PESQUISA DE CAMPYLOBACTER SPP. EM CARNES DE FRANGO COMERCIALIZADAS NA CIDADE DE CAMPO MOURÃO-PR

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1 ISSN ISSN on line Alim. Nutr., Araraquara v. 23, n. 2, p , abr./jun PESQUISA DE CAMPYLOBACTER SPP. EM CARNES DE FRANGO COMERCIALIZADAS NA CIDADE DE CAMPO MOURÃO-PR Karina de Oliveira GONÇALVES* Elisa Hizuru Uemura YAMANAKA* Aline Paula Isolani ALMEIDA* Luciano de Jesus CHANO* Alessandra Braga RIBEIRO** RESUMO: A campilobacteriose causa um grande impacto na saúde pública em todo o mundo, sendo em muitos países a causa mais frequente de gastroenterite em humanos causada por alimentos. A principal fonte de Campylobacter são as aves; dessa forma, pode haver infecção pelo consumo de carne crua, mal cozida, contaminação cruzada no preparo dos alimentos ou por outros alimentos, como água e leite. O despreparo de muitos manipuladores de alimentos em relação a cuidados higiênicos é um dos fatores que favorece a contaminação dos alimentos, afetando principalmente ambientes como restaurantes, hospitais e indústrias de alimentos. Como o congelamento e a refrigeração têm o papel de conservar a carne em bom estado para o consumo, à detecção de bactérias viáveis nesta etapa é muito importante. Diante do exposto acima, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de Campylobacter spp. em frangos refrigerados comercializados na cidade de Campo Mourão-PR por meio do teste imunoenzimático pelo método ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay) com o sistema automatizado VIDAS campy. Dessa maneira, foi possível detectar uma contaminação de 79,16% em 24 frangos, confirmando a grande incidência de Campylobacter em carnes de aves destinadas ao consumo humano. PALAVRAS-CHAVE: Campylobacter spp.; carne de frango; contaminação; saúde pública. INTRODUÇÃO As bactérias do gênero Campylobacter são de grande importância para a saúde pública devido sua alta incidência em todo o mundo, constituindo a maior causa de gastroenterite em humanos, sendo a espécie Campylobacter jejuni a mais comum, seguida por C. coli e C. lari. Esses micro-organismos se encontram na microbiota de animais, como suínos, bovinos e aves, porém estudos epidemiológicos sugerem que o principal veículo de transmissão são os 1, 11, 16, 18 produtos de origem avícola. Estudos indicam que 70% dos indivíduos são infectados por Campylobacter por meio do consumo de carne de aves crua ou mal cozida. 1 No entanto, pode ocorrer infecção por ingestão de outros alimentos, como água, leite, e contaminação cruzada no preparo dos alimentos. Não há dados estatísticos definidos no Brasil, porém é relativamente grande a incidência de toxinfecções por Campylobacter spp. levando-se em conta a frequência com que este micro-organismo é isolado principalmente dos produtos avícolas 5. Nos Estados Unidos da América, relatos de enterite causada por C. jejuni superam os casos de salmonelose e shigelose. 10 Na Alemanha, a infecção causada pelo Campylobacter spp. se enquadra como segunda fonte mais importante de enterite bacteriana aguda. 21 Levando-se em conta o despreparo dos manipuladores em relação às condições higiênico-sanitárias no preparo de alimentos e a possível presença de Campylobacter em sua microbiota, a contaminação cruzada se torna comum. Esse tipo de contaminação afeta principalmente indústrias de alimentos, restaurantes e hospitais, dessa forma se constituindo um potencial risco a saúde pública. 23 A gastroenterite causada por Campylobacter é de curso autolimitante de 5 a 7 dias, sendo que nesse período o indivíduo infectado apresenta diarreia, dor abdominal e febre. 1 Em alguns casos pode haver sequelas da infecção, como a Síndrome de Guillain-Barré que atua afetando o Sistema Nervoso Periférico, causando desmielinização de neurônios, e, ainda, a Síndrome de Fisher e a Síndrome de Reiter, que possui uma manifestação clínica de artrite reativa. 22 São conhecidas 19 espécies de Campylobacter patogênicas ao homem, dentre elas as mais importantes na área de alimentos são as termofílicas (Campylobacter jejuni, C. coli e C. lari). Estas bactérias possuem uma temperatura de crescimento na faixa de 30ºC e 46ºC e são responsáveis por 99% das campilobacterioses, sendo que em 90% o causador é a espécie C. jejuni. 24 Todas as espécies de Campylobacter são bastante sensíveis a temperaturas fora de sua faixa de crescimento, porém, após o descongelamento * Curso de Graduação em Farmácia Faculdade Integrado de Campo Mourão Campo Mourão PR Brasil. ** Departamento de Análises Clínicas e Biomedicina Universidade Estadual de Maringá Maringá PR Brasil. alessandra.bragaribeiro@gmail.com. 211

