagem dissolvida em cada um dos oito pontos que compõem os perfis de dissolução foram avaliados por ANOVA, que indicou que os perfis de dissolução no suco gástrico

84 82 simulado apresentaram diferenças entre os produtos genérico e similar. Em tampão ph 4,5 e ph 6,8, os produtos que apresentaram diferenças foram o referência e genérico, referência e similar e similar e genérico. Figura 12 - Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades do produto referência (a), genérico (b) e similar (c) em cada um dos meios, suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2, tampão acetato ph 4,5 e tampão fosfato ph 6,8 % dissolução Tempo (minutos) (a) ph 1,2 ph 4,5 ph 6,8 % dissolução Tempo (minutos) (b) ph1,2 ph 4,5 ph 6,8 % dissolução Tempo (minutos) (c) ph 1,2 ph 4,5 ph 6,8 Fonte: elaborada pela autora

85 83 Nas Tabelas 15, 16 e 17 estão expressos os dados da porcentagem de fármaco dissolvida de acordo com o tempo, conforme os cálculos de balanço de massa e os valores de Eficiência de Dissolução (ED%) da média (n=12) da porcentagem de fármaco dissolvido. Tabela 15 - Resultado do perfil de dissolução em suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2: média da porcentagem dissolvida de 12 unidades de cada um dos três medicamentos avaliados (Referência, Genérico e Similar), o desvio padrão (DP) e a eficiência de dissolução (ED%) Suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 Medicamento Referência Genérico Similar Tempo % % % DP DP dissolvida dissolvida dissolvida DP 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0, ,64 14,32 15,02 4,61 6,24 2, ,21 4,06 81,78 4,98 62,77 4, ,67 3,27 83,43 4,94 70,53 4, ,09 3,50 81,77 4,90 72,49 2, ,04 3,12 79,78 4,23 75,87 1, ,36 2,70 78,30 3,54 75,71 1, ,64 3,15 76,66 2,90 74,32 1, ,43 1,81 74,94 2,34 74,36 2,61 ED (%) 87,88-84,00-86,13 - Fonte: elaborada pela autora Figura 13 - Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em meio suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 %dissolução Referência Genérico Similar Tempo( minutos) Fonte elaborada pela autora

86 84 Tabela 16 - Resultado do perfil de dissolução em meio acetato ph 4,5: média da porcentagem dissolvida de 12 unidades de cada um dos três medicamentos avaliados (Referência, Genérico e Similar), o desvio padrão (DP) e a eficiência de dissolução (ED%) Meio acetato ph 4,5 Medicamento Referência Genérico Similar Tempo % % % DP DP dissolvida dissolvida dissolvida DP 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0, ,66 3,91 5,60 1,71 4,90 1, ,61 7,22 22,90 3,86 20,67 2, ,73 4,43 35,12 3,89 27,96 2, ,86 2,40 42,30 4,06 29,16 3, ,69 2,39 58,05 2,15 38,94 2, ,65 4,91 66,45 1,96 43,93 1, ,53 4,72 74,22 1,71 49,10 1, ,81 4,25 82,14 1,65 56,54 1,88 ED (%) 85,93-74,77-73,79 - Fonte: elaborada pela autora Figura 14 - Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em meio tampão acetato ph 4,5 %dissolução Referência Genérico Similar Tempo (minutos) Fonte: elaborada pela autora

87 85 Tabela 17 - Resultado do perfil de dissolução em meio fosfato ph 6,8: média da porcentagem dissolvida de 12 unidades de cada um dos três medicamentos avaliados (Referência, Genérico e Similar), o desvio padrão (DP) e a eficiência de dissolução (ED%) Meio fosfato ph 6,8 Medicamento Referência Genérico Similar Tempo % % % DP DP dissolvida dissolvida dissolvida DP 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0, ,15 8,51 8,25 3,89 5,31 0, ,25 4,17 20,42 3,83 20,72 2, ,94 3,33 31,95 3,87 28,17 3, ,90 4,03 43,89 4,98 31,24 2, ,41 2,65 56,86 5,00 42,41 2, ,57 3,59 58,51 2,53 48,26 1, ,23 2,16 65,75 3,15 55,32 0, ,22 1,67 72,98 2,45 64,87 1,17 ED (%) 83,70-76,36-71,32 - Fonte: elaborada pela autora Figura 15 - Representação do perfil de dissolução médio de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em meio tampão fosfato ph 6,8 %dissolução Referência Genérico Similar Tempo (minutos) Fonte: elaborada pela autora Quanto aos estudos de dissolução encontrados na literatura, Bonissatto (2010) realizou ensaios de dissolução da forma farmacêutica comprimidos de diazepam em meios com valor de ph 1,2; 4,4 e 6,8 utilizando o aparato cesto a 100 rpm e 37 ºC. De acordo com seus

