COMPORTAMENTO FRENTE À AÇÃO DE ANTIMICROBIANOS EM CEPAS DE Aeromonas sp. ISOLADAS EM MATADOURO BOVINO LOCALIZADO NO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL 1

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1 ARS VETERINARIA, 16(1):33-38, COMPORTAMENTO FRENTE À AÇÃO DE ANTIMICROBIANOS EM CEPAS DE Aeromonas sp. ISOLADAS EM MATADOURO BOVINO LOCALIZADO NO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL 1 (BEHAVIOR OF THE ACTION OF ANTIMICROBIAL DRUGS ON THE STRAINS OF Aeromonas sp. ISOLATED FROM A BOVINE SLAUGHTERHOUSE LOCATED IN SÃO PAULO STATE, BRAZIL) O. D. ROSSI JÚNIOR 2, L. A. AMARAL 2, A. NADER FILHO 2, N. C. M. REZENDE 3 RESUMO Objetivando verificar o comportamento frente à ação de antimicrobianos de uso comum em cepas de bactérias do gênero Aeromonas, foram testadas 18 cepas da espécie A. hydrophila, 65 da espécie A. caviae e 19 atípicas isoladas em diferentes produtos e locais no fluxograma de abate bovino. O principio ativo com maior percentual de cepas resistentes foi a cefalotina (66,6%), seguido pela carbenicilina (51,0%) e tetraciclina (33,3%). As drogas a que as cepas mostraram-se mais sensíveis foram a gentamicina, a tobramicina, a amicacina, o sulfazotrim, o cloranfenicol e a netilmicina, todas com mais de 70% de sensibilidade. Com referência à espécie A. hydrophila, 100% das cepas mostraram-se sensíveis à gentamicina, polimixina, cefoxitina e netilmicina e 77,8% delas resistentes à carbenicilina. Resistência a múltiplos princípios ativos também foi verificada, sendo que 84,3% das cepas a apresentaram a dois ou mais princípios. PALAVRAS-CHAVE: Aeromonas sp.; Aeromonas hydrophila; Aeromonas caviae; antimicrobianos; teste de sensibilidade. SUMMARY The objective of this work was to verify the behavior of antimicrobials of common use in strains of bacteria of the genus Aeromonas. The strains were 18 of the species A. hydrophila, 65 of the species A. caviae and 19 atypical isolated in different products and places in the fluxogram of bovine slaughter. Cephalotin was the active substance with highest percentage of resistant strains (66.6%), followed by carbenicillin (51.0%) and tetracycline (33.3%). The strains were sensitive to gentamicin, tobramycin, amikacin, sulphazotrin, chloramphenicol, and to netilmicin, all with more than 70% of response. In relation to A. hydrophila 100% of the strains showed to be sensitive to gentamicin, polymixin, cefoxitin and netilmicin and 77.8% of them were resistant to carbenicillin. Resistance to multiple antimicrobial substances was also verified in 84.3% of the strains. KEY-WORDS: Aeromonas sp.; Aeromonas hydrophila; Aeromonas caviae; antimicrobial; sensibility test. 1 Trabalho financiado pela FAPESP 2 Depto. de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal Fac. de Ciências Agrárias e Veterinárias, Campus de Jaboticabal, UNESP. Via de acesso Prof. Paulo Donato Castellane, Km Jaboticabal, SP. 3 Estudante de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Preventiva - FCAVJ/UNESP.

