Aplicação do bipls na previsão da atividade lipase de agentes da cromoblastomicose através de espectroscopia no infravermelho

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1 Aplicação do bipls na previsão da atividade lipase de agentes da cromoblastomicose através de espectroscopia no infravermelho Viviane Müller (UNISC) Marco Flôres Ferrão (UNISC) João Carlos Furtado (UNISC) Juliana Mônica da Costa (UFRGS) Valeriano Antonio Corbellini (UNISC) Maria Lúcia Scroferneker (UFRGS) Resumo A utilização das técnicas de reflexão no infravermelho, em particular a espectroscopia por refletância difusa no infravermelho com transformada de Fourier (DRIFTS), tem possibilitado o desenvolvimento de metodologias rápidas e não destrutivas de análise de microorganismos, facilitando desta forma o diagnóstico clínico. Neste sentido, no presente trabalho foi aplicada a calibração multivariada através do algoritmo bipls, para gerar um modelo otimizado para a previsão da atividade lipase de onze agentes de cromoblastomicose cultivados em meio líquido, empregando-se os espectros DRIFTS. Os resultados obtidos foram comparados com o modelo global, aplicando-se o algoritmo PLS, e com o modelo gerado pelo algoritmo de otimização ipls. O melhor modelo de previsão da atividade lipase foi obtido empregando-se o algoritmo bipls, com as regiões do espectro de cm -1 e cm -1 combinadas, apresentando RMSECV de 0,0137 e coeficiente de correlação de 0,8619. Palavras-chave: Otimização, bipls, Atividade lipase.. 1. Introdução A cromoblastomicose, cromomicose ou dermatite verrucosa, é uma micose subcutânea de aspecto polimórfico, acometendo a pele e o tecido celular subcutâneo. Caracteriza-se pelo surgimento de lesão pápulo-descamativa, que evolui lenta e progressivamente para lesões cutâneas variadas, com sintomatologia discreta e a presença de células escleróticas ou muriformes no exame microscópico do pus ou tecidos. O seu principal agente é a Fonsecaea pedrosoi. A doença é também causada por F. compacta, Cladosporium carrionii, Rhinocladiella aquaspersa e Phialophora verrucosa (MATTE et al, 1997). Mais recentemente têm sido relatados casos por Exophiala jeanselmei e Wangliella dermatitidis. Os agentes são encontrados na natureza, e isolados do solo, ar e vegetais. A penetração do fungo no organismo ocorre geralmente por implantação traumática de material orgânico contaminado pelos conídeos e micélio destes fungos. É doença de distribuição cosmopolita, com maior incidência nas regiões tropicais e subtropicais de clima quente e úmido da América Latina, África e Ásia. No Brasil, o Rio Grande do Sul, São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, e estados da região Amazônica são áreas endêmicas (MATTE et al, 1997). Estudos bioquímicos e imunológicos com Fonsecaea pedrosoi têm mostrado que a virulência e a patogenicidade destes fungos estão relacionados com a produção de melanina, fatores lipídicos, adesão, parede celular conídios e corpos escleróticos que controlam a transição morfológica de células vegetativas para células parasitárias, a persistência no tecido subcutâneo e a resposta inflamatória no hospedeiro (FARBIARZ, 1992; ROZENTAL et al, 1994; LIMONGI et al, 1997; LIMONGI et al., 2000; KNEIPP et al., 2003). 1

