CAPACIDADE DE INCHAMENTO DE HIDROGÉIS DE GELATINA RETICULADOS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE TRANSGLUTAMINASE

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1 CAPACIDADE DE INCHAMENTO DE HIDROGÉIS DE GELATINA RETICULADOS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE TRANSGLUTAMINASE R. C. Simoni 1, G. F. Lemes 2, A. M. Gozzo 3, O. H. Gonçalves 2, M. A. Shirai 2, F. V. Leimann 2 1- Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos - PPGEAL Universidade Federal do Paraná CEP: Curitiba - PR Brasil, Telefone: 55 (44) (rayssa.simoni@gmail.com) 2- Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos PPGTA Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP: , Campo Mourão - PR - Brasil, Telefone: +55 (44) (gisa.lemes@g mail.com, odinei@utfpr.edu.br, marianneshirai@hotmail.com, fernandaleimann@utfpr.edu.br) 3 - Departamento Acadêmico de Alimentos - DALIM Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP: Campo Mourão PR Brasil, Telefone: 55 (44) (angelained@gmail.com) RESUMO Hidrogéis de gelatina foram sintetizados com diferentes quantidades de enzima transglutaminase (20/10 unidades ativas/g proteina), agente reticulante natural responsável pela formação da rede tridimensional do hidrogel, por secagem em estufa e liofilização. Foi avaliado o efeito da quantidade de transglutaminase na cinética de inchamento em fluidos gástrico (FGS) e intestinal (FIS) simulados. Com teores mais elevados da enzima houve menor índice no grau de inchamento das amostras submetidas a secagem em estufa, não sendo observado para as liofilizadas que apresentam estruturas menos rígidas. A reticulação do hidrogel foi comprovada por análise de Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourir (FTIR), sendo evidenciada a presença da banda amida monosubstituída, ligação formada na estrutura do hidrogel pela ação da reticulação da enzima. Os hidrogéis secos em estufa com 10 e 20 unidades ativas/g proteína apresentaram inchamento de 499 % e 347 % e os secos por liofilização constataram 782 % e 615 %, respectivamente. ABSTRACT Gelatin hydrogels were synthesized with different amounts (20/10 active units/g protein) of the enzyme transglutaminase, a natural crosslinking agent responsible for the formation of hydrogel three-dimensional network, by oven drying and freeze drying. The effect of transglutaminase amount was evaluated on the swelling kinetics in simulated gastric fluid (SGF) and simulated intestinal fluid (SGI). With higher levels of the enzyme the swelling degree was lower for samples subjected to oven drying, this was not observed for the freeze-dried hydrogel that presented a less rigid structure. The hydrogel crosslinking was proved with Fourier Transform Infrared Spectrometry (FTIR) analysis, which evidenced the presence of a monosubstituted amide band, a chemical bond formed by the action of the enzyme transglutaminase during crosslinking. The hydrogels dried in an oven with 10 and 20 active units/g protein exhibited a swelling of 499 % and 347 % and the freeze dried 782 % and 615 %, respectively. PALAVRAS-CHAVE: cinética de inchamento, estufa, liofilizador, fluido gástrico simulado, fluido intestinal simulado. KEYWORDS: swelling kinetics, oven dryer, freeze dryer, simulated gastric fluid, simulated intestinal fluid.