2 34 ARS VETERINARIA, 16(1):33-38, INTRODUÇÃO As bactérias do gênero Aeromonas, assim como a Listeria monocytogenes, a Yersinia enterocolitica e o Campylobacter sp., são tidas como patógenos emergentes de veiculação alimentar e normalmente não são incluídas entre as bactérias rotineiramente pesquisadas durante as investigações de surtos (SCHOFIELD, 1992; MERINO et al., 1995; HANDFIELD et al., 1996). Pertencente à família Vibrionaceae, as bactérias do gênero Aeromonas Kluyver and Vand Niel 1936 (POPOFF, 1984) são microrganismos de ocorrência amplamente difundida no meio ambiente (CUNLIFFE & ADCOCK, 1989) e são responsáveis por determinarem patogenias no homem classificadas como de nível não intestinal e gastrentéricas (KO & CHUANG, 1995). Ao nível não intestinal já foram atribuídos às aeromonas quadros como meningites (ELLISON & MOSTOW, 1984), artrites (DEAN & POST, 1967), endocardites (DAVIS et al., 1978), osteomielites (LOPEZ et al., 1968), peritonites (JANDA et al., 1983), infecções cutâneas (JOSEPH et al., 1979) e oculares (LEE et al., 1997). Ao nível gastrentérico as aeromonas são responsabilizadas por quadros que vão de amenas diarréias a casos graves de disenteria (KNOCHEL, 1989). Diferentes estudos, realizados com cepas isoladas tanto de fontes ambientais como de alimentos e casos de diarréia, mostram que as bactérias do gênero Aeromonas podem apresentar resistência a múltiplas drogas. Assim, GRAY (1984) e SINGH & SANYAL (1994) observaram essa característica em cepas isoladas de fezes de animais e do homem, BARNHART & PANCORBO (1992), KROVACEK et al. (1992), ROSSI JÚNIOR et al. (1995) e NOCITI (1997) verificaram em cepas isoladas de diferentes tipos de alimentos de origem animal. O objetivo deste trabalho foi o de verificar o comportamento frente à ação de antimicrobianos de uso comum em cepas de bactérias do gênero Aeromonas isoladas de diferentes locais e produtos no fluxograma de abate bovino, compreendendo desde a pele, na chegada dos animais, até a carne desossada e pronta para a comercialização. MATERIAL E MÉTODOS Cepas testadas - Foram testadas 102 cepas de Aeromonas sp. (18 da espécie A. hydrophila, 65 da espécie A. caviae e 19 atípicas) previamente isoladas de diferentes locais e produtos em um matadouro frigorífico de bovinos situado no interior do Estado de São Paulo, Brasil. As cepas, que foram mantidas sob temperatura de congelamento em caldo BHI adicionado de 20% de glicerol até o momento da realização dos testes, haviam sido isoladas, no ano de 1996, de amostras da água utilizada nos currais, de swabs da superfície das mãos de manipuladores, colhidos antes e durante a jornada de trabalho, das superfícies da pele e muscular das partes dianteira e traseira da carcaça, da superfície de facas, da água residuária da lavagem de carcaças, do ambiente da