Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ

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1 Setembro de 2010 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 24 Versão 1 Diagnóstico in vitro qualtitativo Para utilização com os instrumentos QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene PT QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R PT Sample & Assay Technologies

2 Tecnologias de amostragem e ensaio da QIAGEN A QIAGEN é o principal fornecedor de tecnologias inovadoras de amostragem e ensaio, permitindo o isolamento e a detecção do conteúdo de qualquer amostra biológica. Os produtos e serviços avançados e de elevada qualidade da nossa empresa são garantia de sucesso, desde a amostra ao resultado. A QIAGEN é uma empresa de referência em matéria de: Purificação de ADN, ARN e proteínas Ensaios de ácidos nucleicos e proteínas Investigação em microarn e ARNi Automatização de tecnologias de amostragem e ensaio A nossa missão permitir-lhe-á alcançar o sucesso, bem como resultados notáveis. Para mais informações, visite

3 Índice Conteúdo do kit 4 Símbolos 4 Armazenamento 5 Utilização prevista 5 Limitações de utilização do produto 5 Assistência Técnica 6 Informações sobre segurança 6 Controlo de qualidade 7 Introdução 8 Fundamento 8 Informação sobre o patogénio 8 Características de desempenho 9 Etapas do procedimento 16 Equipamento e reagentes a serem fornecidos pelo utilizador 21 Notas importantes 23 Precauções gerais 23 Preparação dos instrumentos QIAsymphony SP/AS para utilização 23 Preparação do material de amostra 26 Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) 27 Utilização de um controlo interno 27 Conjuntos de controlo de ensaio e conjuntos de parâmetros de ensaio 28 Retornos de ácidos nucleicos 28 Armazenamento de ácidos nucleicos 28 Protocolos Isolamento de ADN no QIAsymphony SP 30 Configuração do ensaio no QIAsymphony AS 37 PCR e Análise de Dados no Rotor-Gene Q 48 Guia de resolução de problemas 57 Referências 63 Informações para encomenda 64 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010 3

4 Conteúdo do kit Kit artus HSV-1/2 QS-RGQ (24) N.º de catálogo Número de reacções 24 Azul HSV-1/2 RG Master 3 x 300 μl Amarela HSV-1/2 RG Mg-Sol* Vermelha HSV-1 RG PC (100 cópias/μl) Castanha HSV-2 RG PC (100 cópias/μl) 600 μl 200 μl 200 μl Verde HSV-1/2 RG IC 1000 μl Branca Água (grau PCR) 1000 μl Manual 1 * Solução de magnésio. Control positivo. Control interno. Símbolos <N> Contém reagentes suficientes para <N> testes Prazo de validade Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Número de catálogo Número de lote Número do material Componentes Contém 4 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

5 Número Limitação de temperatura Fabricante legal Consulte as instruções de utilização Nota importante Armazenamento Os componentes do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ devem ser armazenados a 20ºC e são estáveis até ao prazo de validade impresso no rótulo. Deve evitarse repetir o processo de descongelamento e congelamento (>2 vezes), uma vez que pode reduzir a sensibilidade do ensaio. Se os reagentes se destinarem a ser usados de forma intermitente, devem ser congelados em alíquotas. O armazenamento a 2 8 C não pode exceder um período de 5 horas. Utilização prevista O kit artus HSV-1/2 QS-RGQ é um teste de amplificação de ácidos nucleicos in vitro para a detecção e a discriminação de DNA de vírus do herpes humano simples 1 e 2 em líquido cefalorraquidiano humano (LCR). Este kit de teste diagnóstico utiliza a reacção em cadeia da polimerase (PCR) e está configurado para utilização com os instrumentos QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene Q. O kit artus HSV-1/2 QS-RGQ foi concebido para utilização em conjunto com o quadro clínico e outros marcadores laboratoriais para prognóstico da doença. Limitações de utilização do produto Todos os reagentes podem ser exclusivamente utilizados em diagnóstico in vitro. O produto deve apenas ser utilizado por pessoal com formação específica em procedimentos de diagnóstico in vitro (EN375) e devidamente instruído para o efeito. Para resultados de PCR óptimos, é necessário que as instruções do manual de utilizador sejam rigorosamente observadas. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010 5

6 Deve prestar-se atenção aos prazos de validade impressos na caixa e nas etiquetas de todos os componentes. Não utilize componentes cujo prazo de validade tenha expirado. Embora rara, a ocorrência de mutações nas regiões altamente conservadas do genoma viral cobertas pelos iniciadores (primers) e/ou sonda do kit pode resultar em sub-quantificação ou falha em detectar a presença do vírus. A validade e o desempenho do ensaio são revistos regularmente. Assistência Técnica Na QIAGEN, orgulhamo-nos da qualidade e da disponibilidade da nossa assistência técnica. Os nossos departamentos de assistência técnica são compostos por cientistas experientes com conhecimentos práticos e teóricos abrangentes em tecnologias de amostragem e ensaio e utilização dos produtos QIAGEN. Se tiver alguma dúvida ou dificuldade em relação ao kit artus HSV- 1/2 QS-RGQ ou aos produtos QIAGEN de um modo geral, não hesite em contactar-nos. Os clientes da QIAGEN são a principal fonte de informação no que diz respeito às utilizações avançadas ou especializadas dos nossos produtos. Estas informações são úteis a outros cientistas, bem como aos investigadores da QIAGEN. Por conseguinte, incentivamo-lo a contactar-nos caso tenha alguma sugestão acerca do desempenho dos produtos ou de novas aplicações e técnicas. Para obter assistência técnica e mais informações, consulte o nosso Centro de Suporte Técnico em ou contacte um dos Departamentos da Assistência Técnica ou distribuidores locais da QIAGEN (consulte o verso do manual ou visite Informações sobre segurança Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre um avental de laboratório adequado, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, por favor consulte as folhas adequadas de dados de segurança do material (MSDSs). Estas estão disponíveis online no formato PDF, prático e compacto, no endereço onde poderá encontrar, visualizar e imprimir as MSDSs para cada kit da QIAGEN e respectivos componentes. Para informações de segurança sobre o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini, consulte o Manual QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Para informações de segurança relativas aos instrumentos, consulte o manual do utilizador dos instrumentos relevantes. Elimine as amostras e os resíduos do ensaio de acordo com os regulamentos de segurança locais. 6 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

