CYRO DE MORAES BARBOSA GOMES NETO

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1 Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos Pesquisa sobre o envolvimento do marsupial Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) e de cães domiciliados no ciclo de transmissão da leishmaniose visceral no município de Camaçari, localidade de Barra do Pojuca, Bahia CYRO DE MORAES BARBOSA GOMES NETO SALVADOR - BAHIA 2006

2 ii CYRO DE MORAES BARBOSA GOMES NETO PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) E DE CÃES DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICÍPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO POJUCA, BAHIA Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal. Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Franke Co-orientadora: Profª Drª Maria Emília Bavia Salvador Bahia 2006

3 iii FICHA CATALOGRÁFICA GOMES NETO, Cyro de Moraes Barbosa PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) E DE CÃES DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICÍPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO POJUCA, BAHIA Salvador, 28 de agosto de 2006, 79p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, Orientador Prof. Dr. Carlos Roberto Franke Co-orientador Profª Drª Maria Emília Bavia Palavras-chave Leishmaniose, leishmaniose visceral canina, reservatórios, Didelphis albiventris, sariguê, gambá, timbú.

4 iv PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) E DE CÃES DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICÍPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO POJUCA, BAHIA CYRO DE MORAES BARBOSA GOMES NETO Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Salvador, 28 de agosto de 2006 Comissão Examinadora: Prof. Dr. Carlos Roberto Franke EMV/UFBA Orientador Prof. Dr. Paulo Henrique Palis Aguiar EMV/UFBA Prof. Dr. Wilfried Klein Instituto de Biologia/UFBA

5 Dedico este trabalho a todos aqueles que direta ou indiretamente tenham contribuído para o meu crescimento pessoal e profissional. v

6 vi AGRADECIMENTOS À DEUS, por tudo o que sei que Ele tem reservado para mim e mesmo pelo que ainda ignoro pois confio em Sua sabedoria; A meus pais, Cyro de Moraes Barbosa Gomes Júnior e Dalva Liz Pires Moreira Gomes, que de uma forma ou de outra sempre zelaram por mim e proveram os subsídios necessários ao meu bom desenvolvimento. Com ênfase, à minha Mãe, Dalva Liz Pires Moreira Gomes, pessoa mais importante em toda a minha vida, sendo o alicerce de toda nossa família e constituindo-se na minha maior incentivadora. A minha sempre presente e amada Vó Maria Maria Moreira da Rocha Pires (in memorian) que com seu jeito simples sempre me incentivava e estimulava a continuar a obter o que ela carinhosamente chamava de diploma de Doutor Aos meus amados Arthur, Guilherme e Shirlei Pimentel Santos Barbosa Gomes, que me propiciaram a constituição de uma família. Agradeço assim, todo o amor, carinho, momentos felizes, enfim a nossa convivência ate então; Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke, pela amizade e companheirismo ao longo dos últimos anos e bem como pela liberdade e confiança em mim depositados com o intuito de desenvolvermos esse projeto; Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke, pelo apoio logístico e financeiro em muitos momentos quando o LIVE não pôde suprir sozinho tais gastos ligados `a minha pesquisa; Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Franke, pela orientação ao longo desses anos; Aos amigos e colegas, Alberto Conceição Bispo, Antonio Eduardo Araújo Barbosa, Aroldo Borges Carneiro, Danielle Custódio Leal, Fred da Silva Julião, Joseph Mathias Urban e Shirlei Pimentel Santos Barbosa Gomes, pelo trabalho de campo de captura de marsupiais e coleta de amostras biológicas, bem como pela realização de questionários epidemiológicos aos proprietários de cães examinados no estudo.

7 vii Aos amigos e colegas, Adriano Costa de Alcântara, Bárbara Maria Paraná da Silva Souza, Danielle Custódio Leal, Débora Cristina Portella Medina Barboza, Diana Vianna Velloso Bittencourt e Lídia Silva Oliveira, do Laboratório de Infectologia Veterinária (LIVE), pela realização dos exames laboratoriais das amostras coletadas em Barra do Pojuca, tanto de marsupiais quanto de cães; Aos Médicos-veterinários amigos Alberto Conceição Bispo, Alex Aguiar de Oliveira, Antonio Marcos Machado Regis, Fred da Silva Juliao, Nivaldo de Jesus que foram companheiros em muitos momentos de minha graduação. Ao LIVE pelo subsídio de grande parte deste projeto, custeando aos gastos de aluguel, de água e luz do imóvel utilizado como base de pesquisa em Barra do Pojuca; Ao Professor Geovane Bonina Costa, pelo empréstimo do Freezer do Lana (Laboratorio de Nutrição Animal) que por sinal consumia uma energia incomensurável; À FAPESB pela bolsa de mestrado de um ano, bem como pelo auxilio financeiro ao projeto de mestrado no ano de 2005; Ao Mestrado em Medicina Veterinária Tropical (Ciência Animal nos Trópicos), mais especificamente nas pessoas de seu coordenador na época, o Prof. Dr. Ricardo Castelo Branco Albinati, do Prof. Dr. Carlos Roberto Franke e de Jefferson Costa; Aos acadêmicos em Medicina Veterinária da UFBA, Ana Paula Portela Gomes, Ana Paula, Ianei Oliveira; A Secretária de Saúde de Camaçari; Ao Centro de Controle de Zoonoses (M.V. Marcos Nogueira); Ao Centro de Saúde de Barra do Pojuca, mais especificamente aos agentes de saúde João Gifone, Manuel, Francisco e Antônio;

8 viii De tudo ficou, ficaram três coisas: a certeza que estamos sempre começando, a certeza que é preciso continuar a certeza que podemos ser interrompidos antes de terminar. Fazer da interrupção um novo caminho, fazer da queda um passo de dança, do medo, uma escada, do sonho, uma ponte e da procura, um encontro. Fernando Sabino

9 ix SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS...x RESUMO...xi SUMMARY...xii 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ETIOLOGIA DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA VETOR CONTROLE Técnicas parasitológicas para o diagnostico da LV RESERVATÓRIOS Cão (Canis familiaris) Animais Selvagens Raposas Marsupiais ARTIGO CIENTÍFICO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...56 ANEXO I. Questionário Epidemiológico...77

10 x LISTA DE ABREVIATURAS ELISA IBAMA K LV LVC OMS OPD PCR S W Ensaio imunoenzimático (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Naturais nãorenováveis Corresponde a G ou T (Combinação de primer degenerado) Leishmaniose visceral Leishmaniose visceral canina Organização Mundial de Saúde Orto-FenilenoDiamina (ortho-phenylenediamine) Reação em cadeia de polimerase (Polymerase Chain Reaction) Corresponde a C ou G (Combinação de primer degenerado) Corresponde a A ou T (Combinação de primer degenerado)

11 xi GOMES NETO, C.M.B. PESQUISA SOBRE O ENVOLVIMENTO DO MARSUPIAL (Didelphis albiventris) E DE CÃES DOMICILIADOS NO CICLO DE TRANSMISSAO DA LEISHMANIOSE VISCERAL NO MUNICIPIO DE CAMAÇARI, LOCALIDADE DE BARRA DO POJUCA, BAHIA. Salvador, Bahia, p. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, RESUMO O marsupial Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) vem sendo citado na literatura como importante reservatório de algumas zoonoses, dentre elas a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose cutânea, a Doença de Chagas, doenças consideradas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como endemias de ação prioritárias. Nosso estudo na localidade de Barra do Pojuca, Camaçari, Bahia, avaliou a prevalência da leishmaniose visceral em marsupiais e cães pelas técnicas de ELISA e PCR. Os resultados apontam para uma participação da espécie Didelphis albiventris na epidemiologia da doença com uma soroprevalência de 26,7% (4/15) e 64,7% (11/17) positivos na PCR. A prevalência da população canina foi de 15,6% (39/253), mostrando que comparada a estudos realizados em 2003 esta taxa não tem diminuído, apesar do controle vetorial e do reservatório canino realizado pelos agentes da saúde na área. Os resultados mostram a necessidade de ampliar o conhecimento, buscando definir com clareza o papel da espécie Didelphis albiventris no ciclo de transmissão da L. chagasi e o risco que representa para as populações humanas e caninas nas áreas endêmicas. PALAVRAS-CHAVE: leishmaniose visceral, Didelphis albiventris, reservatório selvagem, Leishmania chagasi, Bahia

12 xii GOMES NETO, C.M.B. THE EVALUATION OF OPOSSUM (Didelphis albiventris) AND DOMICILIATED DOGS INVOLVEMENT IN THE VISCERAL LEISHMANIASIS TRANSMITION CYCLE IN THE MUNICIPALITY OF CAMAÇARI, LOCALITY OF BARRA DO POJUCA, BAHIA. Salvador, Bahia, p. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, SUMMARY The opossum Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) has been considered an important reservoir of some zoonosis in the literature, like visceral and cutaneous leishmaniasis and Chagas disease, which are considered by WHO as high priority endemic diseases. Our study, carried out in the area of Barra do Pojuca (Camaçari, Bahia), evaluated the visceral leishmaniasis seroprevalence in opossum and dogs using indirect ELISA and PCR. The findings point out the involvement of Didelphis albiventris in the disease epidemiology, presenting a seroprevalence of 26,7% (4/15) and 64,7% (11/17) positivity by PCR. The canine population prevalence reached 15,6% (39/253), showing that, compared to a study performed in 2003, its prevalence is not decreasing, despite vector and canine reservoir control has been done by the health control agents in the area. The results presented here clearly ask for an increase of knowledge, looking to define properly the role of Didelphis albiventris in the Leishmania chagasi transmission cycle and risk for human and canine populations in the endemic areas. KEYWORDS: Visceral Leishmaniasis, Didelphis albiventris, wild reservoirs, Leishmania chagasi, Bahia