2 Interessados em desenvolver uma metodologia analítica capaz de estimar a atividade lipase de alguns agentes da cromoblastomicose, este artigo apresenta resultados referentes à aplicação da calibração multivariada empregando PLS, ipls e bipls para dados da impressão metabólica por DRIFT da biomassa obtida por cultivo em meio líquido. 2. Análise multivariada As técnicas quimiométricas para análise multivariada tornaram-se abordagens comuns para análise rápida de amostras complexas de suas assinaturas espectrais e tornam-se mais eficientes com a escolha de regiões espectrais, minimizando, com isso, os erros de previsão. Os benefícios em selecionar-se uma região espectral vão desde a estabilidade do modelo de calibração em relação à colinearidade, como também na interpretação das relações entre o modelo e a composição da amostra. Existem várias maneiras de selecionar a região espectral: critérios objetivos, como por exemplo, determinante da matriz de calibração e avaliação da raiz quadrada dos erros médios de previsão e algoritmos que indicam o conjunto espectral que poderá dar melhores resultados, sendo os mais utilizados: algoritmos genéticos e, atualmente, o método dos mínimos quadrados parciais (Partial Least-Squares PLS), método de intervalo dos mínimos quadrados parciais (Interval Partial Least-Squares ipls) e o método de intervalo inverso dos mínimos quadrados parciais (Backward Interval Partial Least-Squares bipls), utilizados neste artigo. No PLS a calibração multivariada é realizada utilizando a informação do espectro inteiro para construir um modelo da regressão, relacionado à propriedade de interesse. Por esta razão é chamado de método full-spectrum (BORIN e POPPI, 2005). Neste trabalho o PLS foi utilizado com o MATLAB, o qual integra computação matemática, visualização e linguagem eficiente em ambiente flexível para computação técnica. O alicerce do método dos mínimos quadrados parciais, reside na decomposição da matriz X, em termos da soma das várias matrizes M, que apresentem dimensionalidade um, e que são acrescidas de uma matriz de resíduos (que corresponde a parte não modelada de X), conforme a seguinte equação: X = M 1 + M M a + E onde a corresponde ao número de variáveis latentes (componentes principais ou fatores) selecionados para truncar a igualdade, e E corresponde a matriz de resíduos, relacionada ao número de variáveis latentes escolhido. As matrizes M constituem os chamados componentes principais (ou variáveis latentes), e são formadas pelo produto de dois vetores, t (os escores) e p (os pesos) conforme a expressão a seguir: X = t 1.p 1 t + t 2.p 2 t t v.p a t + E A dimensionalidade do espaço original é igual ao número de colunas em X, ou seja, o número de variáveis originais, expresso por m. No novo modelo, a dimensionalidade é descrita pelo número de matrizes M i necessárias para descrever X. Assim, se for possível descrever uma matriz X que tenha muitas variáveis, por um número pequeno dessas matrizes M i haverá um decréscimo na dimensionalidade, sem perda significativa de informação. Na modelagem por mínimos quadrados parciais, tanto a matriz das variáveis independentes X, como a das variáveis dependentes Y são representadas pelos escores e pelos pesos, conforme as expressões a seguir: 2