7 Informações de emergência 24 horas Poderão ser obtidas informações de emergência médica em inglês, francês e alemão 24 horas por dia junto de: Centro de Informações sobre Venenos de Mainz, Alemanha Tel.: Controlo de qualidade De acordo com o Sistema de Gestão da Qualidade Total da QIAGEN certificado pela norma ISO, todos os lotes do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ são testados face a especificações predeterminadas, para garantir uma qualidade constante do produto. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010 7

8 Introdução O kit artus HSV-1/2 QS-RGQ é um sistema pronto a usar para a detecção de ADN de HSV-1 e de HSV-2 através da reacção em cadeia da polimerase (PCR) nos instrumentos Rotor-Gene Q, com preparação da amostra e configuração de ensaio utilizando os instrumentos QIAsymphony SP/AS. O HSV-1/2 RG Master contém reagentes e enzimas para a amplificação específica de uma região de 154 bp dos genomas HSV-1 e HSV-2, e para a detecção directa do amplicon específico nos canais de fluorescência Cycling Green e Cycling Orange do Rotor-Gene Q. Além disso, o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ contém um segundo sistema de amplificação heterólogo para identificar possível inibição da PCR. Esta inibição é detectada como um controlo interno (IC) no canal de fluorescência Cycling Yellow do Rotor-Gene Q. O limite de detecção da PCR do HSV-1/2 analítica não é reduzido. São fornecidos controlos externos positivos (HSV-1 RG PC e HSV-2 RG PC). Fundamento A detecção de patogénios pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) baseiase na amplificação de regiões específicas do genoma do patogénio. Através da PCR em tempo real, o produto amplificado é detectado com recurso a corantes fluorescentes. Estes estão habitualmente aglutinados a sondas de oligonucleotídeos que se ligam especificamente ao produto amplificado. A monitorização das intensidades de fluorescência durante o ensaio de PCR (ou seja, em tempo real) permite e detecção e quantificação do produto que se acumula sem ter de reabrir os tubos de reacção após o ensaio de PCR.* Informação sobre o patogénio O vírus do herpes simples (HSV) encontra-se em fluidos de lesões, saliva, líquido cefalorraquidiano (LCR), e secreções vaginais. A forma primária de transmissão é através de contacto directo com lesões e por meio de relações sexuais, bem como no período perinatal. Lesões na pele e nas mucosas da boca e dos genitais caracterizam a maior parte dos casos positivos de HSV. A infecção HSV tanto pode ser primária (> 90 % destes casos são assintomáticos), como recorrente (secundária). A infecção primária com HSV-1 pode causar, entre outras coisas, gengivostomatite, eczema herpético, ceratoconjuntivite e encefalite; a infecção primária HSV-2 ocorre como, entre outras coisas, vulvovaginite, meningite e herpes generalizada em recémnascidos. Os sintomas primários de uma infecção secundária são lesões cutâneas no nariz, na boca e nas regiões genitais. Ainda mais graves são as formas recorrentes de ceratoconjuntivite e meningite. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

9 Características de desempenho Sensibilidade analítica O limite de detecção analítica relativa à purificação (limite de sensibilidade) foi avaliado para o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ utilizando amostras clínicas positivas para HSV em combinação com a extracção no QIAsymphony SP. A sensibilidade analítica relativa à purificação do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ foi determinada utilizando amostras clínicas de líquido cefalorraquidiano humano (LCR) contaminadas com uma série de diluições de material dos vírus do herpes simples 1 e 2 ATCC (código ATCC VR-260 /VR-734 ) de 450 ao valor nominal 1,42 cópias/ml. Estas foram sujeitas a extracção de ADN usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini, em conjunto com o protocolo Cellfree200 (volume de extracção: 0,2 ml, volume de eluição: 60 μl). Cada uma das 8 diluições foi analisada com o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ em 3 dias diferentes, em 3 ensaios com 11 modelos de replicação cada. Os resultados foram determinados por análise de probit. O limite de detecção analítica do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ em combinação com o Rotor-Gene Q é de 57,27 cópias/ml (p = 0,05) para HSV-1 e 65,74 cópias/ml (p=0,05) para HSV-2. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de o limite de 57,27 cópias/ml do ADN do HSV-1 ou 65,74 cópias/ml de ADN do HSV-2 seja detectado. Na figura 1 encontra-se uma ilustração gráfica da análise probit para HSV-1; o diagrama da análise probit para HSV-2 é mostrado na figura 2. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010 9

10 1.0 95% Proporções Proportions , ~ 57, cópias/ml copies/ml (95%) (39,86 95,69 ( cópias/ml) copies/ml) log (dose) Figura 1. Análise de probit: HSV-1 (Rotor-Gene Q). Sensibilidade analítica relativa à purificação (kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini) do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ no Rotor-Gene Q % Proportions Proporções , ~ 65, cópias/ml copies/ml (95%) (47,62 104,12 ( cópias/ml) copies/ml) log (dose) Figura 2. Análise probit: HSV-2 (Rotor-Gene Q). Sensibilidade analítica relativa à purificação (kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini) do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ no Rotor-Gene Q. 10 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

11 Especificidade A especificidade do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ é, antes de mais, assegurada pela selecção dos primers e sondas, bem como pela selecção de condições de reacção rigorosas. Os primers e as sondas foram verificados em termos de possível homologia com todas as sequências publicadas nos bancos de genes, por análise comparativa de sequências. A detectabilidade de todos os genótipos relevantes foi assim assegurada por um alinhamento da base de dados e por um ensaio de PCR nos instrumentos Rotor-Gene com os seguintes genótipos (ver Tabela 1). Além disso, a especificidade foi validada com 30 amostras distintas de líquido cefalorraquidiano (LCR) negativo para HSV-1 e HSV-2. Estas não geraram quaisquer sinais com os primers e sondas específicos do HSV-1 e do HSV-2 que estão incluídos no HSV-1/2 RG Master. Foi também testada a possibilidade de reacções cruzadas do kit artus HSV- 1/2 QS-RGQ, usando o grupo de controlo listado na tabela 2 (página 12). Nenhum dos patógenos testados demonstrou reactividade. Não ocorreram reacções cruzadas com infecções mistas. Tabela 1. Testes de especificidade dos genótipos relevantes Vírus Estirpe Fonte HSV-1 (Cycling Green) HSV-2 (Cycling Orange) Controlo interno (Cycling Yellow) HSV-1 HF ATCC* + + HSV-1 KOS INSTAND + + HSV-1 MacIntyre QCMD + + HSV-2 HG-52 NCPV + + HSV-2 G ATCC* + + HSV-2 MS QCMD + + * ATCC American Type Culture Collection (Colecção de Culturas de Tipo Americano). INSTAND Society for Promotion of Quality Assurance in the Medical Laboratories (Sociedade para a Promoção da Garantia da Qualidade nos Laboratórios Médicos). QCMD Quality Control for Molecular Diagnostics (Controlo da Qualidade para o Diagnóstico Molecular). NCPV National Collection of Pathogenic Viruses (Colecção Nacional de Vírus Patogénicos). Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