88 86 resultados, a dissolução do comprimido em meio ph 1,2 é mais rápida que em ph 4,4 e 6,8, e a mesma tendência foi apontada nesse trabalho, mesmo sob outra condição de aparato e rotação. Nos gráficos é evidenciado que a velocidade de dissolução foi dependente do ph, uma vez que a dissolução é maior em tampão ph 1,2 comparado aos demais meios. Essa informação foi condizente com os resultados do estudo de solubilidade deste trabalho. Lokniskar e colaboradores (1989) realizaram um estudo de dissolução (aparato cesto a 100 rpm, 37º) comparando os medicamentos referência e genérico em meio HCL 0,1N e tampão acetato ph 4,5. Não foi realizado tratamento estatístico para comparar os perfis, mas claramente foi possível verificar que em ph 1,2, ambos os medicamentos apresentaram alta velocidade de dissolução, com valores por volta de 100% da quantidade declarada dissolvidos em 30 minutos. Já em ph 4,5, o valor médio de dissolução foi inferior: 87,1% (referência) e 37,5% (genérico) aos 30 minutos, sendo que o genérico não alcança 85% aos 90 minutos. Apesar das condições de aparato e velocidade serem diferentes, os resultados deste trabalho são condizentes com os de Lokniskar e colaboradores, devido a melhor dissolução em ph 1,2 e a diferença da velocidade de dissolução em ph 4,5 em medicamentos de marcas diferentes. Domínguez e colaboradores (1994) também encontraram 100% de fármaco dissolvido em HCl ph 1,2 em quatro produtos diferentes aos 30 minutos. Foi realizada a diferença estatística entre a média dos produtos (<0,05) em 1 e 15 minutos. Foram encontradas diferenças, porém a porcentagem final de dissolução entre eles não foi comprometida e não apresentou diferenças relevantes. Neste trabalho, apesar da análise de variância ter apontado diferenças entre os produtos genérico e similar em ph 1,2, é possível notar nas Figuras 13, 14 e 15, que o meio ph 1,2 é aquele onde a dissolução das diferentes especialidades farmacêuticas se dá de maneira mais semelhante, uma vez que ocorre tão rapidamente, devido a influência do ph, que as diferenças entre as formulações se tornam menores em relação a dissolução em meios mais alcalinos. Este trabalho e os comentados anteriormente sugerem que as diferentes formulações podem gerar diferenças nos perfis de dissolução menos ou mais expressivas, porém há o fator ph dependente, que impacta sobre a dissolução do fármaco a partir da forma farmacêutica e sobrepõe-se às características da formulação. No Quadro 3, no tópico 5.3, Avaliação dos medicamentos contendo diazepam e seus excipientes, verifica-se que a diferença qualitativa entre as formulações do medicamento A (referência) e C (similar) não é tão significativa, enquanto que B (genérico) apresenta uma formulação que se distingue das demais. A diferença entre A e C é basicamente o corante (indigocarmin em A e amarelo tartrazina em C) e adição de amido de milho pré-gelatinizado