sala de matança, de conteúdo intestinal e da carne desossada, Testes de sensibilidade a antimicrobianos (BAUER et al., 1966) - Para a realização desses testes as cepas foram repicadas em tubos contendo 5 ml de caldo tripticase soja e incubadas a 37 o C por 18 a 20 horas. Após a incubação, alíquotas das culturas foram gotejadas de forma asséptica em tubos contendo 4 ml de solução salina esterilizada, até a obtenção de turvação idêntica à da solução padrão de cloreto de bário, preparada pela adição de 0,5 ml de uma solução 0,048 M de cloreto de bário a 99,5 ml de ácido sulfúrico a 1% (v/v) (escala de Mac Farland). A seguir, as culturas diluídas foram semeadas, com auxílio de swabs esterilizados, em placas com ágar Mueller-Hinton e, após aproximadamente 3 minutos, tempo necessário à secagem da superfície do meio, foram colocados os polidiscos (Laborclin) contendo os antimicrobianos. A leitura foi realizada após 18 a 24 horas de incubação a 37 o C, através da medida dos halos de inibição, com a utilização de régua milimetrada. Os diâmetros obtidos em milímetro foram comparados com a tabela fornecida pelo fabricante dos discos utilizados. Foram utilizados, para cada uma das cepas testadas, dois polidiscos, cada um contendo 06 antimicrobianos, sendo estes: tetraciclina (30μg), cloranfenicol (30 μg), netilmicina (30 μg), carbenicilina (100 μg), gentamicina (10 μg), amicacina (30 μg), polimixina B (300 μg), tobramicina (10 μg), ampicilina (10 μg), cefalotina (30 μg), cefoxitina (30 μg) e sulfazotrim (25 μg). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados apresentados na Tabela 1 evidenciam que o princípio ativo com maior percentual de cepas resistentes, excetuando a ampicilina que é utilizada como agente seletivo no processo de isolamento, foi a cefalotina (66,6%), seguido pela carbenicilina (51,0%) e tetraciclina (33,3%). HASSANI et al. (1992) trabalhando com cepas de aeromonas isoladas de água de consumo da cidade de Marrakech, Marrocos, encontraram resultado bastante próximo, com 73% das cepas resistentes à cefalotina. Já, ROSSI JÚNIOR et al. (1995), encontraram resultados superiores, com mais de 80% das cepas isoladas de cortes comerciais de frango apresentando-se resistentes à carbenicilina, à cefalotina, à cefoxitina e à polimixina. OBI

3 ARS VETERINARIA, 16(1):33-38, Tabela 1 - Distribuição das cepas de Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae e aeromonas atípicas, isoladas de diferentes pontos do fluxograma de abate bovino, segundo seu comportamento frente à ação de antimicrobianos. ANT. 1 CONC. Aeromonas hydrophila Aeromonas caviae Aeromonas atípicas TOTAL (μg) R 2 I S R I S R I S R I S TE 30 05(27,8) 3 05(27,8) 08(44,4) 18(27,7) 14(21,5) 33(50,8) 11(57,9) 05(26,3) 3(15,8) 34(33,3) 4 24(23,5) 44(43,1) CM 30 03(16,6) 01(5,6) 14(77,8) 05(7,7) 13(20,0) 