UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA SOLANGE INÊS MUSSATTO DRAGONE

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA SOLANGE INÊS MUSSATTO DRAGONE Aproveitamento integral de subproduto da indústria cervejeira em processos químicos e biotecnológicos Lorena SP 2007

2 SOLANGE INÊS MUSSATTO DRAGONE Aproveitamento integral de subproduto da indústria cervejeira em processos químicos e biotecnológicos Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de biomassa Orientador: Dra. Inês Conceição Roberto Lorena SP 2007

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. Catalogação na Publicação Biblioteca Universitária Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo Dragone, Solange Inês Mussatto Aproveitamento integral de subproduto da indústria cervejeira em processos químicos e biotecnológicos / Solange Inês Mussatto Dragone; orientador Inês Conceição Roberto f. : fig. Tese (Doutorado Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Área de Concentração: Conversão de Biomassa) Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo, Bagaço de malte 2. Hidrólise 3. Xilitol 4. Ácido láctico 5. Carvão ativado 6. Ácidos fenólicos 7. Branqueamento I. Título CDU

4 Este trabalho eu dedico a: Meu marido, Giuliano, por estar ao meu lado em todos os momentos, pelo seu amor, respeito, carinho e confiança. Minha mãe, Idalina, por tudo! Por ter me criado com tanto amor e carinho, por ter me educado e sempre me apoiado em todos os momentos. Meu pai, Ercy, que infelizmente não está mais presente fisicamente entre nós, mas que estará sempre dentro de mim como um grande exemplo de dignidade, força, amor e humildade.

5 AGRADECIMENTOS À Dra. Inês Conceição Roberto, pela amizade, confiança e orientação, não apenas durante o doutorado, mas desde 1998, quando iniciei meus trabalhos de pesquisa sob sua orientação. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de doutorado concedida. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelos apoios financeiros. À Novozymes, pela doação das enzimas. Aos professores, George Jackson de Moraes Rocha, Adriane Maria Ferreira Milagres e Ismael Maciel de Mancilha, pelas valiosas explicações e sugestões dadas para que este trabalho pudesse ser realizado da melhor forma possível. Aos professores João Batista de Almeida e Silva, Silvio Silvério da Silva, Maria das Graças de Almeida Felipe e Arnaldo Márcio Ramalho Prata, pela amizade constante. A todos os colegas e funcionários da EEL-USP que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, em especial à Marcela, por quem tenho grande carinho e amizade, ao meu grande amigo Júlio César dos Santos e ao Paulinho (meu padrinho). À Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP) e aos professores do Programa de Pósgraduação em Biotecnologia Industrial de uma forma geral, pelos conhecimentos transmitidos e pela abertura de novas fronteiras em minha vida.

6 RESUMO MUSSATTO, S.I. Aproveitamento integral de subproduto da indústria cervejeira em processos químicos e biotecnológicos f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, O objetivo deste trabalho foi avaliar a possibilidade de aproveitamento integral do bagaço de malte em processos químicos e biotecnológicos. O material foi fracionado através de três diferentes procedimentos: hidrólise com ácido diluído, para separação da hemicelulose; hidrólise alcalina, para solubilização da lignina e hidrólise enzimática, para conversão da celulose em glicose. Para cada um destes procedimentos foi realizado um estudo de otimização das condições de fracionamento, empregando variáveis previamente selecionadas. Os hidrolisados obtidos nas condições otimizadas foram utilizados em processos químicos ou biotecnológicos para obtenção de compostos de interesse comercial, tais como: 1. xilitol, produzido por fermentação da xilose a partir do hidrolisado hemicelulósico, pela levedura Candida guilliermondii; 2. ácido láctico, produzido por fermentação da glicose a partir do hidrolisado celulósico, pela bactéria Lactobacillus delbrueckii; 3. carvão ativado, produzido por ativação química da lignina presente no licor alcalino. Foi também avaliada e otimizada a liberação de ácidos fenólicos durante a hidrólise alcalina da lignina e foi ainda realizado um estudo sobre as características da polpa de celulose obtida nas condições otimizadas, antes e após seu branqueamento com peróxido de hidrogênio, para avaliar sua possibilidade de emprego na produção de papel ou de derivados de celulose. Os resultados de hidrólise ácida da hemicelulose revelaram que a eficiência deste processo em reator foi >85% para todas as condições avaliadas, porém, a produção de xilitol foi favorecida a partir do hidrolisado obtido nas condições de relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, 120ºC por 17 min, atingindo um fator de rendimento de 0,70 g/g e produtividade de 0,45 g/l.h. Na etapa de hidrólise alcalina, os melhores resultados foram obtidos quando o processo foi realizado a 120ºC por 90 min, empregando NaOH 2% p/v e uma relação sólido:líquido de 1:20 g:g. Nestas condições, a polpa obtida apresentou (% p/p): 90,4 de celulose, 8,2 de lignina e 1,1 de hemicelulose. Nas condições otimizadas de hidrólise enzimática para esta polpa (45 FPU/g de matéria seca, substrato 2% p/v, 100 rpm, 45ºC, 96 h), a eficiência de conversão da celulose em glicose foi de 93,1%. A produção de ácido láctico a partir deste hidrolisado apresentou elevado rendimento (0,98 g/g), porém, a produtividade aumentou 2,8 vezes quando o meio foi suplementado com nutrientes. Os carvões obtidos por ativação química da lignina apresentaram uma elevada eficiência para remoção de metais, principalmente níquel, ferro, cromo e silício, a qual foi superior à obtida a partir de um carvão comercial. Através da hidrólise alcalina do bagaço de malte tratado com ácido sulfúrico diluído, foi possível recuperar vários ácidos fenólicos, principalmente os ácidos ferúlico e p-cumárico, que são os dois ácidos fenólicos presentes em maior quantidade neste material. Além disso, a polpa celulósica obtida nestas condições, quando branqueada por uma seqüência utilizando hidróxido de sódio e peróxido de hidrogênio, apresentou características adequadas para utilização na produção de derivados de celulose. Em função destes resultados, foi concluído que o bagaço de malte é um subproduto industrial com grande potencial para aproveitamento como matéria-prima em processos químicos e biotecnológicos. Palavras-chave: Bagaço de malte. Hidrólise. Xilitol. Ácido láctico. Carvão ativado. Ácidos fenólicos. Branqueamento.

7 ABSTRACT MUSSATTO, S.I. Integral use of brewery by-product in chemical and biotechnological processes f. Thesis (Doctoral in Industrial Biotechnology) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, The possibility of brewer s spent grain integral use, in chemical and biotechnological processes, was evaluated. The material was fractionated by means of three different procedures: dilute acid hydrolysis, for the hemicellulose recovery; alkaline hydrolysis, for the lignin solubilization, and enzymatic hydrolysis, for the cellulose conversion into glucose. A study on the optimization of the fractionation conditions using previously selected variables was performed for each one of these procedures. The hydrolysates produced under the optimum conditions were used in chemical or biotechnological processes for obtainment of commercial interest compounds, such as: 1. xylitol, produced by fermentation of xylose from hemicellulosic hydrolysate, by Candida guilliermondii yeast; 2. Lactic acid, produced by fermentation of glucose from cellulosic hydrolysate, by Lactobacillus delbrueckii bacterium; 3. activated charcoal, produced by chemical activation of the lignin present in the alkaline liquor. The phenolic acids release during the lignin alkaline hydrolysis was also evaluated and optimized. In addition, a study about the characteristics of the cellulose pulp produced under the optimum conditions, before and after bleaching with hydrogen peroxide, was also performed to evaluate the possibility of using this pulp on the production of paper or cellulose derivatives. The hemicellulose acid hydrolysis results revealed that the efficiency of this process in reactor was >85% for all the evaluated conditions, but the xylitol production was favored from the hydrolysate obtained in the conditions of 1:8 g:g solid:liquid ratio, 100 mg H 2 SO 4 /g dry matter, 120ºC for 17 min, attaining a yield factor of 0.70 g/g and productivity of 0.45 g/l.h. In the alkaline hydrolysis stage, the best results were obtained when the process was performed at 120ºC for 90 min, using 2% w/v NaOH and a solid:liquid ratio of 1:20 g:g. Under these conditions, the obtained pulp presented (% w/w): 90.4 cellulose, 8.2 lignin and 1.1 hemicellulose. In the optimized conditions of enzymatic hydrolysis for this pulp (45 FPU /g dry matter, 2% w/v substrate, 100 rpm, 45ºC, 96 h), the efficiency of cellulose conversion into glucose was 93.1%. The lactic acid production from this hydrolysate presented a high yield (0.98 g/g), but the productivity increased 2.8-times when the medium was supplemented with nutrients. The charcoals produced by chemical activation of the lignin presented high efficiency for the removal of metals, mainly nickel, iron, chromium and silicon, which was higher than that obtained from commercial charcoal. By alkaline hydrolysis of brewer s spent grain pretreated with dilute sulfuric acid, it was possible to recover several phenolic acids, mainly ferulic and p-coumaric acids that are the two phenolic acids present in larger amount in this material. Furthermore, the cellulose pulp obtained under these conditions presented characteristics suitable for use on the production of cellulose derivatives when bleached by a sequence using sodium hydroxide and hydrogen peroxide. Due to these results it was concluded that brewer s spent grain is an industrial by-product with great potential for use as raw material in chemical and biotechnological processes. Keywords: Brewer s spent grain. Hydrolysis. Xylitol. Lactic acid. Activated charcoal. Phenolic acids. Bleaching.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura Grãos de cevada Figura Representação esquemática do processo de obtenção do bagaço de malte a partir da cevada natural Figura Bagaço de malte Figura Microscopia eletrônica de varredura de partículas do bagaço de malte. (A) Ampliação de 100 vezes; (B) Ampliação de 300 vezes Figura Representação esquemática da ação das enzimas celulolíticas na estrutura da celulose Figura Estrutura da lignina proposta por ADLER (1977) Figura Representação esquemática do trabalho proposto para aproveitamento integral do bagaço de malte Figura Reator utilizado nos experimentos de hidrólise ácida Figura Representação esquemática dos procedimentos utilizados para preparo dos meios de fermentação a partir do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte Figura Banho termostatizado com óleo de silicone, utilizado para a hidrólise alcalina do bagaço de malte Figura Gráficos de Pareto para estimativa dos efeitos das variáveis: (1) relação sólido:líquido, (2) concentração de ácido sulfúrico e (12) a interação entre elas, nas respostas: eficiência de hidrólise da arabinana (A), eficiência de hidrólise da xilana (B), eficiência de hidrólise da hemicelulose (xilana + arabinana) (C) e concentração de lignina solúvel (D), obtidas nos processos de hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave. Efeitos acima da linha de p=0,05 são significativos ao nível de 95% de confiança Figura Cromatograma do hidrolisado obtido em autoclave, nas condições de relação sólido líquido de 1:10 g:g e 120 mg de ácido/g de matéria seca Figura Crescimento da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diluído) ou 85 g/l de xilose (concentrado) Figura Consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diluído) ou 85 g/l de xilose (concentrado) Figura Produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido (MSD),

9 contendo 20 g/l de xilose (diluído) ou 85 g/l de xilose (concentrado) Figura Desempenho da levedura Candida guilliermondii em meio semidefinido preparado com (símbolos abertos) ou sem (símbolos fechados) arabinose. Crescimento celular (, ), consumo de xilose (, ) e produção de xilitol (, ) Figura Consumo de xilose (A) e produção de xilitol (B) pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado de bagaço de malte: HDS ( ), HC ( ), HCT ( ) e HCDS ( ) Figura Superfícies de resposta para os teores de lignina residual e de celulose (% p/p) nas polpas de bagaço de malte, em função das variáveis operacionais empregadas no processo de hidrólise alcalina Figura Micrografia eletrônica de varredura (ampliação: 45 vezes) e aspecto visual das partículas do bagaço de malte nas formas: original (A), pré-tratado com ácido diluído (B) e após a hidrólise alcalina (C) Figura Gráficos de Pareto para o efeito das variáveis: concentração de NaOH, temperatura e tempo de reação, nas respostas: concentração de ácido ferúlico (A) e concentração de ácido p-cumárico (B) nos licores obtidos por hidrólise alcalina do bagaço de malte. Efeitos acima da linha de p=0,05 são significativos ao nível de 95% de confiança Figura Valores previstos pelo modelo linear em função dos valores observados para as respostas de concentração de ácido ferúlico (A) e concentração de ácido p-cumárico (B) nos licores obtidos por hidrólise alcalina do bagaço de malte. 109 Figura Superfícies de resposta descrita pelos modelos para o rendimento em glicose ( ŷ1 ) e o rendimento total (glicose + celobiose) ( ŷ 2 ) da hidrólise enzimática do bagaço de malte Figura Perfil da liberação de glicose durante a hidrólise enzimática do bagaço de malte a 45ºC, 100 rpm e 8% p/v de concentração de substrato, utilizando diferentes relações de enzima/substrato (15 a 85 FPU/g) Figura Efeito da relação enzima/substrato nos rendimentos de hidrólise da celulose do bagaço de malte a 45ºC, 100 rpm e 8% p/v de concentração de substrato Figura Hidrólise enzimática das amostras de bagaço de malte original, celulignina e polpa celulósica. (A) Concentração de glicose e celobiose nos hidrolisados obtidos; (B) Rendimento em glicose e rendimento total de hidrólise para cada amostra utilizada Figura Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das amostras de bagaço de malte. Material original antes (A) e após (B) a hidrólise enzimática; Celulignina antes (C) e após (D) a hidrólise enzimática; Polpa celulósica antes (E) e após (F) a hidrólise enzimática. Ampliação: 300 vezes

10 Figura Efeito da concentração inicial de inóculo nos parâmetros fermentativos da produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado celulósico de bagaço de malte Figura Efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico de bagaço de malte no consumo de glicose (A), produção de ácido láctico (B), crescimento celular (C) e ph da fermentação (D) por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1 ( ): hidrolisado não suplementado; Meio 2 ( ): hidrolisado suplementado com extrato de levedura; Meio 3 ( ): hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS; Meio 4 ( ): MRS com a mesma concentração inicial de glicose do hidrolisado Figura Efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico de bagaço de malte nos parâmetros fermentativos (Y P/S e Q P ) da produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1: hidrolisado não suplementado; Meio 2: hidrolisado suplementado com extrato de levedura; Meio 3: hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS; Meio 4: MRS com a mesma concentração inicial de glicose do hidrolisado Figura Efeito do controle de ph no consumo de glicose (A) e produção de ácido láctico (B) por Lactobacillus delbrueckii em meios: Hidrolisado não suplementado ( ) sem controle de ph e ( ) com controle de ph; Hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS ( ) sem controle de ph e ( ) com controle de ph; Meio MRS com a mesma concentração inicial de glicose do hidrolisado ( ) sem controle de ph e ( ) com controle de ph Figura Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das amostras de bagaço de malte original (A), polpa do bagaço original não branqueada (B), polpa do bagaço original branqueada (C); bagaço de malte pré-tratado (D), polpa do bagaço pré-tratado não branqueada (E), polpa do bagaço pré-tratado branqueada (F). Ampliação: 300 vezes Figura Aparência das amostras de bagaço de malte original (A), polpa do bagaço original não branqueada (B), polpa do bagaço original branqueada (C); bagaço de malte pré-tratado (D), polpa do bagaço pré-tratado não branqueada (E), polpa do bagaço pré-tratado branqueada (F) Figura Massa precipitada e remoção de lignina em função da redução do ph do licor alcalino de bagaço de malte Figura Efeito da redução do ph (de 12,56 - amostra 1, para 2,15 - amostra 10) na cor do licor alcalino de bagaço de malte

11 LISTA DE TABELAS Tabela Planejamento fatorial completo 2 2 para avaliação do processo de hidrólise ácida do bagaço de malte, em autoclave, sob diferentes condições operacionais Tabela Planejamento fatorial completo 2 3 para avaliação do processo de hidrólise ácida do bagaço de malte, em reator, sob diferentes condições operacionais Tabela Composição do meio semidefinido utilizado para crescimento do inóculo da levedura Candida guilliermondii Tabela Planejamento fatorial completo 2 3 para avaliação do processo de hidrólise alcalina do resíduo do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais Tabela Planejamento fatorial completo 2 3 para avaliação do processo de hidrólise enzimática da celulose da polpa do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais Tabela Planejamento fatorial completo 2 2 para avaliação do processo de produção de carvão ativado a partir da lignina do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais Tabela Composição química do bagaço de malte Tabela Concentração de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradação (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel) e ácido acético nos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de malte obtidos em autoclave sob diferentes condições operacionais Tabela Eficiência de hidrólise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) durante a hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave, sob diferentes condições operacionais Tabela Concentração de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradação (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel) e ácido acético nos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de malte obtidos em reator sob diferentes condições operacionais Tabela Eficiência de hidrólise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) durante a hidrólise ácida do bagaço de malte em reator, sob diferentes condições operacionais Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para a concentração de lignina solubilizada durante a hidrólise ácida do bagaço de malte Tabela Consumo de xilose, crescimento celular e produção de xilitol nos hidrolisados de bagaço de malte produzidos em reator, sob diferentes

12 condições operacionais Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para o fator de rendimento (Y P/S ) e produtividade volumétrica em xilitol (Q P ) obtidos durante a fermentação do hidrolisado de bagaço de malte Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para o fator de rendimento em células (Y X/S ) obtido durante a fermentação do hidrolisado de bagaço de malte Tabela Composição química do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte nas formas diluída (original) e concentrada Tabela Parâmetros fermentativos obtidos durante o cultivo da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido Tabela Composição dos hidrolisados de bagaço de malte empregados como meio de fermentação para produção de xilitol Tabela Parâmetros fermentativos e concentração final de células obtidas durante a produção de xilitol a partir dos hidrolisados de bagaço de malte Tabela Concentração de alguns compostos fenólicos identificados nos hidrolisados de bagaço de malte Tabela Composição química do bagaço de malte nas formas original (BO) e prétratado com ácido sulfúrico diluído (BPT), massa recuperada e perda de cada fração após o pré-tratamento ácido Tabela Composição química das polpas de bagaço de malte e perdas de celulose e lignina após o tratamento de hidrólise alcalina sob diferentes condições operacionais Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e resultados do teste t de Student, para os teores de celulose e lignina residual nas polpas obtidas a partir do bagaço de malte Tabela Equações do modelo para a hidrólise alcalina do bagaço de malte e seus respectivos R 2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de lignina residual e teor de celulose nas polpas obtidas Tabela Porcentagem de lignina solubilizada e concentração de ácidos fenólicos no licor obtido a partir da hidrólise alcalina do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais Tabela Equações do modelo para a hidrólise alcalina do bagaço de malte e seus respectivos R 2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de concentração de ácido ferúlico e concentração de ácido p-cumárico no licor alcalino obtido Tabela Rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrólise

13 enzimática do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student, para o rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrólise enzimática do bagaço malte Tabela Análise de variância com erro total e teste da curvatura, para o rendimento em glicose e rendimento total da hidrólise enzimática do bagaço malte Tabela Equações do modelo para a hidrólise enzimática do bagaço de malte e seus respectivos R 2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) de hidrólise Tabela Composição química das amostras de bagaço de malte empregadas no processo de hidrólise enzimática Tabela Composição de carboidratos nos hidrolisados enzimáticos produzidos a partir do bagaço de malte nas formas original, celulignina e polpa celulósica. 127 Tabela Parâmetros fermentativos e concentração de glicose nos meios de fermentação para a produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii Tabela Rendimento e características das polpas de celulose obtidas por hidrólise alcalina do bagaço de malte nas formas original e pré-tratado com ácido sulfúrico diluído Tabela Volume de ácido sulfúrico adicionado nas amostras do licor alcalino de bagaço de malte, caracterização do licor obtido e quantificação da massa de lignina precipitada Tabela Remoção de metais, cor e compostos fenólicos a partir do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte, por adsorção nos carvões ativados preparados a partir da lignina Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para a remoção de níquel, ferro, cromo e silício a partir do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte, por adsorção nos carvões ativados preparados a partir da lignina

14 LISTA DE SIGLAS ATP CLAE MRS UV VPSE Adenosina Trifosfato Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Man, Rogosa and Sharpe Ultravioleta Variable Pressure Secondary Electron

15 LISTA DE SÍMBOLOS ºC graus Celsius β beta p pára α alfa

16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 19 2 REVISÃO DA LITERATURA BAGAÇO DE MALTE Da cevada ao bagaço de malte Características e aplicações do bagaço de malte FRACIONAMENTO DA MATÉRIA-PRIMA LIGNOCELULÓSICA Hidrólise com ácido diluído Hidrólise alcalina Hidrólise enzimática PRODUTOS DE INTERESSE COMERCIAL QUE PODEM SER OBTIDOS POR PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS A PARTIR DE MATÉRIAS-PRIMAS LIGNOCELULÓSICAS Xilitol Ácido láctico Carvão ativado Ácidos fenólicos Polpa de celulose branqueada 38 3 MATERIAIS E MÉTODOS CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE MALTE E ENSAIOS PRELIMINARES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM AUTOCLAVE Determinação do teor de umidade Determinação dos teores de celulose, hemicelulose e lignina Determinação do teor de cinzas Determinação do teor de proteínas Determinação do teor de minerais Hidrólise ácida em autoclave OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM REATOR VISANDO A MÁXIMA LIBERAÇÃO DE XILOSE E PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO Hidrólise ácida em reator Fermentação dos hidrolisados obtidos para produção de xilitol Microrganismo e preparo do inóculo Meio e condições de fermentação AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO CINÉTICO DA LEVEDURA Candida guilliermondii DURANTE A PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE DILUÍDO E CONCENTRADO 48

17 3.3.1 Hidrolisado hemicelulósico Microrganismo e preparo do inóculo Meios e condições de fermentação INFLUÊNCIA DOS COMPOSTOS TÓXICOS PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE A XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii Hidrolisado hemicelulósico Microrganismo e preparo do inóculo Meios e condições de fermentação OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ALCALINA DO BAGAÇO DE MALTE PARA A PRODUÇÃO DE POLPA CELULÓSICA E LIBERAÇÃO DE ÁCIDOS FENÓLICOS OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE MALTE PARA MÁXIMA CONVERSÃO DA CELULOSE EM GLICOSE Enzima Hidrólise enzimática Efeito da hemicelulose e da lignina na hidrólise enzimática da celulose do bagaço de malte PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR Lactobacillus delbrueckii A PARTIR DO HIDROLISADO CELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE Hidrolisado celulósico Fermentação do hidrolisado celulósico para produção de ácido láctico Microrganismo e preparo do inóculo Meios e condições de fermentação BRANQUEAMENTO DAS POLPAS DE CELULOSE OBTIDAS A PARTIR DO BAGAÇO DE MALTE Obtenção das polpas de celulose Branqueamento das polpas de celulose RECUPERAÇAO DA LIGNINA A PARTIR DO LICOR ALCALINO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO DE CARVÃO ATIVADO Obtenção do licor alcalino contendo lignina solúvel Precipitação da lignina a partir do licor alcalino Preparo dos carvões ativados a partir da lignina MÉTODOS ANALÍTICOS Determinação da concentração de glicose, xilose, arabinose, celobiose, xilitol, ácido acético e ácido láctico Determinação da concentração de furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos Determinação da concentração de metais Determinação do ph Determinação da densidade Determinação da cor dos hidrolisados Determinação da concentração celular da levedura Candida guilliermondii Determinação da concentração celular da bactéria Lactobacillus delbrueckii 63

18 Determinação dos parâmetros do processo fermentativo para a produção de xilitol Determinação dos parâmetros do processo fermentativo para a produção de ácido láctico Determinação do teor de proteínas totais presentes no extrato celulolítico Determinação da atividade enzimática do extrato celulolítico Determinação do número kappa das polpas de celulose Determinação da viscosidade das polpas de celulose Determinação da alvura das polpas de celulose Fotomicrografias 67 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE MALTE E ENSAIOS PRELIMINARES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM AUTOCLAVE Composição química do bagaço de malte Ensaios preliminares de hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave Análise estatística da hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM REATOR VISANDO A MÁXIMA LIBERAÇÃO DE XILOSE E PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO Composição química dos hidrolisados obtidos Fermentabilidade dos hidrolisados de bagaço de malte para produção de xilitol AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO CINÉTICO DA LEVEDURA Candida guilliermondii DURANTE A PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE DILUÍDO E CONCENTRADO Composição química dos hidrolisados utilizados como meio de fermentação Avaliação do crescimento celular da levedura Candida guilliermondii durante a fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte Avaliação da produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii durante a fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte Efeito da arabinose na produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii INFLUÊNCIA DOS COMPOSTOS TÓXICOS PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE A XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii Composição química dos hidrolisados de bagaço de malte Fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte contendo diferentes concentrações de compostos tóxicos OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ALCALINA DO BAGAÇO DE MALTE PRÉ-TRATADO PARA PRODUÇÃO DE POLPA CELULÓSICA Características do bagaço de malte utilizado nos experimentos Hidrólise alcalina do bagaço de malte pré-tratado Análise estatística da hidrólise alcalina do bagaço de malte 100

19 4.5.4 Micrografias das polpas de bagaço de malte Balanço de massa da hidrólise alcalina OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ALCALINA DO BAGAÇO DE MALTE PRÉ-TRATADO PARA LIBERAÇÃO DE ÁCIDOS FENÓLICOS Liberação de ácidos fenólicos durante o pré-tratamento do bagaço de malte com ácido sulfúrico diluído Liberação de ácidos fenólicos durante a hidrólise alcalina do bagaço de malte Análise estatística para a remoção de ácido ferúlico e p-cumárico durante a hidrólise alcalina do bagaço de malte OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE MALTE PARA MÁXIMA CONVERSÃO DA CELULOSE EM GLICOSE Composição química do substrato Análise estatística da hidrólise enzimática do bagaço de malte Análise comparativa da hidrólise enzimática do bagaço de malte com a hidrólise enzimática de outros materiais lignocelulósicos Efeito da carga de enzimas na hidrólise enzimática da celulose do bagaço de malte EFEITO DA HEMICELULOSE E DA LIGNINA NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA CELULOSE DO BAGAÇO DE MALTE Hidrólise enzimática do bagaço de malte com diferentes composições químicas Estrutura morfológica do bagaço de malte após a hidrólise enzimática Composição dos hidrolisados celulósicos produzidos EMPREGO DO HIDROLISADO CELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE COMO MEIO DE FERMENTAÇÃO PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO Aspectos gerais do processo fermentativo Efeito do nível de inóculo na produção de ácido láctico EFEITO DO PH E DA SUPLEMENTAÇÃO NUTRICIONAL DO HIDROLISADO CELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR Lactobacillus delbrueckii Efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico Efeito do ph BRANQUEAMENTO DAS POLPAS DE CELULOSE OBTIDAS A PARTIR DO BAGAÇO DE MALTE Características das polpas obtidas Branqueamento das polpas de celulose do bagaço de malte RECUPERAÇÃO DA LIGNINA A PARTIR DO LICAR ALCALINO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO DE CARVÃO ATIVADO Influência do ph na precipitação da lignina a partir do licor alcalino Produção de carvão ativado a partir da lignina e sua utilização na adsorção de metais e compostos fenólicos CONCLUSÕES 152

20 REFERÊNCIAS 155 ANEXOS 172 ANEXO A Trabalhos que já foram publicados em periódicos científicos a partir dos resultados obtidos nesta tese. 172 ANEXO B Recomendações para trabalhos futuros. 173

21 19 1 INTRODUÇÃO Atualmente existe uma grande pressão política e social no que diz respeito à redução da carga poluente proveniente de atividades industriais. Esta é uma preocupação dos órgãos ambientalistas não somente do Brasil, mas de países do mundo todo. Praticamente todos os países, desenvolvidos ou em desenvolvimento, estão procurando se adaptar a esta realidade modificando os seus processos de forma a reciclar ao máximo todo e qualquer resíduo ou subproduto produzido em suas estações de processamento. Neste sentido, a maioria das grandes empresas tem hoje uma visão onde os resíduos e os subprodutos não devem mais ser considerados inutilizáveis, mas sim matérias-primas para outras indústrias. Seguindo este raciocínio, além de deixarem de ser problema, os resíduos e os subprodutos passam a fazer parte de novas tecnologias para desenvolvimento de produtos de interesse. No processo de fabricação da cerveja, a geração de subprodutos é inevitável, sendo o bagaço de malte, o lúpulo gasto e a levedura, os mais produzidos. No entanto, como a maioria destes subprodutos é proveniente de matérias-primas agrícolas, eles podem ser reciclados e reaproveitados. O presente trabalho teve como objetivo o aproveitamento integral do bagaço de malte em processos químicos e biotecnológicos. Inicialmente, a matéria-prima foi caracterizada quimicamente e em seguida foram avaliadas diversas condições de fracionamento visando promover uma separação seletiva de todas as suas frações poliméricas (celulose, hemicelulose e lignina). Nesta fase foram utilizados os procedimentos de hidrólise ácida (para separação da hemicelulose), hidrólise alcalina (para solubilização da lignina) e hidrólise enzimática (para conversão da celulose em glicose). Para cada um destes procedimentos foi realizado um estudo de otimização das condições de fracionamento, empregando variáveis previamente selecionadas. Os hidrolisados obtidos nas condições otimizadas foram utilizados em processos químicos e biotecnológicos para produção de compostos de interesse comercial, tais como: 1. xilitol, produzido por fermentação da xilose a partir do hidrolisado hemicelulósico, pela levedura Candida guilliermondii; 2. ácido láctico, produzido por fermentação da glicose a partir do hidrolisado celulósico, pela bactéria Lactobacillus delbrueckii; 3. carvão ativado, produzido por ativação química da lignina presente no licor alcalino. Foi também avaliada e otimizada a liberação de ácidos fenólicos durante a hidrólise alcalina da lignina, uma vez que estes compostos também apresentam

22 20 interesse comercial. Além disso, foi ainda realizado um estudo sobre as características da polpa de celulose obtida nas condições otimizadas, antes e após o seu branqueamento com peróxido de hidrogênio (tecnologia livre de cloro), para avaliar sua possibilidade de emprego na produção de papel ou de derivados de celulose. Este trabalho está inserido no programa de pesquisas do Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena, que tem como objetivo o desenvolvimento de tecnologias para o aproveitamento de resíduos e subprodutos agrícolas e agro-industriais, visando a produção de insumos por via biotecnológica.

23 21 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 BAGAÇO DE MALTE Da cevada ao bagaço de malte A cevada, cereal empregado principalmente como matéria-prima para a elaboração de cervejas, é um dos cereais mais importantes mundialmente, ficando atrás apenas do trigo, milho e arroz (KENDAL, 1994). O Brasil é o segundo maior produtor de cevada cervejeira da América Latina seguido da Argentina, com uma produção anual de 275 mil toneladas (LIZARAZO; de FRANCISCO, 2003). O grão de cevada (Figura 2.1) é rico em amido e proteínas e é composto basicamente por três partes: uma casca externa, um endosperma amiláceo e o germe (embrião). A casca atua como uma proteção externa para o grão e é constituída principalmente de material celulósico, apresentando proteínas, resinas e tanino em menores quantidades (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001). Figura Grãos de cevada. Antes de ser utilizada no processo cervejeiro, a cevada obtida nos campos é submetida a um processo de maltagem, o qual serve para elevar o conteúdo enzimático dos grãos. No entanto, a cevada recém colhida não pode ser diretamente malteada, pois ainda não apresenta características adequadas de poder germinativo. Por este motivo, após a colheita ela é mantida armazenada durante 4 a 6 semanas até atingir a plenitude de seu poder germinativo, o que é comprovado através de testes laboratoriais. Após este tempo, a cevada já pode ser malteada (TSCHOPE, 2001).

24 22 O processo de malteação consiste em três etapas: maceração, germinação e secagem. Durante a maceração, os grãos limpos de cevada são colocados em tanques com água (temperatura entre 5 e 18ºC) onde são mantidos por um período de aproximadamente dois dias, sendo realizadas sucessivas trocas de água a cada 6 a 8 horas. Após 2 dias a cevada atinge um teor de umidade de 42 a 48%. Nesta etapa, o metabolismo da semente é ativado através da hidratação, induzindo a germinação. Em seguida, a cevada macerada é colocada para germinar em compartimentos apropriados que permitem a passagem de um fluxo de ar úmido através do leito de cevada, mantendo a temperatura dos grãos na faixa de 15 a 21ºC. Nesta segunda etapa ocorrem mudanças físico-químicas e estruturais do grão, sendo formadas e ativadas as principais enzimas do malte (amilases, proteases, glucanases, entre outras). Ao término da germinação (processo que dura de 6 a 7 dias), o malte de cevada obtido é secado em uma temperatura de 40 a 60ºC até obter um teor de umidade de 4 a 5%, para evitar a contaminação microbiana e desenvolver o sabor característico do malte. Em seguida o malte desidratado é armazenado em silos durante 3 a 4 semanas para homogeneizar seu teor de umidade (LIZARAZO; de FRANCISCO, 2003; TSCHOPE, 2001; VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001). Nas cervejarias, o malte de cevada é moído e em seguida submetido a um processo de mosturação, onde os grãos moídos da cevada malteada são misturados com água e a mistura obtida é aquecida em vários níveis de temperatura (aumentados lentamente de 37 a 78ºC). Este processo tem como objetivo promover a hidrólise enzimática dos constituintes do malte, principalmente do amido, que é convertido em açúcares fermentáveis (maltose e maltotriose) e não-fermentáveis (dextrinas). Posteriormente, é realizada uma filtração para separar a fração líquida, denominada mosto, a qual é empregada como meio de fermentação para a produção da cerveja (DRAGONE, 2007; LINKO et al. 1998). A fração sólida obtida é composta pelo bagaço do malte de cevada. A Figura 2.2, é uma representação esquemática do processo de obtenção do bagaço de malte a partir da cevada natural obtida nos campos. Segundo Townsley (1979), o processo cervejeiro é seletivo e remove a partir da cevada malteada somente os nutrientes que são necessários para a fabricação do mosto. O bagaço obtido do malte de cevada pode ser proveniente somente da matéria-prima empregada (malte de cevada), ou da matéria-prima e de adjuntos (arroz ou milho) que podem ser incorporados ao processo durante a mosturação. A adição de adjuntos é feita dependendo do tipo de processo cervejeiro utilizado e do tipo de cerveja que se deseja produzir (REINOLD, 1997).

25 23 CEVADA Água (5 a 18 C) / 48 h Maceração Germinação PROCESSO DE MALTAGEM Secagem Ar úmido (15 a 21ºC) / 6 a 7 dias Armazenamento MALTE DE CEVADA Moagem Água / aquecimento Fração sólida Mosturação Filtração Fração líquida Mosto PROCESSO CERVEJEIRO BAGAÇO DE MALTE Figura Representação esquemática do processo de obtenção do bagaço de malte a partir da cevada natural Características e aplicações do bagaço de malte O bagaço de malte consiste basicamente da casca do grão de cevada obtida após a elaboração do mosto cervejeiro (Figura 2.3). Por esta razão, sua composição química pode variar de acordo com o tipo de cevada utilizada e o seu tempo de colheita, as condições de malteação e mosturação a que esta foi submetida e também com a qualidade e o tipo de adjuntos adicionados ao processo cervejeiro (HUIGE, 1994; SANTOS et al., 2003).

26 24 Figura Bagaço de malte. Embora sua composição química possa sofrer pequenas variações, o bagaço de malte é um material lignocelulósico rico em proteínas e fibras, frações que correspondem a aproximadamente 20-30% e 70-80% de sua composição, respectivamente (HERNÁNDEZ et al., 1999). A estrutura fibrosa deste material pode ser facilmente visualizada na Figura 2.4. Hemicelulose, celulose e lignina são os principais componentes destas fibras (REINOLD, 1997). Além de fibras e proteínas, o bagaço de malte também apresenta em sua composição, lipídeos e cinzas (SANTOS et al., 2003), minerais, vitaminas e aminoácidos (HUIGE, 1994). De acordo com Kunze (1996), 25% dos minerais presentes no bagaço de malte encontram-se na forma de silicatos. Na Figura 2.4, os pontos brilhantes presentes na parte externa do material correspondem a estes compostos. Nota-se, portanto a presença de grandes quantidades de silicatos na estrutura do bagaço de malte. A B Figura Microscopia eletrônica de varredura de partículas do bagaço de malte. (A) Ampliação de 100 vezes; (B) Ampliação de 300 vezes.

