TANASE PRODUZIDA POR Penicillium UTILIZANDO FOLHA DE GOIABEIRA COMO SUBSTRATO

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1 TANASE PRODUZIDA POR Penicillium UTILIZANDO FOLHA DE GOIABEIRA COMO SUBSTRATO Fonseca, J. C. (1) ; Cruz, R. (1) ; Silva, J. L. (1) ; Moreira, K. A. (2) Motta, C. M. S. (1) (1) Departamento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, Recife - PE, Brasil, CNPq; (1) Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco- UFPE, Garanhuns - PE, Brasil. RESUMO A Tanase é uma enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis como ácido tânico, em glicose e ácido gálico. É produzida por microorganismos e vegetais. Dentre os fungos filamentosos, o gênero Penicillium destaca-se como segundo melhor produtor. Para a produção de tanase a Fermentação em estado Sólido (FES) é uma excelente alternativa, por minimizar os custos, além de reaproveitar resíduos agroindustriais e agroflorestais como substratos. A tanase é aplicada na indústria de bebidas, cosméticos, farmacêutica e química. O objetivo desse trabalho foi selecionar espécies de Penicillium capazes de produzir tanase através de FES, utilizando como substrato folhas de goiabeira. Para a avaliação qualitativa, as espécies foram inoculadas em meio ágar Czapeck, modificado pela substituição de sacarose por ácido tânico, e incubadas a 30 C por 72 h. As que apresentaram halo de degradação do ácido tânico foram selecionadas para avaliação quantitativa através de FES. Todas as linhagens foram capazes de degradar ácido tânico e foram selecionadas para a avaliação quantitativa da produção da enzima através de FES. A linhagem que

2 apresentou a maior atividade de tanase foi Penicillium citreonigrum URM 6020, com U ml -l e está sendo indicado para estudos de otimização da produção. Palavras-chave: FES, Pisidium guajava L. INTRODUÇÃO Espécies de Penicillium são de extrema relevância na natureza, pois são encontradas com muita facilidade no solo, sobre serrapilheira, em ambientes úmidos, secos etc., atuando ativamente na reciclagem da matéria orgânica (PITT, 1991). Por outro lado, estas espécies são amplamente utilizadas para a produção de enzimas de interesse industrial, ambiental, farmacêutico, alimentício, bem como na agricultura. Dentre as enzimas produzidas por espécies de Penicillium, destaca-se a tanase (BON et al., 2008; SELWAL;SELWAL, 2012). A tanase é uma enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis como ácido tânico, em glicose e ácido gálico (COSTA, et al., 2008), extracelular, induzível, produzida na presença de acido tânico por fungos filamentosos, bactérias e leveduras. Dentre os fungos filamentosos produtores de tanase, o gênero Penicillium é o segundo melhor produtor, precedido apenas por espécies de Aspergillus (AGUILAR et al., 2001 a,b; MACEDO et al., 2005; COSTA, et al., 2008; MATA-GÓMEZ et al., 2009; CHHOKAR et al., 2010). Dentre os 2

3 fungos filamentosos produtores de tanase, o gênero Penicillium é o segundo melhor produtor, precedido apenas por espécies de Aspergillus (MACEDO et al., 2005). Para a produção de tanase por fungos, dois processos de fermentação podem ser utilizados, a Fermentação Submersa (FS) ou a Fermentação em Estado Sólido (FES). De acordo com a literatura, a FES é mais vantajosa que a submersa, sobretudo pela grande economia de água e pela possibilidade da utilização de resíduos industriais ou de substratos de baixo custo, disponíveis na natureza, como folhas de vegetais a serem utilizados como fonte de carbono e taninos para o fungo durante a produção da enzima. (MACEDO et al., 2005). Há poucos relatos da utilização de folhas de vegetais como substratos para a produção de enzimas por fungos, através de FES. Em 2007, Treviño-Cueto e colaboradores utilizaram folhas de Larrea tridentata, vegetal comum nos Estados Unidos e México, conhecido popularmente como Gobernadora na produção de tanase por Aspergiillus niger através de FES. Manjit et al. (2008) utilizaram folhas de vegetais asiáticos Amla (Emblica phyllanthus), Ber (Mauritiana zyzyphus), Jamum (Syzygium cumini), Jamoa (Syzygium sp.) e Keekar (Acacia nilotica) na produção de tanase por Asgergillus fumigatus através de FES. Neste contexto, folhas de goiabeira podem ser excelentes substratos para produção de tanase por fungos, através de FES. 3

