NANOBIOCOMPÓSITOS DE FILMES AUTOMONTADOS DE COLÁGENO HIDROLISADO COM NANOWHISKERS DE CELULOSE

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1 NANOBIOCOMPÓSITOS DE FILMES AUTOMONTADOS DE COLÁGENO HIDROLISADO COM NANOWHISKERS DE CELULOSE Patrícia S. O. Patricio 1, Marcos P. M. Ferreira 2, Luiz C. A. Oliveira 3, Fabiano V. Pereira 4* 1 Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais CEFETMG Belo Horizonte MG 2 Sesi Benjamim Guimarães- FIEMG - Contagem- MG 3 Universidade Federal de Lavras- UFLA- Lavras- MG 4 Universidade Federal Minas Gerais - UFMG, Belo Horizonte MG fabianovp@ufmg.br Os nanowhiskers de celulose (CNWs) representam uma alternativa viável à preparação de novos nanocompósitos com uso de nanocargas que garantam que o material final seja totalmente biodegradável. Nesse trabalho, nanobiocompósitos formados por colágeno proveniente da extração de resíduos da indústria de couro e CNWs obtidos de eucalipto foram obtidos através da técnica de filmes automontados. Duas diferentes metodologias foram testadas, com e sem secagem dos filmes após a adsorção de cada camada. A técnica de espectroscopia de UV-vis possibilitou um acompanhamento da formação das camadas e os resultados indicam a evolução do crescimento do filme compósito determinado através do aumento do valor da absorbância na região de UV associada a adsorção do colágeno hidrolisado. Imagens da seção transversal dos filmes obtidos por MEV revelaram a presença das camadas construídas através da técnica enquanto que a imagem da superfície revelou uma distribuição homogênea e altamente densa de CNWs. Palavras-chave: nanocompósitos, nanowhiskers de celulose, filmes automontados, colágeno hidrolisado Layer-by-layer assembly of cellulose nanowhiskers and hydrolyzed collagen Cellulose nanowhiskers (CNWs) are promising as a new class of reinforcing material for the preparation of totally biodegradable nanocomposites. We report here the preparation of CNWs multilayer composites with collagen from the residue of the leather industry using layer-by-layer (LBL) technique. Two different methodologies have been used to build up LBL structures on solid substrates: using only rinsing after each dipping in the solutions or using a drying step after every rinsing step. The UV-Vis spectroscopy showed the evolution of the growing composite through the observation of the UV absorbance characteristics of the hydrolyzed collagen. Cross section images of the films obtained using SEM technique revealed a well defined layered architecture whereas the image surface revealed a high density and homogeneous distribution of the CNWs. Keywords: nanocomposites, cellulose nanowhiskers, layer-by-layer, hydrolyzed collagen Introdução A preparação de nanocompósitos poliméricos de alto desempenho tem recebido grande atenção nos últimos anos, tanto do ponto de vista de suas possíveis aplicações industriais como na pesquisa fundamental. Nesse sentido a preparação e o uso de nanoreforços tais como nanotubos de carbono (CNTs) ou argilas naturais destacam-se entre os materiais mais utilizados para dispersão em diferentes matrizes poliméricas, principalmente devido às suas excelentes propriedades mecânicas e propriedades de barreira. No entanto, a busca pela formulação de compósitos ecologicamente viáveis tem apresentado os nanocristais ou nanowhiskers de celulose (CNWs) como uma alternativa viável à preparação de novos nanocompósitos poliméricos. 1, 2 Os CNWs agem como elementos de reforço e formam a estrutura básica de tecidos vegetais, constituindo-se de partículas na forma de bastão, com alto grau de cristalinidade e alta área específica, podendo ser obtidos a partir de diferentes fontes de fibras naturais como algodão, bambu, madeira e de alguns

