ANÁLISE DE FITOPLÂNCTON

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1 ANÁLISE DE FITOPLÂNCTON Exercício realizado na Agência Portuguesa do Ambiente, (APA) Laboratório de Referência do Ambiente, (LRA) ABRIL/MAIO 2011 LEONOR CABEÇADAS* e JOÃO FERREIRA** * Agência Portuguesa do Ambiente, APA ** Instituto da Água, INAG 7 de Junho 2011, INAG No âmbito de um Projecto de colaboração INAG, APA e CIIMAR Merismopedia spp. Kirchneriella spp.

2 Objectivos: Realização de um Exercício com vista a comparar a variabilidade dos resultados de uma análise quantitativa de Fitoplâncton entre os participantes. Delinear um procedimento comum a adoptar no próximo Exercício de Comparação Interlaboratorial (ECI) de fitoplâncton de modo a minimizar potenciais fontes de variabilidade nos resultados entre participantes.

3 Tabela 1. Participação de 12 representantes de 11 Entidades Nome do participante Carla Gameiro Cristina Costa Elisa Pereira Leonor Cabeçadas Manuel Carneiro Micaela Vale Paulo Pereira Sérgio Paulino Sílvia Condinho Sónia Gonçalves Susana Nunes Vitor Gonçalves Instituição participante Quimiteste Engenharia e Tecnologia, S.A. AquaExam, Lda. Nostoc Laboratório de Investigação Biológica, Lda. Agência Portuguesa do Ambiente Águas do Douro e Paiva, S.A. CIIMAR Universidade do Porto Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge Águas do Algarve, S.A. Labelec Estudos, Desenvolvimento e Actividades Laboratoriais, S.A. Laboratório da Água da Universidade de Évora Direcção de Serviços dos Recursos Hídricos/Universidade dos Açores Foi preparada a amostra B Alvito, de Junho de 2010, em triplicado. Três grupos de participantes. Cada grupo analisou 1 dos replicados. Tempo médio de análise da amostra ± 3 horas.

4 Considerando que o método de Utermöhl se baseia no pressuposto de que a distribuição das células no fundo da câmara de sedimentação é a de Poisson, a precisão é dada pela seguinte equação: Para uma estimativa de contagem de fitoplâncton estatísticamente aceitável, recomenda-se serem contadas pelo menos 50 unidades de cada um dos taxon dominantes (células, colónias ou filamentos). A contagem total deve atingir os 500 indivíduos (Venrick, 1978). A Tabela 2 e Figura 1 mostram a relação entre o nº de unidades contadas e a precisão.

5 Tabela 2. Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança (L.C.), (para um nível de confiança de 95% (Anderson & Thröndsen 2003). Nº de células contadas L.C. ± (%) L.C. ( %) Fig.1 Relação entre o nº de células contadas e o limite de confiança (L.C.), (para um nível de confiança de 95%). nº de células contadas Para manter uma precisão aceitável (28%) é suficiente contar 50 unidades de cada um dos taxon dominantes. Para se obter uma precisão de 10 a 9% a contagem total deve situar-se entre os 400 e os 500 indivíduos (Olrik et al., 1998).

6 Cálculo da concentração de fitoplâncton por unidade de volume A conversão das contagens de fitoplâncton para a respectiva concentração, C (densidade /abundância ) num determinado volume de amostra (normalmente litro ou mililitro) obtêm-se através da seguinte equação: Onde: C = Concentração (densidade/abundância) das espécies fitoplanctónicas Células l -1 e Células ml -1 ) V = volume da câmara de contagem (ml) At = área total da câmara de contagem (mm 2 ) Ac = área contada da câmara de contagem (mm 2 ) N = nº de células das espécies contadas (respectivamente

7 Procedimento adoptado para todos os participantes, Método de Utermöhl, NE 15204, 2006: 1 Sedimentação de uma alíquota* da amostra B - Alvito Junho 2010 numa câmara de sedimentação. 2 - Volume de amostra sedimentado ** = 2,4 ml 3 - Área do fundo da câmara de sedimentação = 491 mm Estratégia de contagem: 6 T em 200X Área observada= 54 mm 2 (11% da área do fundo da câmara) Fig. 2 Sedimentação, para evitar a formação de bolhas de ar na câmara de sedimentação ** colocou-se ao lado uma caixa de Petri com água e ambas foram cobertas com caixa de plástico forrada com papel de filtro humedecido para manter a humidade. Nota* = préviamente homogenizada durante 1 min. Nota** = câmara de sedimentação previamente calibrada por pesagem. 6 T em 400X Área observada= 27 mm 2 (6% da área do fundo da câmara ). 5 - Factores de conversão para o cálculo da concentração de fitoplâncton em número de células por litro: 6 T em 200X = T em 400X = 7506