13 1 1. INTRODUÇÃO A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose causada por protozoários do gênero Leishmania, transmitida ao homem, ao cão, e a alguns animais selvagens, principalmente àqueles de hábitos sinantrópicos, através da picada da fêmea do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis (LUTZ & NEIVA 1912) (BADARÓ, et al. 1986; LAINSON et al. 1987; GRIMALDI et al. 1989; CORREDOR et al. 1989a, ASHFORD, 1997; TRAVI, 1998a) quando do advento de seu repasto sanguíneo, onde este inocula formas promastigotas do parasito L. chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937) em um outro hospedeiro (BRASIL, 2003). A LV é causada pela L. chagasi (nas Américas) e Leishmania infantum (no Velho Mundo). A L. chagasi é o principal responsável pela infecção leishmaniótica no Brasil (MARZOCHI et al., 1981; DESJEUX, 1996; MILES et al., 1999). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) a incidência anual da LV no mundo é de cerca de novos casos humanos, dos quais 90% concentramse no Brasil, Bangladesh, Nepal (DESJEUX, 2004; BERN et al. 2005), Índia e Sudão. A doença no Brasil é predominante na Região Nordeste com aproximadamente 77% dos casos nacionais (BRASIL, 2003), valendo ressaltar que esta proporção está diminuindo em virtude do surgimento de novos focos na região Sudeste, principalmente em Minas Gerais (OLIVEIRA et al. 2001). O estado da Bahia desponta entre os estados brasileiros como o de maior número de casos de leishmaniose visceral humana, tendo registrado em média novos casos por ano (FRANKE, et al. 2002b, BRASIL, 2003). A LV é uma doença de grande impacto na saúde pública (CUNHA et al. 1995; TESH, 1995; DESJEUX, 1996; BEVILACQUA et al., 2001; SAVANI et al., 2003), caracterizando-se pela evolução crônica e debilitante (DEANE & DEANE, 1954; MARZOCHI, et al. 1981), além de oportunista (WHO, 1997; WOLDAY et al. 1999; LYONS et al. 2003) e especialmente agressiva aos indivíduos com nutrição

14 2 deficiente e de baixa condição socioeconômica (CERF et al. 1987), ou que vivam em regiões especialmente afetadas por longas secas agravadas pela ocorrência periódica do El Niño (EVANS et al. 1990, 1992; THOMPSON et al. 2002; FRANKE et al. 2002a). Segundo SHERLOCK (1996), o ciclo de transmissão da LV envolve a participação de animais selvagens como marsupiais (Didelphis albiventris) e raposas (Cerdocyon thous Linnaeus, 1766), além de outras espécies selvagens e domésticas (cachorro-do-mato, marsupiais, asnos, roedores) (COURTENAY et al. 1994, 1996; ZERPA et al. 2002; CERQUEIRA et al. 2003; MOHEBALI et al. 2005), porém, dados epidemiológicos mais precisos ainda são insuficientes para quantificar estas relações, demandando estudos específicos com este propósito (ARIAS & NAIFF, 1981; SILVEIRA et al. 1982; TRAVI et al. 1994, 1998a, 1998b; CABRERA et al. 2003; LAINSON, et al. 2005). Com a descoberta de um espécime de D. albiventris naturalmente infectado por L. chagasi em Jacobina Bahia (SHERLOCK et al. 1984, 1988b) e com a confirmação através de infecção experimental (SHERLOCK et al. 1988a), o espectro epidemiológico da LV no mundo foi ampliado, no entanto as medidas praticadas pelos órgãos de saúde para o controle da LV permanecem sendo o diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos, controle da população canina e vetorial (DEANE & DEANE, 1954; ALENCAR, 1956; DYE, 1996; BRASIL, 2003). A inclusão de medidas relativas ao controle populacional de reservatórios selvagens do parasito ainda não tem sido cogitada, apesar dos indícios sobre o papel de reservatório destas espécies, contribuindo para a reintrodução do parasito nas populações humanas e caninas em áreas onde as ações de controle são aplicadas (DYE, 1996; DIETZE et al. 1997). Os didelfídeos (do latim Di = duplo e Delphos = ventre), como o próprio nome indica, possuem uma gestação dividida em duas fases, onde uma etapa ocorre no útero do animal, seguida pela fase final que transcorre no marsúpio. As espécies do gênero Didelphis têm sido utilizadas experimentalmente em vista desta característica reprodutiva (RENFREE, 1981; CÁCERES, 2002), permitindo a

15 3 observação do desenvolvimento embrionário em virtude da produção de embriões facilmente acessíveis, o que se torna interessante aos estudos histológicos, toxicológicos e reprodutivos (BLOCK, 1960; SHERWOOD, et al. 1969). Alguns autores têm se dedicado ao estudo deste gênero, abordando temas como: a dieta, o comportamento, o uso e distribuição espacial e o potencial de dispersor de sementes em floresta pela espécie D. albiventris (CÁCERES, 2000; 2002; 2005); a participação do D. albiventris na epidemiologia da Doença de Chagas (JANSEN et al. 1991, 1997, 1999, 2003, 2005; SCHWEIGMANN et al. 1999) entre outros aspectos. O presente trabalho dedicou-se à avaliação do possível envolvimento da espécie D. albiventris no ciclo da leishmaniose visceral canina (LVC), objetivando contribuir para o conhecimento sobre este novo aspecto epidemiológico e para a reflexão sobre o aprimoramento das medidas de controle desta zoonose.

16 4 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ETIOLOGIA O primeiro reconhecimento dos parasitos pertencentes, atualmente, ao gênero Leishmania foi feito por CUNNINGHAM em Apesar disso, somente em 1900 William Leishman encontrou formas amastigotas distintas em vertebrados infectados por Trypanossoma. Em 1903, Charles Donovan também encontrou o mesmo parasito em pacientes que apresentavam a Doença de Chagas. No entanto as anotações de Leishman só foram publicadas em 1903, em virtude da coincidência nas datas os pesquisadores foram homenageados através do nome dado ao parasito - Leishmania donovani. O gênero Leishmania Ross, 1903 (Kinetoplastida: Trypanossomatidae) inclui aproximadamente 30 espécies diferentes que são classificadas em dois subgêneros, Leishmania e Viannia, possuindo padrões epidemiológicos distintos e algumas espécies com acentuada preferência por reservatórios específicos (MOMEM, 2000). Nicole e Compte (1908), em trabalho realizado na Tunísia, encontraram leishmania em cães e sugerem a efetiva participação dos colonizadores portugueses e espanhóis na introdução da L. chagasi no Novo Mundo, através da provável vinda de cães infectados acompanhando os primeiros colonizadores. As leishmanioses representam um grande impacto à saúde pública nas regiões de sua ocorrência, sendo considerada pela OMS como uma das seis principais endemias da atualidade. Os protozoários pertencentes ao complexo Donovani, envolvidos na forma visceral da doença são divididos em três espécies L. chagasi, L. infantum e L. donovani, as quais apresentam ainda sub-espécies que diferem entre si por ínfimas frações gênicas, distribuição geográfica, predileção por

17 5 hospedeiros, reservatórios e vetores (CUNHA et al. 1995; TESH 1995; DESJEUX, 1996; BEVILACQUA et al., 2001; SAVANI et al. 2003). O agente etiológico da LV nas Américas é o protozoário denominado L. chagasi. Este protozoário apresenta um ciclo biológico heteroxênico, apresentando duas formas distintas: a forma promastigota, presente no vetor (Lutzomyia longipalpis) que se caracteriza por ser flagelada e considerada como a forma infectante (transmitida pelo vetor aos novos hospedeiros - homem, cães ou animais selvagens), e a forma aflagelada ou amastigota, encontrada no interior de macrófagos e monócitos, apresentando um tropismo pelo sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros e reservatórios (DESJEUX et al. 1983; LAINSON et al. 1985; LE PONT & DESJEUX, 1985; BRASIL, 2003; TAUIL, 2006). Dentre os principais fatores responsáveis pelo aumento de risco de infecção por L. chagasi em humanos, a presença de cães infectados é um dos mais importantes em áreas periurbanas e urbanas. A elevação da prevalência canina precede freqüentemente ao surgimento de novos casos humanos de LV na mesma área (PARANHOS-SILVA et al. 1996; COSTA et al. 1990, 1999). Especialmente em crianças, o estado nutricional apresenta um relacionamento direto com a forma evolutiva de manifestações clinicas da doença, apresentando os sintomas clássicos evidenciados em indivíduos em estagio de subnutrição ou desnutrição avançados (ZERPA et al. 2003). Estudos experimentais na África tem demonstrado que uma pessoa que apresente uma alimentação deficitária em energia, proteína, ferro e vitamina A tende a apresentar falhas no funcionamento dos linfonódos e conseqüentemente incapacidade de responder imunologicamente às alterações decorrentes da LV (CERF et al. 1987; HARRISON et al. 1986; ANSTEAD et al. 2001; ALVAR et al. 2006). Além dos fatores sócio-econômicos, determinantes da qualidade de vida das populações, condições ambientais como, influencia da temperatura, desmatamento, seca prolongada, criação de animais domésticos (cão, galinhas,

18 6 porcos, caprinos, bovinos) ou determinadas práticas agrícolas que atraiam direta ou indiretamente o vetor e ou reservatórios selvagens ao peridomicílio, contribuem para o aumento do risco de infecção das populações humanas e caninas susceptíveis. (LANE, 1986; BRAZIL et al. 1987; CERF et al. 1987; MUTINGA et al. 1989; KILLICK-KENDRICK, 1990; BRANDAO-FILHO et al. 1999; LAMPO, 2000; ALEXANDER et al. 2002; FRANKE, 2002a; BERN et al. 2005; MORAES SILVA, 2006). A incidência da LV em crianças é mais proeminente em virtude do desenvolvimento incompleto de seu sistema imune, visto que ainda não se atingiu a maturidade imunológica. Estudos científicos vêm sendo realizados com o objetivo de se determinar em que momento essa maturidade é atingida, no entanto sabe-se que a faixa etária de 24 a 71 meses é a mais atingida pela LV. Outra categoria que apresenta grande incidência corresponde a dos indivíduos adultos portadores de AIDS ou de outras patologias de caráter imunodepressor (PEARSON et al. 1996; SUNDAR et al. 1994; DI MARTINO et al. 1997; BADARÓ et al. 1990; CALDAS et al. 1999; THOMPSON, et al. 2002; PAREDES et al. 2003). Os portadores de co-infecção Leishmania/HIV têm sido considerados importante fonte de infecção, através da doação de sangue ou quando são usuários de drogas injetáveis pelo compartilhamento da seringa (ALVAR et al. 1994). O clima desempenha um importante papel no ciclo epidêmico da LV, através de alterações ecológicas, demográficas e ambientais, movimentos populacionais e processos de urbanização, especialmente em regiões endêmicas expostas a regimes pluviométricos irregulares, com prolongados períodos de estiagem. ELNAIEM e colaboradores (2002) provaram que a influencia da precipitação pluviométrica media e da altitude exercem sobre a presença e a incidência de LV no Sudão. Com o corrente fenômeno de aquecimento global as alterações ecológicas e ambientais de origem natural ou antrópica podem levar a alterações em toda estrutura de fauna e flora de uma região conduzindo à formação de um novo microclima propicio à proliferação de flebótomos ou ao seu deslocamento