12 Tabela 2. Testes de especificidade do kit com patogénios com potencial de reacção cruzada Grupo de controlo Vírus herpes humano 3 (vírus varicela-zoster) Vírus herpes humano 4 (vírus Epstein-Barr) Vírus herpes humano 5 (citomegalovírus) HSV-1 (Cycling Green) HSV-2 (Cycling Orange) Controlo interno (Cycling Yellow) Vírus herpes humano 6A + Vírus herpes humano 6B + Vírus herpes humano 7 + Human herpesvirus 8 (Kaposi s sarcoma-associated herpesvirus) + Vírus da hepatite A + Vírus da hepatite B + Vírus da hepatite C + Vírus da imunodeficiência humana (VIH) Vírus da leucemia de células T humano tipo 1 Vírus da leucemia de células T humano tipo Enterovírus + Parvovírus B19 + Vírus do Nilo Ocidental + 12 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

13 Precisão Os dados de precisão do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ permitem a determinação da variância total do ensaio. A variância total consiste na variabilidade intraensaio (variabilidade de múltiplos resultados de amostras da mesma concentração dentro de um ensaio), na variabilidade entre ensaios (variabilidade de resultados múltiplos do ensaio gerados nos diversos instrumentos do mesmo tipo, por diferentes operadores num laboratório) e a na variabilidade entre lotes (variabilidade de resultados múltiplos do ensaio utilizando diversos lotes). Os dados obtidos foram utilizados para determinar o desvio-padrão, a variância e o coeficiente de variação para o patogénio específico e a PCR de controlo interno. Os dados de precisão analítica do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ (sem considerar a purificação) foram recolhidos usando DNA de HSV-1 e HSV-2 com a concentração de 10 cópias/μl. O teste foi realizado com 8 replicações. Os dados de precisão foram calculados com base nos valores C T das curvas de amplificação (C T : ciclo limite, ver tabelas 3 e 4). Com base nestes resultados, o intervalo estatístico global de determinada amostra com a concentração mencionada é de 1,82 % (C T ) para HSV-1, 0,67 % (C T ) para HSV-2, e 1,24 % (C T ) e 1,58 % (C T ) respectivamente para a detecção do controlo interno. Estes valores baseiam-se na totalidade dos valores individuais da variabilidade determinada. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

14 Tabela 3. Dados de precisão para HSV-1 com base nos valores de C T Variabilidade intraensaio: HSV-1 10 cópias/μl Variabilidade intraensaio: Controlo interno Variabilidade entre ensaios: HSV-1 10 cópias /μl Variabilidade entre ensaios: Controlo interno Variabilidade entre lotes: HSV-1 10 cópias /μl Variabilidade entre lotes: Controlo interno Variância total: HSV-1 10 cópias /μl Variância total: Controlo interno Valor de C T Desviopadrão Coeficiente de variação (%) 30,46 0,25 0,81 25,29 0,08 0,3 29,69 0,69 2,05 24,97 0,31 1,25 29,95 0,40 1,35 24,90 0,30 1,20 29,91 0,55 1,82 24,99 0,31 1,24 14 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

15 Tabela 4. Dados de precisão para HSV-2 com base nos valores de C T Variabilidade intraensaio: HSV-2 10 cópias/μl Variabilidade intraensaio: Control interno Variabilidade entre ensaios: HSV-2 10 cópias /μl Variabilidade entre ensaios: Internal control Variabilidade entre lotes: HSV-2 10 cópias/μl Variabilidade entre lotes: Control interno Variância total: HSV-2 10 cópias/μl Variância total: Control interno Valor de C T Desviopadrão Coeficiente de variação (%) 29,85 0,15 0,50 25,17 0,39 1, ,15 0,49 25,11 0,41 1,63 29,80 0,23 0,79 24,89 0,33 1,32 29,88 0,20 0,67 25,07 0,40 1,58 Robustez A verificação da robustez permite a determinação da taxa de insucesso total do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ. Para verificação da robustez, 30 amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) negativo para HSV foram contaminadas com 172 cópias/ml de HSV-1 ou 200 cópias/ml de DNA de controlo de HSV-2 (uma concentração aproximadamente três vezes superior ao limite de sensibilidade analítica). Após extracção usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini, em conjunto com o protocolo Cellfree200_DSP (volume de extracção: 0,2 ml, volume de eluição: 60 μl), estas amostras foram analisadas com o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ. Adicionalmente, a robustez do controlo interno foi avaliada por purificação e análise das 30 amostras de Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

16 líquido cefalorraquidiano (LCR) contaminadas. Não foram observadas inibições. A robustez do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ é, assim, 99%. Reprodutibilidade Os dados de reprodutibilidade permitem uma avaliação regular do desempenho do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ, bem como uma comparação de eficiência com outros produtos. Estes dados foram obtidos pela participação nos programas de competência estabelecidos. Contaminação cruzada A ausência de contaminação cruzada entre amostras para a totalidade do processo foi comprovada pela detecção correcta de todas as amostras positivas e negativas conhecidas, em posições alternadas (padrão xadrez) para os sistemas artus QS-RGQ seleccionados. Etapas do procedimento O procedimento QIAsymphony RGQ começa com a purificação dos ácidos nucleicos das amostras de líquido cefalorraquidiano humano (LCR) no instrumento QIAsymphony SP. Os eluatos, contendo ácidos nucleicos purificados do procedimento de preparação da amostra, são transferidos para o módulo QIAsymphony AS que efectua então a configuração do ensaio (Figura 3) Os ensaios são depois transferidos para o Rotor-Gene Q para PCR e análise de dados (Figura 4). Uma perspectiva geral das etapas do procedimento é apresentada nas páginas Para mais informações, consulte os protocolos completos neste manual (páginas 30, 37 e 48). 16 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