27 25 O bagaço de malte é o mais importante subproduto proveniente da indústria cervejeira, representando aproximadamente 85% do total de subprodutos gerados (REINOLD, 1997). Segundo Townsley (1979), o bagaço de malte corresponde em média por 31% do peso do malte original e sua geração é da ordem de 20 kg/ hl de cerveja produzida (REINOLD, 1997). Considerando essa relação e sabendo que a produção de cervejas no Brasil no ano de 2006 foi de 9,5 bilhões de litros (DRAGONE, 2007), é possível estimar que somente no ano passado, a produção de bagaço de malte no Brasil foi de cerca de 1,9 milhões de toneladas. Apesar de ser obtido em grandes quantidades durante o ano todo e apresentar uma composição química rica em carboidratos e proteínas, entre outros compostos, o bagaço de malte é muito pouco reaproveitado sendo seu principal emprego (úmido ou seco) como ração para animais, devido ao elevado teor de proteínas e fibras (REINOLD, 1997). Alguns estudos avaliaram a adição deste material na alimentação humana, na manufatura de pães, biscoitos e petiscos (BARTOLOMÉ et al., 2002; ÖZTÜRK et al., 2002; SANTOS et al., 2003), tendo chegado às seguintes conclusões: 1. o bagaço de malte na forma em que é produzido nas cervejarias, apresenta uma granulometria grosseira para adição direta em alimentos, devendo ser primeiramente processado para fornecer farinhas; 2. como as proteínas do bagaço de malte úmido liberam uma coloração marrom clara, o bagaço só pode ser usado na formulação de produtos que não são brancos, como bolos, pães e alguns cookies; 3. sua adição em alimentos deve ser feita em pequenas quantidades (5 a 15%), pois grandes quantidades provocam alteração no sabor, no aroma e nas propriedades físicas do produto final, como por exemplo, na cor e na textura (MIRANDA; GROSSMANN; NABESHIMA, 1994; TOWNSLEY, 1979). Alguns trabalhos têm avaliado também a possibilidade de emprego do bagaço de malte em processos biotecnológicos como substrato para cultivo de microrganismos ou para a produção de enzimas. Wang, Sakoda e Suzuki (2001), encontraram uma boa eficiência biológica e valor nutricional do fungo Pleurotus ostreatus quando cultivado em bagaço de malte e consideraram este material como um dos melhores substratos para cultivo desta espécie de fungo. De acordo com Townsley (1979), o bagaço de malte favorece o crescimento de fungos devido ao seu elevado teor de proteínas. No entanto, Wang, Sakoda e Suzuki (2001) consideram que o crescimento destes microrganismos em bagaço de malte é favorecido não somente pelo elevado teor de proteínas e umidade deste material, mas também devido a algumas propriedades físicas, como o tamanho de partícula, densidade, porosidade e capacidade de retenção de água. Quando utilizado como substrato para produção de enzimas, o bagaço de malte mostrou-se como uma excelente fonte de nitrogênio e energia para

28 26 produção de alpha-amylase por Bacillus subtilis (DUVNJAK; BUDIMIR; SUSKOVIC, 1983) ou Aspergillus oryzae (FRANCIS et al., 2003), xilanase por Aspergillus awamori (BHUMIBHAMON, 1978) ou Streptomyces isoladas do cerrado brasileiro (NASCIMENTO et al., 2002) e ferulosil esterase por Streptomyces avermitilis (BARTOLOMÉ et al., 2003). Dragone (2007) e Brányik et al. (2004) utilizaram o bagaço de malte como suporte para a imobilização das leveduras no processo de produção de cerveja e concluíram que este material é uma alternativa promissora para a imobilização destes microrganismos quando comparado com outros suportes encontrados comercialmente, pois além da capacidade de imobilização de células, apresenta vantagens do ponto de vista econômico e simplicidade de preparação. A extração de compostos de interesse comercial por processamento hidrolítico ou enzimático do bagaço de malte também tem sido avaliada. Kabel et al. (2002) e Carvalheiro et al. (2004b) obtiveram várias misturas de oligossacarídeos com diferentes pesos moleculares, quando submeteram o bagaço de malte a um tratamento hidrotérmico. A hidrólise deste material com ácido sulfúrico diluído proporcionou a liberação de açúcares, principalmente xilose e arabinose (CARVALHEIRO et al., 2004a), enquanto que por tratamento enzimático já foram obtidos açúcares (glicose, xilose) e ácidos hidroxicinâmicos (ferúlico e p-cumárico) (BARTOLOMÉ et al., 2002; BELDMAN; HENNEKAM; VORAGEN, 1987; KHAN; LAMB; SCHNEIDER, 1988). A possibilidade de emprego do bagaço de malte em processos de bioconversão tem sido muito pouco explorada. Carvalheiro et al. (2004a) hidrolisaram o bagaço de malte com ácido diluído e verificaram que o hidrolisado produzido, rico em açúcares, proporcionou elevados rendimentos em biomassa quando fermentado pela levedura Debaryomyces hansenii. A produção de xilitol e arabitol a partir deste hidrolisado também foi avaliada por Carvalheiro et al. (2005), que concluíram que este hidrolisado apresenta características favoráveis para uso na produção de xilitol. 2.2 FRACIONAMENTO DA MATÉRIA-PRIMA LIGNOCELULÓSICA A utilização biotecnológica dos diferentes componentes passíveis de serem obtidos a partir dos materiais lignocelulósicos, requer uma separação seletiva dos mesmos, uma vez que a estrutura complexa da lignocelulose em plantas atua como uma barreira que as protege do

29 27 ataque de bactérias e fungos. Por isso, para que se possa aproveitar integralmente o bagaço de malte, é necessário primeiramente submetê-lo a tratamentos de fracionamento, capazes de promover uma separação seletiva de seus componentes poliméricos (celulose, hemicelulose e lignina). A separação dos principais componentes dos materiais lignocelulósicos pode ser realizada através de diferentes técnicas de fracionamento, as quais incluem tratamentos térmicos, químicos, físicos, biológicos, ou uma combinação entre estes. A escolha do tratamento deve ser feita em função do grau de separação requerido e da finalidade do processo. No entanto, para que o processo seja economicamente vantajoso, o tratamento empregado deve ser eficiente do ponto de vista energético e químico, e deve promover ou proporcionar a conversão efetiva do carboidrato de interesse, para que se obtenha um produto final com alto rendimento. Logo, a degradação ou a perda de carboidratos deve ser evitada, bem como a formação de compostos inibidores do metabolismo celular ou da ação de enzimas usadas nos processos de conversão da biomassa (McMILLAN, 1994). Apesar de existirem vários métodos de tratamento, os processos de hidrólise com ácido diluído, hidrólise alcalina e hidrólise enzimática são as técnicas mais empregadas para fracionamento dos materiais lignocelulósicos em geral Hidrólise com ácido diluído A hidrólise com ácido diluído é um dos processos mais utilizados para separação da hemicelulose (heteropolímero composto por pentoses e hexoses, cujo açúcar principal é a xilose) da biomassa lignocelulósica. Baseia-se em uma técnica realizada normalmente em temperaturas entre 120 e 200ºC, com a adição de pequenas quantidades de ácidos minerais como H 2 SO 4 ou HCl (PALMQVIST; HAHN-HÄGERDAL, 2000). Neste processo de hidrólise, o ácido empregado libera prótons que rompem as ligações éter entre os açúcares existentes na cadeia polimérica formada pela hemicelulose e a celulose. O rompimento destas ligações promove a liberação de vários compostos, principalmente xilose, arabinose e glicose (AGUILAR et al., 2002). Segundo McMillan (1994) a hidrólise completa da hemicelulose ocorre entre 5 a 10 minutos para uma temperatura de 160ºC, ou entre 30 a 60 minutos para uma temperatura de 140ºC. Temperaturas mais elevadas (acima de 200ºC) favorecem a hidrólise da celulose. Devido à estrutura ramificada das xilanas e ao seu grau de cristalinidade ser inferior ao da celulose, as ligações glicosídicas entre os monômeros

30 28 de D-xilose na hemicelulose são menos estáveis que as ligações glicosídicas entre os monômeros de D-glicose na celulose. Como conseqüência, as pentoses são facilmente extraídas do material lignocelulósico através desta técnica de hidrólise. No entanto, além de açúcares, a hidrólise ácida também promove a liberação de outros compostos no meio reacional, tais como o ácido acético e compostos provenientes da degradação dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural) e da lignina (fenólicos e aromáticos) (AGUILAR et al., 2002; NEUREITER et al., 2002; TÉLLEZ-LUIS; RAMÍREZ; VÁZQUEZ, 2002). De acordo com Curreli et al. (2002) a formação de produtos de degradação é o principal problema encontrado quando os materiais lignocelulósicos são tratados com ácidos minerais. Um hidrolisado com elevado rendimento em produtos de degradação apresentará um baixo rendimento na recuperação de açúcares. Além disso, como o ácido acético e os produtos de degradação atuam como inibidores do microrganismo em processos fermentativos, é necessário obter hidrolisados com baixas concentrações destes compostos, o que requer então um estudo para otimização das condições operacionais a serem empregadas (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a). Matos (2001) otimizou as condições de hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar e obteve a máxima recuperação de xilose (22,71 g/l) empregando uma concentração de ácido sulfúrico de 130 mg/g de matéria seca, durante 30 minutos de reação. Canilha (2002) avaliou o efeito da temperatura, concentração de ácido sulfúrico, tempo de reação e relação sólido:líquido no processo de hidrólise ácida da palha de trigo e observou que a temperatura e a concentração de ácido exerceram grande influência na recuperação de xilose. Nas condições otimizadas por este autor (140ºC, H 2 SO 4 1%, 20 minutos e relação sólido:líquido de 1:15 g:g), foram obtidas 15,33 g/l de xilose. Roberto, Mussatto e Rodrigues (2003) otimizaram as condições de hidrólise ácida da palha de arroz e atingiram um rendimento em xilose de 77% quando a reação foi realizada com uma solução de ácido sulfúrico 1%, durante 27 minutos. De uma forma geral, a hidrólise com ácido diluído é considerada uma técnica vantajosa, pois promove elevados rendimentos em açúcares com baixa formação de produtos de degradação (PALMQVIST; HAHN-HÄGERDAL, 2000). Além disso, o uso de reagentes diluídos e temperatura de reação relativamente baixa fazem desta técnica de hidrólise uma tecnologia barata e pouco agressiva ao meio ambiente (CURRELI et al., 2002).

31 Hidrólise alcalina A lignina é uma macromolécula polifenólica que pode ser facilmente solubilizada através da técnica de hidrólise alcalina empregando hidróxido de sódio como agente químico. De acordo com Gonçalves, Schuchardt e Corrêa (1997), o uso de reagentes alcalinos e temperaturas elevadas causa uma série de reações de clivagem das ligações tipo éter entre as unidades de fenilpropano, as quais promovem a dissolução da lignina. Sun e Cheng (2002) reportaram que o tratamento de materiais lignocelulósicos com NaOH diluído promove um inchamento do material, aumentando sua área superficial interna e diminuindo seu grau de polimerização e cristalinidade. Este tratamento promove ainda a separação das estruturas da lignina e dos carboidratos, sendo que a estrutura da lignina, além de separada é também rompida e solubilizada, restando uma polpa rica em celulose como material sólido residual. A hidrólise alcalina é considerada muito útil para a deslignificação de matérias-primas vegetais e plantas fibrosas em geral, sendo um dos processos mais antigos utilizados para obtenção de polpa celulósica (FOELKEL; BARRICHELO, 1975), porém ainda hoje muito empregado em inúmeras indústrias de celulose e papel, de pequeno e médio porte. Quando comparado com outros métodos de polpação comumente utilizados (métodos Kraft e sulfito), a hidrólise alcalina, também denominada como polpação soda, apresenta a vantagem de causar um menor impacto ambiental, pois não requer o uso de agentes sulfurados (IGLESIAS et al., 1996; XIAO; SUN; SUN, 2001). Segundo Fengel e Wegener (1989) a solubilização da lignina e a qualidade da polpa celulósica obtida por hidrólise alcalina de materiais lignocelulósicos, varia de acordo com a matéria-prima utilizada e com as condições de processo empregadas, tais como a relação sólido:líquido, o tempo de reação, a temperatura e a concentração de NaOH, sendo este último considerado como o fator de maior influência na dissolução da lignina. Por esta razão, as condições ótimas de hidrólise alcalina devem ser estabelecidas para cada matéria-prima utilizada. Silva, Rocha e Moura (1990) avaliaram a hidrólise alcalina do bagaço de cana-deaçúcar com concentrações de NaOH variando de 0,25 a 1% e tempos de reação de 5 a 120 minutos e observaram que, para as máximas condições empregadas (1% NaOH, 120 minutos) o conteúdo de lignina solubilizada foi de 97,16%. Balczó e Rocha (2002) conseguiram solubilizar 95% da lignina existente no bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado em meio ácido, empregando um processo de hidrólise com solução de NaOH 1,5%, a 100ºC, durante 1 h. Segundo estes autores, quando a concentração de NaOH empregada foi reduzida

32 30 para 1%, a porcentagem de lignina solubilizada foi diminuiu para 89% Hidrólise enzimática Enzimas produzidas por uma variedade de microrganismos (bactérias e fungos) são capazes de romper a estrutura dos materiais lignocelulósicos, liberando os açúcares no meio reacional. Este processo de hidrólise enzimática, também denominado sacarificação, tem sido normalmente empregado para liberação dos açúcares da fração celulósica (polímero linear de unidades de glicose unidas por ligações do tipo β-(1 4)) dos materiais, apresentando bons resultados. Contudo, antes de ser hidrolisada enzimaticamente, a matéria-prima normalmente necessita ser submetida a uma etapa prévia de tratamento, a qual tem por objetivo promover a abertura da estrutura lignocelulósica (através da remoção da hemicelulose e da lignina), aumentando sua porosidade e facilitando o acesso das enzimas celulolíticas à celulose (CAO; TAN, 2002; SUN; CHENG, 2002). O pré-tratamento pode ser físico (ex. moagem), físicoquímico (ex. explosão a vapor, com amônia ou com CO 2 ), químico (ex. hidrólise com ácido diluído, hidrólise alcalina, ozonólise) ou biológico (empregando microrganismos para degradar o material) (SUN; CHENG, 2002). As enzimas celulolíticas incluem a β-1-4-endoglucanase (endoglucanase, EC ), β-1-4-exoglucanase (celobiohidrolase, EC ), e β-glucosidase (celobiase, EC ), que atuam sinergisticamente rompendo a estrutura da celulose em glicose (BELDMAN; HENNEKAM; VORAGEN, 1987; CAO; TAN, 2002). Uma representação esquemática da ação destas três classes de enzimas na estrutura da celulose, é mostrada na Figura 2.5. As endoglucanases são enzimas que atuam randomicamente ao longo da molécula de celulose, degradando as regiões amorfas e clivando as ligações β-1 4-glicosídicas, promovendo, desta forma, um decréscimo significativo em seu grau de polimerização com pouca liberação de açúcares redutores. As exoglucanases atuam nas regiões terminais da molécula de celulose, hidrolisando ambas as regiões amorfas e cristalinas e promovendo sua despolimerização gradativa através da remoção de unidades de celobiose terminais. As enzimas endoglucanases e exoglucanases geram glicose e principalmente celobiose como produtos de reação. Finalmente, as glucosidases hidrolisam a celobiose em monômeros de glicose. Estas três classes de enzimas, individualmente, acarretam alterações bastante diferenciadas na estrutura da celulose e por apresentarem propriedades complementares,

33 31 descrevem um alto grau de sinergismo durante a hidrólise da celulose (CAO; TAN, 2002; van WYK, 1998). Polissacarídeos menores ligações B(1-4) endoglucanase CELULOSE ligações B(1-4) exoglucanase ligações B(1-4) glucosidase CELOBIOSE GLICOSE Figura Representação esquemática da ação das enzimas celulolíticas na estrutura da celulose. Para que ocorra a hidrólise enzimática da celulose é necessário primeiramente que haja a difusão das enzimas no líquido e posterior transferência destas para a superfície do material, formando então o complexo enzima-celulose (CAO; TAN, 2002). A adsorção das enzimas na superfície da celulose caracteriza o primeiro estágio do processo de hidrólise, ocorrendo em seguida a biodegradação da celulose em açúcares fermentáveis e finalmente a dessorção da celulase (SUN; CHENG, 2002). Durante o processo, as enzimas podem sofrer uma perda progressiva de sua atividade catalítica, devido a fatores como: (a) inibição devido ao acúmulo do produto final de hidrólise no meio reacional (glicose e celobiose); (b) inativação ou desnaturação devido ao efeito prolongado da temperatura e da agitação; (c) ocorrência de uma adsorção não específica e/ou não produtiva de um ou mais componentes enzimáticos sobre o material (RAMOS; SADDLER, 1994). Além disso, as variáveis operacionais (ph, agitação, temperatura, tempo de reação, concentração de enzimas, concentração de substrato) utilizadas também podem interferir na eficiência do processo de hidrólise, inibindo ou acelerando a velocidade da reação (KAYA; HEITMANN; JOYE, 2000). Segundo Aguiar e Menezes (2002), a relação celulase/bagaço apresentou grande influência na hidrólise enzimática do

34 32 bagaço de cana-de-açúcar e a presença da enzima β-glucosidase potencializou a hidrólise da celulose. Kaur, Arneja e Singh (1998) avaliaram a hidrólise enzimática da palha de arroz e otimizaram as condições de reação (para uma máxima liberação de açúcares redutores) como sendo baseadas no uso de uma concentração de substrato de 4% p/v, ph 5,0, temperatura de 50ºC, concentração de enzima de 25 FPU/g de substrato e tempo de reação de 48 h. De uma forma geral, o processo de hidrólise enzimática é considerado interessante, pois proporciona elevado rendimento e gera produtos mais puros e com baixo poder inibitório (SUN; CHENG, 2002). 2.3 PRODUTOS DE INTERESSE COMERCIAL QUE PODEM SER OBTIDOS POR PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS A PARTIR DE MATÉRIAS-PRIMAS LIGNOCELULÓSICAS Xilitol O xilitol é um poliálcool de fórmula estrutural C 5 H 12 O 5, com aparência de um pó branco cristalino, inodoro e de valor calórico igual a 2,4 kcal/g. Por apresentar um poder adoçante similar ao da sacarose e possuir importantes propriedades físico-químicas e fisiológicas, o xilitol é considerado como um produto com potencial para aplicações em diversos setores industriais, como por exemplo, na manufatura de alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos (BAR, 1991). O xilitol é considerado ainda como um adoçante perfeitamente capaz de substituir com vantagens a sacarose, pois além de poder adoçante apresenta propriedade anticariogênica e possui várias aplicações clínicas que o indicam no tratamento de pessoas com diabetes, desordem no metabolismo de lipídeos, lesões renais e parenterais, na prevenção de otite, infecções pulmonares e osteoporose (MUSSATTO; ROBERTO, 2002). Na natureza, o xilitol pode ser encontrado em frutas, vegetais e cogumelos. Entretanto, sua extração diretamente de fontes naturais é um processo antieconômico e impraticável, uma vez que o xilitol é encontrado apenas em pequenas quantidades (menos que 900 mg/ 100 g) (PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998a). Uma alternativa à extração do xilitol diretamente de suas fontes naturais, é a sua obtenção pela hidrogenação da D-xilose presente na fração hemicelulósica da matéria vegetal, o que pode ser realizado por via química

35 33 (empregando agentes químicos como catalisadores) ou por via biotecnológica (utilizando microrganismos como catalisadores do processo de redução). O processo químico é atualmente utilizado para a produção de xilitol em escala industrial. Esse processo inclui cinco etapas: 1. hidrólise ácida do material natural rico em xilana; 2. purificação do hidrolisado até obter uma solução de xilose pura; 3. hidrogenação catalítica da xilose pura a xilitol, com uso de um catalisador (liga Ni-Al 2 O 3 ); 4. purificação da solução de xilitol obtida; 5. cristalização do xilitol (MELAJA; HÄMÄLÄINEN, 1977). De acordo com alguns autores, o custo envolvido na produção de xilitol pela via química é relativamente alto, pois este processo requer um grande aporte energético devido ao uso de elevada pressão (até 50 atm) e temperatura (80-140ºC), utiliza um catalisador de alto custo e necessita de várias etapas para purificação da solução de xilose. Além disso, o xilitol é obtido com um rendimento da ordem de 50-60% (PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998a; SAHA, 2003). Uma alternativa interessante ao processo químico de produção de xilitol é a obtenção por processo biotecnológico, a qual apresenta um menor impacto ambiental e requer um menor consumo de energia (KIM et al., 2004). Dentre os microrganismos estudados para esta bioconversão, as leveduras, especialmente as do gênero Candida, são consideradas as melhores produtoras e por isso tem sido amplamente empregadas neste processo (BARBOSA et al., 1988). A produção de xilitol por via biotecnológica é influenciada por vários fatores, os quais incluem o tipo e a concentração inicial de substrato, o nível e a idade do inóculo, o ph, a temperatura e a demanda de oxigênio (PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998b; WINKELHAUSEN; KUZMANOVA, 1998). Porém, quando hidrolisados hemicelulósicos são utilizados como meio de fermentação, existe ainda um outro fator capaz de interferir no desempenho do processo de bioconversão: a presença de compostos provenientes da degradação dos açúcares ou da lignina, os quais podem ser tóxicos ao microrganismo dependendo da concentração em que se encontram no meio de fermentação (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a). A concentração máxima de cada um destes compostos que pode estar presente no meio de fermentação varia de acordo com a espécie de microrganismo utilizada e o seu grau de adaptação ao meio, o tipo de processo fermentativo empregado e a presença simultânea de vários inibidores, que pode proporcionar um efeito sinergístico (PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1998b). Hidrolisados hemicelulósicos obtidos a partir de diferentes matérias-primas podem ser utilizados como meio de fermentação para a produção

36 34 biotecnológica de xilitol, porém, por apresentarem composições químicas diferentes, cada um deles requer um estudo que defina as condições mais adequadas para realização deste bioprocesso (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a) Ácido láctico Ácido láctico é o nome comercial do ácido 2-hidróxi-propanóico, cuja fórmula estrutural é C 3 H 6 O 3. Com a aparência de um líquido incolor, inodoro e viscoso, o ácido láctico é considerado o mais importante ácido orgânico existente, apresentando numerosas aplicações como regulador de ph, conservante, agente tamponante ou solvente, nas indústrias de alimentos, químicos, fármacos, couros e tecidos (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000; PARAJÓ; ALONSO; SANTOS, 1996). Recentemente, este composto também tem recebido grande atenção como matéria-prima para a manufatura de plásticos biodegradáveis, os quais são alternativas menos agressivas ao meio ambiente do que os plásticos obtidos a partir de materiais petroquímicos (JIN; HUANG; LANT, 2003). Devido a todas estas aplicações, a produção de ácido láctico que corresponde atualmente a um mercado superior a toneladas/ano está prevista em aumentar ainda cerca de 15% com a possibilidade de produção de plásticos biodegradáveis (IDRIS; SUZANA, 2006). Todo este aumento na demanda de produção gera um grande interesse em encontrar métodos alternativos para produzir ácido láctico com o menor custo possível. Industrialmente, a produção de ácido láctico pode ser feita por processo químico ou biotecnológico. A síntese química baseia-se principalmente na hidrólise da lactonitrila por ácidos fortes. No entanto, outras rotas também podem ser utilizadas para obtenção deste ácido, tais como a degradação de açúcares catalisada por bases, oxidação de propilenoglicol, hidrólise do ácido cloropropiônico, reação de acetaldeído, monóxido de carbono e água sob elevada temperatura e pressão (DATTA et al., 1995; JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2007). Por outro lado, o processo biotecnológico utilizado para a produção de ácido láctico baseia-se na bioconversão de uma solução de açúcares (a qual pode conter como fonte de carbono, glicose, frutose, sacarose ou lactose) por bactérias (HOFVENDAHL; HAHN- HÄGERDAL, 2000). Segundo John, Nampoothiri e Pandey (2007) a produção biotecnológica de ácido láctico apresenta várias vantagens quando comparada à síntese química, tais como baixo custo do substrato, uso de temperaturas mais brandas e menor consumo de energia. Além disso, a produção de ácido láctico por processo fermentativo tem também aumentado o

37 35 seu mercado, principalmente na indústria de alimentos, devido à preferência dos consumidores por produtos de origem natural (MOLDES; ALONSO; PARAJÓ, 1999). De acordo com John, Nampoothiri e Pandey (2006) um dos principais problemas relacionados com a produção biotecnológica de ácido láctico em larga escala, é o custo da matéria-prima utilizada. Vários substratos podem ser utilizados como fonte de carbono neste processo, os quais incluem glicose, sacarose, lactose, maltose, manose, xilose e galactose. O uso de resíduos agro-industriais em substituição a estas fontes de carbono pode ser uma alternativa interessante, devido a grande disponibilidade e aos baixos custos com que eles podem ser obtidos (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2006; TANAKA et al., 2006). Parajó, Alonso e Santos (1996) produziram ácido láctico a partir dos hidrolisados de madeira de eucalipto e madeira de pinus, empregando a espécie Lactobacillus delbrueckii como microrganismo e encontraram uma produtividade volumétrica de 2,74 g/l.h em 14 h de processo, a partir de uma concentração inicial de substrato de aproximadamente 37 g/l. Richter e Berthold (1998) produziram ácido láctico com um rendimento de 94%, empregando como matéria-prima o talo de sorgo e o grão de centeio e a espécie Lactobacillus paracasei como microrganismo. Assim como a produção de xilitol, a produção de ácido láctico por microrganismos também é influenciada pelas condições experimentais utilizadas, tais como ph, agitação, temperatura, fonte de carbono, composição do meio de fermentação, carga e idade do inóculo, aeração, concentração inicial de açúcar e forma de condução do processo (contínuo, semicontínuo ou descontínuo) (BAI et al., 2003; HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000; SILVA; MANCILHA, 1991). Conhecer o efeito destas variáveis e estabelecer as melhores condições de processo é de grande importância para se obter elevados rendimentos e produtividades Carvão ativado Durante a hidrólise alcalina dos materiais lignocelulósicos, a lignina é dissolvida podendo ser separada na forma de um licor negro que representa o efluente do processo (FENGEL; WEGENER, 1989). Este licor contém uma série de compostos que são tóxicos e precisam ser removidos antes da descarga deste efluente ao meio ambiente (KARAM; NICELL, 1997). Com o objetivo de diminuir o impacto ambiental, as indústrias de polpa e papel normalmente queimam a lignina dissolvida no licor negro para geração de energia.

38 36 Entretanto, a lignina pode ser utilizada como matéria-prima para a obtenção de vários produtos de interesse comercial, tais como carvão ativado, vanilina, fenóis, benzeno, fertilizantes, polímeros, agentes dispersantes, emulsificantes e quelantes, antioxidantes, adesivos, entre outros (GARGULAK; LEBO, 2000). Normalmente a lignina é isolada do licor negro por precipitação com ácido sulfúrico ou clorídrico, seguido por uma etapa de filtração e lavagem com água para eliminação do álcali residual (SANTOS; CURVELO, 2001). A lignina, por si só, já apresenta poder adsorvente com capacidade de remover corantes, surfactantes, pesticidas, fenóis e metais, tais como chumbo, cobre, zinco, cádmio, mercúrio e cromo. Porém, quando transformada em carvão ativado, sua capacidade de adsorção de compostos é aumentada. A transformação da lignina em carvão pode ser feita por ativação física ou química. A ativação física é um processo realizado em duas etapas onde o material é inicialmente carbonizado a ºC e em seguida ativado em presença de um gás oxidante (por ex. CO 2 ) a ºC. Na ativação química, a lignina é impregnada com um agente químico (H 3 PO 4, KOH ou NaOH) e aquecida em atmosfera inerte a ºC, quando os processos de carbonização e ativação ocorrem simultaneamente (SUHAS; CARROTT; RIBEIRO CARROTT, 2007). Segundo Guo e Rockstraw (2006), a ativação química é mais amplamente utilizada do que a ativação física, pois requer uma menor temperatura e proporciona um maior rendimento do produto. Dentre os agentes químicos que podem ser empregados nesta técnica, o ácido fosfórico destaca-se como sendo o mais utilizado, devido a questões econômicas e ambientais, uma vez que ele requer baixas temperaturas de ativação (aprox ºC) e pode ser recuperado ao final do processo (HSISIHENG; TIEN-SHENG; LI-YEH, 1998; DIAO; WALAWENDER; FAN, 2002). As características dos carvões obtidos por ativação química da lignina, tais como área superficial e distribuição do tamanho dos poros (micro, meso e macroporos) interferem na sua capacidade de adsorção e podem variar de acordo com as condições de temperatura, tempo de carbonização, tipo de agente químico, relação agente/lignina e tempo de impregnação, utilizadas no processo de ativação (SUHAS; CARROTT; RIBEIRO CARROTT, 2007) Ácidos fenólicos Além da produção de polpa de celulose, a hidrólise alcalina de materiais lignocelulósicos também fornece uma série de compostos fenólicos de interesse comercial provenientes da solubilização da lignina, uma vez que esta é uma macromolécula polifenólica

39 37 (Figura 2.6). Tais compostos incluem a vanilina e uma série de ácidos fenólicos, dentre estes os ácidos ferúlico, p-cumárico, p-hidroxibenzóico, vanílico, siríngico, entre outros, os quais apresentam uma série de possíveis aplicações, podendo ser convertidos quimicamente a éteres de arila (usados como aditivo para gasolina), solventes e ácidos orgânicos (FENGEL; WEGENER, 1989) e por bioconversão, a vanilina (LESAGE-MEESEN et al., 1996). Figura Estrutura da lignina proposta por ADLER (1977). O ácido ferúlico, por exemplo, é considerado como um dos mais importantes ácidos fenólicos existentes, pois apresenta ação anti-oxidante, anti-inflamatória, anti-microbiana, anti-trombose e anti-câncer (OU; KWOK, 2004). Devido a todas estas propriedades, ele tem recebido grande atenção para aplicação nas indústrias farmacêutica, cosmética e alimentícia (KROON; WILLIAMSON, 1999). O ácido p-cumárico é também outro ácido fenólico de grande interesse devido a suas propriedades anti-oxidantes (TORRES y TORRES; ROSAZZA, 2001). Além disso, ambos ácidos podem ser utilizados como precursores para a produção de compostos naturais aromáticos de valor agregado.

40 38 A possibilidade de se obter compostos fenólicos (principalmente ácidos fenólicos e vanilina) a partir de matérias-primas de baixo custo, como os materiais lignocelulósicos, tem estimulado as pesquisas nesta área. Diversas matérias-primas já foram avaliadas para esta finalidade, incluindo a madeira de eucalipto, farelo de cevada, fibras de aveia, sabugo e folhagem de milho (CRUZ et al., 1999, 2001; GONZÁLES et al., 2004; LEHTINEN; LAAKSO, 1998) Polpa de celulose branqueada No mundo todo, aproximadamente 95% das matérias-primas utilizadas pela indústria papeleira para obtenção de polpa celulósica são madeiras (JIMÉNEZ et al., 2005). No entanto, várias vantagens têm sido mencionadas sobre a produção de polpas a partir de resíduos agrícolas, as quais incluem uma fácil capacidade de polpação, obtenção de fibras de excelente qualidade para tipos especiais de papel e obtenção de uma polpa branqueada de alta qualidade (LÓPEZ et al., 2000; NAVAEE-ARDEH; MOHAMMADI-ROVSHANDEH; POURJOOZI, 2004). Além disso, o aumento do consumo e da produção de papel durante a última década (50% de aumento) tem despertado um grande interesse em se utilizar resíduos agrícolas para esta finalidade. Atualmente, estes resíduos estão gradualmente substituindo a madeira na produção de polpa e papel, por razões econômicas e ambientais (LOPEZ et al., 2001, 2003). Segundo Jiménez et al. (1999) e López et al. (2000), as polpas obtidas a partir destas matériasprimas podem ser utilizadas em mistura ou não com polpas obtidas a partir de madeiras ou com papel reciclado, para obtenção de vários produtos, tais como papel, papelão e outros derivados lignocelulósicos. O branqueamento das polpas de celulose nada mais é que um tratamento físico-químico que tem por objetivo remover os compostos que geram cor, melhorando também as propriedades da polpa celulósica. Neste processo, são utilizados reagentes que modificam quimicamente as substâncias coloridas, descorando-as (DANILAS, 1988), o que leva a um aumento da alvura da polpa. A alvura é o fator de refletância utilizado para avaliar a eficiência do branqueamento na remoção da cor amarela da polpa celulósica (BIERMANN, 1996). Nas indústrias de polpa e papel, a etapa de branqueamento é uma das mais críticas, pois gera um grande volume de efluentes tóxicos formados por compostos organoclorados de baixa massa molar provenientes do uso de agentes químicos clorados. A maior parte destes compostos apresenta efeito cumulativo nos organismos, além de possuir caráter tóxico,

41 39 mutagênico e/ou carcinogênico (RAHMAWATI et al., 2005; WANG; FERGUSON; McCARTHY, 1992). Embora o cloro e seus derivados sejam considerados agentes de branqueamento eficientes e de baixo custo (BIANCHI; CRISOL; SCHUCHARDT, 1999), preocupações ambientais relacionadas com a descarga destes efluentes têm criado uma grande necessidade em se desenvolver novas tecnologias que utilizem seqüências de branqueamento menos poluentes (RAHMAWATI et al., 2005; TANAKA et al., 2004; TUTUS, 2004). Recentemente, o branqueamento de polpas com tecnologias totalmente livres de cloro, baseadas no uso de agentes químicos oxidativos tais como oxigênio molecular, ozônio ou peróxido de hidrogênio, tem se mostrado como alternativas com grande potencial para substituir os procedimentos convencionais que utilizam compostos clorados (SHATALOV; PEREIRA, 2007). Dentre estes agentes oxidativos o peróxido de hidrogênio é reconhecido como um agente oxidante forte, porém pouco agressivo ao meio ambiente, sendo considerado um dos mais importantes agentes químicos de branqueamento (RAWMAWATI et al., 2005). As polpas de celulose branqueadas podem ser utilizadas para diferentes fins, dependendo do nível de alvura que apresentam. Khristova et al. (2006) produziram polpas branqueadas com 76,9% de alvura, as quais foram consideradas adequadas para uso em papéis para escrita e impressão. De acordo com Caraschi, Filho e Curvelo (1996), polpas branqueadas de baixo rendimento (30 a 35%), com um alto conteúdo de celulose pura (>85%) e baixos conteúdos de poliose (1 a 10%) e lignina (<0,05%) são adequadas para uso na obtenção de derivados de celulose, tais como viscose, acetato de celulose e celofane.

42 40 3 MATERIAIS E MÉTODOS A Figura 3.1 é uma representação esquemática do trabalho proposto para aproveitamento integral do bagaço de malte. Os experimentos foram realizados nos laboratórios do Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP). Bagaço de malte Obtenção / Caracterização Otimização das condições de hidrólise ácida Hidrolisado hemicelulósico Resíduo sólido contendo celulose + lignina Produção de XILITOL Processo Fermentativo Processo Químico Produção de POLPA BRANQUEADA Resíduo sólido contendo celulose Otimização das condições de hidrólise enzimática Hidrolisado celulósico Processo Fermentativo Produção de ÁCIDO LÁCTICO Otimização das condições de hidrólise alcalina Licor contendo lignina solúvel Processo Químico Produção de CARVÃO ATIVADO ÁCIDOS FENÓLICOS Figura Representação esquemática do trabalho proposto para aproveitamento integral do bagaço de malte.