19 7 para uma região anteriormente indene para LV. Os processos de urbanização, movimentos de transumância, êxodo rural e outras formas de migração também podem acarretar em adensamentos populacionais e ter como conseqüência a habitação em condições de pobreza e de precariedade higiênico-sanitária, fatores relevantes em se tratando de LV (TRAVI et al. 2002; BALDI et al. 2004). Entre as influências que o clima pode ocasionar em relação à incidência da LV já estão comprovadas, a diminuição da carga vetorial e conseqüente queda nas incidências canina e humana, outra influencia seria o aumento do êxodo rural. A modificação da paisagem natural, tanto por influência humana ou não pode conduzir ao surgimento de novos ciclos da doença em uma região (TEODORO, 1987). Como alterações climáticas, normalmente, originam-se de causas múltiplas, é de se esperar que os resultados dessas alterações também sejam os mais variados possíveis, sendo assim, em se tratando do impacto que essas possíveis alterações possam ter frente a incidência da LV, é imprescindível que os estudos relacionados a esse tema considerem tanto a sazonalidade quanto os já conhecidos fenômenos climáticos (PATZ et al. 2000; ELNAIEM et al. 2002; FRANKE et al. 2002a). Observa-se em períodos longos de seca uma redução da densidade da população vetorial (de flebotomíneos), reduzindo conseqüentemente a pressão de infecção e a incidência da LV. Com a chegada do período de chuvas, a densidade vetorial que estava minimizada passa a multiplicar-se intensamente levando a um reequilíbrio da quantidade inicial dessa população. Nesse intervalo de tempo, a população de hospedeiros (homens e cães) tornou-se mais suscetíveis a infecção, em virtude das migrações e de nascimentos de crianças, ocorridos desde o início da estação de seca, compondo uma população sem exposição prévia ao parasito. Nestes casos observa-se um incremento da incidência da LV nas regiões mais atingidas pela seca (THOMPSON et al. 2002; PETERSON et al. 2002). Fato semelhante foi observado por FRANKE e colaboradores (2002a) associado à ocorrência do fenômeno climático conhecido por El Niño e sua influência acentuada na região semi-árida do Estado da Bahia, quando os autores

20 8 observaram a elevação periódica da incidência anual da LV posterior a todos os períodos de ocorrência do El Niño. A partir dessa analise do El Niño, em estudo realizado na Colômbia, CARDENAS e colaboradores (2006) verificaram que a incidência de LV aumentava com a chegada do El Niño e diminuía nas fases em que La Niña se manifestava. Alterações ambientais de caráter antrópico, como desmatamento, promoção de queimadas, construção de habitações, aberturas de estradas entre outras, estão associadas ao surgimento endêmico da LV, em virtude da redução dos nichos ecológicos de espécies animais e vetores (potencialmente infectados com L. chagasi) e do aumento de disputas intra e interespecificas por espaço e alimento, ocasionando a imigração destes para as áreas periurbanas em busca de alimento e abrigo, dando início a disseminação de LV nas populações humana e canina destas áreas (PATZ et al. 2000; MOLYNEUX, 1998; GUERRA et al. 2004). KILLICK-KENDRICK (1997) relata a característica inicial da LV na região sul da Europa como sendo predominantemente rural, evoluindo na atualidade para um perfil epidemiológico mais urbano, devido à migração de pessoas e animais infectados e aglomeração de pessoas em condições precárias de saneamento básico. Algumas profissões a exemplo de garimpeiros, pesquisadores, dentre outras, expostas ao contato direto e prolongado com o meio natural, e pessoas que se dedicam ao acampamento, escotismo, entre outras atividades ou esportes que tenham o ambiente de silvático como componente, expõem-se mais às picadas do inseto vetor incrementando o risco de infecção, valendo ressaltar que em estudo realizado em tribos indígenas de Roraima os garimpeiros serviram realmente como fonte de infecção (GUERRA, et al. 2004).

21 9 2.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA A LV está amplamente distribuída pelo mundo, ocorrendo em todos os continentes com exceção da Antártida e Austrália (DEREURE et al. 1999). No entanto, alguns poucos países concentram a maior parte da casuística como Bangladesh, Nepal, Índia, Sudão e Brasil registrando cerca de 90% dos casos. A LV é endêmica em 88 países (22 das Américas e 66 no Velho Mundo), apresentando uma incidência média anual de casos (MONTEIRO et al. 1994; DESJEUX, 1996). HAMIDI e colaboradores (1982) avaliaram no Norte do Irã a prevalência de LV entre chacais e cães, registrando 4/161 chacais e 3/100 cães parasitologicamente positivos, sendo que a sorologia (IFAT), realizada em um número mais reduzido de animais, apresentou positividade em 6/48 e 6/34 respectivamente. FIGURA 01. Distribuição de casos leishmaniose visceral no mundo segundo a Organização Mundial de Saúde, No Brasil, a LV concentra-se na região Nordeste com o registro de aproximadamente 72% dos casos nacionais (BRASIL, 2003). Há pouco menos de uma década esse numero correspondia a 92%, no entanto com o surgimento de novos casos da doença em outras capitais e metrópoles brasileiras, a exemplo do Rio de Janeiro (RJ), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina

22 10 (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e mais recentemente as epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO). Historicamente, o estado da Bahia tem apresentado o maior número de novos casos de LV humana dentre os estados brasileiros, com uma média de casos por ano e um acelerado processo de expansão da área endêmica nas últimas décadas (FRANKE, et al. 2002b, BRASIL, 2003). Franke e colaboradores (2002b) demonstraram, através de mapas temáticos, baseados em uma longa serie histórica (1985 a 1999) da leishmaniose visceral e cutânea no estado da Bahia, que a propagação da doença é um fato concreto e que com o passar dos anos vem se intensificando. FIGURA 02. Distribuição de casos autóctones de leishmaniose visceral segundo município, Brasil 2002.

23 VETOR O principal vetor da LV no Brasil é a Lutzomyia longipalpis (LUTZ & NEIVA, 1912), havendo relatos também do envolvimento da Lutzomyia cruzi no Estado do Mato Grosso Sul. (DOS SANTOS et al. 1998). O L. longipalpis (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) é um inseto díptero flebotomíneo vulgarmente denominado de asa branca, birigui, tatuquira, mosquito palha, cangalhinha, medindo de 1 a 3 mm apresentando o comportamento de pousar com as asas entreabertas e de voar em pequenos saltos. Informações a respeito de comportamento, habitat, hábitos reprodutivos ainda são escassos. (DEANE, 1961; LAINSON, et al. 1977, 1984, 1985; ZELEDON, et al. 1984; GONÇALVES, 1985; CARRASCO & MORRISON, 1998). A L. chagasi é transmitida pela fêmea da espécie L. longipalpis, a qual apresenta hábito hematófago, especialmente durante seu período reprodutivo, em virtude da demanda por um suprimento protéico necessário a produção de ovos. A ingestão de sangue em um animal infectado com macrófagos contendo formas amastigotas de L. chagasi irá acarretar a infecção do vetor. Decorridos alguns dias (aproximadamente sete dias), essas formas amastigotas sofreram alterações bioquímicas e estruturais e convertem-se em formas intermediárias (exclusiva do vetor) denominadas paramastigotas e começam a fixar-se nas paredes do aparelho digestivo do inseto até atingir a probóscide do inseto, se transformam na forma flagelada infectante denominada promastigota. Considera-se que o acúmulo destas formas na probóscide do inseto dificulte novos repastos sanguíneos, fazendo com que o vetor aumente a freqüência destes repastos, possivelmente ampliando o número de animais picados. Esta obstrução parcial da probóscide provocaria, também, um movimento de regurgitação do conteúdo (inclusive com formas promastigotas do parasito) para o interior do hospedeiro durante o ato de sugar o sangue o que facilitaria a disseminação da infecção entre um número maior de hospedeiros (DYE, 1996; LAINSON et al.2005).

24 12 Matéria orgânica, sombra e umidade são condições essenciais para o desenvolvimento de larvas de L. longipalpis, sendo essa espécie de flebotomíneo muito bem adaptada ao ambiente antropizado, e, por conseguinte, provando que a presença desta espécie em grandes centros urbanos é plenamente viável e fator desencadeador de surtos epidêmicos de LV (FERRO et al. 1997; OLIVEIRA et al. 2000; RANGEL & LAINSON 2003; MISSAWA & LIMA 2006; OLIVEIRA et al. 2006). O vetor tem hábito noturno quando busca ativamente os animais para seu repasto sangüíneo. Exemplares adultos são encontrados durante o dia abrigados em fendas nas pedras, cavernas, galinheiros ou no peridomicílio e intradomicílio. As fêmeas são atraídas pelos feromônios exalados pelos machos e também por odores de outros animais, a exemplo de emanações da pele de seres humanos, bem como pelo CO 2 resultante da respiração de cada individuo ou animal (OSHAGHI et al., 1994; HAMILTON & RAMSOONDAR, 1994; URIBE, 1999; PINTO et al. 2001; O`SHEA et al. 2002). 2.4 CONTROLE Para o controle dos focos epidêmicos da LV no Brasil, têm sido preconizadas três medidas de intervenção: 1. Realização de inquérito sorológico na população canina, seguido da eliminação dos cães soropositivos; 2. Controle do vetor pela utilização de inseticidas; 3. Diagnóstico e tratamento dos casos humanos da doença (WHO, 1993; 1996; LACERDA, 1994; ASHFORD, 1998). Estas medidas já haviam sido sugeridas desde a década de cinqüenta por DEANE (1954, 1958), e continuam sendo, praticamente, os únicos recursos para conter os focos epidêmicos da LV. Mais recentemente, em 2003, com o lançamento do Manual de