2 1. INTRODUÇÃO Os hidrogéis são polímeros que possuem grande capacidade de absorção de água, podendo apresentar redes formadas por ligações covalentes, originadas da reticulação e conhecidos como hidrogéis do tipo químico, ou ligações físicas, que seriam as ligações de hidrogênio e forças de van der Waals (Oviedo et al., 2008; Bhattarai et al., 2010). Para a sintetização dos hidrogéis podem ser utilizados polímeros naturais ou sintéticos que são diferenciados quanto a força mecânica não satisfatória dos naturais e as propriedades bioativas não tão boas dos sintéticos (Bajpai et al., 2008). A gelatina é considerada um biopolímero natural solúvel que, por apresentar características biocompatíveis e biodegradáveis, representa uma alternativa como material de encapsulação para liberação controlada de drogas e outros elementos (Lai, 2013; Khan e Scheneider, 2013). Agentes naturais como a transglutaminase podem ser utilizados para obter a reticulação formadora da rede tridimensional dos hidrogéis, evidenciando que não há restrições quanto a ingestão desta, ao contrário de agentes como o glutaraldeído que possuem efeitos citotóxicos e são muito aplicados. As características dos hidrogéis, incluindo o inchamento e propriedades mecânicas, podem ser moduladas pela quantidade de agente de reticulação (Rivero et al., 2010). As propriedades mecânicas, inchamento e perfil de liberação de compostos encapsulados por hidrogéis podem ser influenciados de acordo com as condições em que estes são sintetizados, como a quantidade de agente de reticulação utilizada, temperatura de reação e secagem do hidrogel. Por serem sintetizados por componentes naturais aplicação seria viável para encapsulação de compostos antimicrobianos, como no caso de filmes desenvolvidos por Dias et al (2009), que poderiam acarretar na segurança dos alimentos; glicose, para ingestão de pessoas hipoglicêmicas; entre outros. Dessa forma o trabalho teve como objetivo a síntese de hidrogéis de gelatina reticulados com transglutaminase, bem como a verificação da influência desta no grau de inchamento dos hidrogéis. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.2 Material A gelatina (Vetec) e o glicerol (Vetec) foram utilizados na síntese do hidrogel. A água destilada foi utilizada no preparo das soluções e na verificação do grau de inchamento de equilíbrio dos hidrogéis. A enzima transglutaminase (ACTIVA GM, 80 unidades ativas (U) para 1 g de mistura enzimática) foi disponibilizada pela Ajinomoto, sendo aplicada como agente reticulante. O fluido gástrico foi preparado com ácido clorídrico (HCl) (Vetec) e cloreto de sódio (NaCl) (Vetec). Para o fluido intestinal simulado, o tampão fosfato salino (PBS) foi preparado com fosfato de potássio monobásico e fosfato de potássio dibásico. 2.3 Síntese dos Hidrogéis A formação do hidrogel foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Chambi e Grosso (2006) com algumas alterações. Primeiramente foram dissolvidos 4,2 g de gelatina (7 % p/p) em água destilada (60 ml) à 50 C sob agitação magnética. Em seguida o glicerol (25 g/100 g proteína seca) foi adicionado à solução. A mistura foi resfriada a temperatura ambiente e então a transglutaminase (10 U/g proteína ou 20 U/g proteína) foi acrescentada ainda sob agitação. Por fim, a solução resultante

3 foi vertida em formas de silicone de 4 x 9 cm e levadas para estufa de convecção de ar (Cienlab) a 50 C por 15 minutos. Em seguida, a temperatura foi elevada à 85 C para inativação da enzima por 10 minutos. Finalmente, as formas de silicone foram levadas para secagem e obtenção dos hidrogéis por meio de dois tratamentos: em estufa (Cienlab) à 40 C por 24 horas e em ultrafreezer (Liotop) a -90 C sendo, posteriormente, liofilizadas por 24 h (Liotop L101). Os experimentos foram realizados em triplicata. 