89 87 em C. A diferença do perfil de dissolução de A e C identificada nas Figuras 13,14 e 15 pode ser atribuída a diferenças qualitativas e quantitativas entre os excipientes ou/e o processo de formulação (ROWE et al.,2009; STORPIRTIS; GAI, 2009). A partir dos dados individuais de ED% dos comprimidos (n=12) empregados no ensaio de dissolução (Tabela 18), foi aplicada a ANOVA one-way para verificar diferenças estatisticamente significas entre os produtos (α=0,05). A comparação dos perfis é importante para saber se os produtos liberam o fármaco na mesma quantidade e na mesma velocidade, enquanto que, a comparação das eficiências de dissolução permite quantificar o fármaco liberado em determinado tempo, podendo ser correlacionada com os dados in vivo de esvaziamento gástrico. Dessa forma, é possível prever ou supor se o fármaco estará solubilizado e consequentemente disponível para permear as membranas do TGI, antes de passar para o compartimento posterior ou ser eliminado (OLIVEIRA; MANZO, 2009). Esta informação é de suma importância para os estudos de bioisenção. Se houver a liberação do fármaco em uma porção do TGI que ocasione inativação ou não possibilite sua dissolução, a absorção pode ser prejudicada. No caso do diazepam que é um ácido fraco, e por isso, não é ionizado no estômago, na condição de ph de jejum, ele se dissolverá e permeará adequadamente se estiver dissolvido nesta porção do TGI, ressaltando que o tempo de esvaziamento gástrico geralmente é inferior a 30 minutos e nesta caso a absorção ocorreria antes do início da degradação. A ED% no meio suco gástrico simulado ph 1,2 foi obtida em tempos diferentes para cada fármaco, sendo 10 minutos para o referência, 15 minutos para genérico e 30 minutos para o similar, devido às diferentes velocidades de dissolução que impactaram sobre o tempo necessário para alcançar o platô. Os resultados possibilitaram verificar diferenças estatisticamente significativas entre os produtos referência e genérico. Nos meios acetato ph 4,5 e fosfato ph 6,8, a ED% foi obtida considerando o mesmo tempo para todos os medicamentos (t=95 min.) e ainda sim, as diferenças estatísticas foram mais acentuadas: no tampão ph 4,5 entre os produtos referência e genérico e referência e similar; em tampão ph 6,8 entre os produtos referência e genérico, referência e similiar, e genérico e similar. Pelo teste da ED% verifica-se que o desempenho da dissolução não é semelhante entre os produtos referência e genérico em todos os meios. Os medicamentos referência e similar também não têm eficiência de dissolução semelhantes em ph 4,5 e ph 6,8. E em ph 6,8, até genérico e similar não obtiveram ED% semelhantes.

90 88 Tabela 18 Eficiência de dissolução (ED%) de 12 unidades dos produtos referência, genérico e similar em cada um dos meios: ph1,2, ph 4,5 e ph 6,8 ED% Referência Genérico Similar ph 1,2 a ph 4,5 d ph 6,8 d ph 1,2 b ph 4,5 d ph 6,8 d ph 1,2 c ph 4,5 d ph 6,8 d 84,54 81,91 86,10 80,66 73,32 75,05 85,06 73,96 73,96 90,93 82,86 80,10 83,11 73,33 75,18 86,39 71,67 71,67 78,86 83,02 81,73 83,13 73,32 73,92 87,92 72,33 72,33 90,69 87,46 82,76 85,73 73,55 74,04 87,12 70,92 70,92 91,56 88,44 84,94 84,11 73,70 73,81 84,46 72,12 72,12 81,24 88,85 83,29 87,42 75,68 73,72 86,26 74,67 74,67 89,37 88,27 83,75 86,64 76,21 72,17 86,77 70,06 70,06 92,31 86,65 84,44 82,41 77,04 77,90 85,53 69,44 69,44 82,67 86,83 84,79 84,09 75,15 79,53 88,66 69,08 69,08 89,68 86,35 86,10 84,19 75,01 84,46 82,19 70,02 70,02 90,68 87,52 86,00 84,43 75,41 79,14 85,13 71,12 71,12 92,03 85,57 86,10 82,61 75,39 79,53 82,19 70,58 70,58 a ASC (0-10 min.) b ASC (0-15 min.) c ASC (0-30 min.) d ASC (0-95 min.) Fonte: elaborada pela autora Na Figura 16 estão apresentados os gráficos com a estatística descritiva (Box Plot) dos dados de ED%, presentes na Tabela 18, demonstrando os valores médios, medianas e desvio padrão dos grupos dos comprimidos dos três produtos em cada um dos meios. É possível notar que, assim como nos perfis de dissolução, os resultados de eficiência de dissolução apresentados na Figura 16 sugerem maior liberação do fármaco no suco gástrico simulado sem enzimas e maior eficiência de dissolução do medicamento referência em todos os três meios. Esses vários resultados corroboram para a conclusão de que as diferenças entre essas formulações ou seu processo de produção, características essas estudadas pela biofarmácia, podem ocasionar alteração na velocidade de dissolução das apresentações farmacêuticas avaliadas. Outra observação que os resultados são capazes de subsidiar é que, atualmente, estão disponíveis no comércio nacional, medicamentos que não estão apresentando