25 13 Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral do Ministério da Saúde, uma nova medida vem sendo estimulada para tentar controlar a LV definitivamente. Tal medida baseia-se na conscientização das populações residentes em áreas de risco de infecção por LV através de atividades de educação em saúde que visem uma integração maior entre a referida comunidade e os agentes de saúde locais (BRASIL, 2003). A LV corresponde atualmente a uma zoonose que apresenta rápida expansão geográfica no Brasil. Ao longo das últimas décadas, a ineficiência das medidas de controle ate então adotadas ou a sua não aplicação adequada conduzem a uma redução apenas temporária da incidência da doença nas áreas atingidas (SHERLOCK, 1996; FRANKE, 2002b). A realização de inquéritos sorológicos caninos (amostrais ou censitários), além de sua função de controle do reservatório canino em extensas áreas, tem papel fundamental na detecção de focos silenciosos da doença e na delimitação de regiões ou setores de maior prevalência, onde a execução das medidas de controle se faz mais necessária. No entanto, limitações no orçamento e na disponibilidade de pessoal capacitado reduzem a contribuição dos inquéritos a simples dados gerais de prevalência, pouco adicionando à compreensão das interações entre ambiente, hospedeiro, reservatório, vetor e aspectos socioeconômicos próprios da região. No entanto, é justamente com base no conhecimento sobre estas interações locais que as estratégias de controle da LV devem ser elaboradas e continuamente ajustadas às subseqüentes alterações identificadas através de pesquisas específicas (DESJEUX, 2001). Duas hipóteses são normalmente formuladas para tentar explicar a ineficiência das medidas de controle da LV e, sobre estas hipóteses, baseia-se quase a totalidade das investigações epidemiológicas já realizadas. A primeira hipótese consiste no fato que os testes sorológicos utilizados nos inquéritos caninos falham ao tentar detectar todos os casos positivos na área estudada, permitindo a

26 14 permanência de cães infectados, os quais serão responsáveis pela continuidade da transmissão do parasito nas áreas endêmicas (ALVES & BEVILACQUA, 2004); a segunda hipótese: nos focos endêmicos da LV, a presença de pessoas com infecção assintomática constituem importante reservatório do parasito, viabilizando a continuidade da transmissão nas populações humanas e caninas. Na atual literatura, ambas hipóteses seriam capazes de justificar o baixo impacto da eliminação de cães soropositivos sobre a redução da incidência humana da LV observado em recentes pesquisas (PARANHOS-SILVA et al., 1996; DIETZE, 1997; ASHFORD et al. 1998). No entanto, na literatura brasileira é marcante a falta de dados conclusivos sobre o envolvimento da fauna sinantrópica (espécies de roedores, marsupiais e raposas) atuando como reservatório primário da L. chagasi e sua relação com o registro de casos caninos e humanos da doença. A hipótese sobre o envolvimento de espécimes de roedores, marsupiais e raposas na epidemiologia da LV é tão coerente quanto as anteriores para explicar a ineficiência das medidas de controle, podendo, esta terceira hipótese ser formulada como segue: o endemismo da LV é decorrente da existência de uma ou mais espécies de animais silvestres de hábito sinantrópico, ainda não corretamente avaliadas, atuando como reservatório primário da L. chagasi e contribuindo, como tal, para uma contínua reintrodução do parasito nas populações humana e canina através da ação do vetor. Os trabalhos realizados por LAINSON (1988) e ASHFORD (1996), fornecem vários exemplos que corroboram com esta hipótese, apresentando uma revisão sobre as espécies de animais domésticos e selvagens, possivelmente envolvidas na epidemiologia das leishmanioses na América Latina e em outros continentes. Além destes, outros trabalhos, também, apontam para a necessidade de estudos mais detalhados sobre a participação de espécies sinantrópicas no ciclo da LV, dentre eles podemos citar: MELO et al. (1988) e SILVA et al. (2000) estudando as raposas; HEISH et al. (1959) e BETTINI et al. (1980) estudando roedores;

27 15 SHERLOCK et al. (1984, 1988) e CORREDOR et al. (1989b) estudando marsupiais e roedores. A LV é uma das doenças mais negligenciadas no mundo atualmente, com um impacto significativo nas comunidades de baixa renda, em virtude do investimento no desenvolvimento de novas drogas ser escasso (YAMEY et al. 2002). Alem disso, o tratamento de cães com drogas anti-leishmaniais, segundo REITHINGER (2002), não é uma política de controle prático e eficaz, devido à manutenção do parasito nas comunidades para uma reinfeçcao do flebotomíneos e perpetuação da infecção em comunidades endêmicas; outro fator complicador reside no elevado custo das drogas e da alta taxa de reincidiva entre cães tratados e clinicamente curados (MODABBER, 1989; ROJAS et al. 2006). O que se denota do supracitado é, realmente, que não se cura um animal portador de LV e sim se ameniza os sinais clínicos decorrentes dessa doença. Considera-se assim, que as estratégias alternativas de controle canino, como o uso de coleira impregnada com inseticida tópico (deltametrina) associadas às medidas higiênico sanitárias preconizadas são necessárias enquanto se aguarda a criação de uma vacina para leishmaniose com eficácia comprovada e cobertura vacinal satisfatória (KILLICK- KENDRICK et al. 1997; GAVGANI et al. 2002). O tratamento clínico de cães portadores de LV não é recomendado em virtude da possibilidade, ainda que remota, de se fomentar a formação de cepas resistente do parasito ao tratamento com antimoniais pentavalentes. Outrossim, a presença parasitos nos cães infectados que, por ventura, estejam sob tratamento, torna-se

28 16 um risco iminente de reinfecçao aos seres humanos e animais que coabitem o mesmo ambiente que esse animal tratado (MODABBER 1989; ALVAR et al. 1994; REITHINGER, 2002; ROJAS et al BERMAN et al. 1982; Jackson 1990; Robledo et al ). No Brasil, o único antimoniato encontrado para uso comercial no Brasil é o Glucantime (antimoniato de N-metil glucamina) distribuído pelo sistema único de saúde, no entanto o Ministério da Saúde proibiu a utilização deste medicamento por veterinários em seus pacientes em virtude de ser um medicamento de uso humano, no tratamento de cães. Esta medida tem estimulado, por parte dos clínicos veterinários, a importação do medicamento, permanecendo o risco de surgimento de parasitos resistentes em decorrência da rotina de tratamento da LV canina.

29 Técnicas parasitológicas para o diagnostico da LV O exame parasitológico pode ser feito a partir de biópsias aspirativas esplênicas, medulares, hepáticas e de linfonódos das seguintes formas: 1ª) exame direto dos aspirados em lâminas por microscopia ótica; 2ª) microscopicamente, verificando os cultivos in vitro dos aspirados; e 3ª) inoculando animais de laboratório como os hamsters (Mesocricetus spp.), esperando o surgimento dos sinais clínicos para executar a detecção do parasito (BRASIL, 2006). No exame direto, esfregaços ou imprints são preparados, fixados em lâmina por uma solução alcoólica e corados (panótico) para posterior avaliação da presença de Leishmania sp. nos macrófagos (BRASIL, 2006). As amostras podem também ser inoculadas em meio de cultivo (meio monofásico de inseto Schneider ou meio bifásico - meio NNN Novy, MacNeal e Nicolle acrescido de agar sangue e coberto com um meio líquido RPMI 1624 contendo entre 10 30% de soro fetal bovino - SFB) e cultivadas por 4 a 5 semanas, a C, até que as promastigotas de Leishmania spp. possam ser visualizadas por microscopia invertida ou ótica (BARROUIN-MELO et al. 2006a; BRASIL, 2006; SCHUSTER & SULLIVAN, 2002; SINGH & SIVAKUMAR, 2003; SUNDAR & RAI, 2002). Por último, hamsters podem ser inoculados em laboratório, mas este procedimento não possui valor diagnóstico por requerer um tempo consideravelmente longo para que haja o desenvolvimento da sintomatologia e a confirmação diagnóstica (BRASIL, 2006). Assim, o exame parasitológico diagnóstico da LVC depende da punção de um órgão acometido pela infecção (baço, medula óssea, fígado e linfonódos) e na avaliação via cultivo (BARROUIN-MELO et al. 2006a, 2006b). As principais desvantagens desta técnica diagnóstica são: 1) a coleta invasiva; 2) tempo para avaliação diagnóstica; 3) necessidade de meios de cultivo; 4) contaminação devido à manipulação da amostra; e 5) o teste só pode ser feito em laboratórios

30 18 especializados. a) Teste de Aglutinação Direta (DAT) O teste de aglutinação direta permite o reconhecimento dos antígenos presentes em promastigotas na microplaca de poliestireno de fundo em V pelos anticorpos e na aglutinação, formando um produto visual que permite a leitura (EL-HARITH et al. 1987, 1988; SUNDAR & RAI, 2002). O teste é feito com 11 diluições seriais. A menor diluição onde a aglutinação ainda pode ser visualizada, é considerada o título do soro avaliado. O teste é lido 18 horas após a sua execução (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO & MELO, 2004; SUNDAR & RAI, 2002). O FAST é semelhante ao DAT podendo ser realizado em 3 horas, executado com apenas uma diluição e está sendo avaliado, apresentando sensibilidade e especificidade semelhantes ao DAT (SILVA et al. 2005). As desvantagens dos testes DAT e FAST estão relacionadas a dependência da reação antígeno-anticorpo que confirma a presença de anticorpos produzidos pelo hospedeiro, capazes de reconhecer os antígenos do parasito expostos, sofrendo aglutinação, permitindo a detecção visual. Além disso, a reatividade destes anticorpos pode acontecer com antígenos semelhantes de outros agentes infecciosos, permitindo a conclusão de resultados falso-positivos. Por último, a permanência da reatividade e produção de anticorpos por períodos longos é comum e impede a utilização destes exames para avaliação prognóstica (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO e MELO, 2004; SUNDAR & RAI, 2002). b) Teste Rápido Anticorpo para L. donovani (TRALd) O Teste Rápido Anticorpo para L. donovani (TRALd) está associado a adsorção de uma proteína (Ex. rk39) a uma tira de papel de nitrocelulose contendo, em

31 19 outra região da mesma fita de papel, proteína A ouro coloidal que, ao migrar pelo papel, permite a detecção da reação antígeno-anticorpo que produz um precipitado visível identificando o soro positivo (CERQUEIRA et al. 2003; GONTIJO & MELO, 2004). A desvantagem deste teste tem sido demonstrada em avaliações à campo onde sua sensibilidade tem sido inferior a de outros testes (Ex. DAT), possivelmente, devido as diferentes temperaturas ambientais, o que permite a desnaturação das proteínas associadas ao teste e ao menor tempo de migração das moléculas no papel filtro, por causa da rápida evaporação, gerando resultados falso-negativos. A segunda desvantagem é a leitura subjetiva, ocasionando resultados duvidosos (ZIJLSTRA et al., 2001). c) Imunofluorescência Indireta (IFI) A imunofluorescência indireta (IFI), ou teste com anticorpo imunofluorescente ( Immuno Fluorescent Antibody Test IFAT ), utiliza-se de lâmina de vidro com poços sensibilizados com promastigotas ou amastigotas de Leishmania sp. caracterizadas que, posteriormente, serão expostas ao soro do paciente e a um anticorpo conjugado a um fluorocromo e contra-corada com azul de Evans. Esta lâmina será então lida em microscópio de fluorescência. O resultado é a recíproca da maior diluição do soro do paciente onde a positividade ainda pode ser detectada (BRASIL, 2006). O kit de diagnóstico da Leishmaniose brasileiro, produzido por BioManguinhos (FIOCRUZ), utiliza promastigotas e apresenta 90% de sensibilidade e 80% de especificidade quando o ponto de corte escolhido é 1:40 (FIOCRUZ, 2006). Na Índia, títulos reativos, a partir de 1:20, são considerados significantes e títulos de 1:128 são considerados diagnósticos para leishmaniose. O uso da forma amastigota aumenta a sensibilidade para 96% e mantém a especificidade em torno de 98%, tendo sido capaz de excluir reatividade cruzada com antígenos de outros tripanossomatídeos em avaliações feitas na Índia (SINGH e SIVAKUMAR, 2003).

