Transferência de material genético entre bactérias

Transcrição

1 Transferência de material genético entre bactérias 3 processos principais: - Conjugação - Transformação - Transdução

2 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Experiência que demonstrou a ocorrência de transferência genética entre células de espécies bacterianas diferentes, no solo Caso: adição de células da estirpe de Alcaligenes eutrophus (albergando o plasmídeo metabólico pjp4) a solo contaminado com herbicida 2,4-D; Objectivo: acelerar a biodegradação do herbicida no solo 2,4-D Slow, incomplete degradation of 2,4-D over a 9-week period 2 (species from the genera Pseudomonas sp. and Burkholderia sp.) In RM Mairer, IL Pepper, CP Gerba, Environmental Microbiology Academic Press (ed),2000

3 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Texto explicativo da experiência descrita no slide anterior 3 In RM Mairer, IL Pepper, CP Gerba, Environmental Microbiology Academic Press (ed),2000

4 Plasmídeos bacterianos São elementos genéticos (DNA em cadeia dupla), circulares ou lineares São replicões Têm replicação autónoma Podem existir em cópia única ou haver múltiplas cópias ( / cromossoma) Podem ser eliminados ( curing ) A eliminação pode ser espontânea ou induzida por tratamentos que inibem a replicação do plasmídeo, mas não inibem a divisão da célula que o alberga São dispensáveis à viabilidade celular, mas podem conferir vantagem selectiva em determinados ambientes

5 Alguns plasmídeos são epissomas Plasmídeos que podem existir integrados no cromossoma Alguns plasmídeos são conjugativos Têm genes tra - responsáveis pela formação da estrutura denominada pilus ou tubo de conjugação Podem transferir cópias deles próprios para outras bactérias por conjugação pilus

6 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Factor da fertilidade factor F Plasmídeo conjugativo Factor F de E. coli Muitos são epissomas Organização geral do plasmídeo F de E.coli IS2, IS3 sequências de inserção γδ - transposão Genes tra codificam para enzimas envolvidas na formação do pilus e processo de conjugação; 94,5 kb Genes rep codificam para enzimas envolvidas na replicação do DNA; Ori V origem de replicação Ori T origem de transferência 6 (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

7 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Pseudomonas sp. ADP (P ADP) (Mandelbaum et al. 1995, Appl. Env. Microbiol. 61, ) (A) - Bacterial strain isolated from an herbicide spill site (USA) - Mineralizes atrazine, using it as a N source (ATZ) Atrazine padp-1: Example of a metabolic (catabolic) plasmid 7

8 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Catabolic pathway for atrazine (A) degradation by Pseudomonas sp. ADP, encoded in the catabolic plasmid padp-1 AtzA AtzB Atrazine Hydroxyatrazine AtzC NH 3 + CO 2 AtzF AtzE AtzD Alophanate Biuret Cyanuric acid 8 Martinez et al., J Bacteriol. 183: , 2001

9 (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

10 CONJUGAÇÃO BACTERIANA Mutante auxotrófico de Escherichia coli (requere Biotina, Fenilalanina e Cisteina no meio de cultura) Mutante auxotrófico de Escherichia coli (requere Treonina, Leucina etiamina) Descoberta em 1946 por Lederberg e Tatum 1) provaram que houve transferência de material genético entre as células dos dois mutantes auxotróficos; 2) não provaram que o contacto físico entre as células era necessário para a transferência genética Experiência do tubo em U (1950) (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Em meio de cultura mínimo

11 A experiência do tubo em U Após a experiência, as bactérias são incubadas em meio mínimo (sólido) Não há crescimento de colónias Meio nutritivo completo contacto directo entre as células era necessário para que a transferência de genes ocorresse (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Bernard Davis, 1950

12 Factor da fertilidade factor F Plasmídeo conjugativo Factor F de E. coli Muitos são epissomas Organização geral do plasmídeo F de E.coli IS2, IS3 sequências de inserção γδ - transposão Genes tra codificam para enzimas envolvidas na formação do pilus e processo de conjugação; 94,5 kb Genes rep codificam para enzimas envolvidas na replicação do DNA; OriV origem de replicação OriT origem de transferência (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