91 89 semelhança quanto à velocidade de dissolução, que consequentemente há o risco de uma não equivalência terapêutica entre eles. Figura 16 - Gráficos apresentando estatística descritiva (Box Plot) para dissolução dos produtos em cada um dos meios: suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 (a), tampão acetato ph 4,5 (b) e tampão fosfato ph 6,8 Fonte: elaborada pela autora 5.6 Estudo de solubilidade do fármaco diazepam Na Figura 17 são demonstrados os valores de solubilidade obtidos nesse período de tempo nos três meios avaliados. O diazepam é consideravelmente mais solúvel em meio ph 1,2 e menos solúvel nos demais meios. Essa informação apresenta similaridade em relação aos resultados encontrados no ensaio de dissolução. Analisando a Figura 17, 18 e Tabela 19 é

92 90 possível verificar que as concentrações referentes à solubilidade em ph 1,2 encontradas por CLAE, a partir de 1 hora, começam a decair e após 20 horas, uma concentração consideravelmente inferior a encontrada inicialmente é identificada. Esse resultado é mais um indício da degradação em ph 1,2 relatado na literatura (NUDELMAN; WAISBAUM, 1995; LINDENBERG, 2006). Em meio acetato ph 4,5 o platô foi atingido após 32 horas e em meio fosfato ph 6,8, após 20 horas. De acordo com os resultados apresentados nas Tabelas 19, 20 e 21, as amostras em triplicatas (de cada um dos meios) geraram um desvio padrão relativo conforme, sendo inferior a 5%. O ph não sofreu modificação durante o experimento. Figura 17 Média da solubilidade do fármaco diazepam (n=3, em cada meio) nos meios ph 1,2, ph 4,5 e ph 6,8 (µg/ml) ph 1,2 ph 4,5 ph 6, Tempo (horas) Fonte: elaborada pela autora Um fármaco em FFSOLI é considerado altamente solúvel de acordo com o SBC se sua maior dose descrita em bula, administrada por via oral se solubiliza em um volume igual ou menor a 250 ml de cada uma das soluções tampão utilizadas dentro da faixa de ph fisiológico (1,2 a 6,8), a 37 ± 1ºC (BRASIL, 2011a). Visto que a maior dose do fármaco em questão é 10 mg, esse valor dividido pelos 250 ml de meio, resulta em uma concentração de 40 µg/ml. Na Figura 18 se compara a solubilidade (n=3) em cada um dos meios e o valor de 40 µg/ml como limite entre a alta e baixa solubilidade no SCB. Os gráficos resultam na informação de que o diazepam é um fármaco de alta solubilidade desde o tempo zero e que nos demais meios, passa a ser um fármaco altamente solúvel após 8 horas e se mantém até o fim do ensaio. Em meio suco gástrico simulado sem enzimas, a solubilidade atingiu o equilíbrio em