3 X = TP t + E Y = UQ t + F A relação entre as duas matrizes de dados X e Y pode ser obtida, correlacionando-se os escores de cada bloco, a fim de obter uma relação linear descrita na seguinte expressão: U = bt + e onde U é uma matriz contendo as propriedades (variáveis dependentes) de todas estas amostras; b é um vetor contendo os parâmetros do modelo; T é uma matriz de resposta (assim como um conjunto de espectros) para uma série de amostras de calibração e e é um vetor que representa o ruído do espectro e os erros do modelo (KONZEN et al, 2003). Por outro lado, a técnica ipls é uma extensão do PLS e divide o conjunto de dados em um número de intervalos, calcula o modelo PLS para cada intervalo e apresenta os resultados em um gráfico. O método é planejado para dar uma visão geral dos dados e pode ser útil na interpretação de quais sinais do espectro são mais representativos na construção de um bom modelo de calibração. Por fim, a otimização por bipls remove regiões espectrais sem relevância, na qual os modelos PLS são inicialmente calculados com cada um dos intervalos deixados de fora. Por exemplo, ao escolher-se 20 intervalos, cada modelo PLS é construído com 19 intervalos, deixando de fora um intervalo por vez. O primeiro intervalo eliminado será aquele que quando deixado de fora resulta no pior modelo, isto é, aquele que resulta no RMSECV (Root Mean Square Error of Cross Validation) mais alto. Esse procedimento é continuado até que haja um intervalo restante, conforme representado no pseudocódigo a seguir: Enquanto número de intervalos > 1 faça Fim enquanto Construir os modelos PLS deixando fora um intervalo por vez Verificar qual modelo PLS gera o maior RMSECV Eliminar o intervalo (número de intervalos 1) A definição do número de intervalos no bipls é uma tarefa muito importante pois, se o número de intervalos for demasiadamente pequeno, as regiões espectrais serão largas e, consequentemente, os efeitos de picos menores podem ser perdidos. Por outro lado, se o número de intervalos for muito grande, os resultados ficarão numa escala local e será preciso um tempo computacional maior. 3. Material e métodos 3.1 Amostras As amostras de agentes de cromoblastomicose utilizadas neste trabalho foram obtidas do Laboratório de Fungos Patogênicos do Departamento de Microbiologia ICBS UFRGS, mantidas em ágar Sabouraud a 25 o C e foram assim caracterizadas: Fonsecaea pedrosoi ATCC 46428, ATCC 46422, ATCC 43456, IMTSP 49, IQE (19), MA; Phialophora verrucosa FMC.2214 (8); Cladosporium carrionii IMTSP 680; Cladophialophora bantianum (13); Exophiala jeanselmei CROMO.HC8 (45); Rhinocladiela aquaspersa CROMO.HC1 (691) Avaliação da atividade lipase Uma alçada de cultura de cada amostra foi inoculada em meio líquido para produção de lipase 3

4 (g L -1 : bacto-peptona 10; cloreto de sódio 5; sulfato de magnésio hepta-hidratado 0,5; extrato de levedura 10; Tween 80 10; água 1 L). Após 4 dias de cultivo estático a 30 o C, a biomassa foi triturada em gral e pistilo estéreis, filtrada e em seguida esta suspensão foi padronizada a 550nm em 0,1 de absorbância (cerca de 10 7 células/ml). A partir desta diluição incubou-se 0,2mL de amostra em 20mL (1:100) de meio líquido específico para lipase a 30 o C, desta forma a concentração final do inoculo foi de 10 5 células/ml. As leituras foram realizadas aos 12 dias de cultivo. Para a determinação de biomassa, as amostras foram filtradas em papel filtro Whattman nº44 e o sobrenadante utilizado para a determinação de lipase. A biomassa foi lavada com 5mL de água destilada duas vezes e, após, colocada em estufa a 40 o C por aproximadamente 48 horas, após transferida para dessecador por mais 48 horas, ou até apresentar peso constante. Ensaio de atividade lipase: Preparou-se uma solução de Tween 80 5% em tampão fosfato de potássio 0,1 mol L -1 ph 7. Uma alíquota de 19mL desta solução e 1mL da amostra foram incubados em incubador orbital por 24 horas a 37 o C, sob agitação de rpm. O ensaio do controle foi realizado incubando-se 19mL da solução de Tween 80 5% nas mesmas condições da amostra, porém adicionando-se 1mL da amostra no momento da titulação. Amostras e controles negativos foram titulados com NaOH 0,05mol L -1 até ph 9,5. O volume da NaOH indica a quantidade de ácidos graxos liberados no meio em µmol min -1. A reação foi parada com banho de gelo a 0 o C e as amostras e bancos foram mantidas nestas condições até o momento da titulação. A biomassa desidratada foi triturada em brometo de potássio e analisada por Espectroscopia de Refletância Difusa no Infravermelho com Transformada de Fourier (DRIFTS) na faixa de 3800 a 600 cm -1 com 32 varreduras. Os espectros foram lidos em duplicata em absorbância para cada amostra, normalizados e processados por autoescalamento no software MATLAB, utilizando iplstoolbox (NORGAARD et al, 2000), via processamento de mínimos quadrados parciais por validação cruzada com exclusão de um espectro por vez. Os parâmetros estatísticos utilizados para avaliar os modelos obtidos foram, primeiramente o coeficiente de correlação de validação cruzada (r), o mais próximo de 1 possível, e o menor erro quadrático médio de validação cruzada (RMSECV). Todos os modelos construídos foram otimizados com a exclusão de 12 amostras. 4. Resultados e discussões A aplicação dos algoritmos PLS, ipls e bipls resultou em modelos diferenciados em relação ao RMSECV e ao coeficiente de correlação (r), conforme mostra a Tabela 1. Algoritmo Número de onda (cm -1 ) RMSECV (IU) r PLS ,020 0,6871 ipls ,024 0,4703 bipls ,013 0,8619 Tabela 1 Resultados dos modelos de regressão multivariada PLS, ipls e bipls para a previsão da atividade lipase de agentes de cromoblastomicose utilizados. A técnica PLS gerou um modelo de baixa qualidade, como apresentado nas Figuras 1 e 2. Quando todo o espectro é selecionado foi encontrado um erro quadrático médio de 0,020 e 0,6871 de coeficiente de correlação, para 13 variáveis latentes. 4