2 animais marinhos 3, 4 As propriedades de cristalinidade e dimensões destes cristalitos dependem da origem das fibras de celulose assim como dos detalhes do método de preparação. 3 Para os nanowhiskers de algodão, por exemplo, a microscopia eletrônica descreve dimensões em torno de 10 nm em diâmetro e 300 nm em comprimento enquanto que para os nanowhiskers de tunicados os valores obtidos são de 15 nm no diâmetro e chegando até 2 µm em comprimento. 5, 6 Entre as vantagens para a utilização de CNWs pode-se salientar a sua baixa densidade, seu caráter renovável, a biodegradabilidade e a sua disponibilidade, o que resulta em baixo custo relativo à nanofibras sintéticas, além da sua boa propriedade mecânica. O modo elástico teórico de nanowhiskers de celulose é de 167,5 GPa. 7 Eles podem substituir os nanotubos de carbono como materiais de reforço em muitas aplicações, devido ao seu pequeno tamanho, alta razão de aspecto e extraordinária tensão (podendo aumentar em um fator de 3000 vezes a tensão na ruptura de termoplásticos), sendo considerado uma escolha lógica para o reforço desses materiais. O colágeno por sua vez é a proteína estrutural do tecido conectivo mais abundante nos organismos animais, tendo como principal função proteger os organismos dos agentes externos. Encontra-se no estado sólido e possui uma estrutura fibrosa, sendo insolúvel em água. Os estudos envolvendo o colágeno na área de biopolímeros tornaram-se crescente devido às possibilidades de uso na área biomédica. 8 O colágeno hidrolisado é quimicamente modificado e tem sido investigado como componente de blendas poliméricas, compósitos e complexos interpoliméricos. 9 No que diz respeito a preparação de compósitos de filmes finos, a técnica de fabricação de filmes layer-by-layer (LBL), também chamados de filmes automontados tem sido mencionada como uma das mais promissoras 10 para imobilização de CNWs na matriz, através de um crescimento do filme de forma controlada no nível nanométrico. A técnica consiste de um simples e versátil método de crescimento de filmes multicamadas, através de adsorção seqüencial de compostos de carga oposta sobre um substrato. Utilizando-se dessa metodologia pode-se atingir altos níveis de carga de reforço e com a máxima dispersão dos nanocristais de celulose na matriz, o que é um parâmetro fundamental para a melhoria de propriedades mecânicas. Nesse trabalho foram preparados nanobiocompósitos através da técnica de LBL contendo colágeno hidrolisado e CNWs. Modificações durante a preparação dos nanocompósitos foram realizadas visando estabelecer o método mais viável para o desenvolvimento dos materiais. O acompanhamento do crescimento das camadas do filme foi realizado através de medidas de espectroscopia de absorção no ultravioleta-visível (UV-Vis) e os filmes assim obtidos foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV).

3 Experimental Preparação e caracterização dos materiais de partida Uma dispersão de nanowhiskers de celulose foi obtida a partir de hidrólise ácida de polpa de celulose de eucalipto (gentilmente cedida pelo Laboratório de Celulose e Papel, UFV, MG). Seguindo uma adaptação de metodologia descrita na literatura, 11 1,0 g de polpa de celulose purificada foi adicionada à 8 ml de solução de ácido sulfúrico 64% (em massa) à 45 C. A hidrólise ácida então ocorreu durante 25 minutos, com temperatura controlada e agitação mecânica constante. Imediatamente após a hidrólise a reação foi diluída 10 vezes em água Milli-Q e as suspensões foram então centrifugadas, lavadas uma vez com água e re-centrifugadas. Uma diálise da suspensão obtida foi realizada durante seis dias até que o ph permanecesse constante, em torno de ph=5,5. Finalmente, uma dispersão dos CNWs foi obtida através de sonicação por 5 minutos do material obtido após a diálise. O material final foi filtrado em filtro de porosidade de 25 µm. A presença de CNWs dispersos pôde ser identificada primeiramente através da birrefringência apresentada pela dispersão aquosa. O tamanho, forma e dispersão apresentada pelos CNWs foram caracterizados através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM). O colágeno proveniente da extração de resíduos da indústria de couro foi purificado e posteriormente hidrolisado em solução 1 M de ácido acético. O polímero obtido foi caracterizado por espectroscopia de absorção no infravermelho, análise térmica e absorção atômica. Preparação e Caracterização dos compósitos Lâminas de vidro de microscopia usadas para o crescimento dos filmes por LBL foram previamente lavadas em solução piranha (3:1 H 2 SO 4 :H 2 O 2 ) por 1 h, seguido de lavagem com água destilada. Lâminas de quartzo para medidas na região do UV foram tratadas como soluções de NH 4 OH/H 2 O 2 /H 2 O (1:1:5) e HCl/H 2 O 2 /H 2 O (1:1:6) por 10 minutos à 80 C. As lâminas assim tratadas foram então seqüencialmente imersas nas soluções de colágeno e CNWs seguindo dois procedimentos distintos: Método 1: Imersão da lâmina de vidro em solução 1% m/v de colágeno durante 15 min seguido de lavagem em água destilada, e secagem. Em seguida, o substrato contendo o polímero foi introduzido em solução 1%m/v de whiskers seguindo a mesma seqüência de lavagens descrita para o colágeno. O compósito foi denominado BC1. Método 2: A lâmina de vidro ou quartzo foi imersa em solução 1% m/v de colágeno durante 15 min e lavada por tempo determinado em três béqueres distintos contendo água destilada. Posteriormente o substrato contendo o polímero foi imerso na solução de 1%m/v de CNWs seguindo o mesmo procedimento descrito para o colágeno. A sigla usada para especificar esse material foi BC2.