2 ou má cocção, as bactérias podem recuperar sua atividade, apresentando assim potencial para infecção. 18 O congelamento e a refrigeração têm o papel de conservar o alimento em bom estado para o consumo, controlando o crescimento bacteriano. Portanto, a detecção de bactérias viáveis em produtos refrigerados e congelados é de grande importância, pois, no caso de Campylobacter, apenas 500 células são suficientes para causar infecção. 18 Principalmente para a indústria alimentícia, é de grande importância que a detecção de Campylobacter seja feita de maneira rápida e satisfatória, pois o atraso na emissão de resultados pode comprometer as medidas de controle em abatedouros ou a exportação de produtos. No entanto, a detecção de Campylobacter é dificultada devido às difíceis condições de crescimento da bactéria, sendo que esta requer etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento e posterior inoculação em meios seletivos. Além da cultura, existem outros testes capazes de detectar o micro-organismo mais rapidamente, sendo estes mais sensíveis e específicos, como os imunoenzimáticos e moleculares. 14 Diante do exposto acima, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de Campylobacter spp. em frangos refrigerados comercializados na cidade de Campo Mourão-PR, por meio do teste imunoenzimático pelo método ELFA (Enzime Linked Fluorescent Assay) com o sistema automatizado VIDAS Campy (BioMérieux). 10% de CO 2 e 85% de N 2 (gerador de microaerofilia, marca Probac) e incubadas por 48±2 horas a 42±1ºC. Teste de Triagem por Ensaio Imunoenzimático Após a incubação, foi realizado o teste imunoenzimático pelo método ELFA com o sistema automatizado VIDAS Campy (BioMérieux) para a detecção de Campylobacter spp. 24 Identificação Preliminar de Campylobacter Termofílico As amostras que tiveram resultados positivos pelo teste imunoenzimático foram confirmadas através de plaqueamento diferencial em meios de cultura seletivos. A partir da etapa de enriquecimento, todas as culturas positivas confirmadas pelo teste imunoenzimático foram inoculadas em ágar mccda (modifi ed campylobacter blood free seletive agar) (Laborclin) e após incubadas por horas a 41,5ºC±1ºC em ambiente microaerófilo (gerador de microaerofilia-probac). Após a incubação, foram escolhidas 3-5 colônias presuntivas de Campylobacter e inoculadas em ágar Columbia Sangue (BioMérieux), uma placa a 25ºC em microaerofilia, e outra a 42ºC em aerobiose. Também foram feitos testes de morfologia, oxidase, catalase e nitrato. MATERIAL E MÉTODOS Preparação da Amostra Um total de 24 amostras de frangos inteiros, coletados em quatro semanas consecutivas, de quatro diferentes marcas escolhidas aleatoriamente (refrigeradas e congeladas) comercializadas na cidade de Campo Mourão-PR, foram encaminhadas para análise no Laboratório de Análises de Alimentos da Faculdade Integrado de Campo Mourão- PR e no Laboratório Santa Cecília de Campo Mourão-PR, para a detecção de Campylobacter spp. As amostras foram levadas ao laboratório em suas embalagens comerciais, separadamente em sacos plásticos estéreis e acondicionadas em caixas térmicas contendo gelo reciclável para conservação da temperatura de refrigeração. As análises foram realizadas seguindo-se o método ISO : 2006 e o protocolo do sistema VIDAS Campy (BioMérieux). As carcaças foram retiradas de suas embalagens comerciais e colocadas inteiras em sacos plásticos estéreis individuais para lavagem com 400mL de água peptonada 0,1% (Himedia). Logo após, foram retirados 25mL da água de lavagem e colocada em sacos do tipo stomacher com 225mL de caldo enriquecido seletivo Bolton (Laborclin), suplementado com os antibióticos: cefoperazona, trimetoprim, vancomicina e cicloheximida de acordo com as concentrações preconizadas pelo fabricante. Após homogeneização, a amostra foi colocada em jarra de anaerobiose com, aproximadamente, 