47(72,3) 01(5,3) 02(10,5) 16(84,2) 09(8,8) 16(15,7) 77(75,5) NT 30 01(5,6) 02(11,1) 15(83,3) 12(18,5) 05(7,7) 48(73,8) 02(10,5) 04(21,1) 13(68,4) 15(14,7) 11(10,8) 76(74,5) CA (77,8) 02(11,1) 02(11,1) 31(47,7) 14(21,5) 20(30,8) 07(36,8) 04(21,1) 8(42,1) 52(51,0) 20(19,6) 30(29,4) GE 10 00(0,0) 00(0,0) 18(100,0) 04(6,2) 01(1,5) 60(92,3) 03(15,8) 00(0,0) 16(84,2) 07(6,9) 01(1,0) 94(92,1) AK 30 00(0,0) 00(0,0) 18(100,0) 11(16,9) 04(6,2) 50(76,9) 02(10,5) 02(10,5) 15(79,0) 13(12,7) 6(5,9) 83(81,4) PO (5,6) 00(0,0) 17(94,4) 18(27,7) 14(21,5) 33(50,8) 06(31,6) 01(5,3) 12(63,1) 25(24,5) 15(14,7) 62(60,8) TO 10 00(0,0) 00(0,0) 18(100,0) 12(18,4) 01(1,5) 52(80,0) 02(10,5) 01(5,3) 16(84,2) 14(13,7) 02(2,0) 86(84,3) AM 10 18(100,0) 00(0,0) 00(0,0) 65(100,0) 00(0,0) 00(0,0) 19(100,0) 00(0,0) 00(0,0) 102(100,0) 00(0,0) 00(0,0) CF 30 05(27,8) 00(0,0) 13(72,2) 47(72,3) 04(6,2) 14(21,5) 16(84,2) 01(5,3) 02(10,5) 68(66,6) 05(4,9) 29(28,4) CX 30 01(5,6) 01(5,6) 16(88,8) 17(26,1) 07(10,8) 41(63,1) 06(31,6) 00(0,0) 13(68,4) 24(23,5) 08(7,8) 70(68,6) ST 25 04(22,2) 00(0,0) 14(77,8) 15(23,1) 05(7,7) 45(69,2) 01(5,3) 00(0,0) 18(94,7) 20(19,6) 05(4,9) 77(75,5) 1 Antimicrobianos: TE- tetraciclina; CM- cloranfenicol; NT- netilmicina; CA- carbenicilina; GE- gentamicina; AK- amicacina; POpolimixina B; TO- tobramicina; AM- ampicilina; CF- cefalotina; CX- cefoxitina; ST- sulfazotrim. 2 R- resistente; I- intermediário; S- sensível. 3 Porcentagem em relação ao total de cepas da espécie. 4 Porcentagem em relação ao total de cepas testadas Tabela 2 - Distribuição das cepas de Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae e aeromonas atípicas, isoladas de diferentes pontos do fluxograma de abate bovino, em relação ao número de antimicrobianos a que se mostraram resistentes. RESISTÊNCIA Aeromonas hydrophila Aeromonas caviae Aeromonas atípicas TOTAL (n o de princípios) 1 (n o de cepas) (n o de cepas) (n o de cepas) GERAL ACUMULADO 1 07(38,9) 2 07(10,8) 02(10,5) 16(15,7) 3 16(15,7) (22,2) 16(24,6) 05(26,3) 25(24,5) 41(40,2) 3 01(5,5) 11(16,9) 03(15,8) 15(14,7) 56(54,9) 4 03(16,7) 11(16,9) 04(21,0) 18(17,6) 74(72,5) 5 02(11,1) 10(15,4) 01(5,3) 13(12,7) 13(12,7) (5,6) 04(6,2) 03(15,8) 08(7,8) 21(20,5) 7 02(3,1) 02(2,0) 23(22,5) 8 02(3,1) 01(5,3) 03(2,9) 26(25,4) 9 01(1,5) 01(1,0) 27(26,4) (1,5) 01(1,0) 28(27,4) 12 TOTAL 18(100,0) 65(100,0) 19(100,0) 102(100,0) 1 Antimicrobianos: tetraciclina, cloranfenicol, netilmicina, carbenicilina, gentamicina, amicacina, polimixina B, tobramicina, ampicilina, cefalotina, cefoxitina e sulfazotrim. 2 Porcentagem de cepas resistentes em relação ao total de cepas da espécie. 3 Porcentagem de cepas resistentes em relação ao total de cepas testadas. 4 Total acumulado de resistentes a até quatro princípios. 