4 Os ciclos (através do método 1 ou 2) foram então repetidos até 10 ou 25 vezes para o propósito do presente estudo, embora a deposição possa ser repetida indefinidamente. A morfologia dos materiais obtidos foi investigada por microscopia eletrônica de varredura- MEV, em um aparelho da marca JEOL Modelo JMS 6360 LV, para as imagens de fratura dos filmes e em um MEV com canhão de emissão por efeito de campo, Quanta FEG - FEI, para a investigação das superfícies dos filmes. Os filmes foram recobertos com uma fina camada de 2 nm de ouro e para a obtenção das micrografias da seção transversal as amostras depositadas sobre vidro foram criofraturadas. As medidas de UV-Vis foram realizadas para acompanhamento do crescimento do filme depositado sobre quartzo utilizando um equipamento SHIMADZU UV2550. Resultados e Discussão O espectro de infravermelho obtido para o colágeno purificado e hidrolisado apresentou as principais bandas características do polímero, referente ao estiramento de C=O (próximo a 1730 cm -1 ), N-H e O-H ( cm -1 ). A absorção atômica indicou a presença de cromo próximo a 3ppm. A Figura 1 mostra uma micrografia eletrônica (MET) dos nanowhiskers obtidos de polpa de eucalipto. O comprimento médio dos mesmos situa-se na faixa entre nm e diâmetro de 6-10 nm. Figura 1: Imagem de microscopia eletrônica de transmissão obtida a partir de uma suspensão diluída de CNWs de eucalipto. A barra de escala na imagem é de 200 nm. Para monitorar o crescimento das camadas foi usada uma lâmina de quartzo para a produção dos filmes e os espectros de UV-vis foram coletados com diferentes números de bicamadas. O filme depositado sobre quartzo foi realizado seguindo o método BC2. A Figura 2 indica a evolução do crescimento do filme compósito determinado através de um aumento no valor da absorbância na

5 região de UV (banda próxima a 300 nm associada a absorção do colágeno hidrolisado). O número de bicamadas é indicado na figura. 18 BC 15 BC 12 BC 06 BC 03 BC λ/nm Figura 2: Evolução do crescimento do filme LBL usando espectroscopia UV-Vis. A obtenção dos filmes automontados envolvendo colágeno hidrolisado e CNWs foi possível devido às interações eletrostáticas existente entre esses dois materiais. Os centros positivos estão situados nos grupos amino (-NH + 3 ) presentes na estrutura do colágeno em solução aquosa ácida enquanto que as cargas opostas situam-se nas superfícies dos nanocristais de celulose. Medidas de potencial zeta das dispersões aquosas dos CNWs mostraram valores de - 35 mv, evidenciando a carga líquida negativa na superfície dos whiskers e indicando a formação de uma solução estável. A origem dessas cargas negativas se dá na conversão parcial dos grupos hidroxila da celulose para sulfato no momento da reação de hidrólise ácida com ácido sulfúrico para a formação dos CNWs. Essas cargas também desempenham o papel fundamental de estabilizar, por repulsão, os CNWs em solução aquosa. Pequenos desvios no comportamento esperado para os valores de absorbância com o número de bicamadas na Figura 2 (particularmente entre 12 e 15 bicamadas) pode estar relacionado com imperfeições no crescimento do filme ou a quantidade de polímero depositado não é a mesma para todas as bicamadas. Nesse caso, uma hipótese a ser levada em conta é que a densidade de carga positiva no colágeno hidrolisado pode não ter sido suficiente para um crescimento homogêneo do filme visto que o crescimento do nanocompósito se dá por interações eletrostáticas. Parâmetros como ph da solução de colágeno, tempo de lavagem e de imersão nas soluções podem ser modificados para se atingir uma maior homogeneidade no crescimento do filme e como conseqüência, uma maior linearidade entre o número de bicamadas depositadas e a absorbância medida nos filmes automontados. A morfologia da superfície do filme contendo 18 bicamadas e preparado segundo o método BC2 (filme depositado sobre lâmina de quartzo) é mostrada na Figura 3. Seguindo o procedimento de construção dos filmes LBL, a cobertura externa de cada bicamada é formada por CNWs, sendo