17 Figura 3. Automatização do tipo walkaway nos instrumentos QIAsymphony SP/AS. As amostras, reagentes e consumíveis são introduzidos nas bandejas relevantes. A preparação da amostra e a configuração do ensaio são, então, totalmente automatizados nos instrumentos QIAsymphony SP/AS. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

18 Figura 4. Transferência das amostras para o Rotor-Gene Q. Após preparação da amostra e configuração do ensaio, as reacções são transferidas para o rotor de 72 poços do Rotor-Gene Q para análise por PCR em tempo real. Resumo das etapas do procedimento QIAsymphony RGQ QIAsymphony SP Defina um ensaio/lote usando a interface do utilizador para preparação da amostra. Carregue as bandejas com as amostras, reagentes e consumíveis adequados. Coloque o suporte de eluição na bandeja Eluate (eluato). Operação independente Operação integrada Coloque o suporte de eluição em qualquer ranhura de eluição (isto é, ranhuras 1 4) Dê início ao protocolo. Coloque na ranhura 1 o suporte de eluição com adaptador, incluindo a estrutura de transferência 18 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

19 Quando o processamento da amostra estiver completo, remova manualmente o suporte de eluição da bandeja Eluate (operação independente) ou efectue transferência directa do suporte de eluição para o QIAsymphony AS, através do módulo de transferência (operação integrada). Operação independente Operação integrada Remova o suporte de eluição da ranhura no ecrã táctil, abra depois a bandeja Eluate e remova manualmente o suporte de eluição. Prima Transfer para transferir o suporte de eluição da ranhura 1 do QIAsymphony SP para a ranhura 2 do QIAsymphony AS. Efectue a transferência do ficheiro de resultados do QIAsymphony SP. QIAsymphony AS Mude para a interface do utilizador para configuração do ensaio no ecrã táctil. Dê início ao processo de definição do ensaio. Operação independente Operação integrada Prima New (novo) e seleccione o ficheiro do suporte do ensaio respectivo no QIAsymphony SP. Aparecerá uma mensagem a perguntar se pretende utilizar o suporte de eluição como um suporte de amostras. Prima Yes (sim) para confirmar. Defina um procedimento de ensaio. Os ecrãs que serão visualizados no ecrã táctil permitirão um acompanhamento passo-a-passo do processo de definição do ensaio. Carregue a bandeja Eluate and Reagents (eluato e reagentes) e Assays (ensaios) com as amostras, reagentes e consumíveis adequados. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

20 Para informação detalhada sobre este processo, consulte o ecrã Loading Information (Informações de carregamento) Em alternativa, prima Queue (Fila) e efectue a transferência do ficheiro de informação de carregamento. Dê início ao procedimento de ensaio. Remova os ensaios. Para tal, prima Remove e remova depois manualmente o(s) suporte(s) de ensaio da bandeja "Assays". Transfira o(s) suporte(s) para o Rotor-Gene Q. Efectue a transferência do ficheiro de resultados do QIAsymphony AS e o ficheiro do ciclador. Transfira o ficheiro do ciclador para o Rotor-Gene Q. Rotor-Gene Q Seleccione ou crie um perfil de temperatura Clique em Start Run (iniciar ensaio). Após completar o ensaio, analise os resultados. Manutenção Efectue os procedimentos de manutenção adequados para o QIAsymphony SP/AS e o Rotor-Gene Q, de acordo com os manuais de utilizador dos instrumentos. Consulte a Secção 8 do Manual do Utilizador do QIAsymphony SP/AS Descrição geral e a Secção 9 do Manual do Utilizador do Rotor-Gene Q, para mais informações sobre os procedimentos habituais diários e semanais de manutenção. 20 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

21 Equipamento e reagentes a serem fornecidos pelo utilizador Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre um avental de laboratório adequado, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as Folhas adequadas de dados de segurança do material (MSDSs), disponíveis junto do fornecedor do produto. Pipetas (ajustáveis)* e pontas de pipetas estéreis com filtros Misturador vórtex* Centrifugadora de bancada* com rotor para tubos de ensaio de 2 ml, com capacidade para centrifugação a 6800 x g Para preparação de amostras Instrumento QIAsymphony SP (n.º cat )* Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini (n.º cat ) Adaptadores para o QIAsymphony SP: Suporte de microtubos de eluição QS (adaptador de arrefecimento, EMT, v2, Qsym, n.º cat ) Introdutor de tubos 3B (Introdutor, 2,0 ml v2, samplecarr. (24), Qsym, n.º cat ) Consumíveis para o QIAsymphony SP: Cartuchos de prep. da amostra, 8 poços (n.º cat ) Mangas para 8 barras (n.º cat ) Pontas com Filtro, 1500 μl (n.º cat ) Pontas com Filtro, 200 μl (n.º cat ) Microtubos de eluição CL (n.º cat ) Sacos para eliminação de pontas (n.º cat ) Microtubos 2,0 ml Tipo I (Sarstedt, n.º cat , para usar com amostras e controlos internos Para configuração do ensaio Instrumento QIAsymphony AS (n.º cat )* Suportes de adaptadores e reagentes para o QIAsymphony AS: * Assegure-se de que os instrumentos foram verificados e calibrados de acordo com as recomendações do fabricante. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