93 91 meia hora com o valor de 239,09 ug/ml. Em meio acetato, o equilíbrio foi alcançado em 32 horas e a solubilidade média foi de 48,00 ug/. Já em meio fosfato, foi encontrada a solubilidade média de 47,11 ug/ml em 44 horas, seguida por degradação. Após os tempos citados ocorreram indícios de degradação dos fármacos em todos os três meios avaliados, representados pela queda dos valores de concentração do fármaco a partir dos referidos momentos. Tabela 19 - Valores de concentração (µg/ml) obtidos, em triplicata, para o fármaco diazepam, em diferentes tempos (t) de coleta em horas (h), no meio fluido gástrico simulado sem adição de enzima ph 1,2 Tempo (horas) Replicatas 0 0,5 1 2, ,43 240,46 231,21 209,37 185,34 166,56 145, ,92 238,68 221,03 201,77 177,81 153,77 145, ,0 238,12 222,70 198,60 175,26 156,70 142,37 Média 232,14 239,09 224,98 203,25 179,48 159,01 144,36 DPR (%) 4,88 0,50 2,42 2,72 2,92 4,21 1,20 Fonte: elaborada pela autora Tabela 20 - Valores de concentração (µg/ml) obtidos, em triplicata, para o fármaco diazepam, em diferentes tempos (t) de coleta em horas (h), no meio acetato ph 4,5 Tempo (horas) Replicatas NQ 29,33 33,48 39,62 44,42 45,60 44,46 43,34 2 NQ 31,31 36,92 43,07 48,26 49,88 45,32 43,98 3 NQ 32,19 35,67 41,83 47,40 48,51 43,19 47,29 Média NQ 30,94 35,36 41,51 46,69 48,00 44,33 44,87 DPR (%) NQ 4,73 4,94 4,21 4,32 4,56 2,41 4,73 NQ = Não quantificável Fonte: elaborada pela autora

94 92 Tabela 21 - Valores de concentração (µg/ml) obtidos, em triplicata, para o fármaco diazepam, em diferentes tempos (t) de coleta em horas (h), no meio fosfato ph 6,8 Tempo (horas) Replicatas NQ 27,84 35,88 43,70 44,61 44,11 46,30 43,77 2 NQ 29,64 39,52 45,99 44,52 46,92 47,59 44,98 3 NQ 28,69 37,70 44,44 47,32 45,65 47,42 43,14 Média NQ 28,69 37,70 44,71 45,48 45,56 47,11 43,77 DPR (%) NQ 3,16 4,82 2,62 3,50 3,09 1,49 2,40 NQ = Não quantificável Fonte: elaborada pela autora Figura 18 - Gráficos de concentração versus tempo obtido no estudo de solubilidade de diazepam em suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 (a), acetato ph 4,5 (b) e fosfato ph 6,8 (c) e a comparação entre o perfil de solubilidade e o limite entre alta e baixa solubilidade em cada um dos meios (µg/ml) (a) Tempo (horas) (µg/ml) (b) Tempo (horas) (µg/ml) 60 (c) Tempo (horas) Limite entre alta e baixa solubilidade Fonte: elaborada pela autora

95 Discussão sobre a permeabilidade intestinal do diazepam De acordo com o FDA, a permeabilidade pode ser obtida por meio da determinação da biodisponibilidade absoluta, estudo de balanço de massa e perfusão intestinal in vivo em indivíduos humanos. Entretanto, outras opções que não envolvam seres humanos são admitidas como perfusão intestinal in vivo ou in situ em um modelo animal adequado e/ou métodos de permeabilidade in vitro usando tecidos intestinais excisados. Também é admitida a utilização de culturas de células epiteliais em monocamadas. Quando o resultado de apenas um método aponta claramente a permeabilidade do composto (exemplo: quando a biodisponibilidade absoluta é igual ou superior a 90% ou quando 90% ou mais do fármaco administrado é recuperado na urina) não são necessários outras técnicas, caso contrário é recomendável a comparação com resultados obtidos por outro método (FDA, 2000). Zaki e colaboradores (2010) usaram células 2/4/A1 para determinar a permeabilidade. Foi identificada alta permeabilidade, sendo este, um dado compatível com valor de fração absorvida (FA) de 90%. Na Tabela 3, inserida no tópico , estão compilados outros estudos relacionados à permeabilidade intestinal do diazepam. Valores in vitro de alta permeabilidade para o diazepam são reafirmados pelos valores elevados de fração absorvida que variam de 90 a 100% (DIVOLL et al., 1983; PALM et al., 1997; ABED et al., 2010; TURCO et al., 2011; ZAKI et al., 2010; HASLAM et al., 2011), que se correlacionam bem com a definição de que um fármaco de alta permeabilidade apresenta valor de fração absorvida superior a 90% em comparação com a referência intravenosa (WU e BENET, 2005). Resultados obtidos na literatura apontam valores altos de LogP para o diazepam sendo 2,58 em ph 7,4 (LINDENBERG, 2006), 2,85 (JOUYBAN et al., 2010) e 3,2 (ZAKI et al., 2010). Uma vez que o valor de logp do metoprolol, é 1,34 (KASIM et al., 2004), sendo este utilizado como referência de alta permeabilidade, substâncias com valores de LogP acima deste podem ser classificados como altamente permeáveis. Os dados obtidos de estudos in vivo e in vitro permitem subsidiar a classificação do diazepam como um fármaco altamente permeável.