32 20 As desvantagens deste teste são o pequeno número de exames por lâmina (10 12 amostras por lâmina menos os poços para os controles positivo e negativo); a reatividade cruzada; a ocorrência de falsos-positivos e falsosnegativos; e o protocolo é trabalhoso e dificilmente feito a campo (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO & MELO, 2004; LEONTIDES et al. 2002; SINGH & SIVAKUMAR, 2003; SUNDAR & RAI, 2002). d) Ensaio de Imunoadsorção Ligado à Enzima (ELISA) O ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ), ensaio imunoenzimático (EIE) ou imunoensaio enzimático (EIA Enzyme ImmunoAssay ), faz uso de microplacas de poliestireno de 96 poços, preenchidas ou sensibilizadas com antígenos em concentrações variando de 100ng até 5µg por poço da placa (ATTA et al., 2004; BARROUIN-MELO et al., 2006a, 2006b; CABRERA et al., 1999; INIESTA et al., 2002; LEMESRE et al., 2005; METTLER et al., 2005; MORAES-SILVA et al., 2006; SAHA et al., 2005; SALOTRA et al., 2003; SOLANO-GALLEGO et al., 2001, 2003; TALMI-FRANK et al., 2006; VERCAMMEN et al., 2002; ZARAGOZA et al., 2003), muito embora quantidades diferentes, menores do que as citadas anteriormente, sejam relatadas em vários trabalhos, principalmente, com antígenos purificados ou recombinantes (BRAZ et al., 2002; METTLER et al., 2005; ZERPA et al., 2002; ZIJLSTRA et al., 2001). Existem algumas variações deste ensaio (direto, indireto, sandwich, captura, inibição, celular, etc), mas, para o diagnóstico da leishmaniose visceral, o mais amplamente utilizado tem sido o indireto, permitindo a avaliação do soro do animal infectado, mediante utilização de um sistema enzimático. Assim, diluições do soro suspeito são adicionadas a placa sensibilizada e bloqueada para, posteriormente, adicionar-se um anticorpo conjugado a uma enzima, peroxidase ou fosfatase alcalina (as mais comumente usadas), uma substância cromogênica e um substrato da enzima capaz de oxidá-la, permitindo a mudança de cor no poço da placa gerando uma leitura visual (subjetiva) ou

33 21 objetiva com o apoio de um espectrofotômetro, também conhecido como leitor de ELISA, com filtros de comprimento de onda específicos para o cromógeno utilizado (CROWTHER, 2001; GIBBS, 2006). A reatividade cruzada de diversos antígenos utilizados neste teste, compostos de extratos brutos ou crus, como o SLA (Antígeno solúvel de leishmania ou Soluble-Leishmania Antigen ), embora sejam amplamente utilizados para sensibilização das placas, têm sido demonstradas contra outras espécies de leishmania e com organismos filogeneticamente relacionados como o Trypanosoma cruzi (ALVES & BEVILACQUA, 2004; GONTIJO & MELO, 2004; METTLER et al., 2005; SUNDAR e RAI, 2002). A utilização do antígeno solúvel de promastigotas (SLA) ou de amastigotas de Leishmania sp., é recomendada para a avaliação epidemiológica em áreas endêmicas devido a sua alta sensibilidade e especificidade, detectando animais sintomáticos e assintomáticos com maior freqüência do que antígenos recombinantes, especificamente o antígeno rk39, além do seu menor custo e da facilidade de execução do teste ELISA quando comparado com técnicas mais laboriosas como o PCR (SREENIVAS et al., 2002; METTLER et al., 2005). A associação entre testes ELISA com antígeno solúvel (promastigotas ou amastigotas de Leishmania sp.) e com um antígeno recombinante, por exemplo, o rk39, levariam os resultados sorológicos para um nível superior (MAALEJ et al., 2003; METTLER et al., 2005). e) Western Blotting ou Immunoblotting O Western Blotting ou Immunoblotting depende da separação eletroforética (em campo elétrico) de proteínas em um gel de poliacrilamida ( PAGE ou SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrilamide Gel Electrophoresis ) que, posteriormente, é transferido para o papel de nitrocelulose ou fluoreto de polivinilideno ( PVDF PolyVinyliDene Fluoride ) e submetido aos anticorpos do soro do paciente e revelado com anticorpos conjugados a uma enzima

34 22 capazes de detectar as imunoglobulinas do soro do paciente (HARLOW e LANE, 1988). Esta técnica tem sido testada para o diagnóstico sorológico da leishmaniose (SINGH e SIVAKUMAR, 2003). A maior sensibilidade e especificidade do Western blotting ou Immunoblotting está relacionada ao fato de que os diferentes anticorpos produzidos em resposta a infecção podem reconhecer as diferentes frações do complexo antigêncio, separado eletroforeticamente, permitindo o reconhecimento de forma específica e individual, gerando perfis de reconhecimento distintos, capazes de confirmar e diferenciar a infecção por Leishmania de outros parasitos, além do monitoramento, do prognóstico do paciente e da detecção de reações cruzadas, como demonstrado nas revisões de Sundar e Rai (2002), Singh e Sivakumar (2003) e nos trabalhos de Atta (2004), Iniesta (2002), Lasri (2003), Saha (2005), Vercammen (2002), Zaragoza (2003) e seus colaboradores. A desvantagem desta técnica diagnóstica está na dificuldade de sua execução (pessoal treinado e equipamentos específicos), na produção do antígeno utilizado, e, assim como nas outras técnicas sorológicas, a ausência de resposta (imunossupressão), denota falsos-negativos (MATHIS e DEPLAZES, 1995; SINGH e SIVAKUMAR, 2003; SUNDAR e RAI, 2002). f) Intradermo Reação ou Reação de Montenegro A intradermo reação, reação de Montenegro, hipersensibilidade tardia do tipo IV ou DTH ( Type IV Delayed-Type Hypersensitivity ), detecta a resposta imune celular adquirida que se desenvolve pela ativação dos linfócitos T CD4+ sensibilizados, muito embora células TCD8+ também já tenham sido associadas. Estas células, após serem apresentadas ao antígeno pelas células apresentadoras de antígeno dos tecidos, as células de Langerhans, por exemplo, são estimuladas, tornando-se ativadas e respondendo ao estímulo antigênico com produção de, entre outras) e quimiocinas ( MIF?, TNF-a TNF-?citocinas (IL-2, IFN- Macrophage-Inhibition Factor, MCF Macrophage Chemotatic Factor e MAF - Macrophage Activating Factor ) que mediam a

35 23 atração para o sítio de inoculação e, posteriormente, ativam macrófagos, monócitos e linfócitos T. As células ativadas, entre elas os macrófagos, se acumulam causando inchaço e eritema local. O processo inflamatório instaurado induz os macrófagos a liberarem enzimas para o meio extracelular causando destruição tissular que pode ser detectada e medida após horas da inoculação do antígeno. Assim, na reação de Montenegro, são inoculados 100 a 500mL de uma solução contendo de 5x106 4x108.mL-1 promastigotas de Leishmania sp. mortas em solução veicular de salina com fenol em um braço e apenas a solução veicular no outro, que, após horas, produzirão, em pacientes sensibilizados e responsivos, uma reação com diâmetro maior ou igual a 5mm ou, em alguns relatos, 10mm (BRAZ et al., 2002; GONTIJO et al., 2002; KUBY et al., 1997; MARQUES et al., 2006; OPAS, 2006; ZERPA et al., 2002). Esta reação é geralmente ausente ou discreta em pacientes acometidos pela infecção aguda por Leishmania sp., indicando, em pacientes sintomáticos de área endêmica, a presença da infecção. Por outro lado, pacientes com reação positiva apresentam resistência à doença ou a presença de infecção na fase subclínica e, quando testados pós-tratamento, a positividade tem valor prognóstico positivo, indicando a cura (SINGH e SIVAKUMAR, 2003). As maiores desvantagens deste teste são: 1) a inexistência de um antígeno padronizado; 2) a reatividade cruzada com lepra lepromatosa e tuberculose glandular; e 3) a falta de estudos rigorosos a campo para a validação do seu uso diagnóstico e determinação dos valores de sensibilidade, especificidade e preditivos positivos e negativos (BRASIL, 2006; SINGH e SIVAKUMAR, 2003; SUNDAR e RAI, 2002) Eletroforese de Isoenzimas A eletroforese de isoenzimas ou eletroforese multilocular de enzimas MLEE - MultiLocus Enzyme Electrophoresis, é usada para avaliar a correlação

36 24 taxonômica entre diferentes organismos, como, por exemplo, na caracterização de cepas de Leishmania sp. (GONTIJO et al., 2002; MARTINEZ et al., 1999). A técnica MLEE utiliza-se de um suporte físico (gel) para a corrida eletroforética das enzimas em soluções aquosas. Eletromorfo é a denominação dos padrões eletroforéticos de separação e, os padrões eletromórficos conjuntamente recebem o nome de zimodema. Cada zimodema caracteriza as diferentes Leishmania sp. (BAÑULS et al., 1999; GONTIJO et al., 2002; MARTINEZ et al., 1999). Várias enzimas são utilizadas para avaliar as cepas de Leishmania como a malato desidrogenase NADP+ (MDH); malato desidrogenase NAD+ (ME); glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH); 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGDH); isocitrato desidrogenase (IDH); purina nucleosídio fosforilase (NP1 ou NP2); fosfoglucomutase (PGM); diaforase (DIA); glutamato oxaloacetato transaminase (GOT1 ou GOT2); mannose-fosfato isomerase (MPI); glicose fosfato isomerase (GPI); fumarato hidratase (FH); glutamato desidrogenase (GLUD); nucleoside hidrolase deoxiinosine (NH); peptidase d (PEP-D); alanina aminotransferase (ALAT); e aconitase (ACON), entre outras (BAÑULS et al., 1999; CHICHARRO et al., 2002; GONTIJO et al., 2002; MARTINEZ et al., 1999). A migração destas enzimas pode variar de acordo com à modificação das bases de DNA que determinam a codificação dos aminoácido que compõem a cadeia polipeptídica expressa pelo alelo homólogo de outra cepa de Leishmania sp., modificando a carga elétrica da enzima e, portanto, a migração eletroforética (ZAIDI, KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003). A desvantagem da MLEE está associada a avaliação dos produtos dos genes e não das sequências genéticas o que permite que mutações silenciosas passem desapercebidas e, assim, cepas distintas possam ser consideradas idênticas (ZAIDI, KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003; ZEMANOVÁ et al. 2004).