5% de O 2, RESULTADOS E DISCUSSÃO Considerando os resultados obtidos nas 24 amostras analisadas, verificou-se a ocorrência de Campylobacter termofílico em 17 amostras (70,83%). Nesta porcentagem foram consideradas as amostras que se apresentaram positivas pelo método mini-vidas e confirmadas utilizando-se o método convencional ISO : Das 24 amostras analisadas, 2 (8,33%) apresentaram-se positivas no teste mini-vidas, porém, não foram confirmadas pelo método convencional. O limite de detecção do método imunoenzimático é baixo, portanto é possível que tenham sido detectadas quantidades mínimas do micro-organismo e que os mesmos não conseguiram se multiplicar para detecção pelo método convencional por se tratar de um micro-organismo de difícil cultivo. Segundo Lopes, 17 as células dos patógenos podem ser injuriadas devido aos processos de produção pelos quais o alimento tenha sido submetido, assumindo assim a forma viável, mais não cultivável. Desta maneira, considerando apenas os resultados do método mini-vidas, sendo este mais sensível, pode-se estimar uma contaminação por Campylobacter (C. termofílicos + Campylobacter spp.) de 79,16% das amostras analisadas. Estudo similar realizado por Benetti, 2 para identificação de Listeria sp. e Salmonela sp. em linguiças resfriadas comercializadas no Paraná, demonstrou que o método mini-vidas quando comparado ao método ISO, considerado padrão, é capaz de detectar concentrações mais baixas dos micro-organismos na amostra. 212

3 O número relativamente alto de amostras positivas observado no presente estudo demonstra a possibilidade de contaminação em qualquer uma das várias etapas da cadeia de produção deste alimento, como na granja, transporte para o abatedouro, na evisceração da carcaça, ou mesmo ter ocorrido contaminação cruzada. Este último tipo de contaminação foi observado por Kuana et al., 16 previamente ao abate, quando foram analisados quatro lotes de frangos obtendo ausência de Campylobacter e, após a depenadeira, estes apresentaram resultados positivos. Os autores também observaram que de 96 amostras de carcaças coletadas, 97,4% (37/38) se apresentaram contaminadas após a depenadeira, e 98,3% (57/58) após o chiller, o que evidencia a contaminação cruzada nas indústrias. O chiller corresponde à etapa de resfriamento da carcaça e, segundo Lopes, 17 a contaminação cruzada ocorre especialmente nessa etapa, pois a contaminação cumulativa de Campylobacter no tanque de resfriamento promove o aumento da contaminação superficial do frango com células do micro-organismo presentes na água. Franchin et al., 11 observaram que o alto índice de amostras contaminadas por Campylobacter spp. após o chiller (85%), pode ser devido a baixa e insuficiente concentração de cloro livre na água de resfriamento, não inativando dessa forma o patógeno. A Portaria n. 210, de 10 de novembro de 1998, do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento do Brasil 3 estabelece para aves comercializadas no mercado interno que a água do chiller deve ser clorada, permitindo-se no máximo 5ppm de cloro livre. Na etapa de comercialização da carne no varejo, pode ocorrer contaminação cruzada por meio de superfícies ou equipamentos contaminados, sendo dessa forma necessário um cuidado com a manipulação dos alimentos e o contato com as superfícies potencialmente contaminadas. 17 A frequência de positividade encontrada nesse estudo é maior do que a encontrada por outros autores. Lopes 17 analisou 120 amostras de cortes de frangos refrigerados comercializados no varejo na cidade de São Paulo e encontrou somente 14,2% das amostras contaminadas. Na mesma cidade, Costa 8 estudou a ocorrência de Campylobacter termofílico em frangos coletados no comércio varejista encontrando 19,6% (27/138) de amostras positivas. Carvalho et al. 5 observaram que, de 52 amostras de frango e produtos derivados analisadas, 17 (32,6%) apresentaram-se contaminadas por C. jejuni. No entanto, Cortez et al. 7 encontraram menor contaminação por C. jejuni, sendo que em somente 14 (4,9%) de 288 amostras de aves foi verificada contaminação. Chaves 6 conseguiu isolar Campylobacter spp. em 33,33% (40/120) das amostras de frangos coletadas em granjas na cidade de Belém no estado do Pará, em que 82,5% (33/40) foram identificadas como C. jejuni. O presente estudo propôs analisar a carne de frango refrigerada na etapa de comercialização, pois, sabe-se que a refrigeração e o congelamento da carne têm por objetivo a conservação do alimento. 