43 41 O bagaço de malte utilizado nos experimentos foi fornecido pela Microcervejaria do Departamento de Biotecnologia da EEL-USP. Primeiramente o bagaço foi lavado com água para remoção dos resíduos do processo cervejeiro, sendo em seguida secado em estufa elétrica a 50 ± 5ºC até apresentar um teor de umidade de aproximadamente 10% e armazenado para uso nas etapas seguintes. 3.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE MALTE E ENSAIOS PRELIMINARES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM AUTOCLAVE Determinação do teor de umidade Amostras de aproximadamente 1 grama do bagaço de malte foram colocadas em uma balança com secagem por ação de raios infravermelhos (Denver Instrument IR30). As amostras foram mantidas a 100ºC até obter peso constante e a umidade do bagaço de malte foi então determinada pela diferença de peso obtida antes e após o aquecimento Determinação dos teores de celulose, hemicelulose e lignina O bagaço de malte (10% de umidade) foi caracterizado quanto aos teores de celulose, hemicelulose e lignina, baseando-se nas metodologias descritas por Browning (1967) e Rocha (2000). Aproximadamente 2 gramas de amostra do material foram transferidas para um béquer de 50 ml e adicionou-se 10 ml de H 2 SO 4 72% p/p. A reação foi mantida em banho termostatizado a 45 ± 1ºC, por 7 minutos, sob agitação constante. Após esse tempo, a reação foi interrompida pela adição de 50 ml de água destilada e todo o conteúdo do béquer foi transferido quantitativamente para um Erlenmeyer de 500 ml, onde o volume total de água foi elevado para 275 ml. Em seguida, o Erlenmeyer foi fechado com papel alumínio e autoclavado a 1 atm, 120ºC, durante 45 minutos, para promover a hidrólise completa dos oligômeros restantes. Após autoclavagem, o frasco foi resfriado até temperatura ambiente e o material sólido foi separado da fração líquida por filtração utilizando papel de filtro previamente tarado. O hidrolisado foi recolhido em um balão volumétrico de 500 ml e o sólido contido no papel de filtro foi lavado com água destilada até atingir o volume do balão. A lignina retida no papel de filtro foi lavada ainda com cerca de 800 ml de água destilada e

44 42 secada em estufa à 105ºC até atingir peso constante. A relação entre o peso do resíduo e o peso inicial da amostra foi utilizada para determinar a porcentagem de lignina insolúvel presente no bagaço de malte (equação 1). Uma alíquota de aproximadamente 1 ml da fração líquida obtida foi filtrada em filtro Sep Pak C 18 e analisada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para determinação das concentrações de glicose, xilose e arabinose, as quais foram utilizadas para o cálculo da porcentagem de celulose e hemicelulose presente na amostra (IRICK et al., 1988) de acordo com as equações 2 e 3: % lignina insolúvel = PR*10000/(PA*PSA) equação 1 % celulose = Gli*5000*Fc*Fph/(PA*PSA) equação 2 % hemicelulose = (Xil*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)+(Arab*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA) equação 3 onde: Fc = fator de conversão (0,9 para a celulose e 0,88 para a hemicelulose); Fph = fator de perda de hidrólise (1,055 para celulose e 1,155 para hemicelulose); Gli, Xil, Ara = concentração de glicose, xilose e arabinose, respectivamente (g/l); PA = peso inicial da amostra (g); PR = peso do resíduo de lignina (g); PSA = peso seco da amostra (%). Para determinação da lignina solúvel, uma alíquota de 5 ml do hidrolisado foi alcalinizada com 1 ml de NaOH 6M até atingir ph 12, diluída em balão volumétrico de 50 ml e analisada por espectroscopia de UV (espectrofotômetro Beckman DU 640B) a um comprimento de onda de 280 nm. Amostras do hidrolisado foram também analisadas por CLAE para determinação das concentrações de furfural e hidroximetilfurfural, as quais juntamente com a leitura de absorbância, foram empregadas para calcular a porcentagem de lignina solúvel na amostra, de acordo com as equações 4 e 5 a seguir: % lignina solúvel = (4,187x10-2*(A hid280 -A pd280 )-3,279x10-4)*200 equação 4 A pd280 = (C furf *E furf )/200+(C HMF *E HMF )/200 equação 5

45 43 onde: A hid280 = absorbância do hidrolisado a 280 nm; C furf e C HMF = concentração de furfural e hidroximetilfurfural, respectivamente, no hidrolisado (g/l); E furf = absortividade do furfural (146,85 l/g.cm); E HMF = absortividade do hidroximetilfurfural (114 l/g.cm) Determinação do teor de cinzas Para determinação de teor de cinzas do bagaço, cerca de 1 grama da amostra (pesada em balança analítica) foi colocada em um cadinho de porcelana previamente tarado e aquecida em mufla elétrica a 800ºC por 2 h. As cinzas foram determinadas pela diferença de peso das amostras, antes e após a incineração (equação 6). Antes de serem pesadas, as amostras foram colocadas em um dessecador por 50 minutos. % cinzas = PC*100/PA equação 6 Onde: PC = peso de cinzas (g); PSA = peso seco da amostra (%) Determinação do teor de proteínas O teor de proteínas foi determinado como o conteúdo total de nitrogênio pelo método Kjeldahl, utilizando o fator de correção N 6, Determinação do teor de minerais Os teores de diversos minerais presentes no bagaço de malte foram determinados por espectrometria de emissão atômica por ionização acoplada a plasma, em um aparelho AR Labs modelo 3410, após oxidação com ácido nítrico, conforme metodologia desenvolvida nos laboratórios do Departamento de Engenharia de Materiais, DEMAR, EEL-USP Hidrólise ácida em autoclave Estes experimentos foram realizados sob diferentes condições operacionais (Tabela 3.1), para avaliar a influência das variáveis concentração de ácido sulfúrico (98% p/p) e

46 44 relação sólido:líquido, na eficiência de hidrólise da hemicelulose (xilana + arabinana). Para os experimentos, uma massa de 30 g do bagaço de malte e a quantidade necessária de solução ácida foram acondicionados em frascos Erlenmeyer de 500 ml, os quais foram devidamente fechados e autoclavados a 120ºC durante 27 minutos. Os hidrolisados obtidos foram separados do resíduo sólido por filtração e caracterizados quanto à concentração de açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel. A evaporação de água ocorrida durante o processo de hidrólise foi estimada e utilizada para corrigir os valores de concentração dos compostos identificados nos hidrolisados. Tabela Planejamento fatorial completo 2 2 para avaliação do processo de hidrólise ácida do bagaço de malte, em autoclave, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Níveis originais das variáveis Concentração de H 2 SO 4 (mg/g) Relação sólido:líquido (g:g) Níveis codificados das variáveis Concentração H 2 SO : : : : : : : de Relação sólido:líquido O rendimento em açúcares recuperados (Y S, em gramas de substância que pode ser obtida a partir de 100 g do bagaço de malte em peso seco) e a eficiência de hidrólise (η, %) foram calculados através das equações 7 e 8: Y S = (C*V/M)*100 equação 7 η = (Y S /Y máx )*100 equação 8 onde: C é a concentração da substância na fase líquida (g/l), M é a quantidade de bagaço de malte (em peso seco) utilizada no experimento (g), V é o volume de solução líquida utilizada (l) e Y máx é o rendimento máximo em açúcares recuperados que pode ser obtido (g/100 g em peso seco).

47 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM REATOR VISANDO A MÁXIMA LIBERAÇÃO DE XILOSE E PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO Hidrólise ácida em reator Nesta etapa, os experimentos de hidrólise ácida foram realizados em reatores de capacidade 1,5 L, com forma de tubos cilíndricos de 42,5 cm de altura e 6,7 cm de diâmetro, confeccionados em aço-inox e munidos de aquecimento por resistência elétrica, controle de temperatura e manômetro. Um conjunto de quatro reatores com estas características foi montado e, uma vez ligado, o sistema girava em torno de um eixo (localizado próximo à metade da altura total do sistema), completando uma volta em um tempo de 40 segundos (Figura 3.2). Figura Reator utilizado nos experimentos de hidrólise ácida. Estes experimentos foram realizados empregando diferentes condições de relação sólido:líquido, concentração de ácido sulfúrico (98% p/p) e tempo de reação (Tabela 3.2), para avaliar a influência destas variáveis na eficiência de hidrólise da hemicelulose (xilana + arabinana). Nos ensaios, cada reator foi preenchido com 90 g de bagaço de malte e a quantidade necessária de solução ácida, sendo em seguida fechado e submetido a um aquecimento até 120ºC, temperatura onde a reação foi mantida por diferentes tempos, de

48 46 acordo com o planejamento experimental apresentado na Tabela 3.2. O tempo necessário para aquecimento dos reatores até 120ºC foi de aproximadamente 1,5 h, sendo que um tempo similar a este também foi necessário para o posterior resfriamento dos reatores até temperatura ambiente. Ao término das hidrólises, os materiais sólidos residuais foram separados por filtração e os hidrolisados obtidos foram caracterizados quanto à concentração de açúcares (xilose, arabinose e glicose), ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel. O rendimento em açúcares recuperados e a eficiência de hidrólise para cada condição avaliada foram calculados conforme descrito no item A análise dos resultados obtidos e otimização da melhor condição de hidrólise foram realizadas através do emprego da metodologia estatística de superfície de resposta, utilizando o programa Statistica versão 5.0. Tabela Planejamento fatorial completo 2 3 para avaliação do processo de hidrólise ácida do bagaço de malte, em reator, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Níveis originais das variáveis Concentração de H 2 SO 4 (mg/g) Relação sólido:líquido (g:g) Tempo (min) Níveis codificados das variáveis Concentração de H 2 SO 4 Relação sólido:líquido : : : : : : : : : : : : Tempo Fermentação dos hidrolisados obtidos para produção de xilitol Microrganismo e preparo do inóculo O microrganismo utilizado nestes experimentos foi a levedura Candida guilliermondii FTI 20037, da coleção de culturas do Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos do

49 47 Departamento de Biotecnologia da EEL-USP. A cultura foi mantida repicada em tubos de ensaio contendo ágar extrato de malte inclinado e conservada em geladeira a 4ºC. Um repique com cerca de 24 h foi utilizado para o preparo do inóculo. O meio utilizado para crescimento do inóculo foi formulado utilizando soluções concentradas de cada componente (Tabela 3.3), as quais foram preparadas separadamente e esterilizadas a 121ºC por 20 minutos, exceto a solução de xilose que foi autoclavada a 112ºC por 15 minutos. As soluções foram então misturas assepticamente de forma a se obter a concentração desejada de cada nutriente no meio de cultura. Para a utilização do farelo de arroz como nutriente, preparou-se uma suspensão de farelo em água destilada, em uma concentração de 10% p/v. Esta suspensão foi esterilizada a 121ºC por 20 minutos, resfriada até temperatura ambiente e posteriormente centrifugada em condições assépticas a 1100 g por 20 minutos. A fração líquida então obtida (extrato de farelo de arroz) foi transferida para um frasco previamente esterilizado e conservada em geladeira até a sua utilização, por um período de no máximo 24 h. Tabela Composição do meio semidefinido utilizado para crescimento do inóculo da levedura Candida guilliermondii. Componente Xilose 20,0 Sulfato de amônio 3,0 Cloreto de cálcio 0,1 Extrato de farelo de arroz 20,0* * valor em % p/v Concentração (g/l) O inóculo foi preparado transferindo-se uma alçada de células, proveniente do repique em meio de manutenção, para tubos de ensaio contendo cerca de 5 ml de água destilada esterilizada. Alíquotas de 2 ml desta suspensão foram transferidas para frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml do meio descrito na Tabela 3.3. Os frascos foram incubados à 30 C em agitador rotatório (Tecnal TE-420) a 200 rpm por 24 h. Após este tempo as células foram separadas por centrifugação a 1100 g por 20 minutos e ressuspendidas diretamente no meio de fermentação.

50 Meio e condições de fermentação As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio de fermentação (hidrolisado com o ph ajustado para 6,5 pela adição de NaOH em pastilhas) inoculado com uma concentração celular inicial de 1 g/l. Os frascos inoculados foram incubados à 30 C em agitador rotatório (Tecnal TE-420) a 200 rpm por 24 h. Durante as fermentações foram retiradas amostras para determinação do crescimento celular, consumo de glicose e xilose e produção de xilitol. 3.3 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO CINÉTICO DA LEVEDURA Candida guilliermondii DURANTE A PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE DILUÍDO E CONCENTRADO Hidrolisado hemicelulósico O hidrolisado hemicelulósico utilizado nestes experimentos foi produzido em reatores de 1,5 L de capacidade (item 3.2.1), empregando as seguintes condições de reação: 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos. Ao término da reação, o material sólido residual foi separado por filtração e parte do hidrolisado obtido foi submetida a um processo de concentração sob vácuo, em evaporador com capacidade de 4 litros, a uma temperatura de 70 ± 5ºC, visando aumentar a concentração de xilose para aproximadamente 85 g/l. Os hidrolisados diluído (original) e concentrado foram analisados para determinação das concentrações de açúcares, ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos Microrganismo e preparo do inóculo As condições de cultivo do microrganismo e preparo do inóculo utilizadas nestes experimentos foram as mesmas descritas anteriormente no item

51 Meios e condições de fermentação Para serem utilizados com meio de fermentação, os hidrolisados (diluído e concentrado) tiveram o ph ajustado para 6,5 pela adição de NaOH (pastilhas), sendo que o precipitado formado foi removido por centrifugação (1100 g, 20 minutos). Além das fermentações em meio hidrolisado, foram também realizados alguns ensaios em meio semidefinido contendo as mesmas concentrações de açúcares (glicose, xilose e arabinose) presentes nos hidrolisados. Além de açúcares, os meios semidefinidos foram suplementados com 3,0 g/l de sulfato de amônio, 0,1 g/l de cloreto de cálcio e 10% v/v de extrato de farelo de arroz, o qual foi preparado conforme descrito no item As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio de fermentação (ph 6,5) inoculado com uma concentração celular inicial de 1 g/l. Os frascos foram incubados em agitador rotatório (Tecnal TE-420) a 200 rpm, 30 C durante 30 h (meios diluídos) ou 96 h (meios concentrados). Durante as fermentações foram retiradas amostras para determinação do crescimento celular, consumo de glicose, xilose e arabinose e produção de xilitol. 3.4 INFLUÊNCIA DOS COMPOSTOS TÓXICOS PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE A XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii Hidrolisado hemicelulósico O hidrolisado hemicelulósico utilizado nestes experimentos foi produzido em reatores de 1,5 L de capacidade (item 3.2.1), empregando as seguintes condições de reação: 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos. Ao término da reação, o material sólido residual foi separado por filtração e parte do hidrolisado obtido foi submetida a um processo de concentração sob vácuo, em evaporador com capacidade de 4 litros, a uma temperatura de 70 ± 5ºC, visando aumentar a concentração de xilose para aproximadamente 85 g/l. Os hidrolisados diluído (original) e concentrado foram analisados para determinação das concentrações de açúcares, furfural, hidroximetilfurfural ácido acético e compostos fenólicos (vanilina, seringaldeído, ácido ferúlico e ácido siríngico).

52 Microrganismo e preparo do inóculo As condições de cultivo do microrganismo e preparo do inóculo utilizadas nestes experimentos foram as mesmas descritas anteriormente no item Meios e condições de fermentação Os procedimentos utilizados para preparo dos meios de fermentação a partir do hidrolisado de bagaço de malte original, estão apresentados na Figura 3.3. Concentração (4 vezes) Hidrolisado concentrado Hidrolisado original Hidrolisado diluído (HD) Ajuste do ph para 6,5 Hidrolisado concentrado (HC) Tratamento com carvão ativado e posterior ajuste do ph para 6,5 Hidrolisado concentrado tratado (HCT) Diluição até uma concentração de açúcares igual à do hidrolisado diluído, suplementação com açúcares (xilose, glicose e arabinose) até concentrações 4 vezes maiores e posterior ajuste do ph para 6,5 Ajuste do ph para 6,5 Suplementação com açúcares (xilose, glicose e arabinose) até uma concentração 4 vezes maior do que no hidrolisado diluído e posterior ajuste do ph para 6,5 Hidrolisado diluído suplementado (HDS) Hidrolisado concentrado, diluído e suplementado (HCDS) Figura Representação esquemática dos procedimentos utilizados para preparo dos meios de fermentação a partir do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte.

53 51 O ph dos hidrolisados foi ajustado para 6,5 pela adição de NaOH (pastilhas) e o precipitado formado foi removido por centrifugação (1100 g, 20 minutos). O tratamento do hidrolisado com carvão ativado consistiu na adição de 2,5 g de carvão/100 g de hidrolisado em ph 2,0, a 150 rpm, 45ºC durante 60 minutos. Os cinco meios de fermentação obtidos foram analisados por CLAE para determinação da concentração de açúcares, ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml de meio de fermentação inoculado com uma concentração celular inicial de 1 g/l. Os frascos foram incubados em agitador rotatório (Tecnal TE-420) a 200 rpm, 30 C durante 30 h (HD) ou 96 h (HDS, HC, HCT e HCDS). Durante as fermentações foram retiradas amostras para determinação do crescimento celular, consumo de glicose, xilose e arabinose e produção de xilitol. 3.5 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ALCALINA DO BAGAÇO DE MALTE PARA A PRODUÇÃO DE POLPA CELULÓSICA E LIBERAÇÃO DE ÁCIDOS FENÓLICOS O resíduo do bagaço de malte obtido após a etapa de hidrólise ácida nas condições de 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos, foi submetido a um processo de hidrólise alcalina empregando hidróxido de sódio como agente químico. As reações foram realizadas em ampolas de aço inoxidável de 200 ml de capacidade total, mantendo uma relação sólido:líquido de 1:20 g:g, porém, empregando várias combinações entre as variáveis temperatura, tempo de reação e concentração de NaOH, de acordo com o planejamento fatorial completo 2 3 apresentado na Tabela 3.4. Após serem preenchidas com o bagaço de malte e a solução de NaOH, as ampolas foram devidamente fechadas e introduzidas em um banho com óleo de silicone, onde foram mantidas durante o tempo desejado. Ao término de cada reação, as ampolas foram retiradas do banho de silicone e imediatamente resfriadas em um banho de gelo. Os licores obtidos, contendo a lignina solúvel, foram separados do resíduo sólido por filtração em tecido 100% poliéster e caracterizados quanto à concentração de ácidos fenólicos (ferúlico, p-cumárico, siríngico, vanílico e p-hidroxibenzóico). Os resíduos sólidos obtidos (polpa celulósica) foram lavados

54 52 com água até ph neutro, secados em estufa a 50 ± 5ºC até atingir um teor de umidade de aproximadamente 10% e caracterizados quimicamente quanto aos teores de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas, conforme metodologia descrita nos itens e Tabela Planejamento fatorial completo 2 3 para avaliação do processo de hidrólise alcalina do resíduo do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Níveis originais das variáveis Níveis codificados das variáveis Temperatura Tempo NaOH Temperatura Tempo NaOH ( C) (min) (% p/v) , , , , , , , , , , , , A análise dos resultados obtidos e otimização da melhor condição de hidrólise foram realizadas através do emprego da metodologia estatística de superfície de resposta, utilizando o programa Statistica versão OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE MALTE PARA MÁXIMA CONVERSÃO DA CELULOSE EM GLICOSE Nestes experimentos foi utilizada a polpa celulósica do bagaço de malte obtida após pré-tratamento do material por uma seqüência de hidrólises ácida (empregando 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos) e alcalina (empregando uma solução de NaOH 2% p/v, relação sólido:líquido de 1:20 g:g, 120ºC por 90 minutos). Os processos de hidrólise foram realizados conforme descrito nos itens e 3.5. Para a hidrólise alcalina, foram empregadas ampolas de aço inoxidável de 500 ml de

55 53 capacidade e um banho de óleo de silicone (Lauda) especialmente confeccionado para esta finalidade (Figura 3.4). Após esta seqüência de tratamentos, o material sólido residual obtido (polpa celulósica) foi peneirado e apenas as partículas que passaram em peneira da Série Tyler nº 10 (<1,68 mm) foram utilizadas nas reações de hidrólise enzimática. Figura Banho termostatizado com óleo de silicone, utilizado para a hidrólise alcalina do bagaço de malte Enzima O extrato enzimático comercial, Celluclast 1.5L (Novozymes) produzido por Trichoderma reesei, foi a única fonte de enzimas utilizada nos experimentos. Este extrato era um líquido de cor castanha com densidade de aproximadamente 1,20 g/ml, teor de proteínas de 27 mg/ml e atividade celulolítica total de 74 FPU/ml Hidrólise enzimática Os experimentos de hidrólise enzimática foram realizados empregando diferentes condições de agitação, relação enzima/substrato e concentração de substrato, de acordo com o planejamento fatorial completo 2 3 apresentado na Tabela 3.5. Para os experimentos, a enzima foi adicionada em tampão citrato de sódio 50 mm (ph 4,8) suplementado com 0,02% p/v de

56 54 azida de sódio, para prevenir a contaminação microbiana. Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 25 ml de volume de reação (mistura enzima-tampão). Após a adição do substrato, os frascos foram fechados com papel filme e incubados em agitador rotatório (Tecnal TE-420) a 45 C durante 96 h. Tabela Planejamento fatorial completo 2 3 para avaliação do processo de hidrólise enzimática da celulose da polpa do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Níveis originais das variáveis Níveis codificados das variáveis Agitação Enzima/Substrato Substrato Agitação Enzima/Substrato Substrato (rpm) (FPU/g) (% p/v) Amostras do meio reacional foram retiradas a cada 24 h até o tempo final de hidrólise (96 h), para determinar a concentração de glicose e celobiose liberada. Assim que retirada, a amostra foi aquecida em banho maria a 100ºC durante 5 minutos, para precipitar as proteínas e desta forma cessar a atividade enzimática. Após resfriada, a mistura reacional foi centrifugada a 4000 rpm durante 10 minutos e os hidrolisados obtidos foram analisados para determinar a concentração de glicose e celobiose presente. Através destes valores, o rendimento total de hidrólise da celulose (YT = rendimento em glicose + rendimento em celobiose) foi calculado (equação 9). A análise dos resultados obtidos e otimização da melhor condição de hidrólise enzimática foram feitas através da metodologia estatística de superfície de resposta, empregando o programa Statistica versão 5.0. YT (%) = (glicose/celobiose) 0, (celobiose/celulose) 0, equação 9

57 Efeito da hemicelulose e da lignina na hidrólise enzimática da celulose do bagaço de malte Nestes experimentos, amostras do bagaço de malte com diferentes composições químicas foram utilizadas como substrato no processo de hidrólise enzimática: 1. bagaço de malte na forma original; 2. bagaço de malte pré-tratado com ácido sulfúrico diluído (100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos); 3. bagaço de malte pré-tratado por com ácido sulfúrico diluído (100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos) e posteriormente com hidróxido de sódio (solução de NaOH 2% p/v, relação sólido:líquido de 1:20 g:g, 120ºC por 90 minutos). Os processos de hidrólise foram realizados conforme descrito nos itens e 3.5. A composição química destes materiais foi determinada de acordo com as metodologias descritas nos itens e Os experimentos de hidrólise enzimática foram realizados conforme descrito no item 3.6.2, porém, em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de volume de reação e utilizando condições de agitação, relação enzima/substrato e concentração de substrato, de 100 rpm, 45 FPU/g e 2% p/v, respectivamente. As reações foram mantidas a 45 C durante 96 h. Os hidrolisados obtidos foram analisados por CLAE para determinação das concentrações de glicose, celobiose, xilose e arabinose. O rendimento total de hidrólise da celulose (rendimento em glicose + rendimento em celobiose), para cada substrato utilizado, foi calculado através da equação 9 (item 3.6.2). 3.7 PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR Lactobacillus delbrueckii A PARTIR DO HIDROLISADO CELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE Hidrolisado celulósico O hidrolisado celulósico utilizado como meio de fermentação para a produção de ácido láctico, foi obtido através da hidrólise enzimática da polpa de celulose a partir do bagaço de malte pré-tratado com ácido sulfúrico diluído e posteriormente com solução de NaOH. As condições de hidrólise utilizadas em cada uma destas etapas foram: 1. hidrólise ácida: 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos; 2. hidrólise

58 56 alcalina: solução de NaOH 2% p/v, relação sólido:líquido de 1:20 g:g, 120ºC por 90 minutos; 3. hidrólise enzimática: concentração de substrato de 8% p/v, 45 FPU/g, 100 rpm, 45ºC por 96 h. Estes processos foram realizados conforme descrito nos itens 3.2.1, 3.5 e 3.6.2, respectivamente. A atividade celulolítica total do extrato enzimático comercial, Celluclast 1.5L (Novozymes), utilizado nestes experimentos de hidrólise enzimática foi de 98 FPU/ml Fermentação do hidrolisado celulósico para produção de ácido láctico Microrganismo e preparo do inóculo O microrganismo utilizado nos experimentos foi a bactéria Lactobacillus delbrueckii UFV H2B20, proveniente da coleção de culturas da Universidade Federal de Viçosa (Viçosa, Brasil). A espécie foi mantida repicada em tubos de ensaio contendo meio MRS ágar com a seguinte composição (g/l): glicose (20), peptona (10), extrato de carne (8), extrato de levedura (4), acetato de sódio.3h 2 O (5), citrato triamoniacal (2), fosfato dipotássico (2), sulfato de magnésio.7h 2 O (0,2), sulfato de manganês.4h 2 O (0,05), ágar (14) e 1 ml de Tween 80. A cultura foi conservada em geladeira a 4ºC. O meio utilizado para preparo do inóculo foi o MRS caldo, cuja composição é a mesma do MRS ágar ausente apenas em ágar. Para a formulação deste meio, todos os componentes foram pesados individualmente e misturados um a um em um fraco Erlenmeyer contendo água destilada, sob agitação. Após completa homogeneização, o meio foi autoclavado a 1 atm durante 15 minutos, sendo então resfriado e guardado em geladeira até o momento de uso. Para o preparo do inóculo, duas alçadas de células mantidas em meio MRS ágar foram transferidas para um tubo de ensaio contendo 10 ml do meio MRS caldo. O tubo foi fechado com rolha e papel filme e foi mantido em estufa a 37ºC, sem agitação, durante 24h. Nos experimentos realizados para avaliar o efeito da concentração inicial de inóculo, após 24 h na estufa, 1 ml do inóculo foi transferido para um novo tubo de ensaio contendo 10 ml do meio MRS caldo, sendo mantido novamente em estufa a 37ºC, sem agitação, por mais 24 h. Após este tempo, as células foram separadas por centrifugação (1100 g, 15 min) e ressuspendidas em água destilada esterilizada de forma a se obter uma suspensão com concentração celular de aproximadamente 5 g/l. A partir desta suspensão, diferentes volumes foram adicionados aos meios de fermentação para se obter concentrações iniciais de células

59 57 de 0,5, 0,75 e 1,0 g/l no início da fermentação. Nos experimentos realizados para avaliar o efeito do ph e da suplementação nutricional do hidrolisado, após 24 h na estufa, 2 ml do inóculo foram transferidos para um Erlenmeyer de 250 ml contendo 110 ml de meio MRS caldo, sendo mantido novamente em estufa a 37ºC, sem agitação, por mais 24 h. Após este tempo, as células foram separadas por centrifugação (1100 g, 15 min) e transferidas diretamente para o meio de fermentação de forma a se obter uma concentração celular de 1 g/l no início da fermentação Meios e condições de fermentação Inicialmente os experimentos foram realizados em tubos de ensaio para avaliar o efeito da concentração inicial de inóculo na produção de ácido láctico. O meio de fermentação utilizado nestes experimentos foi constituído pelo hidrolisado celulósico de bagaço de malte com o ph original (4,72) ajustado para 6,0 pela adição de NaOH 5N. Após o ajuste de ph, 10 ml do hidrolisado foi adicionado em cada tubo de ensaio de 25 ml, os quais foram então fechados e autoclavados a 0,5 atm durante 15 minutos. As fermentações foram conduzidas a 37ºC, sem agitação, durante 48 h. A cada 24 h foi retirado um tubo de ensaio para determinação da concentração celular, ph, consumo de glicose e produção de ácido láctico. Posteriormente, foram realizados experimentos em tubos de ensaio para avaliar o efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico de bagaço de malte na produção de ácido láctico. Os meios usados nestes experimentos foram preparados das seguintes formas: Meio 1: Hidrolisado com o ph ajustado para 6,0 pela adição de NaOH 5N. Meio 2: Hidrolisado com o ph ajustado para 6,0, suplementado com 5 g/l de extrato de levedura. Meio 3: Hidrolisado com o ph ajustado para 6,0, suplementado com os mesmo nutrientes do meio MRS caldo. Meio 4: Meio MRS caldo com uma concentração de glicose igual à do hidrolisado (57 g/l). Depois de formulados, os meios foram autoclavados a 0,5 atm por 15 minutos. As fermentações foram conduzidas em tubos de ensaio de 25 ml contendo 10 ml de meio de fermentação, a 37ºC, sem agitação, durante 72 h. A cada 12 h foi retirado um tubo de ensaio para determinação da concentração celular, ph, consumo de glicose e produção de ácido láctico.

60 58 Os experimentos para avaliar o efeito do controle do ph na produção de ácido láctico por fermentação do hidrolisado celulósico de bagaço de malte, suplementado ou não com nutrientes, foram realizados em frascos Erlenmeyer de 250 ml. Estes ensaios foram realizados com os meios 1, 2 e 4 descritos anteriormente. Após a formulação, 100 ml de cada meio foram adicionados aos frascos Erlenmeyer e autoclavados a 0,5 atm durante 15 min. Para avaliar o efeito do controle de ph, foram realizadas fermentações com e sem a adição de NaOH 5N durante a fermentação. Estas fermentações foram realizadas a 37ºC, sem agitação, durante 60 h. O desempenho das fermentações foi avaliado através de retiradas periódicas de amostras (2 ml) a cada 12 h, para determinação da concentração celular, ph, consumo de glicose e produção de ácido láctico. Em todas as fermentações, assim que retiradas do meio de fermentação as amostras foram centrifugadas a 4330 g por 10 min. O sobrenadante foi separado e utilizado para determinação do ph e das concentrações de glicose, celobiose e ácido láctico por CLAE. O precipitado foi lavado com água destilada e utilizado para determinação da concentração celular. 3.8 BRANQUEAMENTO DAS POLPAS DE CELULOSE OBTIDAS A PARTIR DO BAGAÇO DE MALTE Obtenção das polpas de celulose Nesta etapa do trabalho foram obtidas duas polpas de celulose, uma a partir do bagaço de malte original e outra a partir do bagaço de malte pré-tratado com ácido sulfúrico diluído nas condições de 100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos, conforme descrito no item As condições utilizadas para obtenção da polpa de celulose a partir destes materiais basearam-se no uso de uma solução de NaOH 2% p/v, relação sólido:líquido de 1:20 g:g, 120ºC por 90 minutos, conforme metodologia descrita no item 3.5.

61 Branqueamento das polpas de celulose As polpas de bagaço de malte obtidas conforme item foram submetidas a um processo de branqueamento químico realizado em três etapas. Inicialmente, uma amostra de 30 g de cada polpa foi colocada em um béquer de 600 ml juntamente com uma solução de hidróxido de sódio 0,07N de forma a se obter uma consistência de 10%. Em seguida foi adicionado peróxido de hidrogênio (5% em base seca) e o meio reacional foi mantido a 70ºC, durante 40 min, sob agitação. Após este tempo a polpa obtida foi filtrada em um funil de Büchner, lavada com água destilada até ph neutro e secada à temperatura ambiente. Este procedimento foi realizado por duas vezes seguidas. Na terceira etapa do branqueamento, a polpa foi submetida à reação com hidróxido de sódio 0,25 N de forma a se obter uma consistência de 10% e a reação foi mantida a 70ºC durante 60 minutos, sob agitação. Após este tempo, a polpa obtida foi filtrada em um funil de Büchner, lavada com água destilada até ph neutro e secada em temperatura ambiente até obter um teor de umidade de aproximadamente 10%. As polpas obtidas antes e após o branqueamento foram caracterizadas quanto aos teores de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas (itens e 3.1.3), número kappa, viscosidade e alvura. O rendimento das polpas foi determinado pela diferença entre as massas antes e após o branqueamento. 3.9 RECUPERAÇAO DA LIGNINA A PARTIR DO LICOR ALCALINO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO DE CARVÃO ATIVADO Obtenção do licor alcalino contendo lignina solúvel O licor utilizado nestes experimentos foi obtido a partir da hidrólise alcalina do bagaço de malte pré-tratado com ácido sulfúrico diluído (100 mg H 2 SO 4 /g de matéria seca, relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 120ºC por 17 minutos, conforme metodologia descrita no item 3.2.1). As condições utilizadas para hidrólise alcalina basearam-se no uso de uma solução de NaOH 2% p/v, relação sólido:líquido de 1:20 g:g, 120ºC por 90 minutos, conforme metodologia descrita no item 3.5.

62 Precipitação da lignina a partir do licor alcalino Nestes ensaios, foi avaliada a influência do ph na precipitação da lignina a partir do licor alcalino. Um volume de 20 ml do licor foi colocado em 10 tubos de centrífuga de 50 ml de capacidade total. A cada tubo foi adicionado um diferente volume de ácido sulfúrico concentrado (98% p/p) visando obter diferentes valores de ph, variando de 12,56 a 2,15. Após a adição do ácido, os tubos foram fechados, homogeneizados e centrifugados a 4000 rpm durante 10 min. A lignina precipitada foi separada do licor, lavada com cerca de 40 ml de água destilada, homogeneizada e centrifugada novamente a 4000 rpm por 10 min. Este procedimento de lavagem foi realizado duas vezes para cada amostra. Ao término da lavagem, a lignina obtida foi secada em estufa a 60ºC até apresentar massa constante. Os licores obtidos foram mantidos a 4ºC durante 24 h e posteriormente centrifugados a 4000 rpm por 10 min. A lignina então precipitada foi lavada com água conforme descrito anteriormente e secada em estufa a 60ºC até massa constante. A massa total de lignina precipitada foi considerada como a soma da massa precipitada após a adição do ácido e a massa precipitada após o resfriamento. Os licores obtidos foram caracterizados quanto ao ph, concentração total de lignina solúvel e concentração dos ácidos fenólicos: ferúlico, p-cumárico, p-hidroxibenzóico, siríngico e vanílico. A remoção de lignina a partir do licor foi calculada pela diferença entre a concentração de lignina solúvel antes e após o tratamento de precipitação Preparo dos carvões ativados a partir da lignina A lignina seca, recuperada a partir do licor alcalino por precipitação pela adição de ácido sulfúrico até ph 2,15, foi macerada e passada por uma peneira de 170 mesh. Apenas as partículas que passaram por esta peneira (<88 µm) foram utilizadas para a produção de carvão. O processo de ativação da lignina foi realizado empregando diferentes temperaturas de carbonização e relações entre H 3 PO 4 /lignina, de acordo com o planejamento fatorial completo 2 2 apresentado na Tabela 3.6. A lignina foi inicialmente impregnada com ácido fosfórico (85% p/p) na proporção de 1 a 3 g H 3 PO 4 /g lignina e mantida em temperatura ambiente durante 1 h. Após este tempo a mistura foi acondicionada em uma mufla onde foi mantida a 100ºC durante 1 h. Em seguida a temperatura da mufla foi aumentada até a temperatura de carbonização desejada, sendo mantida durante 2 h. Os carvões ativados obtidos foram lavados com água milli Q a 60ºC, durante 48 h, até apresentarem ph neutro.

63 61 Em seguida, estes foram secados em estufa a 105ºC durante 2,5 h, para perder a umidade. Os carvões obtidos nas diferentes condições de ativação foram utilizados para destoxificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte. A concentração de metais (níquel, cálcio, magnésio, zinco, ferro, cromo, alumínio e silício) e compostos fenólicos no hidrolisado antes e após o tratamento, foi determinada para poder calcular a eficiência de cada carvão na remoção destes compostos. A cor dos hidrolisados antes e após os tratamentos também foi determinada. Uma análise estatística dos resultados foi realizada empregando o programa Statistica versão 5.0. Tabela Planejamento fatorial completo 2 2 para avaliação do processo de produção de carvão ativado a partir da lignina do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Níveis originais das variáveis Níveis codificados das variáveis Relação ácido/lignina (g/g) Temperatura de carbonização (ºC) Relação ácido/lignina Temperatura de carbonização MÉTODOS ANALÍTICOS Determinação da concentração de glicose, xilose, arabinose, celobiose, xilitol, ácido acético e ácido láctico As concentrações de glicose, xilose, arabinose, celobiose, xilitol, ácido acético e ácido láctico foram determinadas por CLAE, em um equipamento Waters nas seguintes condições: detector de índice de refração, coluna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm), temperatura de 45ºC, ácido sulfúrico 0,01N como eluente em um fluxo de 0,6 ml/min e volume de amostra de 20µl. Antes de serem injetadas no cromatógrafo, as amostras foram diluídas com água deionizada e filtradas em filtros Sep Pak C 18 (Millipore). As concentrações dos compostos foram calculadas a partir de curvas de calibração obtidas com soluções padrão.