37 25 Outra desvantagem é a necessidade do cultivo de grandes quantidades de cada cepa a ser avaliada ou da amostra obtida e de amostras de referência para que a comparação possa ser feita, aumentando a chance de interferências e contaminações devido a manipulação. Outra desvantagem está relacionada ao baixo valor prognóstico e a ausência de poder de resolução para discernir enter recidivas e re-infecções (EL TAI et al., 2001; MORALES et al., 2001; ZAIDI, KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003). Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Esta técnica utiliza-se de sequências de 18 a 25 pares de bases ( primers ou iniciadores), em média 20 pares de bases, produzidas comercialmente e complementares as sequências-alvo no material genético da amostra a ser avaliada (DNA ou RNA molde), na presença de excesso de dntps (datp, dctp, dgtp e dttp), a enzima Taq DNA polimerase, o íon divalente magnésio (Mg++) na forma de MgCl2 ou MgSO4 em concentrações variadas (1 4mM), em solução tampão Tris-HCl (10-50mM e ph=8,3 8,8) contendo uma concentração máxima de 50mM de KCl, embora outras formulações existam (INNIS, 1989). A reação é feita em um equipamento chamado de termociclador ou máquina de PCR que altera as temperaturas rapidamente (4 C até 100 C), passando pelas temperaturas de desnaturação, C; anelamento, C; e extensão, geralmente, 72 C. Durante a desnaturação, o DNA é separado em duas fitas simples; no anelamento, ocorre a interação dos iniciadores com a sequência de DNA-alvo; e, na extensão, a cópia do DNA é feita pela Taq DNA polimerase. Esta reação é feita de forma cíclica (20 40 ciclos) levando a detecção de um produto que, quando corado por brometo de etídio ou SYBR green, se torna visível sobre uma lâmpada ultravioleta (UV) após a separação eletroforética (HOWELL, JOBS e BROOKES, 2006; INNIS, 1989). A utilização das diversas variantes da técnica de PCR (PCR-RFLP; PCR-SSCP; NESTED-PCR; Multiplex-PCR, Real Time-qPCR, entre outras) na avaliação da

38 26 diversidade genética se torna um aspecto crucial em campos como a taxonomia, o diagnóstico, a avaliação epidemiológica, a genotipagem e a genética de populações dos agentes causadores das leishmanioses, assim como outras doenças, e vem sendo amplamente difundida e utilizada, com resultados que apresentam alta sensibilidade e especificidade, além de excelente repetibilidade e eficácia (CORTES et al., 2004; EL TAI et al., 2001; FERROGLIO et al., 2005; HARRIS et al., 1998; KUHLS et al., 2005; ROTUREAU et al., 2006; ZAIDI KONSTANTINOU e ZERVOS, 2003). A sensibilidade desta técnica está associada a quantidade de DNA-alvo presente na amostra coletada e, assim, genes ou seqüências de DNA multicópias, aumentam este parâmetro. A especificidade, por sua vez, correlacionase com todo o resto (todos os outros reagentes da reação) e, primordialmente, com a seqüência dos primers (BENSOUSSAN et al., 2006; INNIS, 1989). As desvantagens desta técnica estão relacionadas ao 1º) seu alto custo financeiro; 2º) a necessidade de estudos das seqüências genômicas dos alvos a serem avaliados para a definição da seqüência dos primers ; 3º) a necessidade de áreas isoladas para cada etapa da reação (preparação dos tubos de reação, extração de DNA e análise dos produtos); e 4º) a impossibilidade atual de execução à campo.

39 RESERVATÓRIOS A definição corrente de reservatório abrange qualquer ser humano, animal, artrópode, planta ou matéria inanimada onde vive e se multiplica um agente infeccioso, do qual depende para sua sobrevivência, reproduzindo-se de maneira a que possa ser transmitido a um hospedeiro suscetível. (Amer. Assoc. Publ. Health). Um reservatório de infecção é definido como o sistema ecológico em que um agente infeccioso sobrevive persistentemente (WHO, 1984). Hospedeiro, segundo a Associação Americana de Saúde Pública, é a pessoa ou animal vivo, inclusive aves e artrópodes, que, em circunstâncias naturais permitem a subsistência ou o alojamento de um agente infeccioso. O hospedeiro primário ou definitivo é aquele em que o agente chega à maturidade ou passa por sua fase sexuada. O secundário ou intermediário é aquele que se encontra em fase larvária ou assexuada. ASHFORD (1996) enfatiza a importância de se conhecer a taxonomia tanto dos prováveis reservatórios quanto das espécies de vetores incriminadas no ciclo de transmissão das leishmanioses e define o hospedeiro reservatório como sendo um mamífero responsável pela manutenção, por longo tempo, de uma população de agentes infecciosos. Desta forma, teoricamente, a eliminação do hospedeiro reservatório implicaria na eliminação do agente etiológico presente no foco doença, no entanto, no caso das leishmanioses, às vezes, é possível prevenir a transmissão do parasito sem necessariamente eliminar o hospedeiro reservatório. A incriminação de um determinado reservatório de Leishmania exige a demonstração de que a população parasitária precisa daquele mamífero em particular para a manutenção da infecção. Cinco são os critérios que caracterizam um reservatório primário: 1) superposição da distribuição geográfica e temporal dos reservatórios e vetores; 2) sobrevivência do hospedeiro reservatório suficientemente longa para garantir a transmissão; 3) prevalência da infecção entre os reservatórios em níveis superiores a 20%; 4) manutenção do parasito na

40 28 pele ou sangue em quantidades suficientes para infectar facilmente o vetor e 5) a espécie de parasito encontrada no reservatório e no homem ser a mesma (CHABLE-SANTOS et al., 1995). Por outro lado, de acordo com Shaw (1988), os hospedeiros podem ser classificados em três tipos: 1) reservatório primário, onde o hospedeiro é responsável pela manutenção do ciclo do parasito em natureza; 2) reservatório secundário, em que o hospedeiro infectado serve como fonte de infecção para o vetor, mas não é capaz de manter o ciclo indefinidamente e 3) hospedeiro acidental, aquele que se infecta mas não representa fonte de infecção Cão (Canis familiaris) Atualmente, o cão vem sendo incriminado como reservatório da LV, e, como hospedeiro doméstico dessa zoonose, sendo provavelmente, o mais importante reservatório natural relacionado com casos humanos (ALENCAR, 1959; MILES et al., 1999; MONTEIRO et al. 2005). Esse hospedeiro apresenta variações no quadro clínico da doença, passando de animais aparentemente sadios a oligossintomáticos podendo chegar a estágios graves da doença, com intenso parasitismo cutâneo (ABRANCHES et al. 1991; COSTA et al. 1999; DEANE & DEANE, 1955b). Assim, o cão representa uma fonte de infecção para o vetor, sendo um importante elo na transmissão da doença para o homem (DEPLAZES et al., 1995). Outrossim, esse papel mantenedor da infecção leishmaniotica em determinada região pode ser incrementado pela coexistência de outros fatores, como a presença de espécies selvagens sinantrópicas, atuando como potenciais fontes de infecção para a população canina em áreas peri-urbanas (MUTINGA et al., 1989; XIMENES, SOUZA e CASTELLÓN, 1999; ALEXANDER et al., 2002; SILVA, 2003). LYSENKO (1971) sugere que a leishmaniose causada pela L. donovani originou-se de canídeos selvagens (raposas, chacais e lobos) na Ásia Central, e que posteriormente acometeu o cão devido ao seu estreito contato com o homem.

41 29 Em cães, a Leishmania coloniza todos os órgãos, em contraste com o que ocorre em seres humanos, nos quais o parasito está quase que totalmente restrito ao sistema hematopoiético (BERRAHAL et al. 1996). MARZOCHI e colaboradores (1985) ao analisar epidemiologicamente a LV, consideraram a doença canina mais importante que a humana devido a sua alta prevalência nas áreas endêmicas, em virtude do intenso parasitismo dérmico desenvolvido pelos cães. Outro fator marcante incide no fato de ser elevado o número de cães infectados e assintomáticos que passam desapercebidos pelos proprietários e pelo serviço de vigilância epidemiológica, o que retarda a identificação e retirada destes cães das áreas, contribuindo para a continuação do ciclo de transmissão do parasito. O Nordeste Brasileiro segundo ASHFORD (1996) é considerado uma zona de alta prevalência de LV canina e estima que 20 a 30% da população canina esteja permanentemente infectada. O autor ressalta, também, que a queda de pêlos em cães, normalmente observada nos casos clínicos, expõe grandes áreas do corpo do animal a elevado parasitismo, tornando-o uma fonte de infecção importante em virtude de facilidade do acesso do vetor ao corpo do hospedeiro. Os cães são considerados por LAINSON (1988) como hospedeiro amplificador da LV, principalmente em estágios avançados da doença, em virtude do intenso parasitismo dérmico. No entanto, o curso, muitas vezes, letal da doença nesta espécie sugere que o cão é um hospedeiro relativamente recente da L. chagasi e a relação parasito-hospedeiro se encontra ainda pouco ajustada. Fato que fica mais aparente pela comparação com a infecção clinicamente assintomática, normalmente, observada em canídeos selvagens (LAINSON, 1988). A importância do reservatório canino é ainda mais acentuada em virtude de falhas na aplicação das medidas de controle nesta espécie, principalmente no tocante ao diagnóstico sorológico da LV. A utilização ainda freqüente do teste IFI (imunofluorescência indireta) no diagnóstico da LV canina, como observado por CABRERA e colaboradores (2003) induz a resultados falso-negativos, acarretando

42 30 a permanência de animais infectados na área, contribuindo para a manutenção da endemicidade.