13 Conjugação bacteriana: F + x F - F + = estirpe dadora Contém o factor F livre no citoplasma (ou, outro plasmídeo que seja conjugativo) F - = estirpe receptora Não contém o factor F ou outro plasmídeo conjugativo O factor F replica pelo mecanismo do círculo rolante, e é transferido A transferência genética é unidirecional (de F + para F - ) A estirpe receptora torna-se F + A estirpe dadora continua F + Existe em bactérias Gram-negativas (Ex. E. coli, Pseudomonas sp., etc.) e em espécies Grampositivas dos géneros Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus. Fig A, In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

14 O factor F pode existir integrado no cromossoma da bactéria (epissoma) Integração do factor F no cromossoma em E.coli (reversível) - pode ocorrer em diferentes locais do cromossoma bacteriano; - por recombinação entre sequências de inserção homólogas presentes no plasmídeo F (IS a amarelo) e no cromossoma da célula hospedeira (IS a verde). (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Seta O- azul: origem de transferência (local onde se inicia a transferência do cromossoma) A, B, 1, 2 marcadores genéticos

15 Conjugação Hfr x F - Hfr High frequency Factor F (vermelho) Fig B, In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) integrado no cromossoma (preto) (operão tra e OriT do factor F continuam funcionais)

16 Conjugação Hfr x F - Estirpe Hfr ( High frequency of recombination) A estirpe dadora contém o factor F (epissoma) integrado no cromossoma (após integração, o operão tra e a OriT do factor F continuam funcionais) A transferência de DNA começa na orit do factor F (origem de transferência) O DNA das células Hfr replica pelo mecanismo circulo rolante e começa a ser transferido - Neste caso, a frequência de transferência do cromossoma é muito alta em comparação com a do Factor F por células F + A transferência ocorre até haver quebra da ligação entre as células. A transferência completa do cromossoma de E. coli demora cerca de 100 minutos, e a quebra da ligação entre as células usualmente ocorre antes deste tempo o cromossoma (e o factor F) podem não ser transferidos na totalidade para a célula receptora. A célula receptora pode permanecer F - (i.e. receptora) se o plamídeo F não for transferido na totalidade. Após a entrada do cromossoma (ou parte deste) na célula receptora, este DNA é degradado ou incorporado no genoma da célula receptora por recombinação.

17 Conjugação F x F - O plasmídeo F é um epissoma, pelo que pode libertar-se do cromossoma bacteriano - excisão. Plasmídeo F Forma-se por excisão incorrecta do cromossoma Pode levar consigo mais do que 1 gene do cromossoma onde estava integrado Célula Hfr passa a F A célula F pode transferir esse plasmídeo para uma célula receptora F - ( mecanismo semelhante ao da conjugação F + xf - ) factor F integrado Genes do cromossoma

18 Conjugação F x F - Fig , In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) - Os genes cromossomais da bactéria (A) são transferidos com o plasmídeo F para uma outra bactéria e podem ser expressos na célula receptora; - Genes bacterianos (cromossomais) podem ser rapidamente disseminados entre as células de uma população bacteriana, através deste mecanismo.

19 Transferência de DNA por transformação Experiência de Griffith (1928) demonstrando a transferência genética em Streptococcus pneumoniae Tipo S estirpe virulenta (produtora de cápsula) Tipo R estirpe não virulenta Calor morte das células Tipo S (não causam doença) Mistura de suspensão de células Tipo S mortas (pelo calor) com suspensão de células não virulentas vivas As células não virulentas (R) tornam-se virulentas (S)

20 Conclusões das experiências de Griffith: Experiência (A) células da estirpe R (não virulenta) adquiriram um agente transformante presente (slide anterior) no extracto das células da estirpe virulenta S (mortas pelo calor) que as converteram em virulentas Experiência (B) - o agente transformante é DNA presente nas células virulentas S (este slide)

21 Transferência de DNA por transformação (P.ex. transformação em células competentes de Streptococcus pneumoniae) Proteína receptora de ligação ao DNA nuclease corta e degrada uma das cadeias Competent cell Proteína que confere competência específica (ligação a cadeia simples de DNA) Fig , In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

22 Transformation - in soil and marine environments; - may be an important route of genetic exchange in nature. Natural competence has been discovered so far only in certain species of gram-positive (ex. Haemophilus, Streptococcus, Bacillus) and gram-negative genera (ex. Azotobacter Pseudomonas, Helicobacter, etc.) (P.ex. catalizada por endonucleases) Fig , In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

23 Competent cell Transformation with a plasmid often is induced artificially in the laboratory (genetic engineering technology of recombinant DNA) Fig , In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