18 Porém, a pesquisa demonstrou um alto índice de amostras contaminadas por Campylobacter spp. (79,16%) mesmo em carnes refrigeradas. Em estudo realizado por Maziero et al., 18 foi verificado o efeito da temperatura na sobrevivência de C. jejuni, realizando plaqueamento direto e plaqueamento após enriquecimento seletivo. Os autores puderam observar que, de 30 amostras de frangos analisadas por plaqueamento direto, 93,3% das amostras frescas estavam contaminadas por Campylobacter termofílicos. Após refrigeração, 53,3% das amostras apresentaram positividade, e, após o congelamento, encontraram 36,6% das amostras contaminadas por Campylobacter spp. Após o enriquecimento seletivo, as amostras frescas, refrigeradas e congeladas apresentaram, respectivamente, 50%, 36,7% e 33,3% de positividade para C. jejuni. Portanto, não foi detectada diferença significativa nas três condições após o enriquecimento das amostras, mostrando que o C. jejuni, apesar de sensível, se mantém viável nos alimentos, podendo sobreviver em diferentes condições de armazenamento. Boufleur 1 realizou um estudo preliminar com 36 amostras de partes de frangos, obtendo 61,1% de amostras positivas para C. jejuni. Após processo de congelamento durante 7 dias, em 8,3% foi obtido o isolamento de C. jejuni, sugerindo que o congelamento é capaz de diminuir a contaminação, porém não de eliminar o patógeno completamente. A presença de patógenos de origem alimentar como Salmonella spp., Listeria monocytogenes e Campylobacter spp., é relativamente alta em carcaças de frango, como foi observado por Nierop et al. 19 em estudo realizado em Gauteng, África do Sul. Analisando 99 amostras de frangos congelados os autores encontraram Salmonella spp., Listeria monocytogenes e Campylobacter spp. em 19,2%, 19,2% e 32,3% das amostras respectivamente. Jorgensen et al. 15 também puderam observar em estudo realizado na Inglaterra que Campylobacter possui uma maior prevalência em frangos refrigerados 83% (199/241) do que Salmonella 25% (60/241). Estas pesquisas evidenciam que Campylobacter spp. é o maior contaminante em frangos e que pode suportar baixas temperaturas mantendo-se viável nos alimentos refrigerados e congelados. Do gênero Campylobacter, as espécies termofílicas são as mais encontradas em alimentos, principalmente C. coli, C. lari, e C. jejuni. Este último, além de ser o mais encontrado e pesquisado em alimentos, é o maior responsável por doenças gastrointestinais, superando as infecções por Salmonella spp. 10, 18 Em estudo realizado por Dominguez et al., 9 foi verificado que em frangos comercializados no varejo na Espanha houve uma prevalência de Campylobacter (49,50%) maior que de Salmonella (35,83%) nas amostras analisadas, sendo, dessa forma, de extrema importância sua detecção em alimentos. Carvalho et al. 4 analisaram 80 amostras de sobrecoxas de frangos resfriados comercializados em feiras livres e hipermercados, encontrando 13 estirpes de Campylobacter spp. em 10 amostras. Onze estirpes foram identificadas como C. jejuni e duas como C. coli, evidenciando, assim, a ocorrência de espécies diferentes em, pelo menos, três amostras, sendo elas termofílicas, estando de acordo com a presente pesquisa. 213

4 Diversos autores puderam observar um grande índice de contaminação por Campylobacter. Os estudos utilizam diferentes amostras provenientes da carne de frango e também diversas etapas do processamento, desde a granja até o produto final em comercialização. Gomes et al. 12 relataram a detecção de Campylobacter termofílico em 22 dos 24 lotes de frangos destinados ao abate provenientes de pequenas propriedades em Pelotas, sul do Brasil, correspondendo a uma infecção de 91,7% dos lotes analisados. O mesmo autor também relata que a alta incidência de Campylobacter termofílico (75%) em amostras de cloaca sugere que a presença do micro-organismo em aves é, principalmente, devido à contaminação intestinal. Boufleur 1 observou um grande índice de contaminação por Campylobacter, em que 63,5% das amostras de suabes cloacais