5 Total acumulado de resistentes a cinco princípios ou mais. et al. (1995) encontraram percentuais de resistência à tetraciclina, ao ácido nalidíxico e à gentamicina superiores a 88%, em cepas isoladas de casos clínicos de diarréia na Nigéria. Os dados da Tabela 1 evidenciam também que as drogas a que as cepas se mostraram mais sensíveis foram a gentamicina, a tobramicina, a amicacina, o sulfazotrim, o cloranfenicol e a netilmicina, todas com mais de 70% de cepas sensíveis. Dentre outros estudos envolvendo o comportamento de cepas de aeromonas frente a antimicrobianos, KROVACEK et al. (1992) verificaram alta sensibilidade à estreptomicina e ao cloranfenicol em cepas isoladas de bovinos e aves na Índia. Em cepas isoladas de casos clínicos humanos KO & CHUANG

4 36 ARS VETERINARIA, 16(1):33-38, Tabela 3 - Distribuição das cepas de Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae e aeromonas atípicas, isoladas de diferentes pontos do fluxograma de abate bovino, em relação ao número e aos antimicrobianos a que se mostraram resistentes. N O DE PRINCÍPIOS RESISTÊNCIA Aeromonas hydrophila Aeromonas caviae Aeromonas atípicas PRINCÍPIOS 1 (n o de cepas) (n o de cepas) (n o de cepas) TOTAL PRINCÍPIOS GERAL 1 AM 7(38,9) 2 7(10,8) 2(10,5) 16(15,7) 3 16(15,7) 3 2 AM;CF 01(5,6) 08(12,3) 09(8,8) CA; AM 03(16,7) 08(12,3) 01(5,3) 12(11,8) TE; AM 03(15,8) 03(2,9) PO; AM 01(5,3) 01(1,0) 25(24,5) 25(24,5) 3 TE; CA; AM 01(5,6) 01(1,5) 02(2,0) TE; AM; CF 04(6,2) 02(10,5) 06(5,9) CA; AM; CF 01(1,5) 01(5,3) 02(2,0) AM; CF; ST 01(1,5) 01(1,0) PO; AM; CF 01(1,5) 01(1,0) AM; CF; CX 03(4,6) 03(2,9) 15(14,7) 15(14,7) 4 TE; CM; AM; CF 01(5,6) 01(1,0) TE; CM; NT; ST 01(5,6) 01(1,0) CA; AM; CF; CX 01(1,5) 01(1,0) CA; CM; AM; CF 01(5,6) 01(1,0) TE; AM; CF; CX 02(3,1) 01(5,3) 03(2,9) TE; CA; PO; AM 01(5,3) 01(1,0) TE; PO; AM; CF 04(6,2) 02(10,5) 06(5,9) AK; AM; CF; ST 01(1,5) 01(1,0) TE; CM; AM; ST 01(1,5) 01(1,0) NT; GE; AK; AM 01(1,5) 01(1,0) NT; CA; AM; CF 01(1,5) 01(1,0) 18(17,6) 18(17,6) 5 TE; CA; AM; CF; CX 01(5,6) 01(1,5) 02(2,0) TE; CM; TO; AM; CF 01(5,6) 01(5,3) 02(2,0) NT; TO; AM; CF; ST 01(1,5) 01(1,0) CA; AK; TO; AM; CF 01(1,5) 01(1,0) PO; TO; AM; CF; CX 01(1,5) 01(1,0) CA; AM; CF; CX; ST 02(3,1) 02(2,0) CA; TO; AM; CF; CX 02(3,1) 02(2,0) CA; PO; AM; CF; CX 01(1,5) 01(1,0) TE; CM; NT; AM; CF 01(1,5) 01(1,0) 13(12,7) 13(12,7) 6 01(5,6) 04(6,2) 03(15,8) 08(7,8) 7 02(3,1) 02(2,0) 8 02(3,1) 01(5,3) 03(2,9) 9 01(1,5) 01(1,0) (1,5) 01(1,0) 12 TOTAL 18(100,0) 65(100,0) 19(100,0) 102(100) 1 Antimicrobianos: TE- tetraciclina, CM- cloranfenicol, NT- netilmicina, CA- carbenicilina, GE- gentamicina, AM- amicacina, POpolimixina B, TO- tobramicina AM- ampicilina, CF- cefalotina, CX- cefoxitina, ST- sulfazotrim. 2 Porcentagem de cepas resistentes em relação ao total de cepas da espécie. 3 Porcentagem de cepas resistentes em relação ao total de cepas testadas.