64 Determinação da concentração de furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos As concentrações de furfural, hidroximetilfurfural, vanilina, seringaldeído e dos ácidos ferúlico, p-cumárico, siríngico, vanílico e p-hidroxibenzóico foram determinadas por CLAE, em um equipamento Waters nas seguintes condições: detector UV a 276 nm, coluna Waters Resolve C 18 5 µm (300 x 3,9 mm), temperatura ambiente, acetonitrila/água (1/8 com 1% de ácido acético) como eluente em um fluxo de 0,9 ml/min e volume de amostra de 20 µl. Antes de serem injetadas no cromatógrafo, as amostras foram diluídas com água deionizada e filtradas em membranas do tipo HSWP com poros de 0,45 µm (Millipore). As concentrações destes compostos foram calculadas a partir de curvas de calibração obtidas de soluções padrão Determinação da concentração de metais As concentrações dos metais, níquel, cálcio, magnésio, zinco, ferro, cromo, alumínio e silício foram determinados por espectrometria de absorção atômica por chama, em um equipamento PerkinElmer modelo Analyst 800. Para as determinações, 1 ml da amostra foi transferido para um béquer de vidro contendo 5 ml de água (Millipore 18,2 mω.cm), o qual foi colocado em uma chapa com aquecimento. Durante o aquecimento da amostra, foi adicionado 2 a 3 ml de uma mistura ácida de HNO 3 :HCl, para digerir os açúcares formando CO 2 e H 2 O. O tempo de digestão foi de 3 a 4 h ou até que fosse notada mudança da cor inicial. Após a digestão, a amostra foi resfriada e transferida quantitativamente para um balão volumétrico, onde o volume foi completado com água (Millipore 18,2 mω.cm). A diluição foi feita em função da concentração da amostra e da sensibilidade do aparelho Determinação do ph Os valores de ph das amostras foram determinados por potenciometria, em um aparelho Micronal modelo B474, com correção de temperatura.

65 Determinação da densidade Os valores de densidade dos hidrolisados foram determinados em temperatura ambiente, através do uso de um picnômetro de 50 ml Determinação da cor dos hidrolisados Para determinação da cor, o ph das amostras do hidrolisado foi ajustado para 5,5, pela adição de NaOH 6N. Em seguida as amostras foram centrifugadas (4330 g, 10 minutos), filtradas em membrana HSWP com poros de 0,45 µm (Millipore) e diluídas em água destilada também com o ph ajustado para 5,5. As soluções obtidas foram analisadas em espectrofotômetro (Beckman DU 640B) em um comprimento de onda de 440 nm. Nesta análise, o valor zero foi atribuído à água destilada, e a diferença entre as leituras foi calculada como porcentagem de remoção de cor Determinação da concentração celular da levedura Candida guilliermondii O crescimento celular da levedura Candida guilliermondii foi acompanhado por medida da densidade ótica a 600 nm em espectrofotômetro (Beckman DU 640B). Amostras de volume conhecido foram centrifugadas a 4330 g por 10 minutos, para recuperação da massa celular que posteriormente foi lavada 2 vezes com água destilada e diluída para uma faixa de leitura entre 0,05 a 0,5 unidades de DO. A concentração celular foi determinada utilizando uma equação obtida por regressão linear dos dados entre peso seco e absorbância a 600 nm Determinação da concentração celular da bactéria Lactobacillus delbrueckii O crescimento celular da bactéria Lactobacillus delbrueckii foi acompanhado por medida da densidade ótica a 620 nm em espectrofotômetro (Hitachi U-1800). A massa de células, proveniente de amostras de volume conhecido, foi lavada com água destilada e devidamente diluída para uma faixa de leitura entre 0,05 a 0,5 unidades de DO. A concentração celular foi determinada utilizando uma equação obtida por regressão linear dos dados entre peso seco e absorbância a 620 nm.

66 Determinação dos parâmetros do processo fermentativo para a produção de xilitol O fator de conversão de xilose em xilitol (Y P/S, g/g) foi calculado pela relação entre a concentração de xilitol formado (g/l) e a concentração de xilose consumida (g/l). O fator de conversão de substrato em células (Y X/S, g/g) foi calculado pela relação entre a concentração de células formadas (g/l) e a concentração de substrato (glicose + xilose) consumido (g/l). O fator de rendimento de xilitol por célula (Y P/X, g/g) foi determinado pela relação entre a concentração de xilitol formado (g/l) e a concentração de células presentes no meio de fermentação (g/l). A produtividade volumétrica em xilitol (Q P, g/l.h) foi calculada pela relação entre a concentração de xilitol formado (g/l) e o tempo de fermentação (h). O coeficiente volumétrico de consumo de xilose (Q S, g/l.h) foi calculado pela relação entre a concentração de xilose consumida (g/l) e o tempo de fermentação (h). A eficiência de produção de xilitol (η, %) foi calculada pela relação entre os valores de Y P/S obtido (g/g) e o valor máximo teórico para este parâmetro (0,917 g/g) de acordo com Barbosa et al. (1988) Determinação dos parâmetros do processo fermentativo para a produção de ácido láctico O fator de conversão de glicose em ácido láctico (Y P/S, g/g) foi calculado pela relação entre a concentração de ácido láctico formado (g/l) e a concentração de glicose consumida (g/l). A produtividade volumétrica em ácido láctico (Q P, g/l.h) foi calculada pela relação entre a concentração de ácido láctico formado (g/l) e o tempo de fermentação (h). O fator de rendimento de ácido láctico por célula (Y P/X, g/g) foi determinado pela relação entre a concentração de ácido láctico formado (g/l) e a concentração de células presentes no meio de fermentação (g/l). O rendimento máximo teórico para a produção de ácido láctico é de 1 g/g (para microrganismos homofermentativos) Determinação do teor de proteínas totais presentes no extrato celulolítico O teor de proteínas totais do extrato enzimático comercial foi determinado de acordo com o método de Bradford (1976), utilizando como padrão a albumina de soro bovino.

67 Determinação da atividade enzimática do extrato celulolítico A atividade celulolítica total do extrato enzimático comercial foi determinada de acordo com o procedimento descrito por Mandels, Andreotti e Roche (1976), sendo expressa como unidades de papel de filtro (FPU). Nesta análise, 1,5 ml da solução de enzima diluída em tampão citrato de sódio 0,05M (ph 4,8) foi adicionado em um tubo de ensaio contendo uma tira de 50 mg de papel de filtro Whatman n o 1. Esta mistura foi incubada a 50ºC durante 1 h. Os açúcares redutores liberados do papel de filtro pela ação do extrato celulolítico foram estimados pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) segundo Miller (1959). À solução incubada foram adicionados 3 ml de DNS e esta foi mantida durante 5 minutos em banho maria a 100ºC. Após resfriamento foi feita a leitura da absorbância a 540 nm em espectrofotômetro (Hitachi U-1800). Os açúcares redutores foram expressos em µmoles de glicose liberados, com base em uma curva de calibração feita entre absorbância e concentração de glicose. Uma unidade de papel de filtro é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de glicose a partir de papel de filtro Whatman n o 1, em 1 minuto, a 50ºC Determinação do número kappa das polpas de celulose O número kappa (medida indireta de determinação da lignina residual na polpa) foi determinado pela oxidação por permanganato de potássio e titulação iodométrica com tiossulfato de sódio, seguindo-se metodologia padrão (TAPPI, 1985). Amostras de polpas, com massas entre 0,30 e 0,35 g foram pesadas com precisão de 0,1 mg em béqueres e suspensas em 10 ml de água destilada. Cada suspensão de polpa foi transferida com 140 ml de água para um erlenmeyer de 500 ml que foi mantido a 25 o C sob agitação magnética. Uma solução foi preparada misturando 25 ml de uma solução padrão de KMnO 4 0,1 N (recém preparada) com 25 ml de H 2 SO 4 4 N, em um erlenmeyer de 125 ml que foi mantido a 25 o C sob agitação magnética (solução A). Essa solução foi adicionada quantitativamente a cada erlenmeyer contendo a suspensão de polpa, utilizando-se 50 ml de água destilada para lavar as paredes do frasco. Após exatos 10 min (medidos com um cronômetro) foram adicionados 5,0 ml de uma solução de KI 0,1 N. Essa mistura foi titulada com uma solução padronizada de Na 2 S 2 O 3 0,1 N até próximo ao ponto de viragem (desaparecimento da cor castanha). Em seguida, foram adicionados 2,5 ml de uma solução de amido 2% e a titulação

68 66 prosseguiu até a viragem de azul a incolor. Em um experimento paralelo foi quantificado o consumo de KMnO 4 sem a adição de polpa (branco), substituindo-se a suspensão de polpa por 150 ml de água destilada e seguindose o mesmo procedimento descrito acima. O número kappa foi determinado pelas equações 10, 11 e 12 a seguir (TAPPI, 1985), baseados no volume de KMnO 4 e nos ajustes para o volume consumido e para a temperatura. P = (b-a)*n/0,1 equação 10 f = 0,0084*P + 0,895 equação 11 k = P*f *[1 + 0,013*(25 T)]/W equação 12 onde: P = volume de KMnO 4 que reagiu (ml); a = volume de Na 2 S 2 O 3 consumido pela amostra (ml); b = volume de Na 2 S 2 O 3 consumido pelo branco (ml); f = fator de correção determinado para cada P (TAPPI, 1985); N = normalidade da solução de Na 2 S 2 O 3 ; T = temperatura da análise ( o C); W = massa da polpa seca (g); k = número kappa Determinação da viscosidade das polpas de celulose Para a determinação da viscosidade das polpas foi utilizado um viscosímetro em U (Ostwald Fensk) imerso em banho termostatizado a 25 ± 0,1ºC. A determinação da constante do viscosímetro (kv) foi feita com H 2 SO 4 98% p/p. O líquido foi aspirado até ultrapassar as duas marcas de calibração e deixado escoar, sendo então determinado o tempo necessário para que o menisco do líquido ultrapassasse as 2 marcas. Através dos valores de densidade e viscosidade do H 2 SO 4 98% p/p, na temperatura de trabalho, foi calculada a constante do viscosímetro pela equação 13: kv = V/t*d equação 13 onde: kv = constante do viscosímetro (cp*cm 3 /s*g), V = viscosidade do H 2 SO 4 a 25ºC = 19,25 cp (TAPPI, 1982); d = densidade do H 2 SO 4 a 25ºC = 1,84 g/cm 3 (WEAST, 1984); t = tempo de escoamento (s). A viscosidade das polpas foi determinada pelo método padrão Tappi (1982). Uma massa de 0,125 g de cada polpa seca foi pesada (com precisão de 0,1 mg) e em seguida foram adicionados 25 ml de etilenodiamina cúprica (solução 0,5 M em Cu +2 ). A mistura obtida foi mantida sob agitação magnética por 20 min, sendo, após esse tempo, filtrada em cadinho de vidro sinterizado (n o 3) e transferida para o viscosímetro previamente aferido. Depois de

69 67 atingido o equilíbrio térmico, a solução foi aspirada e o tempo de escoamento foi medido conforme descrito anteriormente. A viscosidade da polpa foi determinada pela equação 14: V = kv*t*d Equação 14 onde: V = viscosidade da solução (cp); kv = constante do viscosímetro (cp*cm 3 /s*g); t = tempo de escoamento (s); d = densidade da solução de celulose (1,052 g/cm 3 TAPPI, 1982) Determinação da alvura das polpas de celulose A alvura das polpas foi determinada de acordo com a norma Tappi (1991). Para determinação da alvura, foram preparados corpos de prova seguindo a norma Tappi T-218 sp- 97. Cerca de 4 g de polpa (base seca) foram suspensas em 1300 ml de água destilada e a suspensão obtida foi agitada durante 5 min, sendo posteriormente vertida em um funil de Büchner de 70 mm de diâmetro e filtrada a vácuo. Após filtração, o funil foi invertido e a polpa foi liberada através da passagem de um fluxo de ar. A folha de prova assim formada foi então prensada e colocada para secar em ambiente protegido da luz. Após um dia, as folhas, com gramatura de 0,09 g/cm 2, tiveram a porcentagem de reflexão em 457 nm determinada em um aparelho Photovolt modelo 577. A porcentagem de reflexão foi determinada em três pontos diferentes das polpas e os resultados foram apresentados como média destas medidas. A gramatura, ou seja, a massa por unidade de área do papel, foi calculada através da equação 15, onde g = gramatura (g/cm 2 ), m = massa do corpo de prova (g) e A = área do corpo de prova (cm 2 ). g = (m/a)*10 4 Equação Fotomicrografias Amostras secas do bagaço de malte foram colocadas na base de um suporte metálico, onde foram aderidas através de uma fita adesiva. Em seguidas, estas foram recobertas com ouro e analisadas em um microscópio eletrônico de varredura da marca Leo 1450VP, sendo então obtidas as fotomicrografias. Estas análises foram realizadas no Departamento de Engenharia de Materiais (DEMAR) da EEL-USP.

70 68 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE MALTE E ENSAIOS PRELIMINARES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM AUTOCLAVE Composição química do bagaço de malte Após obtenção, o bagaço de malte foi lavado com água para remover os açúcares residuais provenientes do mosto, e secado até atingir 10% de umidade. Este procedimento foi realizado para poder manter as características do material durante a estocagem, uma vez que, o bagaço de malte procedente do mosto cervejeiro contém açúcares fermentáveis e apresenta um teor de umidade de aproximadamente 80%, o que favorece sua deterioração. A secagem da matéria-prima é também interessante em termos de redução de volume e diminuição dos custos de armazenamento. A composição química do bagaço de malte utilizado neste trabalho está apresentada na Tabela 4.1, onde os valores estão expressos como porcentagem em peso seco de celulose (glucana), hemicelulose (xilana + arabinana), lignina total (Klason + solúvel em ácido), cinzas grupos acetil, proteínas, e extrativos. Observa-se que o bagaço de malte produzido a partir de 100% malte de cevada é um material lignocelulósico composto principalmente por (% p/p): hemicelulose (28,42), lignina (27,78), celulose (16,78) e proteínas (15,25). A estrutura hemicelulósica é formada pelos polissacarídeos xilana e arabinana em uma proporção de 2,3:1. Embora o teor de arabinana no bagaço de malte seja elevado, xilana e glucana são os principais polissacarídeos presentes neste material, assim como em outros resíduos agrícolas. Por outro lado, o bagaço de malte apresenta um alto teor de lignina (27,78 % p/p) que o diferencia da maioria dos resíduos agrícolas. Bagaço de cana-de-açúcar, palha de arroz e palha da cevada, por exemplo, apresentam teores de lignina de 18,10, 17,20 e 15,80 % p/p, respectivamente (ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; SUN et al., 2004, 2005). O teor de proteínas no bagaço de malte (15,25 % p/p) também é maior do que os teores encontrados em outros materiais lignocelulósicos, tais como as palhas de cevada, aveia, arroz e trigo, as quais contêm entre 3,0 a 5,0 % p/p de proteínas (THEANDER; AMAN, 1984). Os aminoácidos ligados às proteínas não foram determinados no presente trabalho, mas alguns

71 69 autores relataram que o bagaço contém os aminoácidos: leucina, valina, alanina, serina, glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, tirosina, prolina, treonina, arginina, lisina, cistina, histidina, isoleucina, metionina, fenilalanina, e triptofano (HUIGE, 1994; MARIANI, 1953). Tabela Composição química do bagaço de malte. Componente (% p/p) Celulose (glucana) 16,78 Hemicelulose 28,42 Xilana 19,94 Arabinana 8,48 Lignina total 27,78 Lignina Klason 22,96 Lignina solúvel em ácido 4,82 Cinzas 4,60 Grupos acetil 1,35 Proteínas 15,25 Extrativos (por diferença) 5,82 Minerais (mg/kg) Cálcio 3515,0 Sódio 309,3 Potássio 258,1 Magnésio 1958,0 Alumínio 36,0 Ferro 193,4 Bário 13,6 Estrôncio 12,7 Manganês 51,4 Cobre 18,0 Zinco 178,0 Fósforo 5186,0 Enxofre 1980,0 Cromo 5,9 Silício 10740,0 Além de celulose, hemicelulose, lignina e proteínas, o bagaço de malte também apresenta 4,6% p/p de cinzas. Uma análise de espectrometria de emissão atômica revelou que diversos minerais estão presentes na composição deste material, os quais incluem: cálcio, sódio, potássio, magnésio, alumínio, ferro, bário, estrôncio, manganês, cobre, zinco, fósforo, enxofre, cromo e silício, em níveis que variam de 5,9 a 10740,0 mg/kg em peso seco (Tabela 4.1). Assim como nas palhas de cereais (aveia, cevada, arroz e trigo) (THEANDER; AMAN,

72 ), as cinzas do bagaço de malte também são ricas em silício; entretanto, o bagaço apresenta teores mais elevados de fósforo e cálcio, minerais existentes em menores proporções nestas outras matérias-primas. O teor de extrativos (ceras, gorduras, gomas, amidos, resinas, taninos, óleos essenciais, e vários outros constituintes citoplasmáticos (KUHAD; SINGH, 1993)) no bagaço de malte foi calculado por diferença. As vitaminas presentes neste material não foram determinadas, mas alguns autores relataram a presença de (ppm): biotina (0,1), colina (1800), ácido fólico (0,2), niacina (44), ácido pantotênico (8,5), riboflavina (1,5), tiamina (0,7) e vitamina B6 (0,7) (HUIGE, 1994; MARIANI, 1953). Após sua caracterização, o bagaço de malte foi submetido a um processo de hidrólise ácida visando recuperar os açúcares provenientes da hemicelulose (xilose e arabinose). A partir da composição química do material, o rendimento máximo destes açúcares que poderia ser obtido no hidrolisado foi calculado e correspondeu a 19,6 g de xilose e 8,3 g de arabinose (g/100 g em peso seco) Ensaios preliminares de hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave Estes ensaios foram propostos para se ter uma avaliação preliminar do comportamento da reação do bagaço de malte em meio ácido sulfúrico, visando recuperar os açúcares da fração hemicelulósica. Nesta etapa, foi utilizado um planejamento fatorial completo 2 2 para avaliar a influência das variáveis relação sólido:líquido e concentração de ácido sulfúrico, na hidrólise do bagaço de malte. As faixas de valores das variáveis utilizadas foram selecionadas de acordo com trabalhos da literatura que utilizaram valores similares para hidrólise ácida de outros materiais lignocelulósicos (AGUILAR et al., 2002; ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; TÉLLEZ-LUIS; RAMÍREZ; VÁZQUEZ, 2002). Os hidrolisados obtidos nas diferentes condições de hidrólise foram analisados para determinação da concentração de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradação (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel) e ácido acético. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 4.2. Nota-se que a concentração destes compostos nos hidrolisados variou para cada condição de hidrólise empregada. Todos os hidrolisados continham xilose e arabinose em concentrações muito mais elevadas que a de glicose, sendo que as máximas concentrações destes açúcares (obtidas no ensaio 3) corresponderam a 13,21 e 8,21 g/l, respectivamente, enquanto que a mais alta concentração de glicose (também obtida

73 71 no ensaio 3) correspondeu a apenas 0,32 g/l. Estes resultados sugerem que as condições de hidrólise utilizadas foram capazes de hidrolisar apenas a fração hemicelulósica do material, sem interferir praticamente na estrutura da celulose, que teria permanecido inalterada. Tabela Concentração de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradação (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel) e ácido acético nos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de malte obtidos em autoclave sob diferentes condições operacionais. Ensaio Variáveis a S:L (g:g) A (mg/g) Respostas (g/l) Glicose Xilose Arabinose Furfural HMF b Lignina solúvel Ácido acético 1 1: ,17 9,65 8,08 0,04 0,10 3,79 0,49 2 1: ,01 2,15 3,91 0,04 0,13 3,29 0,08 3 1: ,32 13,21 8,21 0,02 0,03 2,05 0,60 4 1: ,05 3,68 4,00 0,01 0,04 2,40 0,19 5 1: ,12 6,27 5,62 0,03 0,06 2,78 0,34 6 1: ,11 5,88 5,52 0,03 0,07 2,56 0,30 7 1: ,11 5,35 5,36 0,03 0,06 2,61 0,27 a S:L = relação sólido:líquido; A = concentração de ácido sulfúrico; b hidroximetilfurfural. De acordo com Lee et al. (1978), durante o processo de hidrólise ácida a hemicelulose é hidrolisada mais rapidamente do que a celulose; e quando a reação é conduzida em condições que favorecem a hidrólise da celulose, a maior parte da xilose é degradada a furfural, sendo então muito pouco recuperada. No presente trabalho, as condições de hidrólise utilizadas praticamente não hidrolisaram a celulose e também não favoreceram a formação de furfural e hidroximetilfurfural (subprodutos provenientes da degradação de pentoses e hexoses, respectivamente), uma vez que estes compostos estavam presentes nos hidrolisados em concentrações muito baixas (<0,13 g/l, Tabela 4.2). Estes resultados mostram, portanto, que para todas as condições de hidrólise estudadas, apenas pequenas quantidades de açúcares foram degradadas. As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural obtidas foram inclusive menores do que os valores encontrados em hidrolisados ácido diluídos produzidos a partir de outras matérias-primas lignocelulósicas, tais como silagem, gramíneas, bagaço de cana-deaçúcar, palhas de arroz e de sorgo e madeiras (AGUILAR et al., 2002; KIM; YUM; PARK, 2000; NEUREITER et al., 2004; ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; TÉLLEZ- LUIS; RAMÍREZ; VÁZQUEZ, 2002). Durante a hidrólise ácida do bagaço de malte, os grupos acetil ligados à estrutura da xilana também foram liberados no meio reacional, uma vez que foi verificada a presença de

74 72 ácido acético em todos os hidrolisados obtidos (Tabela 4.2). Porém, este composto também estava presente em baixas concentrações nos hidrolisados, variando de 0,08 a 0,6 g/l. A hidrólise ácida foi ainda capaz de solubilizar parte da estrutura da lignina do bagaço de malte, sendo que a lignina solúvel foi o subproduto obtido em maior concentração nos hidrolisados (variando de 2,05 a 3,79 g/l, Tabela 4.2). A escolha de uma condição de hidrólise que minimize a formação destes compostos é de grande interesse, pois favoreceria o emprego do hidrolisado em processos de bioconversão uma vez que a lignina solúvel é composta principalmente por compostos fenólicos, os quais são extremamente tóxicos para os microrganismos (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a) Análise estatística da hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave A partir das concentrações de xilose e arabinose presente nos hidrolisados, foram calculadas as eficiências de hidrólise da xilana, da arabinana, e da hemicelulose (xilana + arabinana) (Tabela 4.3). As estimativas dos efeitos das variáveis utilizadas na hidrólise e a significância estatística delas foram determinadas pelo teste t de Student e podem ser visualizados nos gráficos de Pareto apresentados na Figura 4.1. Tabela Eficiência de hidrólise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) durante a hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Eficiência de hidrólise (%) Xilana Arabinana Hemicelulose 1 48,93 96,35 63, ,89 93,59 43, ,97 97,84 76, ,44 95,68 54, ,71 100,00 63, ,75 98,80 60, ,67 95,80 57,12 Observa-se que ambas as variáveis, relação sólido:líquido e concentração de ácido, não apresentaram influência significativa ao nível de 95% de confiança sobre a hidrólise da arabinana (Figura 4.1A). Este fato é justificável uma vez que a eficiência de hidrólise da arabinana foi maior que 93,6 % para todas as condições de hidrólise avaliadas (Tabela 4.3).

75 73 Por outro lado, a eficiência de hidrólise da xilana variou significativamente, de 21,89 a 66,97%, demonstrando que houve influência das condições de hidrólise, sobre esta resposta. É interessante notar que a condição que proporcionou o menor valor de eficiência de hidrólise da arabinana (93,59%, ensaio 2) também proporcionou o menor valor de eficiência de hidrólise da xilana (21,89%). No entanto, se compararmos estes dois valores fica evidente que a arabinana do bagaço de malte é hidrolisada muito mais facilmente do que a xilana. Kabel et al. (2002) também observaram que durante o tratamento hidrotérmico do bagaço de malte, a arabinose foi removida mais facilmente da estrutura da hemicelulose do que a xilose. De acordo com Carvalheiro et al. (2004b), a arabinose possui uma maior sensibilidade térmica do que a xilose e por esta razão ela é liberada primeiro da estrutura da hemicelulose. p=0,05 p=,05 p=0,05 (1) -0,98 (1) -9,69 (2) 0,72 (2) 5,75 (12) 0,12 (12) -0,43 (A) (B) Estimativa dos efeitos Estimativa dos efeitos p=0,05 p=0,05 (1) -7,48 (2) -6,42 (2) 4,47 (12) 2,18 (12) -0,28 (1) -0,40 (C) (D) Estimativa dos efeitos Estimativa dos efeitos Figura Gráficos de Pareto para estimativa dos efeitos das variáveis: (1) relação sólido:líquido, (2) concentração de ácido sulfúrico e (12) a interação entre elas, nas respostas: eficiência de hidrólise da arabinana (A), eficiência de hidrólise da xilana (B), eficiência de hidrólise da hemicelulose (xilana + arabinana) (C) e concentração de lignina solúvel (D), obtidas nos processos de hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave. Efeitos acima da linha de p=0,05 são significativos ao nível de 95% de confiança.

76 74 O efeito da relação sólido:líquido e da concentração de ácido na eficiência de hidrólise da xilana está apresentado na Figura 4.1B. Como se pode observar, ambas as variáveis apresentaram efeito principal significativo ao nível de 95% de confiança nesta resposta. O efeito negativo da relação sólido:líquido indica que a eficiência de hidrólise da xilana foi favorecida quando a relação sólido:líquido foi diminuída; enquanto que o efeito positivo da concentração de ácido demonstra que a eficiência de hidrólise foi maior quanto maior a concentração de ácido utilizada. O aumento no rendimento de xilose devido ao aumento da concentração de ácido sulfúrico também foi observado durante a hidrólise de outros materiais lignocelulósicos, tais como bagaço de cana-de-açúcar, silagem e gramíneas (NEUREITER et al., 2002, 2004). Quando comparamos as Figuras 4.1B e 4.1C, observa-se que as variáveis operacionais apresentaram efeitos similares para ambas as eficiências de hidrólise da xilana e da hemicelulose. Isto provavelmente se deve ao fato de que a eficiência de hidrólise da arabinana foi praticamente a mesma para todas as condições avaliadas. Logo, a eficiência de hidrólise da hemicelulose foi dependente principalmente da hidrólise da xilana. A interação entre as variáveis não foi significativa para nenhuma das respostas analisadas, sugerindo que o efeito de cada variável deve ser interpretado individualmente. A análise estatística para a resposta de lignina solúvel (Figura 4.1D) revelou que apenas a concentração de ácido apresentou efeito significativo ao nível de 95% de confiança para esta resposta e com um efeito negativo, indicando que a solubilização da lignina foi favorecida quanto menor a concentração de ácido utilizada no processo. Entretanto, o valor máximo de lignina solúvel não pode ser obtido em ausência de ácido, mas uma concentração mínima deste é requerida. Por outro lado, para se obter uma baixa concentração de lignina solúvel, a concentração de ácido deve ser aumentada. Isto ocorre porque o ácido promove a reticulação da lignina, impedindo sua solubilização. Logo, com o aumento na concentração de ácido uma maior parte da lignina se torna reticulada e deixa de ser solubilizada no meio reacional (FENGEL; WEGENER, 1989). Uma análise de variância com estimativa de curvatura foi realizada para todas as respostas estudadas e revelou que este parâmetro não apresentou significância estatística mesmo a 90% de confiança. Isto significa que na região em estudo, os valores das respostas variaram de forma linear. Como as condições que promoveram os mais altos valores de eficiência de hidrólise da xilana e da hemicelulose foram as mesmas que proporcionaram os mais baixos valores de lignina solúvel, as melhores condições para hidrólise ácida do bagaço de malte em autoclave, na região em estudo, foram baseadas no uso de uma relação

77 75 sólido:líquido de 1:10 g:g e uma concentração de ácido sulfúrico de 120 mg/g de matéria seca. Entretanto, os valores de eficiência obtidos com o uso destas condições de hidrólise (67% para a xilana e 76,2% para a hemicelulose, ensaio 3) revelam que as condições de hidrólise ácida do bagaço de malte ainda precisam ser otimizadas de forma a aumentar a recuperação dos açúcares da fração hemicelulósica, principalmente xilose. Observando o cromatograma obtido para esta condição de hidrólise (Figura 4.2), nota-se a existência de picos entre os tempos de retenção de 6,5 a 8 minutos, sugerindo a presença de oligômeros no hidrolisado. De acordo com alguns autores, a hemicelulose apresenta duas frações de xilana com diferentes suscetibilidades à hidrólise, sendo que uma reage mais rapidamente do que a outra. A fração que é mais facilmente hidrolisada com ácidos diluídos corresponde a 60-80% do total enquanto que os restantes 20-40% correspondem a uma fração mais difícil de ser hidrolisada (GARROTE; DOMÍNGUEZ; PARAJÓ, 2002; KIM; YUM; PARK, 2002; LAVARACK; GRIFFIN; RODMAN, 2002) xilose arabinose MV glicose Minutes Figura Cromatograma do hidrolisado obtido em autoclave, nas condições de relação sólido líquido de 1:10 g:g e 120 mg de ácido/g de matéria seca. 4.2 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ÁCIDA EM REATOR VISANDO A MÁXIMA LIBERAÇÃO DE XILOSE E PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO Nesta etapa do trabalho, os experimentos de hidrólise ácida foram realizados em reator visando aumentar a eficiência de hidrólise da hemicelulose do bagaço de malte, conforme

78 76 discutido na seção anterior. Estes ensaios foram realizados de acordo com um planejamento fatorial completo 2 3 para avaliar o efeito das variáveis relação sólido:líquido, concentração de ácido sulfúrico e também do tempo de reação, nas respostas de eficiência de hidrólise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) e na fermentabilidade dos hidrolisados obtidos para a produção de xilitol Composição química dos hidrolisados obtidos Assim como nos experimentos de hidrólise em autoclave, xilose e arabinose também foram os principais açúcares presentes nos hidrolisados produzidos em reator (Tabela 4.4). A partir das concentrações destes compostos foram calculadas as eficiências de hidrólise, cujos valores obtidos estão apresentados na Tabela 4.5. Analisando esta tabela, observa-se que os resultados de hidrólise ácida do bagaço de malte em reator foram superiores aos obtidos em autoclave, principalmente em relação à eficiência de hidrólise da xilana e da hemicelulose. Em autoclave, a máxima eficiência de hidrólise da xilana e da hemicelulose foi 67% e 76,2%, respectivamente, enquanto que em reator estes valores atingiram 94,2% e 96,5%, (ensaio 8 Tabela 4.5). Mesmo para a condição que proporcionou os mais baixos resultados de eficiência em reator, os valores de hidrólise da xilana e da hemicelulose foram 28% e 16% superiores à melhor condição obtida em autoclave. Isto demonstra que os ensaios preliminares em autoclave foram importantes, pois mostraram a direção para a qual os valores das variáveis exerciam maior influência no processo de hidrólise. Além disso, os melhores resultados obtidos nesta etapa podem ser atribuídos também ao sistema de agitação, presente em reator e ausente em autoclave, o que permitiu uma maior interação entre as partículas do material e a solução ácida. Os elevados valores de eficiência de hidrólise (>85,8%) obtidos para ambos, xilana e arabinana, proporcionaram elevados valores de eficiência de hidrólise da hemicelulose, variando de 88,7 a 96,5% para todas as condições avaliadas. A análise estatística destes resultados revelou que não houve diferença entre os tratamentos a um nível de confiança de 95%, o que permite concluir que a faixa de valores estudada em reator já se encontra dentro de uma região ótima, onde a extração de xilose e arabinose foi máxima independente das variações aplicadas.

79 77 Tabela Concentração de açúcares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradação (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel) e ácido acético nos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de malte obtidos em reator sob diferentes condições operacionais. Ensaio Variáveis a S:L (g:g) A (mg/g) T (min) Concentração (g/l) b Gli Xil Arab Furfural HMF Lignina solúvel Ac. acético 1 1: ,19 21,88 10,71 0,63 0,09 4,22 1,20 2 1: ,57 14,28 7,17 0,31 0,05 2,66 0,77 3 1: ,72 21,44 10,10 0,99 0,08 2,70 1,19 4 1: ,08 15,11 7,21 0,48 0,04 2,73 0,76 5 1: ,25 20,96 10,12 0,87 0,07 3,22 1,34 6 1: ,57 14,36 6,81 0,28 0,03 2,26 1,12 7 1: ,89 22,62 10,51 1,02 0,07 2,56 1,39 8 1: ,96 15,48 7,12 0,46 0,03 2,20 0,81 9 1: ,33 18,16 8,65 0,58 0,04 3,40 1, : ,30 17,69 8,40 0,65 0,05 3,50 1, : ,36 17,60 8,23 0,50 0,04 3,16 1, : ,12 16,94 8,03 0,60 0,05 3,13 0,99 a S:L = relação sólido:líquido; A = concentração de ácido sulfúrico; T = tempo de reação. b Gli = glicose; Xil = xilose; Arab = arabinose; HMF = hidroximetilfurfural Tabela Eficiência de hidrólise da xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) durante a hidrólise ácida do bagaço de malte em reator, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Variáveis a S:L (g:g) A (mg/g) T (min) Eficiência de hidrólise Xilana Arabinana Hemicelulose b 1 1: ,7 100,0 92,7 2 1: ,1 99,0 91,8 3 1: ,7 96,1 89,5 4 1: ,7 100,0 95,1 5 1: ,2 96,6 90,0 6 1: ,5 97,6 90,5 7 1: ,5 100,0 94,1 8 1: ,2 100,0 96,5 9 1: ,0 100,0 95,3 10 1: ,6 100,0 92,7 11 1: ,1 98,1 91,8 12 1: ,8 95,7 88,7 a S:L = relação sólido:líquido; A = concentração de ácido sulfúrico; T = tempo de reação. b Hemicelulose = xilana + arabinana.

80 78 Glicose também estava presente nos hidrolisados obtidos em reator, em concentrações bem menores do que as de xilose e arabinose (Tabela 4.4). Segundo Téllez-Luis, Ramírez e Vázquez (2002), a glicose liberada nos hidrolisados pode ser proveniente da hemicelulose ou da celulose. No entanto, normalmente a celulose não é hidrolisada nas condições operacionais empregadas para hidrólise com ácido diluído. Como no presente trabalho as concentrações de glicose e hidroximetilfurfural (produto da degradação da glicose) nos hidrolisados foram muito baixas (<1,9 e <0,1 g/l, respectivamente), é provável, portanto, que praticamente toda a glicose tenha sido liberada a partir da hemicelulose do bagaço de malte. Além de açúcares, os hidrolisados obtidos em reator também continham ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e lignina solúvel (Tabela 4.4), assim como observado nos hidrolisados obtidos em autoclave. O ácido acético é um composto que, quando presente nos hidrolisados em concentrações maiores que 3 g/l, atua como um potente inibidor do metabolismo microbiano se o hidrolisado for utilizado como meio de fermentação (FELIPE et al., 1995). Segundo Lawford e Rousseau (1998), este ácido atravessa a membrana celular e diminui o ph intracelular, afetando então o metabolismo do microrganismo. Como os hidrolisados de bagaço de malte continham ácido acético em concentrações variando de 0,76 a 1,39 g/l (Tabela 4.4), provavelmente este ácido não será capaz de afetar o metabolismo microbiano quando o hidrolisado for utilizado como meio de fermentação. Porém, não se deve desconsiderar seu efeito interativo com outros compostos tóxicos. Furfural e hidroximetilfurfural foram encontrados em pequenas quantidades (<1,02 g/l) nos hidrolisados, demonstrando que novamente houve pouca degradação dos açúcares durante o processo de hidrólise ácida, independente das condições operacionais utilizadas. Apesar de pequenas, as concentrações de furfural nos hidrolisados foram superiores às concentrações de hidroximetilfurfural (Tabela 4.4), sugerindo que os açúcares do tipo pentoses foram mais suscetíveis à degradação do que os açúcares do tipo hexoses. De acordo com Pessoa Jr, Mancilha e Sato (1997), a degradação dos açúcares durante o processo de hidrólise ácida ocorre quando se utiliza uma elevada concentração de ácido, ou quando a homogeneização do reator é feita de forma inadequada, criando regiões com alta acidez. Téllez-Luis, Ramírez e Vázquez (2002) observaram um aumento na concentração de furfural quando aumentaram a concentração de ácido e o tempo de reação utilizados na hidrólise ácida da palha de sorgo. Lavarack, Griffin e Rodman (2002) também verificaram que o aumento da concentração de ácido durante a hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar favoreceu a degradação de xilose a furfural. No presente trabalho, as baixas concentrações de furfural e hidroximetilfurfural

81 79 obtidas nos hidrolisados provavelmente foram resultados da baixa concentração de ácido (<1,5%) e temperatura de reação (<120ºC) utilizadas. Além de ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural, todos os hidrolisados obtidos também continham lignina solúvel, em concentrações que variaram de 2,2 a 4,22 g/l (Tabela 4.4). Quando comparado com os outros subprodutos presentes nos hidrolisados de bagaço de malte, estes foram os compostos produzidos em maior concentração. Segundo Parajó, Dominguez e Dominguez (1998b) os compostos provenientes da degradação da lignina são mais tóxicos aos microrganismos do que o ácido acético, hidroximetilfurfural e furfural, mesmo quando presentes em baixas concentrações. Ao contrário dos outros subprodutos, a concentração de lignina solúvel nos hidrolisados foi fortemente influenciada pelas condições de hidrólise empregadas. A análise estatística para esta resposta (Tabela 4.6) revelou que todas as variáveis estudadas (relação sólido:líquido, concentração de ácido e tempo de reação) apresentaram efeito significativo a 95% de confiança e com sinal negativo, o que significa que a concentração de lignina solúvel no hidrolisado foi aumentada quando a relação sólido:líquido, a concentração de ácido e o tempo de reação empregados na hidrólise foram diminuídos. De acordo com Fengel e Wegener (1989), uma pequena fração da molécula de lignina sempre é solubilizada durante o tratamento dos materiais lignocelulósicos com ácidos minerais. No entanto, quando a concentração de ácido é aumentada, a lignina se torna menos solúvel (conforme mencionado no item 4.1.3), pois as reações de condensação passam a ocorrer em maior proporção, modificando suas propriedades e também a estrutura, que se torna mais rígida e difícil de solubilizar. O efeito do tempo de reação na solubilização da lignina também está relacionado com a condensação desta molécula. Segundo Allen, Cousin e Pierce (1980) duas reações consecutivas ocorrem quando a lignina é hidrolisada com ácidos diluídos: 1. despolimerização da lignina pelo ácido; 2. condensação/repolimerização da lignina parcialmente hidrolisada. Inicialmente, a reação de hidrólise é predominante, proporcionando um aumento na quantidade de lignina solúvel. Entretanto, com o passar do tempo as reações de condensação tornam-se predominantes, causando um aumento na quantidade de lignina insolúvel residual. Recentemente, estudando a autohidrólise do bagaço de malte, Carvalheiro et al. (2004b) observaram que a recuperação de lignina no resíduo sólido foi maior quando o tempo de reação foi aumentado.