2.4 Cinética de Inchamento dos Hidrogéis em Fluidos Gástrico e Intestinal Simulados As propriedades de inchamento em fluido gástrico simulado (FGS) (ph 1,2) e fluido intestinal simulado (FIS) (ph 7,4) foram determinadas através do mesmo método aplicado na verificação do grau de inchamento de equilíbrio, porém, a uma temperatura de 37 ºC e com um volume de 100 ml de cada fluido. Para isso as amostras permaneceram por 2 horas imersas no FGS e, posteriormente, foram transferidas para o FIS por mais 4 h, considerando este o tempo de digestão. A pesagem dos hidrogéis foi realizada durante os intervalos de tempo de 5, 10, 20, 30, 60 e 120 min imersos no FGS e nos intervalos de 30, 60, 120, 180 e 240 min no FIS (W t). Os graus de inchamento nos fluidos simulados (GIF %) foram então calculados com o uso da Equação 1. Os resultados foram obtidos em triplicata e submetidos ao teste t-student para avaliação de diferença significativa (p < 0,05) no software Statistica 7.0. GIF (%) = ( W t W 0 W 0 ). 100 (1) 2.6 Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) Para análise da interação entre os componentes dos hidrogéis e caracterização das ligações químicas formadas após a síntese dos hidrogéis foi realizado ensaio de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). Para isto, com auxílio de um pistilo e um almofariz, 10 mg de amostra foram trituradas juntamente com 0,2 g de brometo de potássio (KBr) para formação da pastilha, possibilitando a análise. As pastilhas foram produzidas em um pastilhador submetido a 7 kgf de pressão em prensa hidráulica (Bovenau, P15 ST). A leitura do espectro foi realizada em espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier (IR AFFINITY-1, Shimadzu) na faixa de cm -1 utilizando 32 acumulações e resolução de 4 cm RESULTADOS E DISCUSSÃO As amostras foram codificadas como G5010E, G5020E, G5010L e G5020L para facilitar o controle das análises, onde G refere-se a proteína, 10/20 à quantidade de transglutaminase utilizada e E / L ao tratamento aplicado na secagem dos hidrogéis. Na Figura 1 são apresentados os hidrogéis de gelatina secos em estufa e por liofilização.

4 Figura 1 Hidrogéis de gelatina obtido por tratamento em (a) estufa e por (b) liofilização. O aspecto obtido para o hidrogel seco em estufa foi do tipo vitrificado enquanto o hidrogel produzido por liofilização apresentou característica esponjosa. O fato disto ocorrer se deve, possivelmente, a melhor organização da estrutura polimérica ao longo do tempo proporcionada pela secagem em estufa, o que não ocorre na liofilização que mantém a estrutura original em que a amostra foi congelada. Na Figura 2 estão representadas as cinéticas de inchamento nos fluidos gástrico e intestinal simulados para as amostras secas em estufa (a) e por liofilização (b), onde o símbolo * sobre o ponto indica que há diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos. É possível verificar estatisticamente que a amostra com 20 U/ g de proteína de transglutaminase secas em estufa (Figura 2a) não permitiu um inchamento tão elevado quanto a amostra com 10 U/g da enzima, de modo que uma maior quantidade da enzima favoreceu a reticulação e fortaleceu a rede através de ligações cruzadas no interior das cadeias de gelatina por meio da modificação enzimática, sendo um meio alternativo para melhorar a resistência mecânica da estrutura polimérica, alterando a funcionalidade através da permeabilidade ao vapor de água e diminuição da solubilidade (Carvalho e Grosso, 2006). Bigi et al. (2002) avaliaram a estabilização de filmes de gelatina reticulados com genipina e constataram que o grau de inchamento do gel diminuiu de 700 % para, aproximadamente, 200 % com o aumento da concentração do agente reticulante. O fato da amostra G5020L (Figura 2b) não ter apresentado diferença significativa pode ter sido pela influência do tipo de secagem aplicada (liofilização) que mantém uma estrutura mais aberta e esponjosa. Figura 2 Grau de inchamento dos hidrogéis (GIF%) em fluido gástrico simulado (FGS, até 120 min) e em fluido intestinal simulado (FIS, após 120 min): (a) secos em estufa com 10 e 20 U/g proteína de transglutaminase; (b) liofilizados com 10 e 20 U/g proteína de transglutaminase.