96 94 6 CONCLUSÕES 1. A avaliação biofarmacêutica do diazepam infere que o fármaco pode ser classificado como pertencente à classe I no SCB, ou seja, possui alta solubilidade e alta permeabilidade intestinal. No entanto, os resultados do estudo de dissolução demonstraram uma baixa velocidade de dissolução do diazepam quando veiculados nos medicamentos na FFSOLI avaliados, com resultados inferiores aos parâmetros recomendados pelos guias vigentes, o que demanda uma avaliação das formulações visando uma decisão segura sobre a bioisenção de novos produtos contendo este fármaco. 2. No desenvolvimento do método analítico verificou-se que a espectrofotometria UV não foi capaz de diferenciar o analito e os produtos de degradação, o que poderia impossibilitar a realização do estudo de solubilidade. A partir da quantificação por CLAE as amostras indicam degradação após 24 horas nos meios, sendo essa degradação mais acentuada em meio ácido, porém, o método CLAE foi capaz de diferenciar o analito de produto de degradação, além de ter atendido os parâmetros linearidade, precisão e exatidão e especificidade em uma faixa de concentração. 3. Dos 14 medicamentos na forma de comprimidos de 10mg de diazepam, com os dados de excipientes disponíveis, 3 apresentam excipientes críticos capazes de influenciar a absorção. Entretanto, os medicamentos avaliados no estudo de dissolução apresentam excipientes considerados inertes, dependendo das suas características e quantidades empregadas. 4. Os dados da literatura sobre permeabilidade intestinal sugerem uma alta permeabilidade do diazepam. 5. Os estudos de solubilidade apontaram o diazepam como um fármaco de alta solubilidade, sendo o requisito para isto alcançado no suco gástrico simulado sem enzimas ph 1,2 desde o início do ensaio e nos demais meios, após 8 horas em contato com o meio. 6. Os estudos de dissolução mostraram, nas condições experimentais utilizadas, que os três produtos avaliados apresentam uma dissolução insatisfatória em relação aos parâmetros exigidos em bioisenção. Como resultado final do estudo de dissolução destaca-se que nenhum desses medicamentos possui rápida dissolução (85% em 30 minutos) e que pode haver diferenças significativas de perfil de dissolução entre os medicamentos, dependendo dos constituintes da formulação.

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107 105 APÊNDICE APÊNDICE A Resultado do teste de uniformidade de conteúdo do diazepam em dez unidades de cada produto Unidades Teor (%) Produto A Produto B Produto C 1 100,95 104,15 90, ,7 101,35 90, ,1 105,00 92, ,4 105,20 91, ,35 100,85 90, ,25 102,8 94, , , ,45 100,7 94, ,15 100,85 98, ,4 99,3 93,8 Média 102,77 102,52 92,75 DP 1,54 2,18 2,40 Valor de aceitação 4,97 6,26 11,51 Fonte: elaborada pela autora

108 106 APÊNDICE B Teor de diazepam nos produtos A, B e C, obtidos por CLAE, com detecção no DAD a 254 nm Replicata Produto A Produto B Produto C Concentração (µg/ml) Teor (%) Concentração (µg/ml) Teor (%) Concentração (µg/ml) Teor 1 21,20 106,02 19,91 99,54 19,37 96, ,13 105,63 19,90 99,48 19,49 97, ,41 107,04 19,80 99,02 19,12 95,61 Média (%) 21,25 106,23 19,87 99,35 19,33 96,64 DP 0,14 0,72 0,06 0,28 0,19 0,95 DPR (%) 0,66 0,68 0,30 0,28 0,98 0,98 Fonte: elaborada pela autora (%)