82 80 Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para a concentração de lignina solubilizada durante a hidrólise ácida do bagaço de malte. Variáveis independentes e interações EE E t Média 2,819 ±0,083 33,92* Curvatura 0,957 ±0,288 3,33* X 1-0,712 ±0,166 4,29* X 2-0,542 ±0,166 3,26* X 3-0,517 ±0,166 3,11* X 1 X 2 0,547 ±0,166 3,29* X 1 X 3 0,052 ±0,166 0,32 X 2 X 3 0,182 ±0,166 1,10 * valores significativos ao nível de 95% de confiança. X 1 = relação sólido:líquido; X 2 = concentração de ácido sulfúrico; X 3 = tempo de reação Fermentabilidade dos hidrolisados de bagaço de malte para produção de xilitol A eficiência de hidrólise e a concentração de compostos tóxicos no hidrolisado não são as duas únicas respostas que devem ser avaliadas em estudos para otimização das condições de hidrólise. Em termos de aplicação prática, a fermentabilidade do hidrolisado obtido é também muito importante e deve ser considerada. No presente trabalho, todos os hidrolisados de bagaço de malte produzidos foram empregados como meio de fermentação para a produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii. De uma forma geral, é esperado que os hidrolisados apresentem uma boa fermentabilidade devido à presença de baixos níveis de compostos tóxicos e também porque o bagaço de malte é um material que apresenta um elevado teor de proteínas (15,25% p/p) que podem ser solubilizadas durante o procedimento de hidrólise atuando como fonte de nitrogênio para os microrganismos. Confirmando esta idéia, os resultados apresentados na Tabela 4.7 revelam que a levedura foi capaz de crescer e produzir xilitol em todos os hidrolisados de bagaço de malte, mas os resultados de fermentação variaram para cada um deles, mostrando que cada condição de hidrólise produziu um hidrolisado com diferentes características. O consumo de glicose pela levedura foi total em todos os meios utilizados, enquanto que o consumo de xilose variou de 67 a 96,9%, dependendo do hidrolisado empregado (Tabela 4.7). Por outro lado, não houve consumo de arabinose pelo microrganismo durante o tempo de fermentação considerado (24 h).

83 81 Tabela Consumo de xilose, crescimento celular e produção de xilitol nos hidrolisados de bagaço de malte produzidos em reator, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Níveis das variáveis utilizadas na hidrólise a Resultados dos processos fermentativos b S:L A T S o S cons X P Y P/S Q P Y X/S (g:g) (mg/g) (min) (g/l) (%) (g/l) (g/l) (g/g) (g/l.h) 1 1: ,88 78,7 3,86 10,76 0,70 0,45 0,23 2 1: ,28 89,3 3,97 6,30 0,46 0,26 0,28 3 1: ,44 75,2 3,65 9,28 0,53 0,39 0,19 4 1: ,11 86,1 3,61 6,98 0,50 0,29 0,24 5 1: ,96 82,5 4,15 9,07 0,50 0,38 0,21 6 1: ,36 94,5 4,51 5,32 0,38 0,22 0,31 7 1: ,62 67,0 3,18 9,08 0,55 0,38 0,17 8 1: ,48 87,2 3,98 6,43 0,43 0,27 0,24 9 1: ,16 79,1 3,27 7,87 0,55 0,33 0, : ,69 88,1 4,46 8,05 0,51 0,33 0, : ,60 88,1 4,28 7,76 0,48 0,32 0, : ,94 96,9 4,57 7,45 0,41 0,31 0,24 a S:L = relação sólido:líquido; A = concentração de ácido sulfúrico; T = tempo de reação. b S o = concentração inicial de xilose; S cons = porcentagem de xilose consumida; X = concentração celular; P = concentração de xilitol; Y P/S (g/g) = fator de rendimento em xilitol (gramas de xilitol produzido/ gramas de xilose consumida); Q p (g/l.h) = produtividade volumétrica em xilitol (concentração de xilitol formado/ tempo de fermentação); Y X/S (g/g) = fator de rendimento em células (gramas de células formadas/ gramas de substrato (xilose + glicose) consumido). (g/g) O crescimento celular variou de 3,18 a 4,57 g/l, enquanto que a produção de xilitol variou significativamente, de 5,32 a 10,76 g/l, dependendo do hidrolisado utilizado (Tabela 4.7). Como a produção de xilitol tende a aumentar com o aumento da concentração inicial de xilose (MUSSATTO; ROBERTO, 2003; PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1995) estes resultados devem ser comparados em termos dos parâmetros fermentativos Y P/S, Q P e Y X/S. De uma forma geral, quando comparado com a fermentação de hidrolisados produzidos a partir de outras matérias-primas lignocelulósicas, todos os hidrolisados obtidos a partir do bagaço de malte apresentaram boa fermentabilidade. Parajó, Dominguez e Dominguez (1995) obtiveram um Y P/S de 0,38 g/g e Q P de 0,055 g/l.h durante a fermentação do hidrolisado de madeira contendo 17 g/l de xilose, suplementado com nutrientes. Cruz et al. (2000) conseguiram atingir um Y P/S de 0,66 g/g e Q P de 0,41 g/l.h durante a fermentação do hidrolisado de farelo de cevada suplementado ou não com nutrientes. No presente trabalho, valores de Y P/S e Q P de até 0,70 g/g e 0,45 g/l.h, respectivamente, foram obtidos a partir do hidrolisado de bagaço de malte contendo 21,9 g/l de xilose, não suplementado com nutrientes.

84 82 Devido às diferenças observadas nos resultados de fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte, uma análise estatística foi realizada para avaliar os efeitos das variáveis operacionais empregadas no processo de hidrólise, nos valores de Y P/S e Q P obtidos. De acordo com esta análise, a relação sólido:líquido foi a variável de maior influência em ambas as respostas, Y P/S e Q P, apresentando um efeito negativo (Tabela 4.8). O tempo de reação também apresentou significância estatística ao nível de 90% de confiança para Q P, com um efeito negativo. Estes resultados indicam que a produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii foi favorecida em hidrolisados produzidos com a menor relação sólido:líquido (1:8 g:g) e menor tempo de reação (17 minutos). A concentração de ácido não apresentou efeito principal significativo para estas respostas, mas sua interação com o tempo de reação (BC = +2,59) e com a relação sólido:líquido (AB = +4,54) foi significativa ao nível de 90% de confiança para Q P. O sinal positivo destas interações sugere que os valores de Q P foram maiores em hidrolisados produzidos com a menor concentração de ácido (100 mg/g de matéria seca). A curvatura não foi significativa para ambas as respostas, Y P/S e Q P (Tabela 4.8), revelando que os valores destes parâmetros aumentaram linearmente quando os valores das variáveis operacionais utilizadas nas hidrólises foram diminuídos. É interessante notar que o hidrolisado produzido nas condições que favoreceram Y P/S e Q P (condições do ensaio 1) foi o que apresentou a mais alta concentração de lignina solúvel (Tabela 4.4). Em um trabalho realizado por Mussatto e Roberto (2004b) sobre a produção de xilitol a partir de hidrolisado de palha de arroz, os mais altos valores dos parâmetros fermentativos também não foram obtidos a partir do hidrolisado que continha a menor concentração de lignina solúvel. Isto sugere que os hidrolisados que são mais tóxicos aos microrganismos não são aqueles que apresentam as maiores concentrações de lignina solúvel. Provavelmente a lignina contém compostos que não interferem no metabolismo microbiano, ou ainda que possam favorecer o processo fermentativo, apresentando algum efeito estimulante. Tais compostos poderiam ter sido solubilizados em maior quantidade no hidrolisado produzido nas condições do ensaio 1. Como a lignina é formada por uma série de componentes aromáticos e fenólicos, tais como hidroquinona, álcool vanílico, ácidos ferúlico, p-cumárico, siríngico, vanílico, entre outros (ZALDIVAR; MARTINEZ; INGRAM, 2000), um estudo sobre o efeito de cada um destes na bioconversão de xilose a xilitol poderia ser útil para explicar os resultados aqui observados.

85 83 Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para o fator de rendimento (Y P/S ) e produtividade volumétrica em xilitol (Q P ) obtidos durante a fermentação do hidrolisado de bagaço de malte. Variáveis Y P/S (g/g) Q P (g/l.h) independentes e interações EE E t EE E t Média 0,506 ±0,022 22,65* 0,330 ±0,004 85,65* Curvatura -0,037 ±0,077 0,48-0,015 ±0,013 1,12 X 1-0,127 ±0,045 2,85* -0,140 ±0,008 18,17* X 2-0,007 ±0,045 0,17 0,005 ±0,008 0,65 X 3-0,082 ±0,045 1,84-0,035 ±0,008 4,54* X 1 X 2 0,052 ±0,045 1,17 0,035 ±0,008 4,54* X 1 X 3 0,007 ±0,045 0,17 0,005 ±0,008 0,65 X 2 X 3 0,057 ±0,045 1,29 0,020 ±0,008 2,59* * valores significativos ao nível de 90% de confiança. X 1 = relação sólido:líquido; X 2 = concentração de ácido sulfúrico; X 3 = tempo de reação. O fator de rendimento em células, Y X/S, também foi avaliado durante a fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte e apresentou diferenças significativas em função do meio utilizado (Tabela 4.7). A análise estatística para esta resposta revelou que os valores de Y X/S foram afetados principalmente pela relação sólido:líquido e pela concentração de ácido, variáveis que apresentaram efeitos positivo e negativo, respectivamente (Tabela 4.9). Isto significa que os valores de Y X/S foram favorecidos em hidrolisados produzidos com a mais alta relação sólido:líquido e a mais baixa concentração de ácido. Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student para o fator de rendimento em células (Y X/S ) obtido durante a fermentação do hidrolisado de bagaço de malte. Variáveis Y X/S (g/g) independentes e interações EE E t Média 0,234 ±0,006 35,50* Curvatura 0,007 ±0,023 0,33 X 1 0,067 ±0,013 5,12* X 2-0,047 ±0,013 3,61* X 3-0,002 ±0,013 0,19 X 1 X 2-0,007 ±0,013 0,57 X 1 X 3 0,017 ±0,013 1,33 X 2 X 3-0,007 ±0,013 0,57 * valores significativos ao nível de 90% de confiança. X 1 = relação sólido:líquido; X 2 = concentração de ácido sulfúrico; X 3 = tempo de reação.

86 84 De uma forma geral, a análise estatística dos parâmetros fermentativos revelou que os hidrolisados de bagaço de malte produzidos a partir de uma baixa relação sólido:líquido, favoreceram a formação de produto (os valores de Y P/S foram aumentados); enquanto que aqueles obtidos a partir de uma alta relação sólido:líquido favoreceram o crescimento celular (os valores de Y X/S foram aumentados). Em outras palavras, com o aumento na relação sólido:líquido foram produzidos hidrolisados que proporcionaram um desvio no metabolismo microbiano, da formação de produto para o crescimento celular. Com base nos resultados da análise estatística, a melhor condição para hidrólise do bagaço de malte com ácido sulfúrico diluído foi estabelecida como sendo baseada no uso de uma relação sólido:líquido de 1:8 g:g, 100 mg de ácido sulfúrico/g de matéria seca e um tempo de reação de 17 minutos. Vale a pena ressaltar que, além de proporcionar os melhores resultados, esta condição foi também a mais economicamente viável dentre todas as que foram avaliadas, uma vez que necessitou de uma menor quantidade de ácido e um tempo de reação mais curto, requerendo, portanto, um menor consumo de energia. 4.3 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO CINÉTICO DA LEVEDURA Candida guilliermondii DURANTE A PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE DILUÍDO E CONCENTRADO Normalmente os hidrolisados hemicelulósicos não são utilizados como meio de fermentação para produção de xilitol na forma em que são obtidos, pois o baixo teor de xilose presente ( g/l), não é considerado favorável para que o processo de bioconversão ocorra com elevada eficiência (FELIPE et al., 1993; PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1995). Por este motivo, primeiramente os hidrolisados são submetidos a um processo de concentração para aumentar o teor de xilose a valores acima de 50 g/l. Porém, durante esta etapa, a composição química do hidrolisado sofre algumas modificações que podem influenciar no desempenho do microrganismo durante a fermentação. Nesta fase do trabalho, foi então avaliado o comportamento cinético da levedura Candida guilliermondii durante a produção de xilitol a partir do hidrolisado de bagaço de malte diluído e concentrado.

87 Composição química dos hidrolisados utilizados como meio de fermentação O hidrolisado de bagaço de malte utilizado nesta etapa foi produzido nas condições de hidrólise previamente otimizadas. A composição química deste hidrolisado na forma original (diluído) e concentrado, está apresentada na Tabela Nota-se que durante a etapa de concentração do hidrolisado, o teor dos açúcares foi aumentado proporcionalmente ao fator de concentração utilizado (aproximadamente 4 vezes), mostrando que não houve degradação de açúcares durante a realização deste processo. As concentrações de ácido acético e compostos fenólicos também foram aumentadas, mas não proporcionalmente ao fator de concentração empregado, sugerindo que estes compostos podem ter sido parcialmente volatilizados ou degradados durante a etapa de concentração do hidrolisado. O mesmo pode ter ocorrido para o hidroximetilfurfural, cujo teor no hidrolisado não foi alterado após o processo de concentração. Por outro lado, o teor de furfural foi diminuído significativamente, o que é justificável uma vez que este composto é volátil a 70ºC sob vácuo (PERRY; GREEN, 1997). Tabela Composição química do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte nas formas diluída (original) e concentrada. Componentes Concentração no hidrolisado de bagaço de malte (g/l) Diluído Glicose 1,51 6,08 Xilose 22,97 88,62 Arabinose 10,24 40,70 Ácido acético 1,25 3,83 Furfural 0,66 0,01 Hidroximetilfurfural 0,10 0,10 Compostos fenólicos 4,01 10,38 Concentrado Avaliação do crescimento celular da levedura Candida guilliermondii durante a fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte O perfil do crescimento celular da levedura Candida guilliermondii nos hidrolisados de bagaço de malte diluído e concentrado, está apresentado na Figura 4.3. Visando comparar o desempenho da levedura em um meio ausente em compostos tóxicos, alguns ensaios foram também realizados em meio semidefinido contendo as mesmas concentrações de açúcares

88 86 presentes nos hidrolisados (diluído e concentrado). Observa-se que o crescimento da levedura foi similar em ambos os meios contendo 20 g/l de xilose, porém, em meios concentrados (85 g/l de xilose) o crescimento foi maior em meio semidefinido do que em hidrolisado. Estes resultados sugerem que, além de monossacarídeos, o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte apresenta em sua composição alguns compostos que podem estar atuando como fonte de nitrogênio para o microrganismo, favorecendo seu crescimento. No entanto, quando o hidrolisado foi concentrado, o aumento na concentração de alguns compostos, provavelmente os que são tóxicos para o microrganismo, afetou o crescimento celular. 6 5 Células (g/l) Tempo de fermentação (h) MSD diluído MSD concentrado hidrolisado diluído hidrolisado concentrado Figura Crescimento da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diluído) ou 85 g/l de xilose (concentrado). Embora o crescimento celular tenha sido menor em hidrolisado concentrado do que em meio semidefinido, o fator de conversão de substrato em células (Y X/S ) foi maior a partir do hidrolisado concentrado (Tabela 4.11). Este resultado revela que o crescimento celular foi menor em hidrolisado concentrado por que a capacidade da levedura em consumir xilose foi afetada neste meio, o que pode ser verificado através dos valores de velocidade específica de consumo de xilose (Q S ) apresentados na Tabela A Figura 4.4 mostra claramente que em meios concentrados, o consumo de xilose após 96 h de fermentação foi total em meio semidefinido, enquanto que em hidrolisado, 61% da xilose presente no início da fermentação ainda não havia sido consumida. Nos meios de fermentação diluídos, o consumo de xilose e o

89 87 crescimento celular ocorreram de forma similar, sugerindo que o metabolismo da levedura não foi afetado nestes meios. Tabela Parâmetros fermentativos obtidos durante o cultivo da levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido. Meio de fermentação a Parâmetros fermentativos b Y X/S Y P/X η (g/g) (g/g) (g/g) (g/l.h) (g/l.h) (%) Semidefinido diluído 0,14 2,59 0,54 0,37 0,68 58,9 Hidrolisado diluído 0,20 2,34 0,65 0,38 0,62 70,9 Semidefinido concentrado 0,05 10,21 0,76 0,66 1,08 82,9 Hidrolisado concentrado 0,10 2,28 0,37 0,13 0,38 40,3 a Meios diluídos: 20 g/l de xilose; Meios concentrados: 85 g/l de xilose. b Y X/S = fator de conversão de substrato (xilose + glicose) em células; Y P/X = fator de rendimento de xilitol por massa celular; Y P/S = fator de rendimento de xilitol por xilose consumida; Q P = produtividade volumétrica em xilitol; Q S = velocidade específica de consumo de xilose; η = eficiência de produção de xilitol (% do valor máximo teórico = 0,917 g/g). Y P/S Q P Q S Xilose (g/l) Tempo de fermentação (h) MSD diluído hidrolisado diluído MSD concentrado hidrolisado concentrado Figura Consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diluído) ou 85 g/l de xilose (concentrado).

90 Avaliação da produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii durante a fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte A produção de xilitol em meios diluídos e concentrados foi inicialmente avaliada em meios semidefinidos simulando a concentração de xilose presente nos hidrolisados de bagaço de malte. Nestes meios, o aumento da concentração inicial de xilose, de 20 para 85 g/l favoreceu o fator de rendimento e a produtividade volumétrica em xilitol em 40% e 78%, respectivamente (Tabela 4.11). De fato, baixas concentrações de substrato proporcionam menores rendimentos, pois parte da fonte de carbono é utilizada para crescimento celular, enquanto que em altas concentrações de xilose a produção de xilitol passa a ser favorecida. O efeito positivo do aumento da concentração de xilose na produção de xilitol não pôde ser observado em meios hidrolisado, provavelmente devido a alta concentração de compostos tóxicos presentes (Figura 4.5). Os valores de fator de rendimento de xilitol por massa celular (Y P/X ) mostram que a capacidade da levedura em converter xilose a xilitol foi fortemente afetada em hidrolisado concentrado, uma vez que o valor deste parâmetro foi 4,5 vezes menor em hidrolisado do que em meio semidefinido (Tabela 4.11). Logo se pode concluir que, assim como foi observado para o crescimento celular, o aumento da concentração de compostos tóxicos no hidrolisado também afetou a produção de xilitol e conseqüentemente interferiu nos valores dos parâmetros fermentativos Y P/S, Q P e η. Os valores destes parâmetros foram inclusive menores do que os obtidos em hidrolisado diluído (Tabela 4.11). Uma forte inibição no desempenho da levedura Candida guilliermondii também foi observada durante a produção de xilitol a partir de hidrolisado de palha de arroz concentrado (90 g/l de xilose), proporcionando baixos valores de fator de rendimento (0,49 g/g) e produtividade volumétrica (0,32 g/l.h) (MUSSATTO; SANTOS; ROBERTO, 2004). É importante ressaltar que no presente trabalho, os hidrolisados de bagaço de malte (diluído e concentrado) foram utilizados como meio de fermentação sem ser submetidos a nenhum tratamento prévio para reduzir a concentração dos compostos tóxicos presentes. Provavelmente os baixos valores de fator de rendimento e produtividade volumétrica obtidos a partir do hidrolisado concentrado podem ser melhorados se o hidrolisado for tratado antes de ser utilizado como meio de fermentação. Tratamentos de destoxificação de hidrolisados por ajuste de ph (ROBERTO et al., 1991a), uso de carvão ativado (DOMINGUEZ; GONG; TSAO, 1996; MUSSATTO; SANTOS; ROBERTO, 2004) ou resinas de troca iônica

91 89 (DOMINGUEZ et al., 1997; MANCILHA; KARIM, 2003) têm sido considerados eficientes para reduzir a concentração de compostos tóxicos, melhorando o desempenho da levedura e favorecendo a produção de xilitol, como conseqüência Xilitol (g/l) Tempo de fermentação (h) MSD diluído hidrolisado diluído MSD concentrado hidrolisado concentrado Figura Produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diluído) ou 85 g/l de xilose (concentrado) Efeito da arabinose na produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii A bioconversão de xilose a xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos pode ser afetada pela presença e concentração de outros açúcares no meio de fermentação. De acordo com Walther, Hensirisak e Agblevor (2001), elevadas concentrações de açúcares podem causar estresse osmótico, inibição da indução da enzima xilose redutase ou ainda um desvio da produção de xilitol para a produção de etanol. O hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte apresenta uma elevada concentração de arabinose, quando comparado aos hidrolisados obtidos a partir de outras matérias-primas lignocelulósicas. Para avaliar a influência deste açúcar na conversão de xilose a xilitol pela levedura Candida guilliermondii, foram realizados alguns ensaios em meios semidefinidos preparados com a mesma concentração de glicose e xilose presente no hidrolisado de bagaço de malte concentrado, porém, com e sem a adição de arabinose. Os resultados obtidos revelaram um consumo seqüencial dos açúcares xilose e arabinose durante a fermentação, sendo que a arabinose apenas foi consumida quando toda a xilose presente no meio já havia

92 90 sido esgotada. No meio que não continha arabinose, a levedura consumiu xilitol ao término da xilose. Este fato explica a diferença observada na concentração de xilitol obtida ao final das fermentações (Figura 4.6). Apesar de não ter sido consumida pela levedura durante a fermentação de xilose, a presença de arabinose no meio de fermentação não interferiu no crescimento celular, consumo de xilose e na produção de xilitol, conforme pode ser observado na Figura Xilose e Xilitol (g/l) Células (g/l) Tempo de fermentação (h) Figura Desempenho da levedura Candida guilliermondii em meio semidefinido preparado com (símbolos abertos) ou sem (símbolos fechados) arabinose. Crescimento celular (, ), consumo de xilose (, ) e produção de xilitol (, ). Ao final da fermentação o xilitol foi o composto presente em maior concentração no meio (cerca de 60 g/l), seguido pela arabinose, também presente em elevada concentração (40 g/l). Como a presença de arabinose na concentração existente no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte não interferiu na produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii, uma alternativa interessante que poderia ser avaliada seria a realização de um processo fermentativo em dois estágios a partir deste hidrolisado, visando a produção de xilitol a partir da xilose e arabitol a partir da arabinose. Desta forma poderiam ser obtidos dois compostos de elevado valor comercial. A produção de arabitol tem sido pouco estudada, mas as leveduras Candida entomaea e Pichia guilliermondii são consideradas boas produtoras deste composto (SAHA; BOTHAST, 1996).

93 INFLUÊNCIA DOS COMPOSTOS TÓXICOS PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE A XILITOL PELA LEVEDURA Candida guilliermondii Composição química dos hidrolisados de bagaço de malte Como o aumento na concentração inicial de xilose é importante para se obter uma elevada produção de xilitol e, considerando que em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte concentrado o desempenho da fermentação pela levedura Candida guilliermondii foi afetado, realizou-se então nesta etapa um estudo para avaliar o efeito dos compostos tóxicos presentes neste hidrolisado na bioconversão de xilose a xilitol. Vários meios de fermentação foram preparados a partir do hidrolisado de bagaço de malte diluído de forma que apresentassem diferentes concentrações de compostos tóxicos, sendo em seguida utilizados para a produção de xilitol. A composição destes meios está apresentada na Tabela Tabela Composição dos hidrolisados de bagaço de malte empregados como meio de fermentação para produção de xilitol. Composto Concentração no hidrolisado (g/l) HD a HDS b HC c HCT d HCDS e Glicose 1,51 6,00 6,08 6,02 5,93 Xilose 22,97 84,21 88,62 86,94 86,52 Arabinose 10,24 38,75 40,70 39,96 39,77 Furfural 0,66 0,61 0,01 0,00 0,00 Hidroximetilfurfural 0,10 0,08 0,10 0,01 nd Ácido acético 1,25 1,22 3,83 1,53 1,05 Fenólicos totais 4,01 3,93 10,38 5,38 3,34 a HD = hidrolisado diluído; b HDS = hidrolisado diluído suplementado com açúcares; c HC = hidrolisado concentrado; d HCT = hidrolisado concentrado tratado com carvão ativado; e HCDS = hidrolisado concentrado, diluído com água e suplementado com açúcares. nd = não detectado. Conforme mencionado anteriormente, durante a etapa de concentração do hidrolisado alguns compostos tiveram seus teores aumentados enquanto que outros, por apresentarem certa volatilidade nas condições operacionais utilizadas, foram parcialmente removidos ou degradados. O tratamento do hidrolisado concentrado com carvão ativado (HCT) reduziu a concentração dos compostos tóxicos presentes e praticamente não interferiu na concentração dos açúcares. Furfural e hidroximetilfurfural foram praticamente eliminados do hidrolisado

94 92 através deste tratamento, enquanto que a concentração de compostos fenólicos e ácido acético foi reduzida em 48% e 60%, respectivamente (Tabela 4.12). Uma concentração ainda mais baixa destes compostos foi obtida quando o hidrolisado concentrado foi diluído e posteriormente suplementado com açúcares (HCDS). Em HCDS, a concentração de compostos fenólicos e ácido acético foi 68% e 72% menor do que em hidrolisado concentrado, sendo similar à concentração encontrada nos hidrolisados diluídos (original, HD, e suplementado com açúcares, HDS). No entanto, a presença de furfural e hidroximetilfurfural nos hidrolisados diluídos constitui a principal diferença entre estes e o HCDS Fermentação dos hidrolisados de bagaço de malte contendo diferentes concentrações de compostos tóxicos A fermentação para produção de xilitol a partir do hidrolisado diluído (HD) proporcionou um valor de Y X/S (fator de rendimento de células por substrato consumido) mais elevado do que os obtidos nas fermentações dos outros hidrolisados (Tabela 4.13). De fato, Felipe et al. (1993) e Parajó, Dominguez e Dominguez (1995) reportaram que em meios de fermentação contendo concentrações de xilose inferiores a 50 g/l o comportamento cinético da levedura é desviado da produção de xilitol para o aumento da massa celular. No entanto, quando o hidrolisado concentrado (HC) foi utilizado como meio de fermentação, a produção de xilitol não foi favorecida, mas ao contrário, observa-se na Tabela 4.13 que os valores dos parâmetros fermentativos Y P/S e Q P foram os mais baixos dentre todos os meios avaliados. Porém, a capacidade produtiva da levedura (Y P/X ) em HC foi a mesma que em HD. Isto demonstra que o aumento da concentração de compostos tóxicos no meio interferiu principalmente no consumo de xilose pela levedura, uma vez que a xilose consumida foi convertida em xilitol com a mesma eficiência que em hidrolisado diluído. O consumo de glicose não foi afetado pelo aumento da concentração de compostos tóxicos no hidrolisado, uma vez que este açúcar foi totalmente consumido pela levedura logo no início de todas as fermentações. Por outro lado, a arabinose não foi consumida em nenhum dos meios avaliados, durante o tempo de fermentação considerado.

95 93 Tabela Parâmetros fermentativos e concentração final de células obtidas durante a produção de xilitol a partir dos hidrolisados de bagaço de malte. Hidrolisado a Parâmetros fermentativos b Y P/S Q P Y X/S Y P/X η X HD 0,65 0,38 0,20 2,34 70,88 4,91 HDS 0,79 0,86 0,06 10,00 86,15 6,23 HC 0,37 0,13 0,10 2,28 40,35 5,28 HCT 0,55 0,18 0,13 2,83 59,98 6,02 HCDS 0,67 0,78 0,07 7,60 73,06 7,37 a HD = hidrolisado diluído; HDS = hidrolisado diluído suplementado com açúcares; HC = hidrolisado concentrado; HCT = hidrolisado concentrado tratado com carvão ativado; HCDS = hidrolisado concentrado, diluído com água e suplementado com açúcares. b Y P/S = fator de rendimento de xilitol por xilose consumida (g/g); Q P = produtividade volumétrica em xilitol (g/l.h); Y X/S = fator de rendimento de células por substrato (xilose + glicose) consumido (g/g); Y P/X = fator de rendimento de xilitol por massa celular (g/g); η = eficiência de produção de xilitol (% do valor máximo teórico = 0,917 g/g); X = concentração total de células ao final da fermentação. Analisando os hidrolisados com elevada concentração de açúcares, observa-se na Figura 4.7 que a diferença na concentração de compostos tóxicos influenciou tanto no consumo de xilose como na produção de xilitol. Os hidrolisados HC e HCT apresentaram perfis muito similares em relação ao consumo de xilose (Figura 4.7A), sugerindo que apesar da elevada remoção de compostos tóxicos (cerca de 50%), o tratamento do hidrolisado com carvão ativado não favoreceu o consumo desta pentose. Entretanto, a produção de xilitol (Figura 4.7B) foi levemente melhorada a partir de hidrolisado tratado, refletindo também em um aumento no valor dos parâmetros fermentativos (Tabela 4.13). Estes resultados sugerem que a produção de xilitol a partir do hidrolisado de bagaço de malte é favorecida quando a concentração dos compostos tóxicos presentes é diminuída. Porém, é importante destacar que as condições empregadas neste trabalho para tratamento do hidrolisado com carvão ativado, foram otimizadas para o hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz (MUSSATTO; ROBERTO, 2004b). O hidrolisado hemicelulósico de bagaço de malte tratado nestas condições não proporcionou uma melhora significativa na produção de xilitol, como foi observada em hidrolisado de palha de arroz, o que permite concluir que as condições de tratamento do hidrolisado devem ser otimizadas para cada matéria-prima utilizada. O consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii foi mais rápido em HDS e HCDS, do que em HC ou HCT (Figura 4.7A). Além disso, HDS e HCDS também proporcionaram uma maior concentração de xilitol ao final do processo (Figura 4.7B). Dentre estes, a máxima produção de xilitol ocorreu em HDS (62,3 g/l em 72 h de fermentação),

96 94 correspondendo a um fator de rendimento de 0,79 g/g e uma produtividade volumétrica de 0,86 g/l.h. Apesar de ambos hidrolisados terem apresentado similares rendimentos de célula por substrato consumido (Y X/S ), os valores de rendimento de xilitol por massa celular (Y P/X ) confirmam que a capacidade produtiva da levedura foi maior em HDS do que em HCDS (Tabela 4.13). Analisando a composição destes dois hidrolisados (Tabela 4.12) nota-se que a principal diferença entre eles está no teor de furfural, composto que estava presente em HDS e ausente em HCDS. Tal fato sugere que a presença deste composto no hidrolisado (0,61 g/l), além de não ter inibido o processo fermentativo, favoreceu a produção de xilitol. Ojamo, Ylinen e Linko (1988) relataram um efeito benéfico de baixas concentrações de furfural (<0,6 g/l) na produção de xilitol. Além disso, vários autores têm reportado que o furfural somente é tóxico para os microrganismos quando em concentrações maiores que 1 g/l (MARTINEZ et al., 2000; PARAJÓ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1997; ROBERTO et al., 1991b) A B 8 Xilose (g/l) Xilitol (g/l) Tempo de fermentação (h) Tempo de fermentação (h) Figura Consumo de xilose (A) e produção de xilitol (B) pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado de bagaço de malte: HDS ( ), HC ( ), HCT ( ) e HCDS ( ). Uma outra possível explicação para a diferença observada durante a fermentação de HDS e HCDS (Tabela 4.13), seria em função da concentração individual de alguns compostos fenólicos. Os compostos fenólicos totais compreendem uma série de compostos provenientes da degradação parcial da lignina durante o processo de hidrólise ácida, os quais incluem vanilina, seringaldeído, ácidos ferúlico, p-cumárico, siríngico, entre outros. Individualmente,

97 95 estes compostos apresentam diferentes graus de toxicidade para os microrganismos. Por exemplo, Cortez (2005) observou que concentrações de vanilina de até 2 g/l favoreceram a produção de xilitol pela levedura Candida guilliermondii, enquanto que o seringaldeído na mesma concentração foi fortemente tóxico a este microrganismo. No presente trabalho foi constatado a presença de vanilina, seringaldeído, ácido ferúlico e ácido siríngico na composição dos hidrolisados de bagaço de malte (Tabela 4.14). Quando o hidrolisado foi concentrado, a concentração de seringaldeído foi aumentada em 3,4 vezes, enquanto que a concentração de vanilina, que não é considerada tóxica ao microrganismo, foi aumentada em 2,4 vezes. É possível então que durante o processo de concentração do hidrolisado, compostos fenólicos de maior toxicidade ao microrganismo (não identificados neste trabalho) tenham tido suas concentrações aumentadas em maior proporção do que os compostos fenólicos de menor toxicidade. Isto explicaria a maior toxicidade do HCDS quando comparado ao HDS, apesar de ambos apresentarem um teor similar de compostos fenólicos. Tabela Concentração de alguns compostos fenólicos identificados nos hidrolisados de bagaço de malte. Composto Concentração no hidrolisado (g/l) HD a HDS b HC c HCT d HCDS e Vanilina 0,0302 0,0291 0,0719 0,0359 0,0218 Seringaldeído 0,1776 0,1753 0,6127 0,3163 0,1932 Ácido ferúlico 0,0598 0,0595 0,2246 0,0898 0,0709 Ácido siríngico nd nd 0,0435 0,0165 0,0122 a HD = hidrolisado diluído; b HDS = hidrolisado diluído suplementado com açúcares; c HC = hidrolisado concentrado; d HCT = hidrolisado concentrado tratado com carvão ativado; e HCDS = hidrolisado concentrado, diluído com água e suplementado com açúcares. nd = não detectado. Comparando a fermentação do HCT com a do HDS observa-se que houve uma grande diferença nos resultados do processo fermentativo, as quais refletiram principalmente em um aumento de 4,8 vezes em Q P (de 0,18 para 0,86 g/l.h, respectivamente), e de 3,5 vezes em Y P/X (de 2,83 para 10,0 g/g, respectivamente). Analisando a composição destes hidrolisados (Tabela 4.12), a diferença observada em suas fermentabilidades pode ser atribuída a maior concentração de compostos fenólicos totais em HCT. De fato, dentre os compostos tóxicos identificados no hidrolisado de bagaço de malte, os compostos fenólicos parecem ser os mais tóxicos ao microrganismo devido a elevada concentração em que se encontram presentes. Por outro lado, como o ácido acético em concentrações maiores que 3 g/l é tóxico para a levedura