4 A goiabeira (Pisidium guajava L.) é um arbusto perene, pertencente à família Myrtaceae. Trata-se de uma árvore frutífera, originária das Américas Central e do Sul, cultivada em todos os países de clima tropical (ALVES et al., 2006). Seus frutos são ricos em vitamina C e suas folhas e sementes em taninos. Embora existam muitas aplicações industriais da tanase em potencial, poucas são efetivamente empregadas, devido essencialmente ao custo de produção da enzima, que ainda é elevado e ao pouco conhecimento sobre seu modo de ação catalítica. Esta enzima pode ter vasta aplicação na indústria de bebidas (principalmente sucos e cervejarias) cosméticos, farmacêutica e indústria química (LEKHA; LONSANE, 1994), sendo principalmente utilizada na produção de ácido gálico, na estabilização da coloração dos vinhos, na produção de refrigerantes a base de café, no processo de tratamento do couro, na detanificação de alimentos e no tratamento de efluentes da indústria de couros (BANERJEE, et al, 2001). Diante do exposto, os objetivos deste trabalho foram caracterizar qualitativamente e quantitativamente quanto à produção de tanase, 12 espécies de Penicillium procedentes da Micoteca URM; Produzir tanase pelas espécies através da fermentação em estado sólido utilizando folha da goiabeira (Psidium guajava L.) como substrato; Selecionar a melhor espécie; Incorporar os resultados obtidos ao banco de dados da 4

5 Micoteca URM, aumentando o número de culturas caracterizadas quanto ao potencial biotecnológico nesta Coleção. MATERIAL E MÉTODOS Procedência dos fungos Foram testadas 12 espécies de Penicillium (Tabela 1) isoladas do solo de área de Caatinga e Mata Atlântica de Pernambuco, procedentes da Coleção de Culturas - Micoteca URM, do Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil. Detecção da capacidade taninolítica dos fungos As espécies de Penicillium foram repicadas para o centro do meio Ágar Czapek (C 12 H 22 O 11, 30 g; MgSO 4.7H 2 O, 0.5 g; KCl, 0.5 g; FeSO 4.7H 2 O, 0.01 g; KH 2 PO 4, 1.0 g; NaNO 3, 3.0 g; Ágar, 16 g; H 2 O destilada, 1000 ml) contido em placas de Petri, modificado pela substituição da sacarose por 10 g/l de ácido tânico (C 76 H 42 O 56 ), contido em placas de Petri, sendo incubadas em estufa a 30 C por 72h. Após a incubação, a aparência das colônias e tamanho do halo em torno das colônias foi determinada (MURUGAN et al., 2007). 5

6 Tabela 1. Número de registro das espécies de Penicillium na Micoteca-URM. ESPÉCIE Nº URM ANO DE ESTOCAGEM P. aurantogriseum URM P. brevicompactum URM P. canescens URM P. citreonigrum URM P. chrysogenum URM P. commune URM P. corylophillum URM P. decumbens URM P. digitatum URM P. fellutanum URM P. glabrum URM P. restrictum URM

7 Fermentação em estado sólido Para seleção das espécies de Penicillium quanto à produção de tanase através de fermentação em estado sólido, foram utilizadas folhas da goiabeira (Psidium guajava L.) como substrato. Estas folhas foram coletadas em região de Mata Atlântica no Município de Jaboatão dos Guararapes, PE, lavadas com água destilada e secas em estufa a 55 ºC por 72 horas para remover a umidade livre. O material foi finamente triturado em multiprocessador até a obtenção de partículas com aproximadamente 50 µm. O material foi armazenado em recipiente escuro em temperatura ambiente até o momento da fermentação (Treviño-Cueto et al., 2007). Em frascos tipo Erlenmeyers de 125 ml foram adicionados 5.0 g de folhas d goiabeira previamente tratadas e 5 ml de solução de sais na composição (g/l): KH 2 PO 4, 1.0 g; NH 4 NO 3, 5 g, NaCl 1 g, MgSO 4.7H 2 O 1 g e ácido tânico 40 g. O ph foi ajustado para 5.5. Os frascos contendo as folhas foram esterilizados a 121 C durante 20 min. Para a preparação do inóculo, os esporos das culturas com 7 dias de crescimento em ágar extrato de malte foram suspensos em solução salina + Tween 80 0,1%, e em seguida contados em câmara de Neubauer. Os frascos foram inoculados com 1 ml da solução de esporos na concentração 5x10 8 esporos/ml e incubados a 30 C em 7