43 Animais Selvagens A possível existência de reservatórios selvagens ajuda na perpetuação do parasito numa região endêmica, tendo em vista que as medidas de controle da LV estão restritas à eliminação de cães soropositivos, à borrifação do peridomicílio e domicílio com inseticida de ação residual e ao diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos (CABRERA, 2003). O acúmulo de lixo, bem como, a criação de animais domésticos para o consumo humano, a exemplo de galinhas, potencializa a participação de possíveis reservatórios selvagens a exemplo do Cerdocyon thous (raposa) e do D. albiventris (sariguê) e Rattus rattus (rato preto) na epidemiologia da LV, uma vez que contribuem para atrair estas espécies para a proximidade do convívio humano (ALEXANDER et al., 2002). No continente americano, as raposas (Lycalopex sp., Cerdocyon sp.) e marsupiais (Didelphis spp.) têm sido incriminado como hospedeiros reservatórios selvagens do agente causal da LV (SHERLOCK et al., 1988; LAINSON, 1990). Além das espécies de marsupiais e canídeos selvagens, freqüentemente incriminados como reservatórios potenciais de diversas espécies de leishmania, estes protozoários têm sido isolados de outros hospedeiros selvagens, a exemplo do tatu (Dasypus novemcinctus), segundo relato de LAINSON e colaboradores (1979) que encontraram um espécime infectado, e alertaram sobre a possibilidade desta espécie interagir no ciclo de transmissão da leishmaniose. Em 1982, LAINSON e colaboradores relatam a co-infecção por Leishmania sp. e Trypanossoma cruzi em tatus em estudo objetivando comparar o perfil enzimático de diversas espécies de Leishmania. LAMPO e colaboradores (2000) consideram que morcegos possam servir como fonte alimentar para o L. longipalpis e conseqüentemente aventam a possibilidade

44 32 de servirem como hospedeiro de Leishmania sp. Acreditam ainda que se os morcegos se enquadrarem nesse papel, poderão estar perpetuando o parasito no ambiente selvagem alem de outras espécies já conhecidas como os canídeos e marsupiais. Sendo assim, LAMPO e colaboradores (2000), ampliam o campo de visão no tocante a epidemiologia dessa zoonose. GIANNINI (1985) destaca a importância, tanto do Rattus rattus, quanto do Rattus norvegicus como importantes reservatórios de muitas doenças humanas em virtude do caráter sinantrópico dessas espécies. A natureza cosmopolita dos ratos e suas freqüentes migrações, seja por enchentes, falta de alimento ou, involuntariamente, através de navios e outros meios de transporte são possíveis fatores de difusão da L. chagasi (LAINSON, 1988). Através de técnicas moleculares TRAVI e colaboradores (1998), pela primeira vez, demonstraram que o roedor Proechimys pode ser infectado por L. chagasi. LAINSON et al. (2002) sugerem a participação do roedor da espécie Proechimys canicollis como possível hospedeiro reservatório da L. chagasi na Colômbia. HOOSGSTRAL & HYNEMAN (1969) relatam sobre a possibilidade de carnívoros (Felis serval e Genetta) terem se infectado por via oral com leishmania ao ingerirem roedores. O possível envolvimento da espécie de réptil Tarentola mauritanica (gecko), atuando como reservatório da leishmaniose cutânea foi comentada por BELOVA (1971).

45 Raposas Canídeos selvagens são incriminados em diversas regiões do mundo como reservatórios da LV (DEANE & DEANE, 1954; ALENCAR, 1956; ABRANCHES et al. 1984). DEANE & DEANE (1954) utilizaram um espécime de Lycalopex vetulus infectado com L. chagasi para avaliar o potencial desta espécie de infectar vetores que nela se alimentem, e verificaram que todos os dez flebótomos utilizados no experimento, não só foram atraídos a se alimentarem no animal, como todos se apresentaram infectados posteriormente. DEANE & DEANE (1955a) ao examinarem 33 raposas (Lycalopex vetulus) encontraram 12,1% (4/33) infectados. DEANE & DEANE (1962) consideram a Lycalopex vetulus (raposa) um reservatório recente da L. donovani em virtude do grau de severidade da doença para essa espécie, ou seja, o fato da raposa adoecer quanto infectada por Leishmania indica que este animal não está tão bem adaptado como outros possíveis reservatórios da leishmaniose. Os autores comentam que a eliminação desta espécie nas áreas habitadas pelo homem parece ser uma medida de controle complementar importante que traria vantagens adicionais como a redução dos casos de raiva. As raposas podem servir como agentes introdutores da leishmaniose em novas áreas em virtude de que esses animais percorrerem longas distâncias, aproximando-se com freqüência de cães de rua na busca por alimentos nas lixeiras de áreas residenciais (LAINSON, 1988). Na região Nordeste do Brasil a espécie de raposa Cerdocyon thous corresponde ao principal reservatório silvestre da L. chagasi (COURTENAY, 1996).

46 Marsupiais O gambá, também chamado de mucura na Amazônia e Brasil Meridional, de sarigué, sariguê, saruê ou sarigueia na Bahia, de timbú ou cassaco de Pernambuco ao Ceará, e de micurê no Mato Grosso é um mamífero marsupial do gênero Didelphis. O nome gambá tem origem na língua tupi-guarani, onde "gã'bá" ou "guaambá" significa uma mama oca, uma referência ao marsúpio, a bolsa ventral onde se encontram as mamas e onde os filhotes vivem durante parte de seu desenvolvimento (WIKIPEDIA, 2006). Nas Américas, os marsupiais pertencentes à família Didelphidae que comporta 65 espécies divididas em 12 gêneros (HUNSAKER, 1977). Espécies do gênero Didelphis têm sido apontadas como potenciais reservatórios de Leishmania sp. e, em vista do hábito sinantrópico ser uma característica que permeia este gênero, a importância destas espécies para a saúde pública deverá, no futuro, ser considerada, incluindo na pauta das pesquisas, estudos sobre a biologia, dinâmica populacional, hábito alimentar e papel epidemiológico destas espécies. Vários pesquisadores têm se esforçado em contribuir para o conhecimento sobre a relação entre os marsupiais e as leishmanioses, a seguir listaremos os principais autores e suas observações sobre o tema: SHERLOCK e colaboradores (1984) analisando possíveis infecções leishmanióticas em mamíferos silvestres no município de Jacobina (Bahia - Brasil) relatam o primeiro registro de um marsupial (D. albiventris), conhecido localmente como gambá, infectado naturalmente por L. donovani. Apesar do trabalho realizado por YOSHIDA e colaboradores (1979) que examinaram 10 marsupiais (D. marsupialis aurita) e cinco roedores por hemocultura e inoculação intradérmica de punção de fígado e baço em hamster. Dessas inoculações, apenas uma amostra proveniente de um dos marsupiais apresentou resultado positivo. A

47 35 caracterização bioquímica do parasito isolado demonstrou, tratar-se de uma infecção por Leishmania mexicana (GRIMALDI JR., et al. 1985). DEDET e colaboradores (1989) durante uma investigação epidemiológica sobre a leishmaniose cutânea na Guiana Francesa, entre os anos de 1981 e 1987, capturaram, 122 marsupiais (D. marsupialis), dos quais apenas dois animais estavam infectados por L. braziliensis guyanensis. Outra espécie também capturada foi o D. albiventris, num total de sete espécimes, porem nenhum deles apresentou infecção. Pelo baixo número de animais infectados, DEDET e colaboradores (1989) creditam aos didelfídeos o papel de hospedeiro ocasional, concordando com o sugerido por LAINSON e colaboradores (1981). CORREDOR e colaboradores (1989b) identificaram a presença de L. chagasi em 32,4%, sendo que em 12/37 dos exemplares de D. marsupialis capturados em uma área endêmica na Colômbia, próximo às residências humanas. Os autores concluem que o D. marsupialis representa um reservatório ideal de L. chagasi devido à sua elevada abundância nas áreas endêmicas, sua prolificidade e seu comportamento sinantrópico. CÁCERES (2003) ao estudar o comportamento do D. aurita quanto ao modo como essa espécie animal interagia em seu habitat natural avaliando a amplitude de seu deslocamento e variação alimentar que consumia, em um fragmento de floresta no sul do Brasil, relata que em virtude das fêmeas desses animais serem maiores, mais pesadas e conseqüentemente menos ágeis elas se concentram em regiões onde a fonte de recursos como água e alimentos são mais abundantes. Em decorrência disso, os machos didelfídeos, acompanham esse condicionamento, principalmente, durante o período reprodutivo se aproximando de áreas habitadas pelas populações humanas. TRAVI et al (1998a) avaliaram a relação hospedeiro parasito vetor em marsupiais infectados experimentalmente com L. chagasi, utilizando recursos clínicos,

48 36 parasitológicos, histopatológicos e entomológicos, visto que tentativas anteriores de infectar o D. marsupialis tinham se mostrado de difícil realização segundo SHERLOCK e colaboradores (1988). As culturas de aspirado esplênico demonstraram altíssima carga parasitária quando comparados aos demais tecidos, sendo seguida por linfonodos, fígado e sangue. Os autores relataram que D. marsupialis infectados por L. chagasi com quadro subclínico da doença não apresentaram alterações hepáticas significativas. A ausência de formas amastigotas na pele e em órgãos linfóides de um marsupial com título 1:320 para leishmania já havia sido observada por outros autores, tanto em infecção natural quanto experimental. No entanto, neste caso, o parasito pode ser detectado através de inoculação intra-dérmica em hamsters. Este resultado confirma estudos prévios e reforça o fato de que marsupiais podem estar naturalmente infectados sem apresentar sintomas clínicos, mas mantendo o parasito em seus tecidos (CABRERA, 2003). TRAVI et al (1998b) estudando a dinâmica de infecção por L. chagasi em pequenos mamíferos em duas áreas de floresta tropical seca (uma reserva florestal protegida e uma área agrícola) dentro de uma área endêmica para LV na Colômbia e observaram a ocorrência de duas espécies mais comumente positivas para LV, o D. marsupialis e o Proechimys canicollis. Os autores obtiveram por PCR 14,3% (3/21) de prevalência de infecção nos D. marsupialis capturados na área de reserva e 9,5% (13/137) dentre os marsupiais capturados na área agrícola. Não foi registrada diferença significativa na taxa de infecção em D. marsupialis quando comparado ao fator sexo, todavia animais adultos se apresentaram infectados com mais freqüência do que os exemplares jovens. ADLER et al. (1997) relata sobre a capacidade de adaptação do D. marsupialis à ambientes alterados pela ação antrópica, corroborando as observações de TRAVI e colaboradores (1998b) que observaram um número maior destes marsupiais em um campo agrícola quando comparado com uma reserva florestal.