98 96 Candida guilliermondii (FELIPE et al., 1995), é provável que este ácido também tenha influenciado na elevada toxicidade observada para o hidrolisado concentrado. Porém, deve-se considerar também que, apesar de que o ácido acético estava presente nos meios HCT, HDS e HCDS em concentrações consideradas não tóxicas para o metabolismo do microrganismo, a presença de compostos fenólicos nestes meios pode potencializar a toxicidade do ácido acético como conseqüência de um efeito sinergístico entre estes compostos. 4.5 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ALCALINA DO BAGAÇO DE MALTE PRÉ-TRATADO PARA PRODUÇÃO DE POLPA CELULÓSICA Características do bagaço de malte utilizado nos experimentos Esta etapa do trabalho teve como objetivo otimizar as condições de hidrólise alcalina do bagaço de malte visando a obtenção de uma polpa rica em celulose. Nestes ensaios, foi utilizado como matéria-prima o material sólido resultante após a remoção da hemicelulose (celulignina) nas condições otimizadas de hidrólise ácida. Segundo vários autores, a remoção desta fração prévia a hidrólise alcalina é de grande interesse, por várias razões: 1. a hemicelulose é também atacada durante o processo de hidrólise alcalina, contribuindo, portanto, para um maior consumo do reagente químico (FENGEL; WEGENER, 1989; GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996; ZHAO et al., 2002); 2. a remoção da hemicelulose aumenta a porosidade do material, facilitando a difusão e impregnação do hidróxido de sódio na etapa posterior, melhorando desta forma a deslignificação (remoção da lignina) e a uniformidade da polpa obtida (ZHAO et al., 2002); 3. a hemicelulose é uma valiosa fonte de xilose, açúcar que pode ser utilizado para obtenção de produtos de valor agregado, tais como xilitol (MUSSATTO; ROBERTO, 2004b) ou etanol (FERRARI et al., 2004). Logo, com a dissolução desta fração no licor alcalino, potenciais aplicações para o material lignocelulósico seriam perdidas. Análises da composição química do bagaço de malte antes e após o processo de hidrólise ácida foram realizadas com o objetivo de monitorar o rendimento de biomassa recuperada, bem como as perdas de celulose, hemicelulose e lignina ocorridas (Tabela 4.15). De acordo com esta análise, o rendimento de biomassa recuperada após o pré-tratamento ácido do material foi da ordem de 48,55% (p/p). A hemicelulose foi a principal fração

99 97 removida, restando 3,83 g a partir de cada 28,4 g presente no material original. Por outro lado, a estrutura da celulose permaneceu praticamente inalterada, uma vez que foi observada uma redução de apenas 0,3 g (de 16,8 g para 16,5 g) nesta fração após o pré-tratamento. A porcentagem de lignina solubilizada neste estágio (14% p/p) foi maior do que a porcentagem de celulose solubilizada, porém muito menor do que o valor observado para a hemicelulose. Isto já era esperado, pois segundo McMillan (1994), a celulose e a lignina são mais resistentes ao ataque com ácidos diluídos do que a hemicelulose, embora uma pequena parte da lignina (aproximadamente 10% p/p) possa ser solubilizada em meio ácido. Uma elevada remoção, similar àquela obtida para a hemicelulose (cerca de 85% p/p), foi observada também para a fração restante do material (denominada por outros, correspondente a proteínas, extrativos e cinzas) restando apenas 4,32 g a partir de cada 27 g tratadas. Devido à elevada remoção destas duas frações a partir do bagaço de malte original, o resíduo sólido obtido tornou-se enriquecido em celulose e lignina, conforme pode ser observado em sua composição química, apresentada na Tabela Tabela Composição química do bagaço de malte nas formas original (BO) e pré-tratado com ácido sulfúrico diluído (BPT), massa recuperada e perda de cada fração após o prétratamento ácido. Fração Composição (g/100 g) BO BPT Massa recuperada a (g) Perdas (% p/p) Celulose 16,8 34,0 16,50 1,80 Hemicelulose 28,4 7,9 3,83 86,50 Lignina 27,8 49,2 23,90 14,00 Outros b 27,0 8,9 4,32 84,00 Total ,55 51,45 a Massa recuperada a partir de 100 g do bagaço original, calculada pela porcentagem de cada fração em 48,55 g do material pré-tratado (massa total recuperada após o pré-tratamento). b Outros compostos incluem cinzas, proteínas e extrativos Hidrólise alcalina do bagaço de malte pré-tratado O principal objetivo da polpação química é liberar as fibras de celulose do material através da deslignificação, sem degradar ou remover os principais polissacarídeos da parede celular. No entanto, o processo de hidrólise alcalina não é totalmente seletivo para a lignina, e os carboidratos, incluindo a celulose, também podem ser degradados (FENGEL; WEGENER,

100 ; GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996). No presente trabalho, o meio reacional foi imediatamente resfriado em banho de gelo ao término da reação, com o objetivo de impedir a hidrólise alcalina e a reação de peeling da celulose, as quais devem ser evitadas por dois motivos: 1. a hidrólise alcalina pode romper a cadeia polimérica da celulose, diminuindo drasticamente seu tamanho (BERGGREN et al., 2003; KNILL; KENNEDY, 2003); 2. a reação de peeling promove a remoção das unidades de açúcares redutores finais da cadeia polissacarídica, o que também é indesejável (BERGGREN et al., 2003; GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996; KNILL; KENNEDY, 2003). Mesmo tomando este cuidado, a celulose pode ser parcialmente degradada sob condições severas de reação. Logo, a realização de estudos que estabeleçam as melhores condições de polpação é necessária para minimizar a degradação da celulose, maximizando a solubilização da lignina durante a hidrólise alcalina. No presente trabalho, um planejamento experimental foi proposto para avaliar o efeito das variáveis utilizadas na hidrólise alcalina do bagaço de malte e estabelecer as melhores condições para realização deste processo. A composição química das polpas obtidas para cada condição de hidrólise avaliada está apresentada na Tabela Observa-se nesta tabela que o teor de celulose nas polpas variou fortemente dependendo da condição de hidrólise utilizada (de 43,6% p/p no ensaio 5, a 72,1% p/p no ensaio 8) e, embora a maior parte dos tratamentos tenha promovido perdas insignificantes desta fração (< 1,8% p/p), perdas de até 23,3% p/p no teor de celulose foram observadas durante o tratamento alcalino. A Tabela 4.16 mostra também que todas as polpas obtidas apresentavam um resíduo de hemicelulose, que variou de 5,6 a 10,7% p/p. Durante o tratamento alcalino do talo de milho, palha de centeio e palha de arroz, Xiao, Sun e Sun (2001) também obtiveram polpas com resíduos de hemicelulose correspondentes a 7,7, 9,9 e 5,0% p/p, respectivamente. Além de um resíduo de hemicelulose, todas as polpas produzidas a partir do bagaço de malte também continham um resíduo de lignina, que variou de 10,4% p/p (ensaio 8) a 28,5% p/p (ensaio 1) (Tabela 4.16). De fato, resíduos de hemicelulose e lignina podem ser encontrados em polpas obtidas por tratamento alcalino porque parte destas frações encontra-se fortemente ligada à celulose, sendo, portanto, muito resistentes ao processo de hidrólise. De acordo com McKinney (citado por GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996) algumas pentosanas são resistentes ao tratamento alcalino porque durante este processo ocorre uma reação de transglicosilação, onde parte da hemicelulose que é quimicamente ligada à lignina por ligações glicosídicas passa a formar ligações glicosídicas com a celulose. Por outro lado, a dificuldade em remover os últimos traços de lignina durante a reação com NaOH pode ser

101 99 explicada de duas formas: 1. uma pequena fração da lignina é fortemente ligada aos carboidratos por ligação química; 2. os últimos traços de lignina reagem entre si ou com os carboidratos, formando produtos que são difíceis de serem dissolvidos no licor alcalino (GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996). Tabela Composição química das polpas de bagaço de malte e perdas de celulose e lignina após o tratamento de hidrólise alcalina sob diferentes condições operacionais. Ensaio Variáveis Composição da polpa (% p/p) Perda durante a independentes a polpação (% p/p) X 1 X 2 X 3 Celulose Hemicelulose Lignina Outros b Celulose Lignina 1 1, ,2 10,7 28,5 9,6 0,0 60,5 2 2, ,1 10,0 26,3 9,6 0,0 65,0 3 1, ,9 7,1 23,8 11,2 10,9 74,7 4 2, ,3 6,1 21,5 17,1 12,5 76,5 5 1, ,6 7,1 22,5 26,8 23,3 72,6 6 2, ,0 8,6 23,5 11,9 1,7 71,5 7 1, ,3 5,6 21,1 12,0 15,0 79,8 8 2, ,1 7,8 10,4 9,7 1,8 90,2 9 1, ,4 6,1 20,1 17,4 0,0 74,8 10 1, ,9 7,0 21,7 16,4 0,0 72,3 11 1, ,4 7,2 22,8 14,6 0,0 71,3 a X 1 = concentração de NaOH (% p/p); X 2 = temperatura (ºC); X 3 = tempo de reação (min). b Outros incluem proteínas, cinzas e extrativos. Vale a pena observar que, mesmo nas condições mais brandas de reação utilizadas (NaOH 1% p/v, 80ºC, 30 min - ensaio 1) obteve-se uma significativa dissolução da lignina (60,5% p/p), a qual correspondeu a uma redução no teor de lignina do material de 49,2% p/p (no bagaço de malte pré-tratado) para 28,5% p/p (na polpa obtida após a deslignificação). Valor similar de dissolução da lignina (68,8% p/p) foi obtido durante o tratamento da palha de centeio com uma solução de NaOH 4% p/v, a 30º C por 18 h (XIAO; SUN; SUN, 2001). Porém, apesar de no presente trabalho terem sido utilizadas temperaturas mais elevadas de reação (80-120ºC), as condições aqui empregadas podem ser mais econômicas e menos agressivas ao meio ambiente, pois requerem um menor tempo de reação e uma solução de NaOH menos concentrada.

102 Análise estatística da hidrólise alcalina do bagaço de malte Para otimizar as condições de hidrólise alcalina, o primeiro passo é identificar as variáveis que exerceram maior influência nas respostas, o que pode ser feito através de uma análise dos efeitos estimados das variáveis. Esta análise revelou um efeito principal negativo e significativo da temperatura (p<0,05), tempo de reação (p<0,05) e concentração de NaOH (p<0,10), no conteúdo de lignina residual na polpa de bagaço de malte (Tabela 4.17). Os sinais negativos indicam que a polpa obtida nas condições mais brandas de reação apresenta uma maior quantidade de lignina residual. Em outras palavras, a quantidade de lignina residual na polpa é menor quanto maior a concentração da solução de NaOH, a temperatura e o tempo de reação empregado no processo. O aumento na concentração de NaOH até 2% p/v e o aumento na temperatura até 100ºC também foram as variáveis de maior influência na solubilização da lignina durante a polpação de Miscanthus sinensis (IGLESIAS et al., 1996). Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e resultados do teste t de Student, para os teores de celulose e lignina residual nas polpas obtidas a partir do bagaço de malte. Variáveis independentes Lignina residual (% p/p) Teor de celulose (% p/p) e interações EE E t EE SE t X 1-3,550 ±1,638 2,167 c 5,875 ±0,768 7,647 a X 2-6,000 ±1,638 3,662 b 10,425 ±0,768 13,569 a X 3-5,650 ±1,638 3,448 b 3,625 ±0,768 4,718 a X 1 X 2-2,950 ±1,638 1,800-1,775 ±0,768 2,310 c X 1 X 3-1,300 ±1,638 0,793 5,725 ±0,768 7,451 a X 2 X 3-1,250 ±1,638 0,763 6,475 ±0,768 8,427 a a p<0,01; b p<0,05; c p<0,10. X 1 = concentração de NaOH; X 2 = temperatura; X 3 = tempo de reação. Para a resposta de teor de celulose, a análise estatística revelou um efeito principal positivo altamente significativo (p<0,01) de todas as variáveis estudadas (Tabela 4.17), ou seja, quanto maior a concentração de NaOH, a temperatura e o tempo de reação, maior o teor de celulose na polpa obtida. Dentre as variáveis, a temperatura foi a que apresentou maior efeito nesta resposta, uma vez que seu aumento de 80 para 120º C resultou em um aumento médio no teor de celulose na polpa de 10,42% p/p. O aumento da concentração de NaOH (de 1 para 2% p/v) e do tempo de reação (de 30 para 90 min), causaram efeitos menos marcantes, com variações no conteúdo de celulose, de 5,87 e 3,62% p/p, respectivamente. As interações

103 101 entre tempo de reação e temperatura, tempo de reação e concentração de NaOH, e concentração de NaOH e temperatura também foram significativas para esta resposta, com p<0,01, p<0,01 e p<0,10, respectivamente. A significância estatística dos efeitos principais e interações entre as variáveis foi determinada por análise de variância e uma análise de regressão múltipla foi realizada para ajustar os dados experimentais a equações polinomiais (Tabela 4.18). As respostas foram descritas como funções de primeira ordem e os elevados valores de R 2 (>0,90) obtidos indicam que os modelos selecionados são adequados para o processo, mostrando uma forte concordância entre os resultados experimentais e os valores teóricos previstos pelos modelos. Tabela Equações do modelo para a hidrólise alcalina do bagaço de malte e seus respectivos R 2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de lignina residual e teor de celulose nas polpas obtidas. Resposta Equações do modelo a R 2 a Lignina residual ( ŷ1 em %) ŷ 1 = 22,018 1,775X 1 3,0X 2 2,825X 3 0,90 1,475X 1 X 2 0,650X 1 X 3 0,625X 2 X 3 Teor de celulose ( ŷ 2 em %) ŷ 2 = 56, ,937X 1 + 5,212X 2 + 1,812X 3 0,99 0,887X 1 X 2 + 2,862X 1 X 3 + 3,237X 2 X 3 X 1 = concentração de NaOH; X 2 = temperatura; X 3 = tempo de reação. As superfícies de resposta descritas pelas equações do modelo para a lignina residual e o teor de celulose (Figura 4.8) mostram claramente que o aumento no valor das variáveis operacionais favoreceu linearmente o aumento no teor de celulose e a diminuição no teor de lignina residual na polpa obtida. Os melhores valores foram atingidos quando o processo de hidrólise alcalina foi realizado a 120 C, durante 90 minutos, empregando uma solução de NaOH 2% p/v. Nestas condições obteve-se uma polpa com elevado teor de celulose (72,1% p/p) e baixo teor de lignina residual (10,4% p/p). Considerando que uma pequena fração da hemicelulose e da lignina é muito difícil de ser removida da estrutura lignocelulósica durante o processo de deslignificação, maiores esforços não foram dados visando reduzir ainda mais os conteúdos destas frações nas polpas de bagaço de malte. Isto porque o aumento no consumo de energia devido ao uso de uma temperatura e tempo de reação maior, provavelmente não justificaria o pequeno aumento no teor de celulose ou a pequena diminuição no teor de lignina residual na polpa.

104 LIGNINA RESIDUAL (%) CELULOSE (%) ,0 110 TEMPERATURA ( o C) TEMPO DE REAÇÃO (min) CONCENTRAÇÃO NaOH (%) 1,75 1,5 1,25 1, TEMPERATURA ( o C) 80 Figura Superfícies de resposta para os teores de lignina residual e de celulose (% p/p) nas polpas de bagaço de malte, em função das variáveis operacionais empregadas no processo de hidrólise alcalina Micrografias das polpas de bagaço de malte A influência dos processos de hidrólise ácida e alcalina (nas condições otimizadas) na estrutura da partícula do bagaço de malte pode ser observada na Figura 4.9. As Figuras 4.9A (partícula do bagaço de malte na forma original) e 4.9B (partícula de bagaço de malte prétratada com ácido diluído) mostram que o pré-tratamento ácido promoveu algumas rupturas na estrutura do material devido à remoção da hemicelulose. Durante a hidrólise alcalina, a lignina foi atacada e solubilizada no licor produzido. Como conseqüência, a estrutura do bagaço foi fortemente rompida e um resíduo rico em celulose foi gerado. A remoção da lignina permitiu a separação das fibras da celulose, como pode ser visualizado na Figura 4.9C. Em termos de cor, a polpa celulósica obtida apresentou uma coloração bege clara, a qual foi muito diferente da cor original do bagaço de malte (amarelo escuro). Na verdade, o bagaço de malte pré-tratado com ácido diluído apresentou uma cor marrom escura, causada pelo aumento no teor de lignina após a hidrólise ácida. Posteriormente, a elevada remoção desta fração (90,2% p/p) durante a hidrólise alcalina promoveu a descoloração do material (Figura 4.9).

105 103 A B C Figura Micrografia eletrônica de varredura (ampliação: 45 vezes) e aspecto visual das partículas do bagaço de malte nas formas: original (A), pré-tratado com ácido diluído (B) e após a hidrólise alcalina (C).

106 Balanço de massa da hidrólise alcalina Como já foi mencionado anteriormente, o rendimento em biomassa recuperada após o processo de hidrólise ácida foi de 48,55 g/100 g de bagaço de malte original. Um valor similar de rendimento em biomassa recuperada foi obtido para o processo de hidrólise alcalina, sendo recuperadas 46,3 g a partir de 100 g do material pré-tratado. Isto significa que para cada 100 g de bagaço de malte original, foram recuperadas 22,5 g de polpa contendo 72,1% p/p de celulose. Durante a hidrólise alcalina, apenas 1,8% da fração celulósica presente no material pré-tratado foi removida. Ao final deste processo, 16,2 g de celulose foram recuperadas a partir de 16,8 g de celulose presentes em 100 g do bagaço de malte original, o que correspondeu a uma recuperação de 96,4% do total desta fração existente inicialmente. A fração hemicelulósica ainda presente no material pré-tratado foi removida em 54,3% p/p durante a hidrólise alcalina, sendo recuperadas 1,75 g a partir das 28,4 g presentes em 100 g do material original. Isto significa que 6,16% da hemicelulose presente inicialmente no bagaço de malte foi resistente a ambos os processos de tratamento, ácido e alcalino. A remoção da fração correspondente a outros materiais (cinzas, proteínas e extrativos), foi similar à remoção obtida para a hemicelulose, correspondendo a 49,5% p/p. Isto significa que para 27 g desta fração presentes em 100 g do bagaço de malte original, 2,18 g permaneceram no material após as reações ácida e alcalina (8,07% do total existente inicialmente). A lignina foi a principal fração removida durante a hidrólise alcalina (90,2% p/p), sendo recuperadas somente 2,34 g a partir das 23,9 g presentes no material pré-tratado. A porcentagem de lignina que permaneceu na polpa após os dois processos de hidrólise, correspondeu a 8,42% do total desta fração presente no material original. 4.6 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ALCALINA DO BAGAÇO DE MALTE PRÉ-TRATADO PARA LIBERAÇÃO DE ÁCIDOS FENÓLICOS Além da produção de polpa celulósica, a deslignificação dos materiais lignocelulósicos gera um efluente líquido, denominado licor alcalino, o qual é rico em compostos fenólicos provenientes da degradação da lignina. Como estes compostos (principalmente os ácidos fenólicos) apresentam grande interesse comercial, e, considerando que os ácidos ferúlico e p- cumárico são os dois ácidos fenólicos presentes em maior quantidade no bagaço de malte

107 105 (BARTOLOMÉ; FAULDS; WILLIAMSON, 1997; BARTOLOMÉ et al., 2003), fez-se então nesta etapa um estudo sobre a influência das variáveis operacionais empregadas na hidrólise alcalina do bagaço de malte, na liberação destes compostos Liberação de ácidos fenólicos durante o pré-tratamento do bagaço de malte com ácido sulfúrico diluído Inicialmente, o hidrolisado hemicelulósico obtido por hidrólise ácida do bagaço de malte foi analisado quimicamente para verificar se houve liberação de ácidos fenólicos durante esta etapa de tratamento do material. Os resultados obtidos revelaram a presença de apenas um ácido fenólico: o ácido ferúlico, em concentração de 51,0 mg/l. A presença deste ácido já foi também observada em hidrolisados hemicelulósicos obtidos a partir da hidrólise ácida de outras matérias-primas lignocelulósicas, tais como palha de arroz (CORTEZ, 2005), bagaço de cana-de-açúcar (VAN ZYL; PRIOR; DU PREEZ, 1988) e alguns tipos de madeira (JÖNSSON et al., 1998; TRAN; CHAMBERS, 1985). A pequena liberação de ácido ferúlico durante esta etapa de hidrólise provavelmente ocorreu devido à localização deste ácido na parede celular do material. De acordo com alguns autores, o ácido ferúlico encontra-se ligado tanto com a arabinose nas hemiceluloses, quanto com a lignina, enquanto que os outros ácidos fenólicos encontram-se predominantemente ligados com a lignina (MAILLARD; BERSET, 1995; SUN et al., 2000). Isto explica porque apenas parte do ácido ferúlico foi solubilizada junto com a arabinoxilana durante o pré-tratamento ácido do bagaço de malte, enquanto que os outros ácidos fenólicos não foram solubilizados neste estágio Liberação de ácidos fenólicos durante a hidrólise alcalina do bagaço de malte Durante a hidrólise alcalina do bagaço de malte pré-tratado, 60 a 90% p/p da lignina presente no material foi solubilizada dependendo das condições de reação utilizadas. Os licores então produzidos continham vários ácidos fenólicos, dentre os quais, ferúlico e p- cumárico foram os mais abundantes (Tabela 4.19). De acordo com White e Xing (1997), os ácidos ferúlico, p-cumárico, siríngico, p-hidroxibenzóico, vanílico, caféico e protocatecuico são os ácidos fenólicos mais encontrados em cereais. Isto justifica a presença de grande parte deles nos licores alcalinos produzidos a partir do bagaço de malte, uma vez que este material é proveniente do grão de cevada. Além disso, as maiores concentrações dos ácidos ferúlico e p-

108 106 cumárico também podem ser explicadas, uma vez que estes são os ácidos fenólicos presentes em maior quantidade no grão de cevada, estando concentrados principalmente na casca do grão (MAILLARD; BERSET, 1995; WHITE; XING, 1997) e o bagaço de malte é composto basicamente por esta fração do grão de cevada original. O ácido ferúlico é também o ácido fenólico encontrado em maior quantidade em outros grãos de cereais, tais como centeio (ANDREASEN et al., 2000), trigo (LEMPEREUR; ROUAU; ABECASSIS, 1997), arroz e milho (ADOM; LIU, 2002). Tabela Porcentagem de lignina solubilizada e concentração de ácidos fenólicos no licor obtido a partir da hidrólise alcalina do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Variáveis a LS b Concentração de ácidos fenólicos no licor (mg/l) X 1 X 2 X 3 (% p/p) Ferúlico p-cumárico Siríngico Vanílico p-hb c 1 1, ,6 74,20 67,10 4,90 3,10 1,30 2 2, ,0 85,00 100,70 4,70 2,70 1,50 3 1, ,7 85,70 95,80 5,20 3,00 4,50 4 2, ,5 111,90 114,70 5,40 2,90 7,80 5 1, ,6 91,50 91,60 5,00 2,90 1,60 6 2, ,5 100,30 105,90 5,40 2,40 1,40 7 1, ,8 112,40 106,70 7,10 2,60 13,70 8 2, ,2 145,30 138,80 8,10 3,10 26,90 9 1, ,8 99,50 114,40 5,80 3,60 5, , ,3 92,90 104,10 5,50 3,40 3, , ,3 96,80 100,80 5,70 3,40 3,10 a X 1, concentração de NaOH (% p/p); X 2, temperatura (ºC); X 3, tempo de reação (min). b lignina solubilizada; c Ácido p-hidroxibenzóico Análise estatística para a remoção de ácido ferúlico e p-cumárico durante a hidrólise alcalina do bagaço de malte A Tabela 4.19 mostra que houve uma grande variação nas concentrações dos ácidos ferúlico (74,20 a 145,3 mg/l) e p-cumárico (67,10 a 138,8 mg/l) nos licores obtidos, em função das condições de reação utilizadas. Por esta razão, uma análise estatística foi realizada para avaliar a influência das variáveis operacionais empregadas na hidrólise alcalina do bagaço de malte, na liberação destes ácidos. Os gráficos de Pareto apresentados na Figura 4.10 representam os efeitos estimados de cada variável estudada, bem como da interação entre elas, nas concentrações dos ácidos ferúlico e p-cumárico obtidas no licor alcalino. Observa-se

109 107 através destes gráficos que todas as variáveis estudadas influenciaram na liberação destes dois ácidos a partir do bagaço de malte, sendo que todas apresentaram efeito positivo. Tal efeito significa que quanto maior a concentração de NaOH, a temperatura e o tempo de reação empregados na hidrólise alcalina, maior foi a liberação de ácido ferúlico e p-cumárico a partir do material. Quando todas as variáveis foram utilizadas em seu nível superior (concentração de NaOH de 2,0% p/v), temperatura de 120 C e tempo de reação de 90 min ensaio 8), 90,2% p/p da lignina presente no bagaço de malte foi solubilizada. A p=0,05 Ácido ferúlico Temperatura (X 2 ) 8,60 Tempo (X 3 ) 7,65 NaOH (X 1 ) 6,49 X 1 X 2 3,26 X 2 X 3 2,27 X 1 X 3 0, Efeito estimado (Valor absoluto) B Ácido p-cumárico p=0,05 NaOH (X 1 ) 4,31 Temperatura (X 2 ) 3,95 Tempo (X 3 ) 2,82 X 1 X 3 X 2 X 3 X 1 X 2-0,26 0,23 0, Efeito estimado (Valor absoluto) Figura Gráficos de Pareto para o efeito das variáveis: concentração de NaOH, temperatura e tempo de reação, nas respostas: concentração de ácido ferúlico (A) e concentração de ácido p-cumárico (B) nos licores obtidos por hidrólise alcalina do bagaço de malte. Efeitos acima da linha de p=0,05 são significativos ao nível de 95% de confiança.

110 108 A temperatura foi a variável de maior influência (+8,60) na liberação de ácido ferúlico, seguida pelo tempo de reação (+7,65) e pela concentração de NaOH (+6,49) (Figura 4.10A). A interação entre concentração de NaOH e temperatura (X 1 X 2 ) também foi estatisticamente significativa para esta resposta, com um efeito de sinal positivo (+3,26), indicando que a liberação deste ácido é ainda mais favorecida quando elevadas concentrações de NaOH e temperatura são empregadas simultaneamente. Para a liberação de ácido p-cumárico, apenas os efeitos principais das variáveis foram estatisticamente significativos sendo que dentre estes, o maior efeito foi o da concentração de NaOH (+4,31), seguido pela temperatura (+3,95) e pelo tempo de reação (+2,82) (Figura 4.10B). Uma vez que 90,2% p/p da lignina presente no material foi solubilizada quando a hidrólise alcalina foi realizada nos níveis mais altos das variáveis, maiores esforços não foram feitos para solubilizar o restante da lignina que permaneceu no bagaço de malte. Isto porque o gasto energético envolvido no uso de uma temperatura ainda mais elevada ou de um tempo de reação mais prolongado, provavelmente não justificaria o pequeno aumento na concentração dos ácidos fenólicos no licor alcalino. Por este motivo, optou-se por estabelecer as melhores condições operacionais de hidrólise alcalina dentro da faixa de valores avaliada. Uma análise de regressão múltipla foi então realizada para obter modelos matemáticos que descrevam a relação entre as variáveis operacionais e as respostas estudadas. De acordo com esta análise, modelos lineares podem ser bem ajustados para explicar a variação de ambas as respostas (concentração de ácido ferúlico e de ácido p-cumárico) como função das variáveis operacionais empregadas na hidrólise alcalina do bagaço de malte, uma vez que a curvatura não foi significativa para nenhuma das respostas. Os modelos matemáticos que descrevem a concentração de ácido ferúlico e ácido p-cumárico no licor alcalino foram representados pelas equações dadas na Tabela Tabela Equações do modelo para a hidrólise alcalina do bagaço de malte e seus respectivos R 2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de concentração de ácido ferúlico e concentração de ácido p-cumárico no licor alcalino obtido. a Resposta Equações do modelo a R 2 Ácido ferúlico ( ŷ1 em mg/l) ŷ 1 = 99,59 + 9,84X ,04X ,59X 3 + 0,99 4,94X 1 X 2 + 3,44X 2 X 3 Ácido p-cumárico ( ŷ 2 em mg/l) ŷ 2 = 103, ,36X ,342X 2 + 8,09X 3 0,92 X 1 = concentração de NaOH; X 2 = temperatura; X 3 = tempo de reação.

111 109 A interação entre as variáveis temperatura e tempo de reação (X 2 X 3 ) foi mantida na equação do modelo para a resposta de ácido ferúlico, para minimizar o erro de determinação. De uma forma geral, os elevados valores de R 2 ( 0,92) obtidos indicam que os modelos selecionados são adequados para o processo, mostrando uma forte concordância entre os resultados experimentais e os valores teóricos previstos pelas equações. A Figura 4.11 mostra os valores de concentração de ácido ferúlico e ácido p-cumárico previstos pelos modelos e os valores reais obtidos nos ensaios. Observa-se nestas figuras uma distribuição dos pontos ao redor da linha, para ambas as respostas, o que confirma que os modelos lineares foram bem ajustados. 160 A Ácido ferúlico 150 Valores previstos (mg/l) Valores observados (mg/l) 150 B Ácido p-cumárico 140 Valores previstos (mg/l) Valores observados (mg/l) Figura Valores previstos pelo modelo linear em função dos valores observados para as respostas de concentração de ácido ferúlico (A) e concentração de ácido p-cumárico (B) nos licores obtidos por hidrólise alcalina do bagaço de malte.

112 110 Para finalizar, realizou-se um balanço de massa para quantificar a extração de ácido ferúlico obtida a partir do bagaço de malte. Considerando que este ácido está presente no material em uma concentração de 0,32% p/p (BARTOLOMÉ; FAULDS; WILLIAMSON, 1997), a quantidade liberada durante o pré-tratamento com ácido sulfúrico foi estimada em 11%. Logo, a porcentagem de ácido ferúlico no material submetido à hidrólise alcalina era de aproximadamente 0,285% p/p, quantidade que foi totalmente solubilizada no licor durante a realização da hidrólise nas condições operacionais otimizadas. A extração enzimática de ácido ferúlico a partir do bagaço de malte tem sido estudada por alguns autores, porém, os resultados obtidos são menores do que os encontrados no presente trabalho. Por exemplo, o emprego de uma esterase de Aspergillus niger proporcionou a liberação de apenas 3,3% do ácido ferúlico presente neste material. Quando esta enzima foi utilizada juntamente com uma xilanase de Trichoderma viride, a liberação deste ácido foi aumentada para 30% (BARTOLOMÉ; FAULDS; WILLIAMSON, 1997). Um resultado um pouco maior (43% de liberação) foi obtido através do cultivo de Streptomyces avermitilis CECT3339 em bagaço de malte (BARTOLOMÉ et al., 2003). Além de proporcionar menores rendimentos de extração, o uso de enzimas requer um tempo de reação mais prolongado (até 48 h, aproximadamente). No presente trabalho, o uso de uma solução diluída de NaOH (2% p/v) em um curto tempo de reação (90 min) foi suficiente para extrair todo o ácido ferúlico presente no bagaço de malte. 4.7 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE MALTE PARA MÁXIMA CONVERSÃO DA CELULOSE EM GLICOSE Composição química do substrato A polpa de celulose obtida nas condições otimizadas de hidrólise alcalina foi utilizada nesta etapa do trabalho como substrato para obtenção de glicose. No entanto, como a reação de hidrólise alcalina foi conduzida em um banho termostatizado diferente daquele onde foram realizados os experimentos do planejamento experimental, a polpa de celulose aqui obtida apresentou uma composição química diferente daquela obtida anteriormente. A composição desta polpa foi de (% p/p): 90,5% celulose, 1,1% hemicelulose e 8,2% de lignina; enquanto que a composição da polpa obtida anteriormente na melhor condição de hidrólise foi de

113 111 (% p/p): 72,1% celulose, 7,8% hemicelulose e 10,4% lignina. Provavelmente, a maior solubilização da hemicelulose e da lignina ocorreu devido ao melhor controle de temperatura e agitação do banho utilizado, que pode ter proporcionado uma transferência de calor mais adequada para o meio reacional. Como conseqüência, houve um aumento no teor de celulose do material, o que é bastante interessante, pois permite obter uma maior quantidade de glicose após a reação enzimática Análise estatística da hidrólise enzimática do bagaço de malte A hidrólise enzimática da polpa de celulose foi realizada empregando diferentes condições de agitação, relação enzima/substrato e concentração de substrato, de acordo com um planejamento fatorial completo 2 3, visando maximizar o rendimento em glicose liberada. Os resultados obtidos, analisados em termos de rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) de hidrólise, estão apresentados na Tabela Tabela Rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrólise enzimática do bagaço de malte, sob diferentes condições operacionais. Ensaio Variáveis Agitação (rpm) Enz/Subst (FPU/g) a Substrato (% p/v) Respostas Rendimento em glicose (%) ,6 65, ,7 51, ,1 99, ,5 89, ,9 40, ,9 36, ,8 83, ,2 80, ,3 79, ,0 80, ,7 81, ,2 81,0 a Relação enzima/substrato. Rendimento total (%) Nota-se na Tabela 4.21 que ambas as respostas variaram de acordo com as condições de processo utilizadas. Uma análise de estimativa dos efeitos foi então realizada para identificar as variáveis de maior influência no processo de hidrólise. De acordo com esta análise (Tabela

114 ), apenas a variável relação enzima/substrato apresentou efeito significativo (p<0,01) para ambas as respostas. Tal efeito, de sinal positivo, indica que o aumento no valor desta variável favoreceu o rendimento em glicose e o rendimento total de hidrólise da celulose em glicose + celobiose. As outras duas variáveis estudadas (agitação e concentração de substrato) não apresentaram efeito significativo, mesmo a um nível de 90% de confiança, para o rendimento em glicose; mas para o rendimento total de hidrólise, a variável concentração de substrato apresentou um efeito significativo a 90% de confiança e de sinal negativo, indicando que quanto menor a concentração de substrato utilizada, maior foi o rendimento total de hidrólise obtido. Tabela Estimativa dos efeitos (EE), erros-padrão (E) e teste t de Student, para o rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrólise enzimática do bagaço malte. Variáveis independentes e Rendimento em glicose (%) Rendimento total de hidrólise (%) interações EE E t EE SE t X 1-9,525 ± 8,641-1,102-7,905 ± 6,335-1,248 X 2 53,110 ± 8,641 6,146*** 39,400 ± 6,335 6,220*** X 3-13,765 ± 8,641-1,593-16,050 ± 6,335-2,534* X 1 X 2 3,900 ± 8,641 0,451 1,145 ± 6,335 0,181 X 1 X 3 4,225 ± 8,641 0,489 4,405 ± 6,335 0,695 X 2 X 3-2,530 ± 8,641-0,293 3,900 ± 6,335 0,616 *** Valor significativo a 99% de confiança; *Valor significativo a 90% de confiança. X 1 = agitação; X 2 = relação enzima/substrato; X 3 = concentração de substrato. A significância estatística dos efeitos principais e interações entre as variáveis foi determinada por análise de variância. Para a resposta de rendimento em glicose, a análise de variância realizada para um modelo linear revelou que apenas a relação enzima/substrato foi significativa a um nível de 99% de confiança, com um coeficiente de determinação (R 2 ) de 0,89. No entanto, quando se fez a estimativa da curvatura (Tabela 4.23), todas as variáveis estudadas, bem como todas as interações entre elas passaram a ser significativas a pelo menos 95% de confiança e o coeficiente de determinação (R 2 ) aumentou para 0,99, sugerindo que um modelo matemático de segunda ordem é mais adequado para explicar as variações do rendimento em glicose, em função das variáveis avaliadas na região de estudo. Resultados similares foram obtidos para a análise de variância dos resultados de rendimento total da hidrólise enzimática. A análise de variância para esta resposta mostrou que para um modelo

115 113 linear, apenas as variáveis relação enzima/substrato e concentração de substrato foram significativas (a um nível de 99% e 90% de confiança, respectivamente) com um coeficiente de determinação (R 2 ) de 0,90. Entretanto, quando se fez a estimativa da curvatura (Tabela 4.23), todas as variáveis estudadas, bem como as interações entre elas (exceto a interação entre agitação e relação enzima/substrato) passaram a ser significativas a pelo menos 95% de confiança e o coeficiente de determinação (R 2 ) aumentou para 0,99, sugerindo que um modelo matemático de segunda ordem também é mais adequado para representar as variações do rendimento total de hidrólise, em função das variáveis estudadas, na região analisada. Tabela Análise de variância com erro total e teste da curvatura, para o rendimento em glicose e rendimento total da hidrólise enzimática do bagaço malte. Variável Rendimento em glicose SQ GL MQ F p Curvatura 741, , ,551 0,000*** X 1 181, , ,011 0,000*** X , , ,055 0,000*** X 3 378, , ,467 0,000*** X 1 X 2 30, ,420 25,484 0,007*** X 1 X 3 35, ,701 29,909 0,005*** X 2 X 3 12, ,802 10,725 0,031** Erro 4, ,194 Total 7027, Variável Rendimento total de hidrólise SQ GL MQ F p Curvatura 397, , ,649 0,000*** X 1 124, , ,592 0,000*** X , , ,448 0,000*** X 3 515, , ,369 0,000*** X 1 X 2 2, ,622 2,572 0,184 X 1 X 3 38, ,808 38,067 0,004** X 2 X 3 30, ,420 29,839 0,005*** Erro 4, ,019 Total 4218, X 1 = agitação; X 2 = relação enzima/substrato; X 3 = concentração de substrato. GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrática; MQ = média quadrática. *** Valor significativo a 99% de confiança; **Valor significativo a 95% de confiança. R 2 = 0,99 para ambos, rendimento em glicose e rendimento total de hidrólise.