estavam contaminadas. Em 52,5% das amostras contaminadas foi observada a espécie C. jejuni. Hariharan et al. 13 observaram em isolados de cecos de frangos de corte em estudo realizado em Granada na Espanha uma taxa de contaminação alta: 99 (79,2%) de 125 frangos apresentaram-se contaminados por Campylobacter termofílicos. O mesmo autor pesquisou e diferenciou as espécies mais importantes em questão (C jejuni, C. coli e C. lari), e pôde observar que várias amostras continham mais de uma espécie, sendo um fator preocupante para a saúde dos consumidores. Há poucos estudos descritos em literatura com frangos inteiros e refrigerados, devido a difícil recuperação do micro-organismo. Porém, é de grande importância à detecção de Campylobacter nesta etapa devido à baixa quantidade de células capazes de causar doença (500 células), e também pelo fato do produto estar exposto ao consumo humano, ou seja, a etapa final antes de se apresentar à mesa do consumidor. 18 No Brasil, não há dados estatísticos da prevalência de campilobacteriose entre a população, porém estima-se uma alta incidência devido à frequência com que o microorganismo é isolado nos alimentos, principalmente em frangos. 5 Estatísticas da Dinamarca revelam que há um caso de campilobacteriose para cada frangos ingeridos. 20 Na Alemanha, a doença se enquadra entre a segunda causa mais comum de gastroenterite. 21 CONCLUSÃO A presença confirmada de Campylobacter termofílico em frangos refrigerados sugere que deve haver maior atenção no manuseio e preparação da carne de frango, uma vez que a maioria das amostras estudadas (79,16%) se apresentou contaminada. Soma-se a isto, o fato de que as bactérias podem permanecer viáveis por longos períodos em carnes refrigeradas e congeladas. As bactérias do gênero Campylobacter, principalmente a espécie C. jejuni, constituem um dos maiores causadores de gastroenterites em humanos. Dessa forma, os manipuladores devem oferecer aos alimentos um tratamento térmico adequado para total eliminação do patógeno. Além disso, deve-se evitar que haja contaminação cruzada com alimentos crus, pois como foi observado, a carne de frango pode ser classificada como um produto potencialmente capaz de causar doenças. AGRADECIMENTOS À empresa Laborclin pela doação de meios de cultura, a empresa BioMérieux pela doação do kit VIDAS Campy e ao Laboratório de Análises Clínicas Santa Cecília por ter contribuído na execução desta pesquisa. GONÇALVES, K. O.; YAMANAKA, E. H. U.; ALMEIDA, A. P. I.; CHANO, L. J.; RIBEIRO, A. B. Study about the Campylobacter spp. present in chicken meat sold in the city of Campo Mourão-PR. Alim. Nutr., Araraquara, v. 23, n. 2, p , abr./jun ABSTRACT: Campylobacteriosis has a great impact on public health worldwide, and in many countries the most frequent cause of gastroenteritis in humans caused by food. The main source of Campylobacter, are the chickens. Therefore, people may be infected by eating raw or undercooked meat, cross-contamination in food preparation or other types of foods, such as water and milk. The unpreparedness of people who handle this kind of food connected to the hygienic-sanitary conditions is one of the factors that favor contamination food, and mainly affecting environments like restaurants, hospitals and food industries. As freezing and refrigeration have specific role of preserving the meat in good condition for consumption, the detection of viable bacteria in this step is very important. According to what was exposed above, the present study evaluated the occurrence of Campylobacter in chickens sold in Campo Mourão-PR, through enzyme immunoassay method ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) with the automated VIDAS campy. Thus it was possible to detect the contamination of 79.16% from the 24 tested chickens, confirming the high incidence of Campylobacter in poultry meat for human consumption. KEYWORDS: Campylobacter spp.; chicken meat; contamination; public health. REFERÊNCIAS BLOUFLEUR, R. 1. Campylobacter jejuni em frangos de corte, carne e vísceras de frango no Rio Grande do Sul e o efeito do congelamento sobre a contaminação nos cortes f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria - RS,

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