5 Figura 1 Região espectral (DRIFTS) utilizada para a modelagem PLS. Figura 2 Resultado do PLS: gráfico de correlação do modelo global para 13 variáveis latentes Em virtude do baixo desempenho para o PLS utilizando toda a faixa espectral, o espectro foi dividido em 20 subintervalos eqüidistantes para aplicação do ipls. Na Figura 3, as barras indicam o erro de previsão obtido por validação cruzada para cada intervalo selecionado e a linha pontilhada, o modelo global. A figura mostra que, para 13 variáveis latentes, o modelo global é melhor que qualquer um dos modelos locais. 5

6 Figura 3 - Erro quadrático médio de validação cruzada obtido por validação cruzada para cada intervalo O modelo obtido com a aplicação da técnica ipls (Figuras 4 e 5) apresentou qualidade inferior com erro padrão de 0,024 e coeficiente de correlação em 0,4703, para 4 variáveis latentes. Para o modelo ipls foi selecionado o intervalo 8 que corresponde à faixa espectral cm -1. Figura 4 Região espectral (DRIFTS) utilizada para a modelagem ipls. Figura 5 Resultado do ipls: gráfico de correlação para 8 o intervalo utilizando 4 variáveis latentes. 6

7 O melhor modelo de previsão da atividade lipase foi obtido com as regiões selecionadas de cm -1 e cm -1, com RMSECV de 0,0137 e coeficiente de determinação de 0,8619 (Figuras 6 e 7). Para este modelo foi utilizada a técnica bipls, com 13 variáveis latentes, considerando os mesmos 20 intervalos. As faixas espectrais selecionadas pelo bipls podem explicar algumas características observadas no metabolismo dos microorganismos empregados. Por exemplo, a região de cm -1 refere-se ao acúmulo de ácidos graxos e de RNA e DNA no interior das células, estando estes processos relacionados com a atividade lipase destes microrganismos (NAUMANN, 2000). Esta consideração também é reforçada pela seleção dos intervalos que correspondem às regiões de absorção de grupos carboxilato (~1400 cm -1 ) e banda de amida III, além da absorção de carboidratos e ésteres de ácidos carboxílicos e de fosfato ( cm -1 ). Por fim a seleção de intervalos que correspondem a região de absorção dos anéis aromáticos ( cm -1 ) indica a existência de correlação entre a atividade lipase e o acúmulo de melanina intracelular. Figura 6 Regiões espectrais (DRIFTS) utilizadas para a modelagem bipls. Conclusões Figura 7 Resultado do bipls: gráfico de correlação empregando 13 variáveis latentes. Este artigo aplicou os algoritmos de calibração multivariada PLS, ipls e bipls para dados da impressão metabólica obtidos por DRIFT da biomassa de agentes comuns da cromoblastomicose. Os resultados obtidos mostram a importância da escolha da região 7