8 6 - Os taxa seleccionados para contagem na ampliação de 200X foram os seguintes: Aphanizomenon sp. filamento (21 células/filamento) Woronichinia spp. colónia (128 células/colónia) Coelastrum reticulatum coenobia > 20 µm (32 células/coenobium) Chlorococcales coloniais colónia > 20 µm (7 células/colónia) Closterium aciculare célula solitária Closterium acutum var. variabile célula solitária Cosmarium spp.- célula solitária Staurastrum spp. célula solitária Cryptomonas obovata - célula solitária 7 - Os taxa seleccionados para a contagem na ampliação de 400X foram os seguintes: Merismopedia spp. coenobia (4 células/coenobium) Coelastrum reticulatum coenobia < 20 µm (16 células/coenobium) Crucigenia spp. coenobia (4 células/coenobium) Oocystis spp. coenobia (4 células/ceoenobium) Tetraedron spp. célula solitária Chlorococcales não coloniais < 20 µm célula solitária Chlorococcales coloniais < 20 µm (5 células/colónia) Cyclotella spp. célula solitária Chroomonas acuta célula solitária Nanofitoflagelados não identificados célula solitária Notas: Para a espécie Coelastrum reticulatum distinguiram-se duas classes de tamanho (coenobium > 20 µm e coenobium < 20 µm) quantificadas cada uma delas em ampliações diferentes, respectivamente em 200X e 400X. O nº médio de células por filamento, colónia e/ou coenobia foi calculado com base em 30 unidades taxonómicas, n=30.

9 Tabela 3. Resultados obtidos Fitoplâncton total, Nanoplâncton e Micro plâncton (cel/ml) Participante FitoTotal Nano Micro Código (cel /ml) (cel/ml) (cel/ ml) ELab11A ª semana ELab câmara 1 ELab n=5 ELab ELab ELab11A ª semana ELab1101* câmara 2 ELab n=6 ELab ELab1112 # ELab ELab11A ª semana ELab1105 & câmara 3 ELab1109** n=4 ELab11A04d Média SD CV% N Mediana Estratégia de contagem Todos os Participantes Excepções 6T 200x *, & 2T 400x 6T 400x # 3T 400x ** 5T 200x; 4T 400x

10 (cel/ml) FitoTotal (cel/ml) Nano (cel/ml) Micro (cel/ml) Fig.3 Resultados obtidos pelos participantes para a análise quantitativa de Fitoplâncton Total e para as fracções respectivamente de nanofitoplâncton e microfitoplâncton (cel/ml).

11 Fig. 4 Boxplots para resultados de Fitoplâncton total, Nanoplâncton e Microplâncton (cel/ml) com todos os participantes.

12 (cel/ml) Limite Superior de Controlo, LSC FitoTotal (cel/ml) Média (cel/ml) (-3SD) (+3SD) Limite Inferior de Controlo, LIC Fig.5 Resultados obtidos pelos participantes para a análise quantitativa de Fitoplâncton Total (cel/ml). A média ( cel/ml) e ± 3SD (9 607 e cel/ml) são calculados com base nos resultados de todos osparticipantes.

13 Nano (cel/ml) Fracção do Nanofitoplâncton (cel/ml) Fig.6 - Resultados para a fracção de nanofitoplâncton (cel/ml). Fig.7 Boxplot para a fracção de nanofitoplâncton (cel/ml).

14 Meris* (cel/ml) Cret<20um** (cel/ml) Tabela 4 - Teste-U não paramétrico Mann-Whitney Para resultados de Merismopedia spp. (cel/ml) em 2 transeptos 400X vs 6 transeptos 400X (todos os participantes). n 1 n 2 U *valores aproximados P (bicaudal) P (unicaudal) , , normal aprox z = 0, ,815334* * Fig.8 - Resultados para Merismopedia spp. e Coelastrum reticulatum <20 µm (cel/ml) (todos os participantes). Fig.9 Percentagem de desvio em relação à média para contagens de Merismopedia spp. (nºcélulas) em 2 transeptos em 400X (todos os participantes) As duas amostras não são significativamente diferentes (P>=0,05, bi-caudal). % desvio em relação `a média Merismopedia spp Nº de células contadas

15 CV% (400X) Fig.10 - Coeficiente de variação (%) referente a cada um dos participantes na contagem com a ampliação de 400X CV% (200X) Fig Coeficiente de variação (%) referente a cada um dos participantes na contagem com a ampliação de 200X.