5 ARS VETERINARIA, 16(1):33-38, (1995), na China, encontraram alta sensibilidade apenas à amicacina e ao cloranfenicol. No que se refere ao comportamento frente aos antimicrobianos das diferentes espécies encontradas, os dados da Tabela 1 mostram que 100% das cepas da espécie Aeromonas hydrophila mostraram-se sensíveis à gentamicina, à amicacina e à tobramicina e percentual pouco menor de cepas à polimixina, à cefoxitina e à netilmicina. No tocante à resistência, 77,8% delas foram à carbenicilina. GRAY (1984), trabalhando com cepas de Aeromonas hydrophila isoladas de bovinos, suínos e eqüinos, encontraram alto percentual de cepas sensíveis ao trimetropim e à tetraciclina (95,4%) e resistentes à amoxacilina e à carbenicilina, diferentemente do verificado no presente estudo onde apenas 44,4% das cepas foram sensíveis à tetraciclina. HASSANI et al. (1992) encontraram comportamento semelhante ao verificado por GRAY (1984), com 100% das cepas isoladas de água resistentes à amoxacilina. Dentre as cepas da espécie Aeromonas caviae, verifica-se na Tabela 1 que a maior sensibilidade foi verificada frente à gentamicina (92,3%), seguido pela tobramicina (80,0%), amicacina (76,9%), netilmicina (73,8%) e cloranfenicol (72,3%) e a maior resistência frente à cefalotina (72,3%). Esse comportamento está bastante próximo daquele verificado por HASSANI et al. (1992), onde 96% das cepas de Aeromonas caviae apresentaramse sensíveis ao cloranfenicol e 91% delas resistentes à cefalotina. A análise dos dados constantes das Tabelas 2 e 3 evidencia a ocorrência de resistência a múltiplos princípios ativos, sendo que 84,3% das cepas a apresentaram a dois ou mais princípios. Esses dados diferem daqueles verificados por SINGH & SANYAL (1992), onde a resistência a múltiplos princípios ativos foi encontrada em porcentagem pequena de cepas, particularmente entre aquelas isoladas de casos clínicos de diarréia e estão bastante próximos aos verificados por FALCÃO et al. (1998) e YADAV & VERMA (1998) em cepas de aeromonas isoladas de água e alimentos de origem animal, respectivamente. Os dados das tabelas evidenciam também que dentre as cepas de Aeromonas hydrophila 22,2% delas apresentaram resistência a dois princípios e 38,9% apresentaram resistência a até seis princípios em diferentes combinações. BARNHART & PANCORBO (1992) também verificaram resistência para múltiplos antimicrobianos. De 119 cepas de Aeromonas hydrophila isoladas de carcaças de frango e água de lavagem em diferentes pontos do fluxograma de processamento, a resistência a vários princípios ocorreu em 46% delas, sendo que, destas, 76,3% foram à ampicilina e à cefalotina e o restante 23,6% a dois, três ou quatro princípios em diferentes combinações. No presente estudo, conforme apresentado na Tabela 2, apenas 5,6% das cepas de Aeromonas hydrophila apresentaram resistência à ampicilina e à cefalotina em conjunto. Por outro lado, 16,7% delas o apresentaram à carbenicilina e à ampicilina. Os dados das Tabelas 2 e 3 demonstram também múltipla resistência apresentada pelas cepas de Aeromonas caviae. Pode-se verificar que 89,2% das cepas foram resistentes a dois ou mais princípios ativos, sendo que houveram cepas resistentes a nove e até onze dos doze antimicrobianos testados. Em que pese a espécie Aeromonas caviae ser considerada como a de menor potencial patogênico, comparativamente à Aeromonas hydrophila, a presença de cepas dessa espécie, resistentes a um amplo espectro de antimicrobianos, veiculadas por alimentos de origem animal, deve ser motivo de preocupação. NOCITI (1997), ao verificar que 27,6% das cepas de Aeromonas hydrophila e 29,3% das de A. caviae, isoladas de carcaças e cortes comerciais de frango, mostraram-se resistentes a um amplo espectro de antimicrobianos, concluiu pelo risco de infecção dos consumidores daqueles produtos, por microrganismos de alta resistência. MORIÑIGO et al. (1990) atribuem o aumento do número de microrganismos e da diversificação de espécies com múltipla resistência, isolados a partir de fontes ambientais, à generalizada adição de antibióticos em rações animais e à utilização em abuso dessas substâncias na prática da medicina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARNHART, H.M.; PANCORBO, O.C. Cytotoxicity and antibiotic resistance profiles of Aeromonas hydrophila isolates from a broiler processing operation. Journal of Food Protection, v.55, n.2, p , BAUER, A.W.; KIRBY, W.M.; SHERRIS, J.C.; TURCK, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, v.45, p , CUNLIFFE, D.A.; ADCOCK, P. Isolation of Aeromonas spp. from water by using anaerobic incubation. Applied and Environmental Microbiology, v.55, n.9, p , DAVIS, W.A., KANE, J.C.; GARAGUSI, V.F. Human Aeromonas infections: A review of the literature and a case report of endocarditis. 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