109 107 APÊNDICE C Determinação de peso de 20 unidades de cada produto (A, B e C), peso médio e desvios porcentuais em relação à média Unidade 1 2 Produto A Produto B Produto C Peso (g) Desvio (%) Peso (g) Desvio (%) Peso (g) Desvio (%) 0,1737 0,44 0,1701 0,66 0,1381-1,02 0,1742 0,73 0,1671-1,12 0,1409 0,98 3 0,1712-1,00 0,1708 1,07 0,1388-0, ,1743 0,79 0,1710 1,19 0,1415 1,41 0,1722-0,42 0,1680-0,58 0,1462 4,78 0,1724-0,31 0,1694 0,24 0,1408 0,91 0,1743 0,79 0,1688-0,11 0,1381-1,02 0,1723-0,36 0,1754 3,80 0,134-3,96 0,1727-0,13 0,1669-1,23 0,1396 0,05 0,1736 0,39 0,1697 0,42 0,1412 1,20 0,1718-0,65 0,1647-2,54 0,1399 0,27 0,1735 0,33 0,1706 0,95 0,1357-2,74 0,1728-0,07 0,1678-0,70 0,1394-0,09 0,1725-0,25 0,1683-0,41 0,1413 1,27 0,1733 0,21 0,1682-0,46 0,1396 0, ,1741 0,68 0,1697 0,42 0,1372-1, Média Fonte: elaborada pela autora 0,1732 0,16 0,1702 0,72 0,142 1,77 0,1732 0,16 0,1688-0,11 0,1401 0,41 0,1718-0,65 0,1669-1,23 0,1377-1,31 0,1715-0,83 0,1673-1,00 0,1384-0,81 0,1729 0,1689 0,1395

110 108 APÊNDICE D Resultado do teste de friabilidade (n=20, 20 rpm, t=5 minutos) Produto Peso inicial dos Peso final dos Perda durante o comprimidos (g) comprimidos (g) teste (g) Perda (%) A 3,4586 3,4439 0,0147 0,42 B 3,3797 3,3660 0,0137 0,40 C 2,7905 2,7855 0,0050 0,18 Fonte: elaborada pela autora

111 109 APÊNDICE E Resultado do teste de dureza com resultados em Newtons (N) realizado com 10 unidades de cada produto Dureza (N) Unidade Produto A Produto B Produto C ,5 26,5 2 38, , , , ,5 28, , , ,5 25, , ,5 26 Média 39,7 37,4 29,0 DP 7,35 8,61 3,30 Fonte: elaborada pela autora

112 110 ANEXOS Anexo A Resumo de resultados parciais apresentado em SINPOSPq 2012: Development of diazepam quantitative assay to be applied in solubility and dissolution tests in biorelevants media Lorena Barbosa Arrunátegui*; Gabriella Gonzaga Dutra; Neila Márcia Silva Barcellos; Jacqueline de Souza Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas (CiPharma) da Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. * lorenabarrunategui@yahoo.com.br Introduction: Diazepam is a psychoactive drug with sedative and anxiolytic effects. Its therapeutic importanceis reaffirmed by the presence in Brazilian and WHO s Essential Medicines lists, as well as in the list of biowaiver candidates of International Pharmaceutical Federation. The biowaiver is the replace in vivo tests for assessment of bioequivalence using in vitro tests of solubility and dissolution and permeability studies. For the quantification of diazepam in biorelevant media employed in solubility and dissolution studies, is necessary the development of analytical method that allows determination of the content without interference of degradation products. Objective: This work aims identify the parameters of linearity and specificity of ultraviolet spectrometry method, adapted from Brazilian Pharmacopoeia 5th ed., and evaluate the feasibility of its use in solubility and dissolution studies in biorelevant medium. Methods: The ultraviolet spectrometry method was used for determination of diazepam at 254 nm, in the buffer solutions: simulated gastric fluid without enzymes (ph 1.2), buffer acetate (ph4.5) and buffer phosphate (ph6.8). For preparation of calibration curve were used two stock solutions (SE): SE 1: 10 mg of diazepam in 100 ml of hydrochloric acid 0.1 M and SE 2: 10 ml of SE1 diluted to 50 ml of corresponding biorelevant media.the standard curves were constructed by dilution of SE2 aliquots obtaining the following concentrations: in buffer ph 1.2 were 0.11, 1.1, 4.4, 7.7, 11.0, 13.0, 30.0, 60.0, 90.0, 120.0, 150.0(µg/mL). In bufferph 4.5: 0.11, 1.1, 4.4, 7.7, 11.0, 13.0, 10.0, 20.0, 40.0, 60.0, 80.0 (µg/ml). And in buffer ph 6.8: 0.11, 1.1, 4.4, 7.7, 11.0, 13.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0 (µg/ml). The specificity of the spectrophotometric method was evaluated by possible interference of the degradation products from a solution of diazepam at 11 µg/ml in three media after light exposure. Samples exposed for up to 50 hours were compared to freshly prepared solution by performing scanning between nm. Results: The absorbance versus diazepam concentration results for buffer ph1.2 and ph6.8 promoted appropriate linear relationship with evaluation coefficients(r²) around 0.999, except for ph4.5 that showed R² The specificity test shows results of absorbance versus time for diazepam solutions prepared in three mediums, and exposed and not exposed to light. It was observed that about 18 hours after preparation of the solutions on those three media, was found significant diazepam degradation. However the method does not allow differentiating the degradation products from analyte of interest. Conclusion: The results showed that the UV spectrofotometric method was not able to eliminate the interference of degradation products that arise after light exposure. So, is not possible apply this method in studies of solubility and dissolution of diazepam in biorelevant media. Keywords: diazepam, UV spectrometry, biorelevant media, linearity, specificity, benzodiazepine Financial support: FAPEMIG, CAPES e UFOP