8 estufa BOD. Após 120 h de fermentação, em cada frasco foram adicionados 50 ml de água destilada esterilizada com 0,01% de Tween 80 e mantidos em agitador rotativo (Shaker) a 150 rpm durante 10 minutos. Em seguida o material fermentado foi submetido a filtração direta usando em papel de filtro (CELAB 22,15 micra) como o auxílio de uma bomba a vácuo. O filtrado de cada frasco foi considerado extrato bruto enzimático e preservado em 4 C para futuras análises (Sabu et al., 2005). Determinação da atividade enzimática A atividade enzimática da tanase foi determinada colorimetricamente de acordo com Sharma et al. (2000) com modificações. Em tubo de ensaio, foram adicionados 0.4 ml do extrato enzimático bruto e em seguida 0,6 ml de solução etanólica de rodanina (0,667 g de rodanina e 100 ml de etanol absoluto). Após agitação em Vortex a solução permaneceu em repouso durante 5 minutos. Após este período, foram adicionados 0,4 ml da solução de hidróxido de potássio 0,5 N (14 g de hidróxido de potássio e 500 ml de água destilada esterelizada). Após três minutos, foram adicionados 8,6 ml de água destilada e após agitação vigorosa em Vortex, cada amostra, em triplicata, foi lida em espectrofotômetro a 520 nm. O aparelho foi calibrado com um tubo nas mesmas condições 8

9 da amostra, porém com água destilada substituindo o extrato enzimático. RESULTADOS E DISCUSSÃO Quanto a capacidade de degradar ácido tânico, todas as 12 espécies produziram halo a 30 C por 72 horas (Tabela 4). Comportamento semelhante também foi observado por outros autores. Batra e Saxena (2005), avaliaram qualitativamente quanto a produção de tanase 35 espécies de Aspergillus e 25 de Penicillium. As espécies foram inoculadas em meio sólido contendo 1% de ácido tânico e 3% de ágar, durante 72h a 30 ºC. Das 25 espécies de Penicillium, apenas P. oxalicum, P. avellancum, P. camembertii, P. giganteum, P. nigricans, P. stipitatum e P. cyclopium, ou seja, 28% não produziram. Devido ao fato de todas as espécies terem degradado ácido tânico na avaliação qualitativa, todas foram selecionadas para a quantificação da produção da enzima, através de fermentação em estado sólido utilizando folhas de goiabeira como substrato. 9

10 Tabela 4. Detecção da produção de tanase em meio sólido por espécies de Penicillium estocadas na Coleção de Culturas Micoteca- URM. ESPÉCIE Nº URM ZONA DE HIDRÓLISE (mm) P. aurantogriseum P. brevicompactum P. canescens P. citreonigrum P. chrysogenum P. commune P. corylophillum P. decumbens P. digitatum P. fellutanum P. glabrum P. restrictum Dentre as 12 espécies de Penicillium testadas quanto a produção de tanase em meio sólido utilizando folhas de goiabeira como substrato. Penicillium citreonigrum URM 6020, foi a espécie melhor produtora com atividade U ml -l (Tabela 05). 10

11 Tabela 5. Atividade de tanase (U/mL) produzida por espécies de Penicillium utilizando substrato folha de goiabeira para a produção de tanase, após 96 h de incubação. ESPÉCIE Nº URM FOLHA DE MANGUEIRA (U ml-l) P. aurantogriseum ,12 P. brevicompactum ,47 P. canescens ,52 P. citreonigrum ,90 P. chrysogenum ,71 P. commune ,14 P. corylophillum ,52 P. decumbens ,61 P. digitatum ,04 P. fellutanum ,80 P. glabrum ,52 P. restrictum ,33 Em 2007, avaliando a produção de tanase por diferentes espécies de fungos, através de FES, utilizando folhas de ber (Zyzyphus mauritiana), jamun (Syzygium cumini), amla (Phyllanthus emblica) e jawar (Sorghum vulgaris), Kumar et al. (2007) observaram a produção máxima de 69 U/g seca, após 96 h de incubação a 30 ºC por Aspergillus ruber, utilizando folhas de jamum. Tais resultados foram bastante inferiores aos encontrados no presente estudo, quando folhas 11