22 Suporte de reagente 1QS (Adaptador de arrefecimento, Suporte de Reagente 1, Qsym, n.º cat ) Suporte de reagente 2QS (Adaptador de arrefecimento, Suporte de Reagente 2, Qsym, n.º cat ) Tubos em tira RG 72 QS (Adaptador de arrefecimento, Tubos em tira RG 72, Qsym, n.º cat ) Consumíveis para o QIAsymphony AS: Tiras de tubos e tampas, 0,1 ml (n.º cat ) Tubos, cónicos, 2 ml, Qsym AS (n.º cat )* ou Microtubos 2,0 ml Tipo I (Sarstedt, n.º cat , Tubo, cónico, 5 ml, Qsym AS (n.º cat )* ou Tubos com base plana de PP (Sarstedt, n.º cat , Frascos de reagente, 30 ml, QSym AS (n.º cat ) Microtubos de eluição CL (n.º cat ) Pontas com Filtro, 1500 μl (n.º cat ) Pontas com Filtro, 200 μl (n.º cat ) Pontas com Filtro, 50 μl (n.º cat ) Sacos para eliminação de pontas (n.º cat ) Para PCR Instrumento Rotor-Gene Q 5plex HRM Software para Rotor-Gene Q, versão 2.02 ou superior * Verifique a disponibilidade de stocks. Assegure-se de que os instrumentos foram verificados e calibrados de acordo com as recomendações do fabricante. 22 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

23 Notas importantes Precauções gerais O utilizador deve ter em atenção as seguintes recomendações: Utilize pontas de pipetas estéreis com filtros. Durante as etapas manuais, mantenha os tubos fechados sempre que possível e evite contaminação. Descongele completamente todos os componentes à temperatura ambiente (15 25ºC) antes de dar início ao ensaio. Assim que estiverem descongelados, misture os componentes (pipetando repetidamente para cima e para baixo ou aplicando impulsos no vórtex) e centrifugue brevemente. Assegure-se de que não há espuma ou bolhas nos tubos de ensaio. Certifique-se de que os adaptadores necessários são pré-arrefecidos a 2 8ºC. Trabalhe com rapidez e mantenha os reagentes de PCR em gelo ou no bloco de arrefecimento antes de proceder ao seu carregamento Proceda continuamente entre etapas do procedimento. Não exceda em mais de uma hora o tempo de transferência entre cada módulo (QIAsymphony SP para QIAsymphony AS para Rotor-Gene Q). Preparação dos instrumentos QIAsymphony SP/AS para utilização Feche todas as bandejas e coberturas. Ligue os instrumentos QIAsymphony SP/AS e aguarde até que o ecrã Sample Preparation (preparação de amostras) apareça e o procedimento de inicialização fique completo. Aceda ao instrumento (as bandejas serão desbloqueadas). Carregamento dos cartuchos de reagentes (RC) para a bandeja de Reagents and Consumables (reagentes e consumíveis) Os reagentes para a purificação de ácidos nucleicos estão contidos num cartucho de reagentes (RC) inovador (ver Figura 5). Cada cavidade do cartucho de reagente (RC) contém um reagente específico, como por exemplo partículas magnéticas, tampão de lise, tampão de lavagem ou tampão de eluição. Os cartuchos de reagentes (RC) parcialmente utilizados podem voltar a ser fechados com tiras vedantes reutilizáveis, evitando a geração de resíduos por reagentes sobrantes no fim do procedimento de purificação. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

24 Cobertura perfurável (PL) Suporte de enzimas (ER) Tira vedante reutilizável Cavidade para partículas magnéticas Ranhuras para as tampas roscadas dos tubos enzimáticos Estrutura com cavidades para reagentes Suporte de cartucho de reagentes Figura 5. Cartucho de reagente (RC) para QIAsymphony. O cartucho de reagentes (RC) contém todos os reagentes necessários para o procedimento de purificação. Antes de iniciar o procedimento, certifique-se de as partículas magnéticas estão completamente em suspensão. Remova a cavidade das partículas magnéticas da estrutura do cartucho de reagentes, agite vigorosamente no vórtex durante pelo menos 3 minutos e coloque novamente na estrutura do cartucho de reagente, antes da primeira utilização. Coloque o cartucho de reagente (RC) no respectivo suporte. Coloque o suporte de enzimas (ER) no suporte de cartuchos de reagente. Antes de usar um cartucho de reagente (RC) pela primeira vez, coloque a cobertura perfurável (PL) por cima do cartucho de reagente (RC) (Figura 6). A cobertura perfurável (PL) tem bordos afiados. Tome cuidado ao colocála no cartucho de reagente (RC). Assegure-se de que a cobertura perfurável (PL) é colocada sobre o cartucho de reagente (RC) na orientação correcta. Após remoção da cobertura da cavidade das partículas magnéticas e do suporte de enzimas, os tubos são abertos (as tampas de rosca podem ser armazenadas em ranhuras especiais para o efeito, ver Figura 5), o cartucho de reagente (RC) é subsequentemente carregado na bandeja de Reagents and Consumables. 24 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

25 Cobertura perfurável (PL) Figura 6. Configuração fácil de bancada com cartuchos de reagentes (RC). Os cartuchos de reagentes (RC) parcialmente utilizados podem ser armazenados até voltarem a ser necessários; consultar Storage (Armazenamento) no Manual do QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Carregamento de utensílios de plástico na bandeja de Reagents and Consumables Os cartuchos de preparação das amostras, as mangas de 8 barras (ambas pré-embaladas nas caixas de unidades) e as pontas com filtros descartáveis (pontas de 200 μl fornecidas em suportes azuis, pontas de 1500 μl fornecidas em suportes pretos) são carregados na bandeja Reagents and Consumables Certifique-se de que as coberturas das caixas de unidades são removidas antes de carregar as caixas na bandeja Reagents and Consumables. As pontas têm filtros para prevenir contaminação cruzada. As ranhuras do suporte de pontas no QIAsymphony SP de bancada podem ser preenchidas com qualquer tipo de suporte de pontas. O QIAsymphony SP identificará o tipo de pontas carregadas durante o inventório. Não reponha manualmente os suportes de pontas ou caixas de unidades para cartuchos de preparação de amostras ou mangas de 8 barras antes de dar início a outro protocolo. O QIAsymphony SP pode utilizar suportes de pontas e caixas de unidades parcialmente usadas. Carregamento da bandeja Waste (resíduos) Os cartuchos de preparação de amostras e as mangas de 8 barras usados durante o ensaio são recolocados no suporte em caixas de unidades vazias na bandeja Waste Assegure-se de que a bandeja Waste tem caixas de Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