113 111 Anexo B Resumo de resultados parciais apresentado em IV CONCIFOP 2013 Validação de método cromatográfico para a quantificação de diazepam em meios biorrelevantes Lorena Barbosa Arrunátegui*; Gabriella Gonzaga Dutra ; Neila Márcia Silva Barcellos; Jacqueline de Souza.Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas (CiPharma) da Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. *lorenabarrunategui@yahoo.com.br A quantificação de fármacos em meios biorrelevantes, ou seja, aqueles que mimetizam a constituição e/ou o ph de líquidos característicos de porções do trato gastrintestinal é de suma importância para estudos aplicáveis à bioisenção. Esta consiste na isenção ou substituição dos testes in vivo de bioequivalência por avaliação in vitro utilizando dados de solubilidade e permeabilidade do fármaco e estudos de dissolução a partir da forma farmacêutica. Visando atender a uma demanda do Ministério da Saúde e da Federação Farmacêutica Internacional em fornecer dados para subsidiar a discussão sobre bioisenção de produtos a base de diazepam, o método a seguir foi desenvolvido e validado. O método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) da Farmacopeia Brasileira 5ª ed. foi adaptado: fase móvel: água/acetonitrila/metanol 40:40:20; coluna C18, detecção por DAD (254) nm. A solução estoque (SE) foi preparada a partir da adição de metanol a 25 mg de diazepam em balão de 25 ml. As alíquotas de SE foram diluídas nos seguintes meios biorrelevantes: suco gástrico simulado sem enzimas (ph 1,2), tampões acetato ph 4,5 e fosfato ph 6,8, nas seguintes faixas de concentração: 3,0 a 15,0 (µg/ml) em meios ph 1,2 e 4,5 e 3,0 a 30,0 (µg/ml) em ph 6,8. A especificidade em relação aos excipientes utilizados na forma farmacêutica e condições de estresse sobre a SE foi satisfatória. A construção da curva analítica obtida por meio da média de três determinações gerou coeficientes de avaliação (R²) iguais a 0,999 nos três meios, possibilitando uma resposta linear para quantificação de diazepam nas faixas de concentração apresentadas. Os resultados de precisão e a exatidão se apresentaram de acordo com os limites variando de 0,10 a 4,06% (DPR) e 96,74 a 102,68%, respectivamente. O método se mostrou adequado para quantificar o diazepam diluído nos meios avaliados, possibilitando a realização de estudos de solubilidade e dissolução. - Palavras-Chave: Validação, diazepam, CLAE, meios biorrelevantes - Agências de Fomento: FAPEMIG, CAPES e UFOP

114 Anexo C - Submissão do artigo científico intitulado Sistema de Classificação Biofarmacêutica: Importância e Inclusão nas Legislações sobre Bioisenção à Revista Panamericana de Salud Pública. 112