16 CONCLUSÕES O coeficiente de variação de 28% (n=15) observado para os resultados obtidos pelos participantes no exercício de análise de fitoplâncton traduz uma variabilidade de resultados controlada. Procedimentos a adoptar no futuro exercício 1-Volume de sedimentação Recomenda-se o uso simultâneo de 3 câmaras de sedimentação de diferentes volumes de modo a permitir a escolha da mais adequada (ex. 25, 10 e 5 ml). 2-Estratégia de contagem Células de dimensões elevadas (ex. Ceratium spp.), colónias (ex. Fragilaria spp., Microcystis spp., Tabellaria spp.), coenobia (ex. Coelastrum spp., Pediastrum spp., Woronichinia spp.) e filamentos (ex. Anabaena spp., Aphanizomenon spp., Tribonema spp.) devem ser contados como uma unidade taxonómica numa ampliação baixa (ex. 200X) em toda a câmara, metade da câmara ou 6 transeptos, dependendo da abundância da amostra. Caso seja adoptada uma contagem em meia câmara, esta deve ser feita contando sempre o 2º transepto de modo a obter uma contagem distribuída por toda área do fundo da câmara e não a área correspondente à metade superior ou inferior da câmara. Células de pequenas dimensões (ex. células isoladas de Microcystis spp., Chroomonas spp., Plagioselmis spp., Tetraedron spp.), coenobia/colónias de pequenas dimensões (ex. Merismopedia spp., Crucigenia spp.) devem ser contadas em ampliação elevada (ex. 400X) no nº de campos /transeptos considerados necessários, dependendo da abundância da amostra.

17 R1479 Merismopedia tenuissima Lemmermann Célula: 0,6 2 µm R1476 Merismopedia minima Beck Célula: 0,5 0,6 µm BIOVOLUME ø=0,6 μm; V=0,113 μm 3 a) cel/ml 0,001 mm 3 /l b) cel/ml 0,006 m 3 /l Fig. 12 Exemplos da distribuição de Merismopedia spp. na amostra da Albufeira do Alvito em Junho de Concentrações de biovolume de Merismopedia spp. calculadas respectivamente para a) amostra original e b) amostra analisada no exercício de Abril/Maio de 2011.

18 REFERÊNCIAS Andersen, P & J. Throndsen, Estimating cell numbers. In Hallegraeff, G.M. Anderson D.M. & A.D. Cembella (eds) Manual on Harmful Marine Microalgae. Monogr. on Oceanogr. Method. no. 11. p UNESCO Publishing, Paris. Brierley, B. Carvalho, L. Davies, S. & J. Krokowski, Guidance on the quantitative analysis of phytoplanktocn in Freshwater samples. Phytoplankton Counting Guidance v doc NE 15204, Water quality Guidance standard on the enumeration of phytoplankton using inverted microscopy (Utermöhl technique). Hallegraeff, G.M., Andersen D.M. & A.D. Cembella (eds), Manual on Harmful Marine Microalgae. UNESCO Publishing, Paris, 793 pp. HELCOM, Manual for Marine Monitoring in the COMBINE Programme of HELCOM, ANNEX C-6: Phytoplankton Species composition, Abundance and Biomass, 12 pp. INAG, Manual para a avaliação da qualidade biológica da água em lagos e albufeiras segundo a Directiva Quadro da Água. Protocolo de amostragem e análise para o Fitoplâncton. Ministério do Ambiente, do Ordenamento do Território e do Desenvolvimento Regional. Instituto da Água, I.P. Lund, J. W. G., Kipling, C. & E. D. Le Cren, The inverted microscope method of estimating algal numbers and statistical basis of estimation by counting. Hydrobiologia 11: 2, pp Olrik, K., Blomqvist P., Cronenberg G. & P. Eloranta, Methods for quantitative assessment of phytoplankton in freshwaters, part I. Naturvärdsverket, Svensk miljöövervakning, Rapport Venrick, E.L., How many cells to count?. In: Sournia (ed.). Phytoplankton manual. UNESCO Monogr. Oceanogr. Method. 6:

19 ERRATA referente ao 3º Exercício de Comparação Interlaboratorial de Junho de 2010 Cloroplastos pequenos espalhados por toda a célula, nomeadamente na região média Pseudostaurastrum, falsa desmídea que se pode confundir com Staurastrum pela forma exterior aparentemente parecida. Esta microalga já foi classificada como Tetraedron limneticum (Chlorophyceae). A verdadeira Conjugatophyceae (Staurastrum) caracteriza-se por 2 cloroplastos grandes, cada um deles numa das semi células, enquanto que a Xanthophyceae (Pseudostaurastrum) tem vários cloroplastos pequenos discoides distribuídos por toda a célula. Fot.37 - R1280 Staurastrum brachiatum (Ralfs) West & West Célula: x μm Istmo: 5-9 μm R1338 Pseudostaurastrum limneticum (Borge) Couté & Rousseli Xanthophyceae/Mischococcales Agradece-se ao Vitor Gonçalves (Univ. dos Açores) a correcta identificação da espécie R1280 Staurastrum brachiatum (Ralfs) West & West (Foto ACOI- Coimbra) Dois cloroplastos grandes cada um deles localizado numa das semi células. Sem cloroplastos na zona do istmo