8 espectral para a obtenção de modelos otimizados, bem como do algoritmo de calibração multivariada a ser empregado. A comparação dos três algoritmos mostrou que o bipls levou à obtenção de modelos mais robustos, ou seja, com menor erro quadrático médio de validação cruzada, demonstrando que o parâmetro a ser estimado, no caso a atividade lípase, é dependente de vários fatores do metabolismo. Do ponto de vista matemático, a combinação das diferentes faixas espectrais (intervalos) promoveu um efeito sinérgico, que pode ser observado através do aumento significativo do coeficiente de correlação, quando da utilização do bipls. Por fim, atingindo os objetivos propostos no início deste artigo, a atividade lipase dos agentes da cromoblastomicose pode ser estimada através dos espectros de refletância difusa no infravermelho com transformada de Fourier (DRIFTS), modelados através do algoritmo bipls, resultando numa metodologia rápida e limpa, uma vez que não utiliza reagentes químicos para a aquisição dos espectros e não destrói as amostras empregadas. 8

9 Referências BARTHUS, R.C.; MAZO, L.H. & POPPI, R.J. Determinação simultânea de NADH e ácido ascórbico usando voltametria de onda quadrada com eletrodo de carbono vítreo e calibração multivariada. Eclética Química, vol.30, n.4, São Paulo, BORIN, A. & POPPI, R.J. Application of mid infrared spectroscopy and ipls for the quantification of contaminants in lubricating oil. Vibrational Spectrocopy, n. 37, p , FARBIARZ, S.R.; CARVALHO, T.U. de; ALVIANO, C. & SOUZA, W.I. de. Effect of melanin on the interaction of Fonsecaea pedrosoi with mammalian cells in vitro. J. Med. Vet. Mycol., n.30, p , KONZEN, P.H.A.; FURTADO, J.C.; CARVALHO, C.W.; FERRÃO, M.F.; MOLZ, R.F.; BASSANI, I.A. & HÜNING, S.L. Otimização de métodos de controle de qualidade de fármacos usando algoritmos genéticos e busca tabu. Pesquisa Operacional, v. 23, n. 1, Rio de Janeiro, jan/abr, KNEIPP, L.F.; PALMEIRA, V.F.; PINHEIRO, A.A.S.; ALVIANO, C.S.; ROZENTAL, S.; TRAVASSOS, L.R. & MEYER-FERNANDES, J.R. Prosphatase activity on the cell wall of Fonsecaea pedrosoi. Med Mycol., n.41, p , LIMONGI, C.L.; ROZENTAL, S.; ALVIANO, C.S. & SOUZA, W. de. The influence of surface carbohydrates on the interaction of Fonsecaea pedrosoi with Chinese Hamster ovary glycosylation mutant cells. Mycopathologia, n.138, p , Isolation and partial characterization of na adhesin from Fonsecaea pedrosoi. Med. Mycol., n.39, p , MATTE, S.M.W.; LOPES, J.O.; MELO, I.S.; ESPADIM, L.E.R. & PINTO, M.S. Cromoblastomicose no Rio Grande do Sul: relato de 12 casos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, vol. 30, n.4, Uberaba, jul/ago, NAUMANN, D. Infrared spectroscopy in microbiology. In: Encyclopaedia of Analytical Chemistry. MEYERS, R.A. Ed. Chichester: John Wiley & Sons Ltd., p , NORGAARD, L.; SAUDALAND, A. WAGNER, J.; NIELSEN, J.P.; MUNCK, L. & ENGELSEN, S.B. Interval Partial Least-Squares Regression (ipls): a comparative chemometric study with an example from Near-Infrared Spectroscopy. Applied Spectroscopy, n. 54, p , ROZENTAL, S.; ALVIANO, C.S. & SOUZA, W. de. The in vitro susceptibility of Fonsecaea pedrosoi to activated macrophages. Mycopathologia, n.126, p.85-91,