49 37 A realização do presente trabalho objetivou ampliar o conhecimento sobre a epidemiologia da LV, com especial ênfase na avaliação da participação da espécie D. albiventris no ciclo de transmissão da doença e na prevalência da população canina residente em uma localidade endêmica para LV situada no município de Camaçari, Bahia.

50 38 3. ARTIGOS CIENTIFICOS ARTIGO ENCAMINHADO A REVISTA CIENCIA ANIMAL BRASILEIRA

51 39 Pesquisa sobre o envolvimento do marsupial Didelphis albiventris Lund, 1840 (Didelphimorphia, Didelphidae) e de cães domiciliados na epidemiologia da leishmaniose visceral no município de Camaçari, localidade de Barra do Pojuca, Bahia GOMES NETO 1, C.M.B; FRANKE 2, C.R.; ALCANTARA 1, A.C.; BARBOSA 3, A.E.A., URBAN, J.M.; STÖCKER, A.; GOMES 4, S.P.S.B.; BISPO 4, A.C.; LEAL 5, D.C.;BITTENCOURT 5, D.V.V.; CARNEIRO 5, A.J.B. 1 Mestrando (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos); 2 Prof. Dr. da Escola de Medicina Veterinária UFBA; 3 Biólogo; 4 Médico Veterinário Autônomo; 5 Acadêmicos de graduação de Medicina Veterinária - UFBA RESUMO O marsupial Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) vem sendo citado na literatura como importante reservatório de algumas zoonoses, dentre elas a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose cutânea, a Doença de Chagas, doenças consideradas pela O.M.S. como endemias de ação prioritárias. Nosso estudo na localidade de Barra do Pojuca, Camaçari, Bahia, avaliou a prevalência da LV em marsupiais e cães pelas técnicas de ELISA e PCR. Os resultados apontam para uma participação da espécie D. albiventris na epidemiologia da doença com uma soroprevalência de 26,7% (4/15) e 64,7% (11/17) positivos na PCR. A prevalência da população canina foi de 15,6% (39/253), mostrando que comparada a estudos realizados em 2003 esta taxa não tem diminuído, apesar do controle vetorial e do reservatório canino realizado pelos agentes da saúde na área. Os resultados mostram a necessidade de ampliar o conhecimento, buscando definir com clareza o papel da espécie D. albiventris no ciclo de transmissão da L. chagasi e o risco que representa para as populações humanas e caninas nas áreas endêmicas. PALAVRAS-CHAVE: leishmaniose visceral, Didelphis albiventris, reservatório selvagem, Leishmania chagasi, Bahia

52 40 THE EVALUATION OF OPOSSUM Didelphis albiventris LUND, 1840 (DIDELPHIMORPHIA, DIDELPHIDAE) AND DOMICILIATED DOGS INVOLVEMENT IN THE VISCERAL LEISHMANIASIS TRANSMITION CYCLE IN THE MUNICIPALITY OF CAMAÇARI, LOCALITY OF BARRA DO POJUCA, BAHIA. Salvador, Bahia, p. Dissertação de Mestrado (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, SUMMARY The opossum Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) has been considered an important reservoir of some zoonosis in the literature, like visceral and cutaneous leishmaniasis and Chagas disease, which are considered by WHO as high priority endemic diseases. Our study, carried out in the area of Barra do Pojuca (Camaçari, Bahia), evaluated the visceral leishmaniasis seroprevalence in opossum and dogs using indirect ELISA and PCR. The findings point out the involvement of D. albiventris in the disease epidemiology, presenting a seroprevalence of 26,7% (4/15) and 64,7% (11/17) positivity by PCR. The canine population prevalence reached 15,6% (39/253), showing that, compared to a study performed in 2003, its prevalence is not decreasing, despite vector and canine reservoir control has been done by the health control agents in the area. The results presented here clearly ask for an increase of knowledge, looking to define properly the role of D. albiventris in the Leishmania chagasi transmission cycle and risk for human and canine populations in the endemic areas. KEYWORDS: Visceral Leishmaniasis, Didelphis albiventris, wild reservoirs, Leishmania chagasi, Bahia

53 41 INTRODUÇÃO O marsupial Didelphis albiventris LUND, 1840 (Mammalia, Marsupialia) vem sendo citado na literatura com importante reservatório de algumas zoonoses, dentre elas a leishmaniose visceral (LV), a leishmaniose cutânea, a Doença de Chagas (SHERLOCK et al., 1984, 1996; LLANOS-CUENTAS, 1999; HERRERA et al., 2005; JANSEN et al., 1991, 1997), doenças consideradas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como endemias de ação prioritárias (WHO 1997). SHERLOCK (1984) fez o primeiro relato sobre a infecção do D. albiventris por leishmania e a cepa isolada foi identificada como Leishmania donovani, o marsupial foi capturado no município de Jacobina, Bahia. Após este relato, CORREDOR et al. (1989), na Colômbia, examinaram 37 exemplares de D. marsupialis, encontrando 12 (32,4%) infectados por Leishmania chagasi sem apresentarem sinais clínicos da doença, segundo os autores, estes marsupiais ocorrem em abundância nas áreas endêmicas do país. TRAVI et al. (1998b) encontrou exemplares de D. marsupialis infectados por L. chagasi na Colômbia, e comparando a freqüência de captura e prevalência da infecção em uma área de reserva florestal (14,3%, 3/21) e em uma área de floresta degradada (9,5%, 13/137), concluido que a espécie representa um importante reservatório de L. chagasi e que estes marsupiais apresentam elevada capacidade de adaptação a ambientes antropizados, representando um risco para a saúde pública. CABRERA et al. (2003) em um estudo de foco de LV em Barra de Guaratiba, Rio de Janeiro, obtiveram nos D. marsupialis capturados em uma área uma soroprevalência de infecção por L. chagasi, 29% (9/31) de positividade demonstrando o envolvimento desta espécie de marsupial na epidemiologia da LV. Estes resultados tornam evidente a necessidade de aprimorarmos o conhecimento sobre este potencial elo do ciclo de transmissão da L. chagasi em áreas endêmicas com vistas a um melhor delineamento das ações de controle desta zoonose. O presente estudo objetivou avaliar a prevalência de infecção por L. chagasi nas populações de D.

54 42 albiventris e de cães domésticos em uma localidade do Estado da Bahia, e analisar a possível associação epidemiológica entre estas espécies na manutenção do endemismo da LV na região estudada. MATERIAIS E MÉTODOS O estudo foi realizado na localidade de Barra do Pojuca, município de Camaçari (12º42'S e 38º20'O), Bahia no período de junho de 2005 a maio de A localidade é situada a cerca de 50 km da cidade de Salvador, capital do Estado. A população de Camaçari é de habitantes segundo o censo demográfico realizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2000). O município apresenta clima úmido, o período chuvoso ocorre entre os meses de abril e junho, a média pluviométrica anual é superior a mm e a temperatura média anual é de 25,4ºC. Com base em ortofotos (1:8.000) da localidade de Barra do Pojuca, a área foi dividida em 150 quadrantes com área de m 2 cada, dos quais, por critério de alternância, 65 deles foram incluídos no estudo. A escolha do município Camaçari como área de estudo para o possível envolvimento de marsupiais na epidemiologia da LV levaram em consideração os seguintes aspectos: 1) A crescente incidência da doença registrada nas populações humana e canina residentes nesta região; 2) A alta densidade populacional encontrada neste município, representando um ambiente propício ao surgimento de focos epidêmicos da doença; 3) O acelerado desenvolvimento deste município e migração de pessoas e animais possivelmente infectados. A contínua pressão migratória, em sinergismo com as decorrentes alterações ambientais e o crescimento desorganizado deste centro urbano, com assustadores índices de pobreza e baixa qualidade de vida,

55 43 são fatores presentes em todos os focos epidêmicos da leishmaniose visceral, descritos na literatura mundial Nos quadrantes selecionados procedeu-se a colocação de 25 armadilhas colapsáveis do tipo Tomahawk e Sherman utilizando-se banana, abacaxi, ovos e mamão como isca para atrair os marsupiais. As armadilhas foram dispostas ao entardecer e recolhidas até as oito horas do dia seguinte, permanecendo este período uma vez em cada quadrante. Os marsupiais capturados foram anestesiados com uma combinação de Cloridrato de cetamina (Ketamina Agener Ketamina 10% - Agener União) e Cloridrato de Xilazina (Calmium Xilazina 2% - Agener União) na proporção de 1:2, utilizando-se a dose de 0,3 ml/kg de peso vivo. Com o animal anestesiado, procedeu-se a coleta de até 3 ml de sangue por punção intra-cardíaca ou punção da veia da caudal. Todos os procedimentos foram precedidos de tricotomia e rigorosa assepsia local. A captura dos marsupiais ocorreu com a devida permissão do IBAMA (Protocolo Nº /04-70) e todos os animais, após se recuperarem da anestesia, foram soltos no mesmo local da captura. Nos quadrantes em que havia casas com cães, em cada casa, foi aplicado um questionário (dados não publicados) aos proprietários e todos os cães residentes foram contidos fisicamente, com utilização de mordaças, submetidos à coleta de uma amostra de 3 a 5 ml de sangue por punção venosa cefálica ou jugular, sem utilização de anestésicos e, posteriormente as amostras foram destinada `a sorologia por ensaio imunoenzimático (ELISA) e ao diagnóstico pela PCR, assim como as amostras coletadas nos marsupiais. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas, específicas para cada um dos dois testes, e conservadas a 20ºC até o momento de uso.

56 44 A localização dos quadrantes foi feita através do sistema de posicionamento global GPS (Garmim 12 canais GPS45). Figura 1. Composição artificial da área de estudo (localidade de Barra do Pojuca Camaçari - Bahia). a partir de cinco ortofotos produzidas pela Conder e editadas com auxilio do software Photo Stich Cânon para alinhamento perfeito das projeções