26 unidades vazias suficientes para os resíduos plásticos gerados durante a execução do protocolo. Certifique-se de que as coberturas das caixas de unidades são removidas antes de carregar as caixas de unidades na bandeja Waste. Se estiver a utilizar caixas de mangas de 8 barras para recolher os cartuchos de preparação de amostras e as mangas de 8 barras usadas, certifique-se de que o espaçador da caixa foi removido. Deve fixar-se à parte frontal da bandeja Waste um saco para pontas com filtros usadas. A presença de um saco para eliminação de pontas não é verificada pelo sistema. Certifique-se de que o saco de eliminação de pontas está devidamente fixado, antes de dar início ao protocolo. Para mais informações, consulte os manuais do utilizador que acompanham o instrumento. Esvazie o saco de pontas após um máximo de 96 amostras terem sido processadas para evitar o encravamento do sistema com pontas. Um contentor para resíduos recolhe os resíduos líquidos gerados durante o procedimento de purificação. A bandeja Waste apenas pode ser fechada se o contentor de resíduos estiver devidamente posicionado. Elimine os resíduos líquidos, de acordo com os regulamentos ambientais e de segurança locais. Não coloque o frasco de resíduos cheio em autoclave. Esvazie o frasco de resíduos após o processamento de um máximo de 96 amostras. Carregamento da bandeja Eluate (eluato) Coloque o suporte de eluição necessário na bandeja "Eluate". Utilize a Elution slot 1 (ranhura de eluição 1) com o respectivo adaptador de arrefecimento Para uma operação integrada, coloque na posição 1 o suporte de eluição com adaptador, incluindo a estrutura de transferência. Inventariação Antes de iniciar um ensaio, o instrumento verifica se foram carregados nas respectivas bandejas consumíveis suficientes para o(s) lote(s) em espera. Preparação do material de amostra O kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini é adequado para uso em amostras de líquido cefalorraquidiano humano (LCR). Previna a formação de espuma nas amostras. As amostras devem ser equilibradas à temperatura ambiente (15 25 C) antes de dar início ao ensaio. 26 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

27 Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)- tampão AVE (AVE) Recomendamos veementemente o uso de ARN portador (CARRIER). Se o ARN portador (CARRIER) não for adicionado, a recuperação dos ácidos nucleicos pode ser significativamente reduzida. Para preparar a solução de stock de ARN portador (CARRIER), adicione 1350 μl de tampão AVE (AVE) (fornecido em ampolas de 2 ml) ao tubo contendo 1350 μg de ARN portador (CARRIER) liofilizado para obter uma solução de 1 μg/μl. Dissolva completamente o ARN portador (CARRIER), divida-o em alíquotas de dimensões convenientes e armazene a 2 8ºC, até um máximo de 2 semanas. Cálculo do volume da mistura de ARN portador (CARRIER) por tubo O volume mínimo da mistura ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) deve incluir volume adicional suficiente para ter em consideração perdas de líquido por pipetagem ou evaporação. Consulte a tabela 5 para informação sobre os volumes a usar com o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ. Os tubos com misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) (e controlo interno opcional) são colocados no porta-tubos. O porta-tubos contendo mistura(s) de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) deve ser colocado na ranhura A na bandeja de amostras. Podem ser usados até 8 tubos da mistura por lote e até 24 tubos por ensaio de 4 lotes. Utilização de um controlo interno É fornecido um controlo interno (HSV-1/2 RG IC) com o kit artus HSV-1/2 QS- RGQ. Isto permite ao utilizador controlar o procedimento de isolamento de ADN e verificar a possível inibição da PCR. Utilizando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini em conjunto com o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ requer a introdução de um controlo interno (HSV-1/2 RG IC) no procedimento de purificação para monitorizar a eficiência da preparação da amostra e ensaios a jusante. Os controlos internos devem ser adicionados com a mistura ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) e o volume total da mistura de controlo internomistura ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) mantém-se em 120 μl. Para esta aplicação, adicione o controlo interno para isolamento, conforme demonstrado na Tabela 5. Isto representa a adição de um controlo interno para o isolamento a um rácio de 0,1 μl por 1 μl de volume de eluição. Durante o cálculo da quantidade de controlo interno a utilizar bem como do título da amostra processada, é necessário ter em consideração o volume exacto da solução de eluição que é usada em cada amostra. Uma vez que se perdem pequenas quantidades de líquido durante a transferência e contacto com as Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

28 partículas magnéticas, o volume inicial da solução de eluição deve ser superior ao volume seleccionado para garantir que o eluato final apresenta o volume correcto. Recomendamos a preparação de misturas novas para cada ensaio, imediatamente antes de usar. Utilize o calculador de IC para determinar o volume total necessário, incluindo volume morto, para o número de amostras a serem testadas. Tabela 5. Preparação do controlo interno ARN portador (CARRIER) Componente Volume (μl) ARN portador de stock (CARRIER) 2,5 Controlo interno* 9,0 Tampão AVE 108,5 Volume final por amostra 120,0 * O cálculo da quantidade de controlo interno baseia-se nos volumes de eluição iniciais (90 μl). O volume morto adicional depende do tipo de tubo de amostra utilizado. Utilize o calculador de IC para determinar o volume total necessário, incluindo volume morto, para o número de amostras a serem testadas. Conjuntos de controlo de ensaio e conjuntos de parâmetros de ensaio Os conjuntos de controlo do ensaio são uma combinação de um protocolo com parâmetros adicionais, tais como o controlo interno, para purificação da amostra no QIAsymphony SP. Um conjunto de controlo do ensaio predefinido é pré-instalado para cada protocolo. Os conjuntos de parâmetros de ensaio são a combinação de uma definição de ensaio com parâmetros adicionais definidos, tais como modelos de replicação e número de standards de ensaio, para configuração de ensaio no QIAsymphony AS. Retornos de ácidos nucleicos Os eluatos preparadas com ARN portador (CARRIER) podem conter mais ARN portador (CARRIER) que ácidos nucleicos alvo. Recomendamos a utilização de métodos de amplificação quantitativos para determinar os retornos. Armazenamento de ácidos nucleicos Para períodos de curta duração até 24 horas, recomendamos o armazenamento de ácidos nucleicos purificados a 2 8ºC. Para períodos de 28 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

29 armazenamento de longa duração, superiores a 24 horas, recomendamos o armazenamento a 20ºC. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