6 que esses encontram-se interagindo fortemente com a camada anteriormente depositada de colágeno. As imagens mostram uma cobertura uniforme e altamente densa de CNWs depositados sobre o polímero. a) b) Figura 3: Imagens de MEV da superfície do filme contendo 18 bicamadas em duas diferentes magnificações: (a) e (b) X A Figura 4 mostra a seção transversal dos materiais obtidos a partir das fraturas dos filmes. A investigação das imagens de fratura indicou a formação das bicamadas mostradas pelas ranhuras de colorações levemente diferentes. A amostra BC2 possui uma morfologia mais rugosa com um aspecto menos homogêneo em comparação a amostra BC1. a) b) Figura 4 - Imagens de MEV da fratura dos filmes automontados contendo 30 bicamadas: a)bc1 e b)bc2. Conclusões Nanobiocompósitos formados por colágeno proveniente da extração de resíduos da indústria de couro e nanowhiskers de celulose de eucalipto foram obtidos através da técnica de filmes automontados. A técnica de espectroscopia de UV-vis possibilitou o acompanhamento da formação Anais do 10o Congresso Brasileiro de Polímeros Foz do Iguaçu, PR Outubro/2009

7 das camadas através do aumento da intensidade da absorbância da banda característica do colágeno. Os resultados obtidos por MEV para as amostras dos nanobiocompósitos revelaram a presença das camadas mostradas pelas ranhuras com coloração diferenciada visualizadas nas imagens. Também foi possível verificar que o método de preparação influenciou no modo de fratura dos materiais. Para os filmes obtidos no processo que envolveu a secagem a fratura apresentou um aspecto menos rugoso, sugerindo um crescimento mais homogêneo dos filmes pelo método BC1. Um estudo a respeito da dependência da morfologia das superfícies dos filmes com relação aos diferentes métodos utilizados bem como um aperfeiçoamento da homogeneidade no crescimento dos filmes ainda está sob investigação. Esse trabalho representa resultados iniciais no sentido de gerar uma nova classe de materiais multicamadas formados por polímero biodegradável e CNWs como elementos de reforço e que são adicionados de forma controlada e organizada na formação do nanobiocompósito. Biopolímeros preparados a partir de colágeno hidrolisado com boas propriedades mecânicas podem encontrar 12, 13 aplicações biomédicas em engenharia de tecidos tais como próteses arteriais e pele artificial. Finalmente, a morfologia encontrada para a distribuição dos CNWs nos filmes, formando uma rede altamente densa e uniforme de bastões rígidos de celulose é promissora para o desenvolvimento de materiais de alto desempenho, podendo a metodologia ser estendida para aplicações em diferentes polímeros para a fabricação de novos nanobiocompósitos. Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório de Celulose e Papel (UFV) pela polpa de celulose e ao Centro de Microscopia da UFMG pelas imagens. Referências Bibliográficas 1. K. Oksman; A. P. Mathew ; D. Bondeson; I. Kvien Comp. Sc. and Tech. 2006, 66, L. Petersson ; K. Oksman Comp. Sc. and Tech. 2006, 66, M.M.S., Lima; J.T. Wong; M. Paillet; R. Borsali; R. Pecora Langmuir 2003, 19, Y. Wang; X. Cao; L. Zhan Macr. Biosc. 2006, 6, V. Favier ; G.R. Canova ; A. Drufesne; C. Gauthier Polym. AdV. Technol. 1995, 6, A. Dufresne; M. B. Kellerharls Macromolecules 1999, 32, K. Tashiro; M. Kobayashi Polymer 1991, 32, M. C. Dascalu; C. Vasile; C. Silvestre; M. Pascu Polymer Journal 2005, 41, A. Sionkowska, European Polymer Journal 2003, 39, P. Podsiadlo ; B. Shim ; J. Lee; M. Cuddihy; N. A. Kotov; Biomacromolecules 2005, 6, S. Beck-Candanedo; M. Roman, D.G. Gray BioMacromolecules 2005, 6, A. Sionkowska Polymer Degradation and Stability 2006, 91, K. Matsumoto ; T. Nakamura; Y. Shimizu; Y. Yamamoto et. al. Asaio Journal 1999, 45, 288.