24 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Plasmids as vectors for the construction of genetically modified microorganisms 24 In Tortora, Funke, Case, Microbiology, an Introduction, Perason (ed) 9th editon, 2007

25 Transdução Generalizada Injecção e replicação do DNA do vírus (a vermelho) na célula infectada TRANSDUÇÃO Fig , In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

26 Transdução Generalizada É a transferência de genes bacterianos entre células diferentes mediada por vírus que infectam bactérias (designados por bacteriófagos ou fagos) P.ex. fenómeno observado em E. coli, Salmonella typhimurium, etc) Ocorre aleatoriamente; qualquer parte de um genoma bacteriano pode ser transferido para uma bactéria receptora Resulta do facto de fragmentos do DNA da bactéria hospedeira entrarem, por engano, na cabeça do bacteriofago aquando da sua replicação e maturação pode ocorrer, por exemplo, durante o Ciclo Lítico de replicação de virus em bactérias infectadas. Transdução Especializada (v. aula sobre virus)

27 Copyright The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Notas adicionais sobre plasmídeos e transferência de material genético 27

28 Plasmídeos Col Em Escherichia coli, Salmonella sp., Enterobacter sp. Codificam para colicinas (bacteriocinas) Bacteriocinas matam células de organismos filogeneticamente próximos O modo de acção é: Formação de poros na membrana plasmática Destruição da camada de peptidoglicano Inactivação de ribossomas Alguns destes plasmídeos são conjugativos Alguns também contêm genes de resistência (p.ex resistência a antibióticos) Plasmídeos R Factores de Resistência Têm genes que codificam para a resistência a antibióticos, metais (Hg, Ni, Co), etc. Alguns são conjugativos Geralmente não se integram no cromossoma

29 Plasmídeos de virulência - Contêm genes de virulência que tornam a bactéria mais patogénica P.ex. genes que codificam para a síntese de cápsula (podem conferir resistência aos mecanismos de defesa do hospedeiro) P.ex., genes que codificam para toxinas (ex. Enterotoxinas produzidas por estirpes patogénicas de E. coli ou por Staphylococcus aureus, toxina do tétano por Clostridium tetani, antrax, etc.) ou para a formação de tumores em plantas (ex. Agrobacterium tumefaciens). Plasmídeos metabólicos Contêm genes envolvidos em processos metabólicos: P.ex., genes que codificam para enzimas capazes de degradar pesticidas, compostos aromáticos, diversos açúcares, produção de pigmentos, etc (designados genéricamente por plasmídeos catabólicos) P.ex., genes responsáveis pela fixação biológica de azoto

30 Transferência de DNA por transformação Consiste na entrada de DNA livre existente no meio ambiente e sua incorporação estável numa célula receptora competente; o DNA livre é proveniente de outras células existentes no meio circundante e que, por exemplo, podem ter sofrido lise. Quando as células lisam, libertam quantidades consideráveis de DNA (fragmentos de dimensão variável e plasmídeos) para o ambiente circundante. Célula competente Célula viável que está num estado fisiológico particular que permite a entrada de DNA livre no seu interior; Nem todas as células de uma população bacteriana estão aptas para receber e integrar DNA (só as competentes) A competência é um fenómeno complexo e envolve a expressão de vários genes específicos. Transformação é um processo importante de troca de material genético na Natureza É um processo aleatório e qualquer fragmento de DNA livre presente no ambiente extracelular das células pode ser transferido A frequência de transformação em células muito competentes é elevada: cerca de 1 célula em cada mil presentes numa população receberão e integrarão de forma estável um fragmento de DNA (frequência = 10-3 )

31 Transformação Artificial em bactérias Em laboratório, a transformação é efectuada em espécies geralmente não competentes (P.ex., E. coli) Transformação é muito usada em Engenharia Genética para introduzir DNA recombinado em células hospedeiras (construção de microrganismos geneticamente modificados) Existe uma variedade de técnicas para tornar as células temporariamente competentes, mesmo que não o sejam naturalmente: P.ex., tratamento das células com cloreto de cálcio e/ou outros iões, seguido de choque térmico; A célula fica mais permeável à entrada de DNA Outro método: Electroporação ou electrotransformação exposição da suspensão de células a campo eléctrico com intensidade adequada, de modo a permeabilizar as células (mantendo-as viáveis), na presença do DNA a transferir