116 114 Para estabelecer as equações matemáticas de segunda ordem que descrevam o comportamento destas respostas em função das variáveis estudadas, seria necessária a realização de alguns ensaios adicionais modificando a faixa de valores das variáveis. No entanto, estes ensaios não foram realizados por duas razões: 1. no planejamento experimental estudado foi possível atingir elevados valores de rendimento (93,1% em glicose e 99,4% total - ensaio 3). Logo, estes ensaios adicionais não proporcionariam um aumento significativo nos valores destas respostas; 2. quando a análise de variância foi realizada sem estimativa da curvatura, foram obtidos altos valores de R 2 (>0,89), os quais indicam uma boa concordância entre os resultados experimentais e os valores previstos pelas equações de primeira ordem. Por este motivo, o modelo linear foi então aplicado para as duas respostas, obtendo-se as equações apresentadas na Tabela Tabela Equações do modelo para a hidrólise enzimática do bagaço de malte e seus respectivos R 2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) de hidrólise. Resposta Equações do modelo a R 2 a Rendimento em glicose ŷ 1 = 59,65 4,76X ,55X 2 6,88X 3 + 0,89 ( ŷ 1 em %) 1,95X 1 X 2 + 2,11X 1 X 3 1,26 X 2 X 3 Rendimento total de hidrólise ŷ 2 = 72,57 3,95X ,70X 2 8,02X 3 + 0,90 ( ŷ 2 em %) 0,57X 1 X 2 + 2,20X 1 X 3 1,95 X 2 X 3 X 1 = agitação; X 2 = relação enzima/substrato; X 3 = concentração de substrato. Através das equações obtidas do modelo (Tabela 4.24) foi possível construir uma representação tridimensional da superfície de resposta para o rendimento em glicose e para o rendimento total de hidrólise, na região estudada (Figura 4.12). Estas figuras mostram claramente que ambas as respostas foram bem ajustadas a uma superfície plana e que os maiores valores de rendimento em glicose e rendimento total de hidrólise podem ser obtidos utilizando o nível superior de relação enzima/substrato (45 FPU/g) e inferior de concentração de substrato (2% p/v) e agitação (100 rpm).

117 ,560 39,639 45,719 51,798 57,878 63,957 70,037 76,116 82,196 88,275 above acima RENDIMENTO EM GLICOSE (%) ,0 6,5 SUBSTRATO (% p/v) 5,0 3,5 2, ENZIMA/SUBSTRATO (FPU/g) ,939 52,980 58,021 63,062 68,103 73,144 78,185 83,226 88,267 93,307 above acima RENDIMENTO TOTAL (%) ,5 5 3,5 SUBSTRATO (% p/v) ENZIMA/SUBSTRATO (FPU/g) Figura Superfícies de resposta descrita pelos modelos para o rendimento em glicose ( rendimento total (glicose + celobiose) ( ŷ 2 ŷ 1 ) e o ) da hidrólise enzimática do bagaço de malte Análise comparativa da hidrólise enzimática do bagaço de malte com a hidrólise enzimática de outros materiais lignocelulósicos A análise estatística da hidrólise enzimática do bagaço de malte revelou que o rendimento em glicose e o rendimento total de hidrólise foram aumentados quando agitação utilizada no processo foi diminuída (Tabelas 4.22 e 4.23). Uma influência similar da agitação

118 116 foi também observada durante a hidrólise enzimática de outras matérias-primas lignocelulósicas. Durante a hidrólise enzimática de Avicel, por exemplo, Mukataka, Tada e Takahashi (1983) verificaram que o uso de elevadas agitações (> 200 rpm) diminuiu o rendimento de conversão da celulose, enquanto que o uso de uma agitação mais moderada (100 a 200 rpm) proporcionou melhores resultados de rendimento de hidrólise. Por outro lado, Gan, Allen e Taylor (2002) constataram que o aumento da velocidade de agitação de 50 para 90 rpm não influenciou significativamente na hidrólise enzimática de um material celulósico obtido a partir de madeira dura. De acordo com Ingesson et al. (2001) a hidrólise enzimática da celulose requer uma adequada mistura do meio reacional para garantir o contato entre as enzimas e o substrato e promover a transferência de massa e calor dentro do reator. O uso de alguma agitação é necessário, pois aumenta a velocidade e o rendimento da hidrólise, mas o uso de uma agitação muito elevada pode causar a perda da atividade das enzimas devido à força de cisalhamento gerada pelo misturador, reduzindo o rendimento de conversão (INGESSON et al., 2001; WRIGHT, 1988). A concentração de substrato foi outra variável que influenciou no rendimento em glicose e no rendimento total de hidrólise da celulose do bagaço de malte (Tabela 4.22), sendo que o valor de ambas as respostas foi aumentado quando a concentração de substrato foi diminuída. Em termos numéricos, o aumento da concentração de substrato de 2 para 8% p/v proporcionou uma redução de 13,8% no rendimento em glicose. Resultados bastante similares foram observados durante a hidrólise enzimática de α-celulose, onde o aumento da concentração de substrato de 2,5 para 7,5% p/v reduziu o rendimento em glicose em 14% (INGESSON et al., 2001). O efeito da concentração de substrato na hidrólise enzimática da celulose também já foi avaliado para outros materiais lignocelulósicos, tais como bagaço de cana-de-açúcar (MANONMANI; SREEKANTIAH, 1987), sabugo de milho (CHEN; XIA; XUE, 2007) e madeira mole (TENGBORG; GALBE; ZACCHI, 2001). Em todos estes casos, assim como no presente trabalho, foi observado que a concentração de glicose no hidrolisado e o rendimento da hidrólise enzimática apresentam perfis opostos, com a concentração de glicose aumentando e o rendimento de hidrólise diminuindo com o aumento da concentração de substrato. Este efeito pode ser atribuído a uma possível inibição pelo produto, causada pela alta concentração de glicose obtida meio, e às limitações de transferência de massa dentro da

119 117 mistura reacional devido à alta viscosidade da suspensão (INGESSON et al., 2004; WEN; LIAO; CHEN, 2004). Outros fatores que podem contribuir para um baixo grau de conversão da celulose quando se utiliza altas concentrações de substrato, principalmente quando são empregadas baixas quantidades de enzima, incluem diferentes tipos de inativação da enzima e uma adsorção não específica das enzimas na molécula de lignina (VLASENKO et al., 1997). A hidrólise enzimática do bagaço de malte também foi influenciada pela relação enzima/substrato empregada de forma que, quanto maior a carga de enzimas utilizada, maior foi o rendimento de hidrólise obtido (Tabela 4.22). Na verdade, esta foi a variável de maior influência na hidrólise enzimática do bagaço de malte, sendo que seu aumento de 5 para 45 FPU/g de substrato proporcionou um aumento de 53,1% e 39,4% no rendimento em glicose e no rendimento total de hidrólise, respectivamente. Durante a hidrólise enzimática da madeira de álamo, Sattler et al. (1989) também observaram um aumento (31%) no rendimento de conversão da celulose quando a relação enzima/substrato foi aumentada de 5 para 50 FPU/g de substrato. De fato, o favorecimento da hidrólise enzimática devido ao aumento da relação enzima/substrato já foi observado para diferentes substratos celulósicos, obtidos a partir de madeira dura (GAN; ALLEN; TAYLOR, 2002), madeira mole (PAN et al., 2005), bagaço de cana-de-açúcar (MANONMANI; SREEKANTIAH, 1987), cascas de arroz (YÁÑEZ; ALONSO; PARAJÓ, 2006) e palha de arroz (KAUR; ARNEJA; SINGH, 1998; VLASENKO et al., 1997). No entanto, a quantidade de enzimas requerida para se atingir uma completa conversão da celulose em glicose varia para cada matéria-prima utilizada. Por exemplo, durante a hidrólise enzimática de madeira, a máxima conversão de celulose em glicose foi obtida utilizando uma relação enzima/substrato de 11,4 FPU/g. O aumento na quantidade de enzimas não favoreceu o processo de hidrólise e não afetou o rendimento final em glicose (EKLUND; GALBE; ZACCHI, 1990). Por outro lado, durante a hidrólise enzimática da palha de arroz pré-tratada por explosão a vapor, foi necessário o uso de 100 FPU/g de substrato para hidrolisar completamente a celulose (VLASENKO et al., 1997). No presente trabalho, uma relação enzima/substrato de 45 FPU/g foi suficiente para promover uma hidrólise completa da celulose a partir do bagaço de malte.

120 Efeito da carga de enzimas na hidrólise enzimática da celulose do bagaço de malte Conforme apresentado no item 4.7.2, a concentração de substrato otimizada para a hidrólise enzimática da celulose do bagaço de malte foi de 2% p/v. A concentração máxima de glicose no hidrolisado que pode ser obtida a partir desta concentração de substrato, é de 20,1 g/l. Este valor é baixo se for desejada a utilização do hidrolisado como meio de fermentação, para produção de etanol ou ácido láctico, por exemplo, o que necessitaria a realização de uma etapa de concentração para aumentar o teor de glicose. Porém, a inclusão desta etapa pode aumentar o custo global do processo. Desta forma, poderia ser mais vantajoso produzir diretamente um hidrolisado com uma concentração mais elevada de glicose, de forma que a etapa de concentração não se torne necessária. Isto é possível aumentando a concentração de substrato utilizada no processo de hidrólise. No presente trabalho, a concentração máxima de substrato avaliada foi de 8% p/v, pois para concentrações maiores não foi possível obter uma mistura adequada do meio reacional, devido à alta viscosidade da suspensão. Porém, com o uso de uma concentração de substrato de 8% p/v e uma relação enzima/substrato de 45 FPU/g, não foi atingida a máxima conversão de celulose em glicose (rendimento em glicose = 73,8%). Para tentar melhor os resultados de rendimento do processo de hidrólise, alguns ensaios foram realizados empregando uma concentração de substrato de 8% p/v, mas aumentado a quantidade de enzima utilizada para até 85 FPU/g de substrato. Os resultados obtidos nestes experimentos estão apresentados na Figura A Figura 4.13 mostra claramente o aumento na liberação de glicose a partir da celulose do bagaço de malte, quando a relação enzima/substrato utilizada no processo de hidrólise foi aumentada de 15 para 45 FPU/g de substrato. Porém, o uso de uma quantidade maior de enzimas não favoreceu a hidrólise da celulose em glicose, de forma que o rendimento em glicose foi mantido constante para relações enzima/substrato de 45 a 85 FPU/g (Figura 4.14). Estes resultados sugerem que o aumento na quantidade de enzimas favorece a hidrólise enzimática da celulose do bagaço de malte, mas até certo limite, acima do qual a velocidade da reação não é mais alterada. Por esta razão, os ensaios onde se utilizou 45 FPU/g a 85 FPU/g de substrato proporcionaram resultados similares de rendimento em glicose e rendimento total de hidrólise de cerca de 74% e 84%, respectivamente. Em nenhum destes casos foi obtida, portanto, uma completa conversão da celulose em glicose, provavelmente devido a uma possível inibição das enzimas pelo produto da reação. De acordo com alguns

121 119 autores, as enzimas celulolíticas de Trichoderma reesei são altamente sensíveis à inibição causada por ambos os produtos de hidrólise, glicose e celobiose (VLASENKO et al., 1997; WEN; LIAO; CHEN, 2004), sendo que quanto maior a concentração destes compostos no meio reacional, maior a inibição que eles causam a estas enzimas Concentração de glicose (g/l) Tempo de hidrólise (h) 15 FPU/g 25 FPU/g 35 FPU/g 45 FPU/g 55 FPU/g 65 FPU/g 75 FPU/g 85 FPU/g Figura Perfil da liberação de glicose durante a hidrólise enzimática do bagaço de malte a 45ºC, 100 rpm e 8% p/v de concentração de substrato, utilizando diferentes relações de enzima/substrato (15 a 85 FPU/g) Rendimento de hidrólise (%) Rendimento em glicose Rendimento total de hidrólise Relação enzima/substrato (FPU/g) Figura Efeito da relação enzima/substrato nos rendimentos de hidrólise da celulose do bagaço de malte a 45ºC, 100 rpm e 8% p/v de concentração de substrato.

122 120 Apesar da conversão da celulose ter sido incompleta, alguns dos hidrolisados obtidos nestes experimentos apresentaram uma concentração de glicose de aproximadamente 59 g/l, valor mais adequado para uso em processos fermentativos. Porém, além de glicose estes hidrolisados também continham celobiose em concentrações variando de 6,7 a 7,9 g/l. Uma alternativa para reduzir a concentração deste composto no hidrolisado seria a suplementação do extrato enzimático com a enzima β-glicosidase, a qual atua na conversão da celobiose em glicose (CAO; TAN, 2002). Porém, o alto custo envolvido com a adição de uma outra enzima no processo, pode não justificar a adição de β-glicosidase para converter esta baixa concentração de celobiose. De acordo com Chen, Xia e Xue (2007) o custo da enzima contribui significativamente no custo total do processo de conversão de biomassas e, portanto, a quantidade de enzima utilizada no processo deve ser minimizada o máximo possível. Além disso, dependendo do processo fermentativo a ser realizado, a presença de celobiose no meio de fermentação pode não interferir no desempenho do microrganismo. Alguns autores verificaram inclusive consumo de celobiose quando o hidrolisado de madeira foi utilizado como meio de fermentação para a produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii NRRL B-445 (MOLDES; ALONSO; PARAJÓ, 1999). 4.8 EFEITO DA HEMICELULOSE E DA LIGNINA NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA CELULOSE DO BAGAÇO DE MALTE Estes ensaios foram realizados com o objetivo de avaliar a influência das frações de hemicelulose e lignina na hidrólise enzimática do bagaço de malte e assim verificar a necessidade de se submeter o material a duas etapas prévias de tratamento para poder atingir elevados rendimentos de hidrólise. Três amostras com diferentes composições químicas foram preparadas a partir deste material e utilizadas como substrato nos experimentos de hidrólise: 1. bagaço de malte na forma original; 2. bagaço de malte obtido após o processo de hidrólise ácida (celulignina); 3. bagaço de malte obtido após as seqüências de hidrólise ácida e alcalina (polpa celulósica). Conforme se observa na Tabela 4.25, o bagaço de malte original é composto principalmente por hemicelulose e lignina. Na amostra tratada com ácido (celulignina) a lignina é a fração presente em maior quantidade, enquanto que a polpa é basicamente constituída por celulose.

123 121 Tabela Composição química das amostras de bagaço de malte empregadas no processo de hidrólise enzimática. Componente Composição química (g/100 g) Bagaço de malte original Celulignina Celulose 16,8 34,0 90,4 Hemicelulose 28,4 7,9 1,1 Lignina 27,8 49,2 8,2 Outros a 27,0 8,9 0,3 a outros componentes incluem cinzas, proteínas e extrativos Polpa celulósica Hidrólise enzimática do bagaço de malte com diferentes composições químicas Os resultados da hidrólise enzimática do bagaço de malte com diferentes composições químicas estão apresentados na Figura Observa-se nesta figura que os resultados obtidos variaram com a composição do material. A formação de glicose (Figura 4.15A) foi favorecida na amostra com baixo teor de hemicelulose e lignina (polpa celulósica), a qual também proporcionou o mais alto rendimento total de hidrólise da celulose (Figura 4.15B). Por outro lado, o material original rendeu os mais baixos valores de glicose liberada e rendimento total de hidrólise. Esses resultados sugerem que a composição química do substrato, isto é, a presença de hemicelulose e/ou de lignina na amostra afetou negativamente a hidrólise enzimática da celulose. Os resultados obtidos a partir do resíduo de celulignina revelam a influência da hemicelulose na hidrólise enzimática da celulose, uma vez que, apesar do teor de lignina na amostra ter sido aumentado após o pré-tratamento ácido, a hidrólise enzimática desta amostra proporcionou maiores valores de liberação de glicose e rendimento total de hidrólise do que os obtidos a partir do material original. Esta melhora nos resultados pode ser atribuída, portanto, à baixa presença de hemicelulose no material. A remoção de lignina, além da hemicelulose, aumentou ainda mais esses resultados. A partir da polpa celulósica, foram atingidos os mais altos valores de rendimento em glicose (85,6%) e rendimento total de hidrólise (91,7%). Tais valores foram 14,5% e 17,4% superiores àqueles obtidos a partir da celulignina, e 280% e 310% superiores àqueles obtidos a partir do material original. Concluise, portanto, que quanto menor os teores de hemicelulose e lignina na amostra, melhor o desempenho da hidrólise enzimática da celulose.

124 (A) Glicose (Gli) e Celobiose (Cel) (g/l) Gli - Original Gli - Celulignina Gli - Polpa celulósica Cel - Original Cel - Celulignina Cel - Polpa celulósica Tempo de hidrólise (h) Rendimento em glicose, YG (%) Rendimento total de hidrólise, YT (%) (B) YT - Original YT - Celulignina YT - Polpa celulósica YG - Original YG - Celulignina YG - Polpa celulósica Tempo de hidrólise (h) Figura Hidrólise enzimática das amostras de bagaço de malte original, celulignina e polpa celulósica. (A) Concentração de glicose e celobiose nos hidrolisados obtidos; (B) Rendimento em glicose e rendimento total de hidrólise para cada amostra utilizada. De acordo com Mansfield, Mooney e Saddler (1999), os materiais lignocelulósicos na sua forma original são relativamente resistentes à ação enzimática. Porém, a remoção da hemicelulose e da lignina modifica a estrutura do material, tornando a celulose mais aberta e acessível ao contato com as enzimas. Por essa razão, a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos em sua forma original ocorre com baixa eficiência.

125 123 Assim como foi observado no presente trabalho, a remoção parcial da hemicelulose e da lignina também proporcionou uma melhora no rendimento em glicose durante a hidrólise enzimática da celulose a partir de outros materiais lignocelulósicos, tais como cascas de arroz (YÁÑEZ; ALONSO; PARAJÓ, 2006), sabugo de milho (ÖHGREN et al., 2007), bagaço de cana-de-açúcar (MARTÍN; KLINKE; THOMSEN, 2007) e madeira de álamo (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000). De acordo com Liao et al. (2005), tanto a hemicelulose como a lignina, inibem física e/ou quimicamente a ação das enzimas, impedindo a celulose de ser atacada. Com a remoção dessas duas frações, a cristalinidade da celulose é reduzida, enquanto que a porosidade do material e a área superficial acessível às enzimas são aumentadas, favorecendo a ação enzimática (MANSFIELD; MOONEY; SADDLER, 1999; SUN; CHENG, 2002). Estudando a hidrólise enzimática de Pinus radiata, Wong et al. (1988) concluíram que durante o pré-tratamento do material, a remoção da hemicelulose e redistribuição da lignina aumentaram a área superficial presente na forma de poros, melhorando desta forma a acessibilidade às enzimas. Pan et al. (2005) sugeriram que a lignina reduz a hidrólise da celulose através de dois distintos mecanismos: 1. formando uma barreira física que impede ou previne o acesso da enzima à celulose; 2. adsorvendo irreversivelmente as enzimas celulase, impedindo, portanto, a ação delas sobre a celulose. Por essa razão, em amostras com elevado teor de lignina grande parte das enzimas são adsorvidas ou bloqueadas por esta molécula e apenas uma pequena parte consegue se adsorver efetivamente na superfície do substrato. Por outro lado, para amostras com baixo teor de lignina, muitas enzimas podem ser adsorvidas na celulose, sendo efetivas e digerindo rapidamente a biomassa (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000). Embora a lignina seja considerada um dos fatores mais limitantes da hidrólise enzimática da celulose (BERLIN et al., 2005), no presente trabalho foi verificado uma grande influência negativa da hemicelulose na ação das enzimas à celulose. Isto porque, quando esta fração foi removida quase que totalmente (86,5% de remoção, junto com apenas 14% de remoção da lignina, obtendo a celulignina), o rendimento total de hidrólise aumentou em 3,5 vezes comparado com o rendimento obtido a partir do material original, atingindo um valor de 78,1% (Figura 4.15B). O pré-tratamento do bagaço de malte pelas seqüências de hidrólise ácida e alcalina promoveu uma remoção quase total de ambas as frações, hemicelulose e lignina (99,3% e 94,7% de remoção, respectivamente), porém, o rendimento total de hidrólise foi aumentado em 4 vezes quando comparado com o rendimento obtido a partir do material original, atingindo um valor de 91,8%. Estes resultados sugerem, portanto, que não é

126 124 necessário promover uma remoção total das frações de hemicelulose e lignina da amostra, para se atingir elevados rendimentos durante a hidrólise enzimática da celulose. Alguns autores também relataram que não é necessário remover completamente a lignina do material para que a hidrólise enzimática da celulose seja completa (GREGG; SADDLER, 1996). Neste caso, uma análise econômica poderia ser útil para avaliar se os melhores resultados obtidos no rendimento da hidrólise enzimática a partir da polpa celulósica justificariam o custo envolvido com a realização da etapa de tratamento alcalino da celulignina, antes da hidrólise enzimática. De um ponto de vista ambiental a não realização desta etapa seria benéfica, pois a degradação da lignina durante a hidrólise alcalina gera um licor rico em compostos fenólicos, dentre os quais, muitos são tóxicos e precisam ser removidos antes da descarga deste efluente no meio ambiente (KARAM; NICELL, 1997). É também interessante notar que a partir da celulignina do bagaço de malte, mas principalmente a partir da polpa celulósica, a hidrólise enzimática da celulose apresentou uma fase inicial logarítmica associada com uma rápida liberação de glicose, seguida por uma diminuição na velocidade de produção deste açúcar à medida que a reação avançou (Figura 4.15A). Para explicar este comportamento, alguns autores sugeriram que durante a hidrólise enzimática da celulose, as enzimas celulolíticas degradam rapidamente a fração amorfa mais acessível do substrato. Com o progresso da hidrólise, a celulose torna-se mais resistente à hidrólise como resultado do aumento da cristalinidade (GHARPURAY; LEE; FAN, 1983; GREGG; SADDLER, 1996; PURI, 1984). Outros fatores associados com a natureza do sistema enzimático utilizado também têm sido sugeridos para explicar a diminuição da velocidade da hidrólise da celulose. Estes incluem a inativação térmica das enzimas, a adsorção irreversível ou ligação não específica das celulases e a inibição das enzimas pelo produto da reação (GREGG; SADDLER, 1996; MORIYAMA; SAIDA, 1986; RAMOS; NAZHAD; SADDLER, 1993) Estrutura morfológica do bagaço de malte após a hidrólise enzimática Vários autores consideram que o melhor desempenho da hidrólise enzimática quando se utiliza substratos pré-tratados, está relacionado às modificações morfológicas causadas pelo pré-tratamento na estrutura do material (GHARPURAY; LEE; FAN, 1983; RAMOS; NAZHAD; SADDLER, 1993). Por este motivo, algumas fotomicrografias em microscópio eletrônico de varredura foram realizadas, para as diferentes amostras de bagaço de malte, com

127 125 o objetivo de se verificar as mudanças estruturais ocorridas no material durante os processos de hidrólise ácida, alcalina e enzimática (Figura 4.16). (A) (B) (C) (D) (E) (F) Figura Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das amostras de bagaço de malte. Material original antes (A) e após (B) a hidrólise enzimática; Celulignina antes (C) e após (D) a hidrólise enzimática; Polpa celulósica antes (E) e após (F) a hidrólise enzimática. Ampliação: 300 vezes.

128 126 A Figura 4.16A mostra que o bagaço de malte na sua forma original apresenta uma estrutura de fibras rígidas e altamente ordenadas. Com a remoção da hemicelulose, a estrutura deste material foi modificada, mas a estrutura principal não foi rompida (Figura 4.16C). Quando a lignina também foi removida (Figura 4.16E), a estrutura do material foi fortemente modificada resultando em uma estrutura muito diferente das outras duas, original e celulignina. Neste caso, as fibras de celulose tornaram-se totalmente expostas, o que aumentou a área superficial e a porosidade do material. Conseqüentemente, essas fibras encontram-se mais susceptíveis à ação das enzimas do que as outras duas amostras de bagaço de malte. Ooshima, Burns e Converse (1990) também observaram que quanto mais severo o pré-tratamento utilizado, maior a área superficial da celulose disponível para as enzimas. Após a hidrólise enzimática, observa-se que a estrutura do material original praticamente não foi modificada (Figura 4.16B), confirmando a baixa eficiência de hidrólise obtida. A imagem da celulignina hidrolisada (Figura 4.16D) mostra uma maior destruição das fibras neste caso quando comparada com as fibras hidrolisadas a partir do material original, o que justifica o melhor desempenho da hidrólise a partir da celulignina do que a partir da amostra original. As fibras hidrolisadas a partir da polpa celulósica do bagaço de malte foram completamente destruídas (Figura 4.16F), o que explica os altos valores de rendimento em glicose e rendimento total de hidrólise, atingidos a partir deste substrato. Nota-se ainda neste caso que as fibras de celulose tornaram-se mais estreitas e curtas, sugerindo um ataque longitudinal e lateral das fibras Composição dos hidrolisados celulósicos produzidos A composição em termos de carboidratos (glicose, celobiose, xilose e arabinose) dos hidrolisados produzidos a partir do bagaço de malte encontra-se na Tabela Observa-se nesta tabela que a glicose foi o principal açúcar presente nos hidrolisados produzidos a partir da celulignina e da polpa celulósica. Embora a concentração tenha sido diferente para cada caso, estes valores estão relacionados com a composição química do material, de forma que quanto maior o teor de celulose presente, maior a concentração de glicose que poderia ser obtida no hidrolisado. Para o bagaço de malte nas formas original, celulignina e polpa celulósica, a máxima concentração de glicose que poderia ser obtida no hidrolisado seria de 3,7 g/l, 7,6 g/l e 20,1 g/l, respectivamente. Estes resultados demonstram, portanto, que a liberação de glicose a partir do material foi favorecida com a realização dos pré-tratamentos

129 127 de hidrólise ácida e alcalina, uma vez que a concentração de glicose nos hidrolisados enzimáticos correspondeu a 23%, 74% e 86% do máximo que poderia ser obtido para o material na forma original, celulignina e polpa celulósica, respectivamente. Tabela Composição de carboidratos nos hidrolisados enzimáticos produzidos a partir do bagaço de malte nas formas original, celulignina e polpa celulósica. Componente Concentração de carboidratos no hidrolisado (g/l) Original Celulignina Polpa celulósica Glicose 0,84 5,65 17,21 Celobiose - 0,24 1,17 Xilose 0,86 0,60 - Arabinose 1, A arabinose foi o principal açúcar encontrado no hidrolisado produzido a partir da amostra original. Existem duas explicações possíveis para este fato: 1. a arabinose presente no bagaço de malte apresenta uma alta sensibilidade térmica, a qual é maior do que aquela apresentada pela xilose (CARVALHEIRO et al., 2004b), e por esta razão ela teria sido facilmente liberada da estrutura da hemicelulose durante o processo de hidrólise; 2. as celulases são geralmente misturas de várias enzimas e, além daquelas envolvidas no processo de hidrólise da celulose (endoglucanase, exoglucanase, e β-glucosidase) existem também várias enzimas auxiliares que atacam a hemicelulose, tais como glucuronidase, acetilesterase, xilanase, β-xilosidase, galactomananase e glucomananase (DUFF; MURRAY, 1996; SUN; CHENG, 2002) que poderiam ter atacado a estrutura da hemicelulose liberando xilose e arabinose no meio reacional. Um aspecto importante que deve ser considerado quando se avalia a composição de hidrolisados é com respeito à presença de subprodutos. De acordo com Martín et al. (2002), a baixa formação de subprodutos é uma importante vantagem da hidrólise enzimática quando comparada à hidrólise ácida, por exemplo. No presente trabalho, todos os hidrolisados produzidos continham outros carboidratos (xilose, arabinose ou celobiose) em sua composição, além de glicose. O hidrolisado obtido a partir do bagaço de malte original continha xilose e arabinose em concentrações mais elevadas que a de glicose, enquanto que o hidrolisado produzido a partir da celulignina continha celobiose e xilose em mistura com a glicose, porém, em concentrações menores que a deste açúcar (Tabela 4.26). No hidrolisado

130 128 obtido a partir da polpa celulósica, somente celobiose foi detectada em mistura com a glicose. Em termos de proporção, nota-se que a xilose estava presente no hidrolisado original, em uma relação de 1/1 com a glicose. Porém, no hidrolisado da celulignina, esta proporção foi reduzida para 1/9,4 e no hidrolisado da polpa celulósica não foi detectada a presença de xilose. Esta diminuição na relação xilose/glicose se deve à liberação da xilose durante as etapas de pré-tratamento do bagaço de malte. A mesma explicação pode ser dada para justificar a presença de arabinose apenas no hidrolisado do bagaço de malte original (Tabela 4.26). Por outro lado, a presença de celobiose foi verificada nos hidrolisados obtidos a partir da celulignina e da polpa de celulose, mas não a partir do material original. Além disso, quanto mais pré-tratado o material, maior a concentração de celobiose obtida no hidrolisado (Tabela 4.26) o que sugere um efeito maior de inibição das enzimas neste hidrolisado, afetando a capacidade de conversão da celobiose em glicose. Tal efeito pode estar relacionado com a alta concentração de glicose obtida neste meio. A presença de compostos tóxicos ao metabolismo microbiano (hidroximetilfurfural, furfural, ácido acético e compostos fenólicos) não foi detectada nos hidrolisados produzidos. Este fato pode ser atribuído à alta especificidade das enzimas celulase (BEGUIN; AUBERT, 1994), e também às condições brandas de reação empregadas. A ausência de compostos tóxicos é de fundamental importância para o emprego do hidrolisado em processos de bioconversão, pois a maior limitação do uso de hidrolisados para esta finalidade se deve à inibição causada pelos compostos tóxicos nele presentes (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a). 4.9 EMPREGO DO HIDROLISADO CELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE COMO MEIO DE FERMENTAÇÃO PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO Aspectos gerais do processo fermentativo O hidrolisado obtido por hidrólise enzimática da polpa celulósica do bagaço de malte foi empregado como meio de fermentação para a produção de ácido láctico pela bactéria Lactobacillus delbrueckii. No entanto, como era de interesse utilizar um hidrolisado contendo cerca de 50 g/l de glicose, este foi produzido nas condições otimizadas de hidrólise, porém, utilizando uma concentração de substrato de 8% p/v. Análises da composição química do hidrolisado assim obtido revelou a presença de glicose e celobiose nas concentrações de

131 129 57,8 g/l e 7,5 g/l, respectivamente. Quando cultivada neste hidrolisado, a bactéria Lactobacillus delbrueckii foi capaz de consumir a glicose presente e produzir ácido láctico, o qual foi detectado apenas na forma isomérica L. Embora o ácido láctico se apresente sob duas formas isoméricas, D e L, de acordo com Hofvendahl e Hahn-Hägerdal (2000) normalmente a maioria das bactérias ácido lácticas produzem apenas a forma isomérica L deste ácido. A celobiose presente no hidrolisado não foi consumida pelo microrganismo durante o tempo de fermentação considerado (48 h) e a presença de subprodutos da reação, incluindo etanol, ácido acético e ácido fórmico, também não foi verificada no hidrolisado fermentado. Este resultado é interessante, pois para que a produção de ácido láctico em escala industrial ocorra de forma eficiente, a formação de subprodutos deve ser evitada ou mantida em um mínimo (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000) Efeito do nível de inóculo na produção de ácido láctico A produção de ácido láctico por microrganismos é influenciada por vários fatores, os quais incluem ph, agitação, fonte de carbono, temperatura, suplementação nutricional e nível do inóculo (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000; SILVA; MANCILHA, 1991). Para avaliar o efeito da concentração inicial do inóculo na produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado celulósico de bagaço de malte, foram realizados alguns ensaios empregando valores de concentração celular inicial de 0,5, 0,75 e 1,0 g/l. Os resultados obtidos revelaram que após 48 h de fermentação, o ph inicial de todos os ensaios havia sido reduzido de 5,95 (ph inicial) para aproximadamente 4,5, devido a formação e liberação de ácido láctico no meio reacional. Porém, o consumo de glicose e a produção de ácido láctico variaram para cada nível de inóculo utilizado. A eficiência destas fermentações foi avaliada através dos valores dos parâmetros: produtividade volumétrica (Q P ), fator de conversão de glicose em ácido láctico (Y P/S ) e fator de rendimento de ácido láctico por célula (Y P/X ). Os resultados obtidos estão apresentados na Figura Nota-se na Figura 4.17 que os valores de Y P/S aumentaram com o aumento do nível de inóculo de 0,5 para 1,0 g/l, atingindo o valor máximo de 0,73 g/g (73% de eficiência) quando se utilizou 1,0 g/l de células no início da fermentação. Por outro lado, quando o nível de inóculo foi dobrado, os valores de Y P/X foram reduzidos pela metade, sugerindo que o aumento da quantidade de células no início da fermentação exerceu um efeito negativo sobre

132 130 a capacidade do microrganismo em converter glicose a ácido láctico. Tal efeito pode estar relacionado com a presença de nutrientes no meio de fermentação. O hidrolisado celulósico de bagaço de malte foi utilizado como meio de fermentação na forma em que foi produzido, isto é, sem suplementação adicional de nutrientes. Como a polpa de celulose que foi hidrolisada enzimaticamente continha uma pequena fração (0,3% p/p) composta por proteínas e minerais, é possível que parte destas substâncias tenham sido solubilizadas durante o processo de hidrólise enzimática, proporcionando desta forma alguma fonte nutricional para o desenvolvimento do microrganismo. No entanto, esta quantidade de nutrientes solubilizada pode não ter sido suficiente para os microrganismos quando o nível de inóculo foi aumentado. Isto teria afetado o desempenho das células em converter glicose a ácido láctico, justificando a queda observada nos valores de Y P/X. Y P/S (g/g); Q P (g/l.h) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Y P/X (g/g) 0,0 0,5 0,75 1, Concentração inicial de inóculo (g/l) 0 Figura Efeito da concentração inicial de inóculo nos parâmetros fermentativos da produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado celulósico de bagaço de malte. Por outro lado, quanto maior o nível de inóculo utilizado, maior a quantidade de células disponíveis para realizar este processo de bioconversão. Por esta razão, o aumento da carga do inóculo de 0,5 para 1,0 g/l foi capaz de mascarar esta menor capacidade da célula em converter glicose a ácido láctico, uma vez que o fator de rendimento do processo (Y P/S ) foi aumentado em 20%. Conclui-se então com estes resultados que, quando se utilizou um

133 131 inóculo com 1 g/l de células, o fator de rendimento em ácido láctico por substrato consumido foi maior do que nos outros experimentos devido ao maior número de células presentes no meio de fermentação. Durante a produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii a partir de resíduo de abacaxi, Idris e Suzana (2006) também verificaram uma relação entre a concentração de células e a produção de ácido láctico, de forma que a produção deste ácido foi favorecida quando a concentração celular utilizada foi aumentada. O aumento do nível de inóculo de 10 4 para 10 6 esporos/ml também favoreceu a produção de ácido láctico por uma espécie mutante do fungo Rhizopus (MIURA et al., 2003). Em relação à produtividade volumétrica em ácido láctico (Q P ) observa-se na Figura 4.17 que o valor deste parâmetro foi idêntico em todos os experimentos. Isto significa que em um tempo de fermentação de 48 h as células produziram a mesma quantidade de ácido láctico em todos os meios avaliados. Um comportamento similar foi observado por Gomez e Goma (1986) durante a fermentação para produção de ácido láctico a partir de glicose empregando diferentes níveis de inóculo (0,4, 2,5 e 3,6 g/l). De acordo com estes autores, um tempo de fermentação de 50 h foi suficiente para que todos os meios de fermentação atingissem a mesma concentração final de ácido láctico, devido à queda do ph do meio de fermentação. Durante a fermentação para produção de ácido láctico, na medida em que o ácido láctico é formado e excretado para fora da célula, o ph do meio de fermentação diminui causando uma inibição no crescimento do microrganismo, reduzindo então o rendimento de formação de produto (SILVA; MANCILHA, 1991). Logo, no presente trabalho, um tempo de 48 h foi longo o suficiente para permitir que as células produzissem, em todos os meios de fermentação, a mesma quantidade de ácido láctico capaz de proporcionar a queda do ph até este valor limite onde o metabolismo do microrganismo foi afetado. Por este motivo, todas as fermentações apresentaram valores similares de ph final e de produtividade volumétrica. De acordo com Hofvendahl e Hahn-Hägerdal (2000), o ph ótimo para produção de ácido láctico varia entre 5,0 e 7,0. Valores abaixo deste limite afetam negativamente o desempenho do microrganismo, determinando o final da fermentação.