30 Protocolo: Isolamento de ADN no QIAsymphony SP O kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini (QIAGEN, n.º cat ) está validado para purificação de ADN viral obtido de líquido cefalorraquidiano humano (LCR) para utilização com o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ. A tabela 6 mostra informações gerais sobre o protocolo. Tabela 6. Informações gerais sobre o protocolo Kit Material para amostra Volume da amostra (incluindo volume excedente) Nome do protocolo Conjunto de controlo do ensaio predefinido Volume de eluição Versão de software necessária Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini Líquido cefalorraquidiano (LCR) 350 μl Cellfree200_V4_DSP Cellfree200_V4_DSP artus HSV 60 μl Versão 3.1 ou superior Aspectos importantes antes do início do procedimento Certifique-se de que está familiarizado com o modo de funcionamento dos instrumentos QIAsymphony SP/AS. Consulte os manuais de utilizador que acompanham os instrumentos para obter as instruções de funcionamento. Antes de dar início ao procedimento, leia Notas importantes, nas páginas Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

31 Antes de utilizar um cartucho de reagente (RC) pela primeira vez, verifique se os tampões QSL2 e QSB1 não contêm um precipitado. Se necessário, remova as cavidades contendo os Tampões QSL2 e QSB1 do cartucho de reagente (RC) e incube durante 30 minutos a 37ºC, com agitação ocasional para dissolver o precipitado. Assegure-se que coloca novamente as cavidades nas posições correctas. Se o cartucho de reagente (RC) já estiver perfurado, assegure-se de que as cavidades são seladas com tiras vedantes reutilizáveis e proceda à incubação do cartucho de reagente completo (RC), durante 30 minutos a 37ºC com agitação ocasional em banho-maria.* Tente evitar a agitação vigorosa do cartucho de reagente (RC), caso contrário poderá formar-se espuma que pode levar a problemas de detecção do nível líquido. Todos os componentes do kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Mini têm estabilidade demonstrada no interior dos instrumentos QIAsymphony SP/AS, durante pelo menos o tempo normal necessário para processar 96 amostras. Outros aspectos importantes antes de iniciar o procedimento Prepare todas as misturas necessárias, incluindo misturas contendo o ARN portador (CARRIER) e os controlos internos imediatamente antes de iniciar o procedimento. Para mais informações, consulte Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), na página 27 e Utilização de um controlo interno, na página 27. Assegure-se de que cobertura perfurável (PL) é colocada no cartucho de reagente (RC) e a cobertura da cavidade das partículas magnéticas foi removida, ou se for utilizado um cartucho de reagente (RC) parcialmente usado, assegure-se de que a tira vedante reutilizável foi removida. Antes de iniciar o procedimento, certifique-se de as partículas magnéticas estão completamente em suspensão. Agite vigorosamente no vórtex a cavidade contendo as partículas magnéticas, durante pelo menos 3 minutos antes da primeira utilização. Antes de carregar o cartucho do reagente (RC), remova a cobertura da cavidade contendo as partículas magnéticas e abra os tubos de enzimas. Assegure-se de que o suporte de enzimas foi equilibrado à temperatura ambiente (15 25ºC). Assegure-se de que a cobertura perfurável (PL) é colocada no cartucho do reagente (RC) ou, se utilizar um cartucho de reagente parcialmente usado, certifique-se de que a tira vedante reutilizável foi removida. * Assegure-se de que os instrumentos foram objecto de verificação, manutenção e calibração regulares, de acordo com as recomendações do fabricante. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

32 Caso as amostras tenham códigos de barras, oriente as amostras no porta-tubos, de forma a que os códigos de barras fiquem virados na bandeja Sample (amostra) para o lado esquerdo do QIAsymphony SP, onde se situa o leitor de códigos de barras. Procedimento 1. Feche todas as bandejas e coberturas dos instrumentos QIAsymphony SP/AS. 2. Ligue os instrumentos QIAsymphony SP/AS e aguarde até que o ecrã Sample Preparation apareça e o procedimento de inicialização fique completo. O interruptor de alimentação está localizado no canto inferior esquerdo do QIAsymphony SP. 3. Aceda aos instrumentos. 4. Assegure-se de que a bandeja Waste está devidamente preparada (ver Tabela 7) e efectue uma inventariação da mesma, incluindo o colector de pontas e resíduos líquidos. Substitua o saco de eliminação de pontas, se necessário. Tabela 7. Preparação da bandeja Waste Suporte de caixa de unidades 1 4 Suporte de saco de resíduos Suporte do frasco de resíduos líquidos Esvazie as caixas de unidades Aplique o saco de resíduos Esvazie e instale o frasco de resíduos líquidos 5. Coloque o suporte de eluição necessário na bandeja "Eluate" (eluato). Use apenas a Elution slot 1 (ranhura de eluição 1) com o adaptador de arrefecimento correspondente (Adaptador de Arrefecimento, EMT, v2, Qsym, n.º cat ). Para uma operação integrada, coloque na posição 1 o suporte de eluição com adaptador, incluindo a estrutura de transferência. 6. Coloque o(s) cartucho(s) de reagentes (RC) e consumíveis necessários na bandeja Reagents and Consumables (ver Tabelas 8 e 9). O número de pontas com filtros fornecido pode diferir dos números visualizados no ecrã táctil, dependendo das definições. 32 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

33 Tabela 8. Preparação da bandeja Reagents and Consumables RC Posição 1 e 2 Suporte de pontas posição 1 17 Suporte de pontas posição 1 17 Suporte de caixa de unidades posição 1 4 Suporte de caixa de unidades posição 1 4 Carregue 1 cartucho de reagente (RC) para um máximo de 96 amostras Carregue suportes de pontas com filtro descartáveis suficientes, 200 μl (ver Tabela 9) Carregue suportes de pontas com filtro descartáveis suficientes, 1500 μl (ver Tabela 9) Carregue 3 caixas de unidades contendo cartuchos de preparação de amostras Carregue 1 caixa de unidades contendo mangas de 8 barras. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