5 Na Figura 3 estão contidos os espectros de infravermelho dos componentes puros utilizados na sintetização dos hidrogéis e do hidrogel G5020E, escolhido aleatoriamente para analisar a ação da transglutaminase. Figura 3 Espectros de infravermelho: (a) hidrogel seco em estufa com 20 U/g proteína de transglutaminase; (b) componentes puros utilizados na sintetização dos hidrogéis. Pelo espectro da Figura 3a pode ser observado a presença da banda localizada em 1550 cm -1, referente ao grupamento amida monosubstituída. Esta banda também está presente no espectro de gelatina pura (Figura 3b, indicada com círculo preto). Nos hidrogéis esta banda tem a intensidade aumentada quando comparado com a gelatina pura, em função da criação das ligações de reticulação promovidas pela tranglutaminase. Dessa forma é possível confirmar que a transglutaminase agiu como agente de reticulação na formação dos hidrogéis. A gelatina apresenta tanto resíduos de grupamento glutamina quanto de lisina (Fuchsbauer et. al., 1996; Carvalho e Grosso, 2006; Cortesi et. al., 1999). Dessa forma, o produto da reação de reticulação é a formação de um grupamento amida monosubstituída bem como amônia. 4. CONCLUSÕES A sintetização dos hidrogéis foi possível, evidenciando a disposição destes em absorverem grande quantidade dos fluidos, além de ter sido utilizado componentes naturais que podem ser ingeridos sem causar danos à saúde do ser humano. Foi obtido um hidrogel reticulado para as diferentes quantidades de transglutaminase aplicadas, porém, houve comportamento significativamente diferenciado na capacidade de inchamento para a amostra seca em estufa, o que não ocorreu para a secagem por liofilização. Fator importante que deve ser considerado para atender as finalidades da liberação de compostos encapsulados. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Pró-Reitoria de Graduação e Educação Profissional da UTFPR, a Fundação Araucária, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológica (CNPq, chamada universal MCTI/CNPq Nº 14/2014) pelo apoio financeiro.

6 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bajpai, A. K., Shukla, S. K., Bhanu, S., Kankane, S. (2008). Responsive polymers in controlled drug delivery. Progress in Polymer Science, 33, Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. (2010). Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 62, Bigi, A., Cojazzi, G., Panzavolta, S., Roveri, N., Rubini, K. Stabilization of gelatina films by crosslinking with genipin. Biomaterials, 23, Carvalho, R. A., Grosso, C. R. F. (2006). Efeito do tratamento térmico e enzimático nas propriedades de filmes de gelatina. Ciênc. Tecnol. Aliment., 26(3), Chambi, H., Grosso, C. (2006). Edible films produced with gelatin and casein cross-linked with transglutaminase. Food Res. Int., 39, Cortesi, R., Esposito, E., Osti, M., Squarzoni, G., Menegatti, E., Davis, S. S. Nastruzzi, C. (1999). Dextran cross-linked gelatin microspheres as a drug delivery system. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 47(2), Dias, M. V., Nilda, F. F. S., Borges, S. V., Oliveira, I. A., Silva, W. A. S., Oliveira, R. N. (2009). Desenvolvimento de filmes antimicrobianos de alginate de sódio Resultados Preliminares. Anais do 10 Congresso Brasileiro de Polímeros. Fuchsbauer, H. L., Gerber, U, Engelmann, J., Seeger, T., Sinks, C., Hecht, T. (1996). Influence of gelatin matrices cross-linked with transglutaminase on the properties of an enclosed bioactive material using P- galactosidase as model system. Biomaterials, 17(15), Khan, S. A., Schneider, M. (2013). Improvement of Nanoprecipitation Technique for Preparation of Gelatin Nanoparticles and Potential Macromolecular Drug Loading. Macromolecular Bioscience, 13, Lai, J. Y. (2013). Influence of solventcomposition on the performance of carbbodiimide cross-linked gelatin carries for retinal sheet delivery. J Mater Sci: Mater Med, 24, Oviedo, I. R., Mendez, N. A. N., Gomez, M. P. G., Rodriguez, H. C., Martinez, A. R. (2008). Design of a physical and nontoxic crosslinked poly(vinylalcohol) hydrogel. International Journal of Polymeric Materials, 57, Rivero, S., García, M. A., Pinotti, A. (2010). Crosslinking Capacity of Tannic Acid in Plasticized Chitosan Films. Carbohydrate Polymers, 82,