134 EFEITO DO ph E DA SUPLEMENTAÇÃO NUTRICIONAL DO HIDROLISADO CELULÓSICO DE BAGAÇO DE MALTE NA PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR Lactobacillus delbrueckii Nos experimentos anteriores foi verificado que o hidrolisado celulósico de bagaço de malte apresenta características favoráveis para ser utilizado como meio de fermentação para a produção de ácido láctico. Porém, o desempenho da fermentação foi afetado pela queda do ph ocorrida em decorrência da formação deste ácido. Por este motivo, os experimentos realizados nesta etapa foram conduzidos com e sem o controle do ph de fermentação, para avaliar a influência desta variável no processo de bioconversão. Além disso, alguns ensaios foram também realizados empregando o hidrolisado suplementado com nutrientes, para verificar a possibilidade de melhorar os valores dos parâmetros fermentativos obtidos anteriormente Efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico A adição de nutrientes ao meio de fermentação empregado para a produção de ácido láctico tem sido investigada em um grande número de trabalhos envolvendo como substrato sacarose, glicose, lactose, soro de queijo, hidrolisados hemicelulósicos, entre outros. Nestes estudos, os principais nutrientes adicionados aos meios de fermentação incluem o extrato de levedura e os componentes presentes na formulação do meio MRS caldo (meio empregado para crescimento de bactérias) (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000). A Figura 4.18 mostra que a adição de extrato de levedura ao hidrolisado celulósico de bagaço de malte favoreceu o consumo de glicose e a produção de ácido láctico pelo microrganismo; no entanto, o desempenho da fermentação foi ainda melhor quando o hidrolisado foi enriquecido com os nutrientes do meio MRS. De fato, as bactérias ácido lácticas são considerados microrganismos de grande exigência nutricional, pois apresentam uma capacidade limitada em biosintetizar vitaminas do complexo B e aminoácidos (FITZPATRICK; O KEEFFE, 2001; OH et al., 2005). Logo, para garantir boas condições de crescimento e atividade biológica destas bactérias, o meio de cultivo deve conter minerais, vitaminas do complexo B, aminoácidos, bases purinas e pirimidinas (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 2000; KWON et al., 2000; PAULI; FITZPATRICK, 2002).

135 133 (A) (B) Glicose (g/l) Ácido láctico (g/l) Tempo de fermentação (h) Tempo de fermentação (h) (C) 2, ,5 (D) 6, ,0 2,0 2,0 5,5 5,5 5,0 5,0 Células (g/l) 1,5 1,0 1,5 1,0 ph 4,5 4,0 4,5 4,0 3,5 3,5 0,5 0, Tempo de fermentação (h) 3,0 3, Tempo de fermentação (h) Figura Efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico de bagaço de malte no consumo de glicose (A), produção de ácido láctico (B), crescimento celular (C) e ph da fermentação (D) por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1 ( ): hidrolisado não suplementado; Meio 2 ( ): hidrolisado suplementado com extrato de levedura; Meio 3 ( ): hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS; Meio 4 ( ): MRS com a mesma concentração inicial de glicose do hidrolisado. A necessidade de suplementação nutricional do hidrolisado celulósico de bagaço de malte é justificável uma vez que o material submetido à hidrólise enzimática (polpa celulósica) já havia sido pré-tratado duas vezes, com ácido diluído e com solução de hidróxido de sódio. Por esta razão, importantes componentes nutricionais, tais como minerais (presentes nas cinzas) e proteínas existentes no material original, já haviam sido quase totalmente solubilizados durante estas etapas. Mesmo assim, observa-se na Figura 4.18B que houve produção de ácido láctico a partir do hidrolisado sem suplementação nutricional, o que sugere a presença de alguma fonte de nutrientes neste meio. A necessidade de suplementação nutricional do hidrolisado para a produção de ácido láctico já foi verificada também em hidrolisados obtidos a partir de outros materiais lignocelulósicos, tais como palha de trigo

136 134 (GARDE et al., 2002), madeira (PARAJÓ; ALONSO; SANTOS, 1996; WEE et al., 2006), bagaço de mandioca e bagaço de cana-de-açúcar (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2006). A adição de extrato de levedura ao hidrolisado de bagaço de malte proporcionou um aumento de 27% na produção de ácido láctico. Por outro lado, quando o hidrolisado foi suplementado com os nutrientes do meio MRS, o aumento na produção de ácido láctico foi de 67%. Resultados similares a estes foram também observados em outros trabalhos sobre produção de ácido láctico, conforme relatado por Hofvendahl e Hahn-Hägerdal (2000). Estes autores compararam diversos estudos sobre a produção de ácido láctico onde os meios de fermentação foram suplementados com diferentes tipos de nutrientes. Além de observar um efeito positivo da suplementação nutricional na produção deste ácido, eles também verificaram que a adição dos nutrientes do meio MRS tem proporcionado melhores resultados de fermentação do que a adição de extrato de levedura apenas. Isto poderia ser explicado pelo fato de que o meio MRS é uma mistura mais completa de nutrientes, pois também contém extrato de levedura e ainda é acrescido de extrato de carne, peptona entre outros nutrientes. De acordo com Kwon et al. (2000), quanto mais completa a mistura de nutrientes adicionada ao meio de fermentação, maior será a produtividade volumétrica em ácido láctico. Um fato interessante observado foi que os resultados de consumo de glicose e produção de ácido láctico a partir do hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS foram superiores àqueles obtidos no próprio meio MRS (Figuras 4.18A e B). Isto sugere que o hidrolisado celulósico de bagaço de malte apresenta algum componente em sua composição que não foi identificado, mas que atuou sinergisticamente com os nutrientes do meio MRS favorecendo a produção de ácido láctico. O crescimento celular também foi favorecido em meios suplementados com nutrientes, porém, neste caso, os resultados foram similares em ambos os hidrolisados suplementados, com extrato de levedura ou com os nutrientes do meio MRS (Figura 4.18C). A partir dos meios suplementados, o crescimento do microrganismo foi inicialmente rápido, mas praticamente cessou após 12 h de fermentação. Por outro lado, no meio não suplementado, o crescimento do microrganismo foi muito pequeno, não havendo uma fase inicial exponencial, como aquela observada nos outros meios. É importante ressaltar que todos estes ensaios foram realizados sem controle do ph do meio de fermentação, o que claramente afetou o desempenho do processo. A Figura 4.18D mostra que durante as primeiras 12 h de fermentação houve uma forte queda do ph (de 6,0 para 4,4) em todos os meios, devido à produção de ácido láctico. Conseqüentemente, o

137 135 metabolismo do microrganismo foi afetado e nas 12 h seguintes de fermentação, o consumo de glicose foi pequeno em todos os meios, prejudicando a produção de ácido láctico e o crescimento celular. Mesmo assim, ainda houve uma pequena formação de ácido láctico durante este período, causando uma queda do ph para 4,2, o que praticamente determinou o final de todas as fermentações. Observa-se na Figura 4.18 que após 24 h de fermentação, o ph de todos os meios permaneceu praticamente estável em 4,2 e não foi mais verificado consumo de glicose, produção de ácido láctico e crescimento celular. Comportamento similar foi observado durante a fermentação para a produção de ácido láctico por Lactococcus lactis, a partir do hidrolisado de farinha de trigo, onde a queda do ph inicial (5,85) para 3,2, durante as primeiras 24 h do processo, determinou o final da fermentação (HOFVENDAHL; HAHN- HÄGERDAL, 1997). Com base nestes resultados, os parâmetros fermentativos da produção de ácido láctico foram calculados apenas para os tempos de fermentação de 12 e 24 h (Figura 4.19). Observase que com 12 h de fermentação, todos os meios formulados a partir do hidrolisado de bagaço de malte apresentaram valores similares de fator de rendimento em ácido láctico (Y P/S ), os quais foram superiores ao valor obtido no meio MRS. Porém, a produtividade volumétrica foi maior nos meios suplementados com nutrientes, atingindo um valor máximo de 0,79 g/l.h no hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS (meio 3). Considerando 24 h como tempo final de fermentação (tempo a partir do qual não foi mais observado consumo de glicose e produção de ácido láctico) observa-se que os valores de fator de rendimento permaneceram na faixa de 0,7 g/g para os meios MRS e hidrolisado não suplementado. No entanto, estes valores aumentaram cerca de 10% nos meios onde o hidrolisado foi suplementado com nutrientes, mostrando que a adição de nutrientes ao hidrolisado favoreceu a produção de ácido láctico pelo microrganismo. Ao contrário do fator de rendimento, a produtividade volumétrica em ácido láctico foi bastante diferente considerando os tempos de 12 ou 24 h como final da fermentação (Figura 4.19). Com 12 h de processo, quando o microrganismo ainda estava em condições de ph favoráveis ao seu desenvolvimento, as produtividades obtidas em todos os meios foram 40% maiores do que os valores observados após 24 h de fermentação. Esta queda nos valores de produtividade volumétrica indica que a produção de ácido láctico entre 12 e 24 h de fermentação foi menor do que a produção obtida entre 0 e 12 h, ou seja, entre 12 e 24 h de processo o microrganismo não conseguiu produzir ácido láctico com a mesma eficiência que produziu durante as 12 h iniciais.

138 136 Yp/s (g/g); Qp (g/l.h) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 Meio 1 Meio 2 Meio 3 Meio 4 Yp/s (g/g); Qp (g/l.h) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 Meio 1 Meio 2 Meio 3 Meio 4 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 Yp/s Qp 0,0 Yp/s Qp Parâmetros fermentativos para 12 h de processo Parâmetros fermentativos para 24 h de processo Figura Efeito da suplementação nutricional do hidrolisado celulósico de bagaço de malte nos parâmetros fermentativos (Y P/S e Q P ) da produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii. Meio 1: hidrolisado não suplementado; Meio 2: hidrolisado suplementado com extrato de levedura; Meio 3: hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS; Meio 4: MRS com a mesma concentração inicial de glicose do hidrolisado. Estes resultados permitem concluir que a produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii em hidrolisado celulósico de bagaço de malte pode ser realizada com elevados valores de rendimento (0,70 g/g) e produtividade volumétrica (0,79 g/l.h) quando o hidrolisado é suplementado com nutrientes. Porém, como o ph de fermentação não foi controlado, uma grande quantidade de glicose (33 a 43 g/l) permaneceu nos meios, comprometendo a produtividade do processo e a posterior purificação do caldo fermentado Efeito do ph O ph é considerado um dos principais fatores que interferem na produção de ácido láctico por fermentação, pois a atividade metabólica dos microrganismos depende do ph extracelular (SILVA; MANCILHA, 1991). De acordo com Hofvendahl e Hahn-Hägerdal (2000), o ph ótimo para a produção de ácido láctico varia entre 5 e 7, dependendo da espécie utilizada. Para a bactéria Lactobacillus delbrueckii, valores de ph na faixa de 5,5 a 7,5 foram considerados adequados para proporcionar um bom crescimento e produção de ácido láctico (IDRIS; SUZANA, 2006), por isso, no presente trabalho, todas as fermentações iniciaram com um valor de ph igual a 6,0.

139 137 A Figura 4.20 apresenta os perfis de consumo de glicose e produção de ácido láctico nas fermentações realizadas com e sem o controle do ph. Observa-se que durante as primeiras 12 h de processo, ambas as fermentações, com e sem controle de ph, apresentaram resultados bastante similares. Isto ocorreu tanto em hidrolisado como no meio MRS. Porém, a partir deste tempo o consumo de glicose e a produção de ácido láctico foram influenciados pelo ph do meio de fermentação. Quando o ph foi mantido em 6,0, as fermentações prosseguiram até o tempo final considerado (60 h); enquanto que quando o ph não foi controlado, as fermentações praticamente terminaram após 12 h de processo, devido à queda do ph para um valor de aproximadamente 4,6. De acordo com alguns autores, os ácidos fracos, como por exemplo, o ácido láctico, são realmente capazes de inibir o crescimento bacteriano dependendo do ph do meio de fermentação. Na medida em que o ácido láctico é excretado para fora da célula, ele diminui o ph externo. Com a queda do ph, este ácido, que está presente na forma não dissociada, tem a sua passagem facilitada através da membrana plasmática. Desta forma, o ácido entra novamente na célula e ao encontrar um ph interno igual a 7,4, ele se dissocia liberando prótons H+. A célula passa então a gastar energia na forma de ATP para expulsar estes prótons do seu interior. Quanto maior a quantidade de ácido formado, mais o ph externo diminui e uma quantidade maior de ácido entra novamente na célula e se dissocia. Logo, maior será o gasto de energia da célula para manter sua integridade física. Isto ocorre até certo limite onde a célula não apresenta mais energia suficiente para bombear os prótons para fora. Então o crescimento pára e a célula pode chegar à morte (HOFVENDAHL; HAHN-HÄGERDAL, 1997; KASHKET, 1987). Na fermentação do hidrolisado não suplementado, com controle de ph, a produção de ácido láctico foi de 12,76 g/l, valor 62% superior ao obtido no final da fermentação sem controle de ph (7,87 g/l) (Figura 4.20B). Por outro lado, em hidrolisado suplementado e com controle de ph, a produção de ácido láctico atingiu 35,54 g/l, enquanto que a máxima concentração obtida neste meio sem controle de ph, foi de 13,02 g/l. Estes valores representam um aumento de 170% na produção de ácido láctico quando o ph do hidrolisado suplementado foi controlado. Comparando as fermentações em hidrolisado, fica claro novamente que a suplementação nutricional promoveu um aumento na eficiência de conversão da glicose a ácido láctico. Os parâmetros fermentativos obtidos nestas fermentações estão apresentados na Tabela Observa-se nesta tabela que houve uma grande quantidade de glicose residual em todos os meios sem controle de ph, o que demonstra que o consumo de glicose pelo microrganismo

140 138 foi afetado nestes meios. O controle do ph de fermentação favoreceu o consumo desta hexose, principalmente a partir do hidrolisado suplementado, proporcionando, como conseqüência, uma maior formação de ácido láctico. Devido à maior formação deste ácido, a produtividade volumétrica (Q P ) neste meio foi a mais elevada dentre todos os meios avaliados, atingindo 0,59 g/l.h ao final da fermentação, mas com um pico de 0,82 g/l.h com 12 h de processo (A) (B) Glicose (g/l) Ácido láctico (g/l) Tempo de fermentação (h) Tempo de fermentação (h) Figura Efeito do controle de ph no consumo de glicose (A) e produção de ácido láctico (B) por Lactobacillus delbrueckii em meios: Hidrolisado não suplementado ( ) sem controle de ph e ( ) com controle de ph; Hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS ( ) sem controle de ph e ( ) com controle de ph; Meio MRS com a mesma concentração inicial de glicose do hidrolisado ( ) sem controle de ph e ( ) com controle de ph. Tabela Parâmetros fermentativos e concentração de glicose nos meios de fermentação para a produção de ácido láctico por Lactobacillus delbrueckii. Hidrolisado não suplementado Hidrolisado suplementado MRS Sem controle de ph Com controle de ph Sem controle de ph Com controle de ph Sem controle de ph Com controle de ph Glicose inicial (g/l) 50,86 51,05 50,97 51,14 50,13 52,09 Glicose final (g/l) 41,23 38,00 37,84 15,58 40,02 28,58 Ácido láctico (g/l) 7,87 12,76 13,02 35,54 8,33 23,46 Y P/S (g/g) 0,82 0,98 0,99 0,99 0,82 0,99 Q P (g/l.h) 0,13 0,21 0,22 0,59 0,14 0,39 Y P/X (g/g) 8,94 16,57 8,57 17,95 6,31 18,62 Y P/S = fator de rendimento de ácido láctico por glicose consumida (g/g); Q P = produtividade volumétrica em ácido láctico (g/l.h); Y P/X = fator de rendimento de ácido láctico por célula (g/g).

141 139 Os valores de fator de rendimento em ácido láctico (Y P/S ) foram elevados ( 0,82 g/g) em todos os experimentos (Tabela 4.27), sugerindo que o microrganismo foi capaz de converter quase toda a glicose consumida em ácido láctico, independente do meio de fermentação utilizado. Os valores mais baixos foram observados nos meios sem controle de ph. Em hidrolisado suplementado, os valores de Y P/S obtidos foram similares em ambos os meios, com e sem o controle do ph de fermentação, embora a produção de ácido láctico tenha sido quase três vezes maior no meio onde o ph foi controlado. Isto significa que a produção de ácido láctico foi afetada no meio sem controle de ph porque o consumo de glicose pelo microrganismo foi prejudicado. Com relação à produção de ácido láctico por grama de célula, os valores de Y P/X mostram claramente que o controle de ph foi fundamental para que houvesse uma maior formação de produto por célula BRANQUEAMENTO DAS POLPAS DE CELULOSE OBTIDAS A PARTIR DO BAGAÇO DE MALTE Além de ser utilizada como matéria-prima para obtenção de glicose por hidrólise enzimática, a polpa de celulose obtida na condição otimizada de hidrólise alcalina foi também submetida a um processo de branqueamento para verificar sua possibilidade de emprego na produção de papel ou de derivados de celulose. Para comparação, uma polpa de celulose foi também produzida a partir do bagaço de malte original e submetida ao mesmo procedimento de branqueamento, visando avaliar o efeito do pré-tratamento ácido na qualidade da polpa branqueada Características das polpas obtidas A composição química das duas polpas de celulose utilizadas nestes experimentos está apresentada na Tabela Nota-se nesta tabela que as polpas apresentaram composições químicas diferentes em função dos tratamentos a que foram submetidas. De acordo com alguns autores, para se produzir papéis de alta qualidade é necessário promover uma elevada remoção da hemicelulose e da lignina do material (sem interferir na estrutura da celulose), pois a presença destas frações diminui a qualidade dos papéis, sendo que a lignina interfere ainda na etapa de fabricação (CHEN et al., 2001; GRACE; LEOPOLD;

142 140 MALCOLM, 1996). O processo de hidrólise alcalina utilizado no presente trabalho, foi capaz de remover seletivamente as frações de hemicelulose e lignina, a partir dos dois materiais utilizados. Quando aplicado ao material original, a remoção destas frações foi superior a 78% p/p enquanto que a celulose praticamente não foi atacada (remoção de 3,0% p/p). Como conseqüência, o teor de celulose neste material foi aumentado em 3,2 vezes após a polpação, atingindo 54,3% p/p. Quando o processo de hidrólise alcalina foi aplicado ao material prétratado, obteve-se um aumento similar no teor de celulose (2,7 vezes) devido também à elevada remoção de hemicelulose e de lignina (>94% p/p) e à baixa remoção de celulose ( 10% p/p). No entanto, como o material pré-tratado apresentava um teor de celulose (34% p/p) quase duas vezes maior do que o do bagaço de malte original (16,8% p/p), sua polpa também atingiu um teor de celulose aproximadamente duas vezes maior do que o da polpa do bagaço de malte original (Tabela 4.28). Tabela Rendimento e características das polpas de celulose obtidas por hidrólise alcalina do bagaço de malte nas formas original e pré-tratado com ácido sulfúrico diluído. Características Polpa do bagaço de malte original Não branqueada Branqueada Polpa do bagaço de malte pré-tratado Não branqueada Celulose (% p/p) 54,3 60,8 90,5 95,7 Hemicelulose (% p/p) 20,4 13,7 1,0 0 Lignina (% p/p) 14,4 12,6 8,1 3,4 Cinzas (% p/p) 3,1 1,4 0,4 0,3 Rendimento a (%) 30,1 78,8 33,5 88,9 Número kappa 48,4 40,2 27,9 11,2 Viscosidade (cp) 13,7 10,9 12,5 3,1 Alvura (%) 27,2 39,1 33,8 71,3 a calculado para cada processo individualmente. Branqueada Além da composição química, a Tabela 4.28 também apresenta outras características das polpas obtidas a partir do bagaço de malte original (BMO) e pré-tratado (BMP), incluindo o rendimento, número kappa, viscosidade e alvura. Nota-se que o rendimento da hidrólise alcalina foi similar para ambas as polpas (30,1% p/p e 33,5% p/p, para BMO e BMP, respectivamente). Porém, como o material pré-tratado havia sido recuperado com um rendimento de 48,6% p/p, a massa total de polpa obtida para cada 100 g de bagaço de malte original foi de apenas 16,3 g, ou seja, aproximadamente metade do rendimento da polpa

143 141 obtida por hidrólise alcalina do bagaço de malte original (30,1 g/100 g). Apesar do maior rendimento, a polpa de BMO apresentou uma qualidade inferior à da polpa de BMP, uma vez que seu número kappa foi mais elevado e sua alvura foi menor (Tabela 4.28). Um rendimento similar de polpa (27,9%) foi encontrado por Khristova, Kordsachia e Khider (2005) após a hidrólise alcalina das folhas de tamareira. Nesse caso, os autores atribuíram o baixo rendimento de polpação ao baixo teor de celulose (30,3% p/p) e aos elevados teores de lignina (31,2% p/p) e extrativos (21,2% p/p) presentes na matéria-prima. Considerando este fato, os baixos rendimentos obtidos para as polpas de bagaço de malte também são justificáveis, uma vez que os materiais submetidos à hidrólise alcalina também apresentavam baixo teor de celulose (16,8% p/p e 34% p/p para BMO e BMP, respectivamente), e elevado teor de lignina (27,8% p/p e 49,2% p/p para BMO e BMP, respectivamente) Branqueamento das polpas de celulose do bagaço de malte A etapa de branqueamento modificou as características de ambas as polpas, porém a diferença entre elas foi notável (Tabela 4.28), demonstrando que o tratamento do material com ácido diluído prévio ao processo de polpação interferiu nas características das polpas produzidas. O teor de lignina e a viscosidade da polpa de BMP branqueada foram menores do que os da polpa de BMO branqueada, enquanto que o teor de celulose e a alvura foram maiores. O número kappa (um indicador do conteúdo de lignina na amostra) da polpa de BMP branqueada foi baixo ( 11,0), indicando que a maior parte da lignina presente nesta polpa foi removida utilizando esta seqüência de branqueamento livre de cloro. Por outro lado, a polpa de BMO branqueada apresentou um número kappa elevado, aproximadamente 4 vezes maior do que o da polpa de BMP (Tabela 4.28). Provavelmente a presença de extrativos nesta polpa afetou negativamente o processo de branqueamento. Essa fração é composta por resinas, ceras, gorduras gomas, amidos, taninos, óleos essenciais entre outros constituintes (KUHAD; SINGH, 1993) e de acordo com Fengel e Wegener (1989) ela deve ser removida antes da separação da lignina para evitar a formação de produtos de condensação com a lignina, durante o processo de polpação. Tais produtos de condensação diminuem a solubilidade da lignina residual interferindo na posterior remoção dessa fração (ARGYROPOULOS et al., 2001). De fato, foi observada a formação de uma espécie de cola durante a hidrólise alcalina do BMO, a qual proporcionou uma forte união entre as fibras de celulose (Figura

144 B). O branqueamento dessa polpa não foi eficiente, pois as fibras permaneceram fortemente unidas entre si (Figura 4.21C) e a polpa branqueada apresentou uma cor amarela (Figura 4.22C) devido ao elevado teor de lignina presente (12,6% p/p), correspondendo a uma alvura de apenas 39,1%. Os resultados obtidos no branqueamento da polpa de BMP foram melhores do que os da polpa de BMO, provavelmente devido à ausência de extrativos nesta polpa e à elevada remoção de hemicelulose ocorrida durante o pré-tratamento ácido. Como conseqüência, o material tornou-se mais susceptível ao ataque alcalino e a degradação de lignina ocorreu de forma mais eficiente, liberando as fibras de celulose, conforme pode ser observado na Figura 4.21E. Além disso, a polpa de celulose foi branqueada mais facilmente atingindo uma alvura de 71,3% (Figura 4.22F). Uma alvura de 71,3% é um bom valor considerando a simplicidade do processo de branqueamento empregado e o uso de uma seqüência livre de cloro. Tanaka et al. (2004) produziram uma polpa a partir de resíduos de dendezeiro, com alvura de 73-74% após o branqueamento com uma seqüência realizada em quatro etapas, utilizando O 2, ácido, O 3 e H 2 O 2. Tutus (2004) obteve uma alvura de 68,34% em uma polpa de palha de arroz utilizando um procedimento de branqueamento de apenas uma etapa, empregando H 2 O 2 em mistura com uma solução de NaOH 2,25% p/v, concentração quase 10 vezes maior do que a utilizada no presente trabalho (0,28% p/v). A viscosidade da polpa de BMP foi fortemente reduzida após o branqueamento (de 12,5 para 3,1 cp, Tabela 4.28), indicando que o grau de polimerização da celulose foi diminuído, uma vez que a perda de viscosidade ocorre devido à clivagem aleatória das ligações glicosídicas dessa cadeia polissacarídica (VU; PAKKANEN; ALÉN, 2004). De fato, Abrantes et al. (2007) relataram que, embora o peróxido de hidrogênio seja um eficiente agente de branqueamento, ele realmente apresenta pouca seletividade, o que reflete em grandes perdas de viscosidade. Como a degradação da celulose pelo uso de peróxido ocorre devido à decomposição deste agente químico, uma possibilidade para minimizar esse problema seria utilizar sulfato de magnésio juntamente com o H 2 O 2, pois este sal reduz a velocidade de decomposição do peróxido e desta forma, poderia impedir as reações de degradação dos carboidratos (LAPIERRE; BERRY; BOUCHARD, 2003).

145 143 A D B E C F Figura Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das amostras de bagaço de malte original (A), polpa do bagaço original não branqueada (B), polpa do bagaço original branqueada (C); bagaço de malte pré-tratado (D), polpa do bagaço pré-tratado não branqueada (E), polpa do bagaço pré-tratado branqueada (F). Ampliação: 300 vezes.

146 144 A D B E C F Figura Aparência das amostras de bagaço de malte original (A), polpa do bagaço original não branqueada (B), polpa do bagaço original branqueada (C); bagaço de malte pré-tratado (D), polpa do bagaço pré-tratado não branqueada (E), polpa do bagaço pré-tratado branqueada (F). Durante o branqueamento da polpa de BMO também foi observada uma perda da viscosidade, mas em menor extensão, diminuindo de 13,7 para 10,9 cp (Tabela 4.28). Isso provavelmente ocorreu devido à resistência proporcionada pela cola formada pelos produtos de condensação com a lignina, a qual teria impedido o ataque do agente de branqueamento. Por este motivo, o grau de polimerização da celulose foi preservado, mas os teores de lignina e hemicelulose também foram pouco reduzidos, o que levou à geração de uma polpa com menor qualidade do que aquela obtida a partir de BMP.

147 145 Estes resultados sugerem, portanto, que apenas a polpa de celulose obtida a partir do bagaço de malte pré-tratado apresenta potencial para aplicação em processos industriais, podendo ser utilizada, por exemplo, para a produção de derivados de celulose, tais como viscose, acetato de celulose e celofane. Isto porque, de acordo com Caraschi, Filho e Curvelo (1996), polpas branqueadas de baixo rendimento (30 a 35%), com um alto conteúdo de celulose pura (>85%) e baixo conteúdo de poliose (1 a 10%) e lignina (<0,05%) são adequadas para esta finalidade. Por outro lado, a realização de alguns testes adicionais de resistência à tração, resistência ao rasgo, entre outros, seria útil para verificar a possibilidade de emprego desta polpa na produção de papéis RECUPERAÇÃO DA LIGNINA A PARTIR DO LICAR ALCALINO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO DE CARVÃO ATIVADO Influência do ph na precipitação da lignina a partir do licor alcalino No processo de hidrólise alcalina, realizado nas condições otimizadas para produção de polpa de celulose a partir do bagaço de malte pré-tratado, 95,3% p/p da lignina presente no material foi removida e solubilizada no licor, correspondendo a uma concentração de 12,44 g/l. De acordo com Fengel e Wegener (1989) a lignina é altamente solúvel em meio alcalino, mas sua solubilidade diminui na medida em que o ph é reduzido. No entanto, como a natureza da lignina varia para cada espécie de planta (HON, 1996), o perfil da sua precipitação com a redução do ph também pode variar de acordo com a matéria-prima utilizada. No presente trabalho, a adição de ácido sulfúrico para redução do ph do licor, causou a precipitação da lignina solubilizada, de forma que, quanto menor o ph, maior a massa de lignina recuperada (Tabela 4.29). É interessante observar que a queda de ph até o valor de 7,71 (amostra 4) praticamente não influenciou na precipitação da lignina, que foi removida a partir do licor em apenas 0,32% (Tabela 4.29). No entanto, a redução do ph para um valor próximo de 6 já passou a influenciar na precipitação desta fração, aumentando a remoção para 15,67%. Este valor foi aumentado em 4,4 vezes quando o ph foi reduzido de 5,98 para 4,3. A Figura 4.23 mostra claramente que o maior aumento na massa de lignina precipitada ocorreu na faixa de ph entre 7,71 e 4,3, atingindo um valor de remoção de 68,49%. Para valores de ph menores que 4,3,

148 146 foi observado um acréscimo de 13% na massa de lignina removida, porém, este incremento na remoção foi cerca de 5 vezes menor quando comparado ao aumento observado na faixa de ph entre 7,71 e 4,3. Tabela Volume de ácido sulfúrico adicionado nas amostras do licor alcalino de bagaço de malte, caracterização do licor obtido e quantificação da massa de lignina precipitada. Amostra V H2SO4 98% (ml) ph Lignina solúvel (g/l) Remoção de lignina (%) 1 original - 12,56 12,44-0, ,14 10,61 12,42 0,16 0, ,16 9,90 12,40 0,32 0, ,18 7,71 12,40 0,32 0, ,20 5,98 10,49 15,67 0, ,22 4,30 3,92 68,49 0, ,24 3,23 2,63 78,86 0, ,26 2,62 2,45 80,30 0, ,28 2,48 2,33 81,27 0, ,30 2,15 2,31 81,43 0,3208 Massa precipitada (g) 0,35 0,30 massa precipitada remoção de lignina Massa precipitada (g) 0, , , , ,05 0 0, ph Remoção de lignina (%) Figura Massa precipitada e remoção de lignina em função da redução do ph do licor alcalino de bagaço de malte.

149 147 No mais baixo valor de ph avaliado (2,15), 81,43% da lignina solubilizada no licor foi recuperada (Tabela 4.29). Um rendimento similar de recuperação de lignina (87,8%) foi obtido por Santos e Curvelo (2001) quando reduziram de 13,6 para 3,0, o ph do licor alcalino de madeira de eucalipto. No entanto, este valor de remoção é 10% superior ao obtido no presente trabalho para o valor de ph de 3,23 (78,86% de recuperação). De acordo com Rohella et al. (1996), a composição da lignina solubilizada varia de uma biomassa para outra e também com o processo de polpação utilizado. Isto explicaria as diferenças observadas entre os resultados do presente trabalho e aqueles obtidos por Santos e Curvelo (2001), uma vez que além de terem sido utilizadas matérias-primas diferentes, o licor alcalino de bagaço de malte foi obtido por polpação soda (hidrólise alcalina) enquanto que o licor obtido por estes autores foi obtido pelo processo de polpação Kraft. Segundo Villar, Caperos e García-Ochoa (2001), o emprego de ácidos para precipitação da lignina é o método mais utilizado para recuperar a lignina Kraft a partir do licor de polpação, sendo capaz de proporcionar 100% de recuperação quando o ph é reduzido para uma faixa de valores entre 2,0 e 3,0. No presente trabalho, a lignina solubilizada no licor obtido por polpação soda do bagaço de malte não foi totalmente recuperada quando o ph foi acidificado até 2,15, confirmando que realmente o processo de polpação utilizado pode influenciar na posterior recuperação da lignina a partir do licor. Embora a lignina não tenha sido totalmente recuperada, o valor de remoção obtido em ph 2,15 (81,43%) foi elevado e pode ser comparado com outros já descritos na literatura. Por exemplo, Sun, Tomkinson e Bolton (1999) utilizaram H 3 PO 4 (9,68 N) para reduzir o ph do licor alcalino obtido a partir do bagaço de dendê. Neste processo eles observaram que com a redução do ph de 13,8 para 2,0 foi possível recuperar 1 g de lignina para cada 100 ml de licor acidificado. Entretanto, além de lignina o precipitado continha produtos provenientes da degradação de polissacarídeos uma vez que o material submetido à polpação não havia sido pré-tratado. No presente trabalho, o rendimento de massa recuperada em ph 2,15 foi de 1,6 g/100 ml de licor acidificado, e esta massa foi composta basicamente pela lignina, pois a fração hemicelulósica do material já havia sido quase totalmente solubilizada durante o prétratamento ácido e a celulose praticamente não foi atacada durante o processo de hidrólise alcalina. Considerando estes fatos, a massa de lignina recuperada no presente trabalho foi quase duas vezes maior do que a obtida por Sun, Tomkinson e Bolton (1999), o que é justificável dado que o bagaço de malte contém 27,8% p/p de lignina enquanto que o bagaço de dendê contém apenas 14,2% p/p. Portanto, estes resultados sugerem que a eficiência de

150 148 recuperação da lignina solubilizada no licor alcalino foi similar quando se utilizou ácido sulfúrico concentrado (presente trabalho) ou ácido fosfórico 9,68 N (SUN; TOMKINSON; BOLTON, 1999). Como conseqüência da remoção da lignina, observou-se uma forte alteração na cor do licor. Nota-se na Figura 4.24 que o licor na sua forma original (1) apresentava uma cor marrom escura e à medida que o ph foi reduzido, sua cor passou a se tornar mais clara, de forma que no mais baixo valor de ph avaliado (2,15 amostra 10), o licor apresentou uma cor amarela clara. Segundo Fengel e Wegener (1989), a cor escura do licor alcalino é proveniente dos grupos funcionais cromóforos (quinonas, fenólicos, entre outros) gerados a partir da degradação da lignina, os quais são solúveis em meio alcalino, mas não em meio ácido. Figura Efeito da redução do ph (de 12,56 - amostra 1, para 2,15 - amostra 10) na cor do licor alcalino de bagaço de malte. Nota-se também na Figura 4.24 que apesar de na amostra 5 (ph 5,98) já ter ocorrido uma remoção de 15,67% da lignina, a cor do licor ainda não tinha sido alterada, sendo tão escura quanto na amostra original (amostra 1). Provavelmente, os compostos que conferem cor ao licor ainda não tinham sido precipitados nesta faixa ph (entre 12,56 e 5,98). Na amostra 6 (ph 4,30), 68,49% da lignina foi precipitada, causando alteração na cor do licor. A queda do ph de 4,3 para 3,23 (amostra 7) também influenciou na cor do licor, que se tornou amarela e pouco se alterou com a posterior redução do ph para 2,15 (amostra 10). Estes resultados sugerem, portanto, que os grupos cromóforos que conferem cor ao licor alcalino, foram removidos principalmente na faixa de ph entre 5,98 (amostra 5) e 3,23 (amostra 7).