34 Tabela 9. Material de plástico necessário para lotes de amostras 1 4 Pontas com filtro descartáveis, 200 μl Pontas com filtro descartáveis, 1500 μl Cartuchos de preparação de amostras Mangas de 8 barras Um lote, 24 amostras* Dois lotes, 48 amostras* Três lotes, 72 amostras* Quatro lotes, 96 amostras* * Utilizar mais que um tubo de controlo interno por lote e efectuar mais que uma inventariação, requer pontas com filtro descartáveis adicionais. Estão disponíveis suportes de 32 pontas/pontas com filtros O número de pontas com filtro necessárias inclui pontas com filtro para 1 inventariação por cartucho de reagente. Estão disponíveis 28 cartuchos de preparação de amostras/caixa de unidades. Estão disponíveis doze mangas de 8 barras/caixa de unidades. 7. Efectue uma inventariação da bandeja Reagents and Consumables 8. Coloque as amostras no porta-tubos apropriado e coloque-os na bandeja Sample (consultar tabela 10). Tabela 10. Carregar amostras na bandeja Sample Tipo de amostra Volume da amostra (incluindo volume excedente) Tubos de amostras Introdutor Líquido cefalorraquidiano (LCR) 350 μl Microtubos 2,0 ml Tipo I (Sarstedt, n.º cat ) Introdutor de tubo 3B (n.º cat ) 34 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

35 9. Coloque o(s) tubo(s) contendo a mistura de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), incluindo o controlo interno, no portatubos e carregue-o(s) na ranhura A da bandeja Sample. Para obter mais informações sobre a preparação da mistura, consulte Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), na página 27 e Utilização de um controlo interno, na página Utilizando o ecrã táctil, introduza a informação necessária para cada lote de amostras a ser processado Introduza as seguintes informações: Informações da amostra Protocolo a ser executado (escolha o conjunto de controlo de ensaio Cellfree200_V4_DSP artus HSV da categoria artus QS-RGQ ) Volume de eluição 60 μl (ver Tabela 11) e posição de saída slot 1 Tubo(s) contendo a mistura de ARN portador (CARRIER) tampão AVE (AVE), incluindo o controlo interno (escolha o IC com nome Cellfree200_V4_DSP artus HSV ) Após a informação sobre o lote ter sido introduzida, o estado muda de LOADED (carregado) para QUEUED (em fila). Assem que o lote é colocado em fila o botão Run (executar) aparece. Tabela 11. Volume de eluição pré-seleccionado Volume de eluição préseleccionado (μl)* Volume de eluição inicial (μl) * O volume de eluição pré-seleccionado para o protocolo. Este é o volume acessível mínimo de eluato no tubo de eluição final. O volume inicial da solução de eluição necessário para assegurar que o volume real de eluato é igual ao volume pré-seleccionado. 11. Prima o botão Run (executar) para dar início ao procedimento de purificação. Todas as etapas de processamento são totalmente automatizadas. No final do protocolo, o estado do lote muda de RUNNING (em curso) para COMPLETED (completo). Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/

36 12. Quando o processamento da amostra estiver completo, remova manualmente o suporte de eluição da gaveta Eluate (operação independente) ou efectue transferência directa do suporte de eluição para o QIAsymphony AS através do módulo de transferência (operação integrada). Para a operação independente, remova o suporte de eluição da ranhura no ecrã táctil, abra depois a bandeja Eluate e remova manualmente o suporte de eluição. Para a operação integrada, prima Transfer para transferir o suporte de eluição da ranhura 1 do QIAsymphony SP para a ranhura 2 do QIAsymphony AS. Recomendamos que prossiga imediatamente para a configuração do ensaio no QIAsymphony AS, após o teste ter terminado. Dependendo da temperatura e da humidade, os eluatos deixados no QIAsymphony SP após o teste terminar podem passar por condensação ou evaporação. Para períodos de armazenamento de curta duração até 24 horas, recomendamos o armazenamento de ácidos nucleicos purificados a 2 8ºC. Para períodos de armazenamento de longa duração, superiores a 24 horas, recomendamos o armazenamento a 20ºC. Os ficheiros de resultados são gerados para cada suporte de eluição. 13. Se um cartucho de reagente (RC) for apenas parcialmente usado, efectue a sua selagem com tiras vedantes reutilizáveis e feche os tubos contendo proteinase K com tampas de rosca, imediatamente após o protocolo terminar, para evitar a evaporação. Para mais informações sobre armazenamento de cartuchos de reagentes (RC) parcialmente usados, consulte Storage no Manual do QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. 14. Elimine os tubos de amostras usados, placas e resíduos de acordo com os regulamentos de segurança locais. Consulte o Manual do QIAsymphony DSP Virus/Pathogen para obter informações de segurança. 15. Feche as bandejas do instrumento e prossiga com a configuração do ensaio no QIAsymphony AS (página 37). 16. Limpe o QIAsymphony SP durante ou após a configuração do ensaio no QIAsymphony AS. Para a operação integrada, limpe todos os instrumentos no final do processo. Siga as instruções de manutenção no Manual do Utilizador do QIAsymphony SP/AS Descrição Geral. Certifique-se de que efectua regularmente a manutenção, de forma a minimizar o risco de contaminação cruzada. 36 Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/2010

37 Protocolo: Configuração do ensaio no QIAsymphony AS O QIAsymphony AS efectua a configuração de ensaio para reacções. As amostras processadas no QIAsymphony SP podem ser transferidas automaticamente para o QIAsymphony AS (operação integrada). Para maior flexibilidade, o QIAsymphony SP e AS também podem ser operados de forma independente.* Os pormenores do ensaio são apresentados na Tabela 12. Tabela 12. Parâmetros de ensaio usando o kit artus HSV-1/2 QS-RGQ Informação do processo Material de entrada da amostra Volume de mistura padrão Volume modelo Detalhes Eluato 30 μl 20 μl Número de reacções 4 24 ou 4 72 Tempo de teste Versão de software necessária Para 4 reacções: aproximadamente 9 minutos Para 72 reacções: aproximadamente 35 minutos Versão 3.1 ou superior Para a configuração do ensaio para o HSV-1/2, podem ser configuradas até 216 (3 x 72) ensaios num protocolo do QIAsymphony AS. Os ensaios foram realizados com cada reacção única (sem replicações) e a mistura padrão foi preparada pelo instrumento. Aspectos importantes antes do início do procedimento Antes de dar início ao procedimento, leia Notas importantes, nas páginas Os volumes de reagentes estão optimizados para 24 reacções. Com outros números de reacções, os reagentes em excesso devem ser eliminados após o ensaio. * Os QIAsymphony SP e AS permanecem fisicamente ligados durante a operação independente. Manual do kit artus HSV-1/2 QS-RGQ 09/