12 de mangueira foram utilizadas, além de terem sido expressas na base seca, onde os resultados da atividade em U ml -l são multiplicados pela quantidade de resíduo utilizada em cada frasco. Manjit al. (2008) avaliaram através de fermentação em estado sólido (FES) a produção de tanase por Aspergillus fumigatus isolado de efluentes de curtume. Como fontes de carbono, foram utilizadas folhas de folhas Amla (Phyllanthus emblica), Ber (Zyzyphus mauritiana), Jamun (Syzygium cumini), Jamoa (Syzygium sp.) e Keekar (Acacia nilotica) vegetais típicos da Índia que atuaram como indutores para a produção da enzima. Vários parâmetros foram estudados para otimizar a produção da enzima. O valor máximo de rendimento 174,32 g de U g - 1 foi obtido a 25 C após 96 h de incubação a ph 5,0. Tal resultado foi obtido após a otimização da produção. Entretanto, no presente estudo preliminar, P. citreonigrum URM 6020 produziu U ml -l de tanase. Provavelmente, após estudos de otimização a produção da tanase por P. citreonigrum URM 6020 será elevada consideravelmente. Em 2011, Selwal & Selwal avaliaram a produção de tanase por um isolado de Penicillium atramentosum, proveniente de efluente de curtume, através de fermentação submersa, utilizando folhas de amla (Phyllanthus emblica), ber (Zyzyphus mauritiana), jamoa (Eugenia cuspidate), jamun (Syzygium cumini) e keekar (Acacia nilotica) em pó. Os autores observaram máximo rendimento de tanase de 32,8 e 34,7 12

13 U/ml, a partir de folhas de amla (2% w/v) e keekar (3% w/v), respectivamente, incubadas a 30 C durante 72 h. Comparando com o presente estudo, folhas de goiabeira apresentam-se mais promissoras para a produção de tanase, pois estimularam a produção máxima de U ml -l durante screening da produção de tanase por Penicillium citreonigrum, resultados bastante elevados em relação aos obtidos por Selwal & Selwal. CONCLUSÃO Espécies de Penicillium isolados de amostras de solo de Mata Atlântica e Caatinga são produtoras de tanase; A FES é um excelente processo para produção de tanase utilizando fungos filamentosos; Folhas de goiabeira (Psidium guajava L.) são potenciais substratos para produção de tanase por espécies de Penicillium, através de FES; Penicillium citreonigrum URM 6020 é excelente produtor de tanase por FES utilizando folhas de goiabeira como substrato, apresentando atividades de tanase antes não relatadas pela literatura, em estudo preliminar. 13

14 REFERÊNCIAS ALVES, P. M.; Leite, P. H. A. S.; Pereira, J. V.; Pereira, L. F.; Pereira, M. S. V.; Higino, J. S.; Lima, E. O. Atividade antifúngica do extrato de Psidium guajava Linn. (goiabeira) sobre leveduras do gênero Candida da cavidade oral: uma avaliação in vitro. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 16, n.2, p , BATRA, A.; SAXENA, R.K. Potential tannase producers from the genera Aspergillus and Penicillium. Process Biochemistry, v. 40, p , BATTESTIN, V.; Matsuda, L.K.; Macedo, G.A. Fontes e aplicações de taninos e tanase em alimentos. Alim. Nutr. Araraquara, v.15, n.1, p.63-72, 2004 BON, E.P.S., Ferrara, M.A., Corvo, M.L. Enzimas em Biotecnologia Produção, aplicações e Mercado. Editora Interciência, Rio de Janeiro LEKHA, P.K.; Lonsane, B.K. Production and application of tannin acyl hydrolase: state of the art. Advances in Applied Microbiology, v. 44, , MACEDO, G.A.; Matsuda, L.K.; Battestin, V. Seleção de Fungos Produtores de Tanases em resíduos Vegetais Ricos em Taninos. Ciênc. Agrotec. v. 29, n. 4 p , MANJIT; Yadav, A.; Aggarwal, N. K.; Kumar, K.; Kumar, A. Tannase production by Aspergillus fumigatus MA under solid-state fermentation. Microbiol Biotechnol. v. 24, p , MONDAL, K.C.; Banerjee, D.; Jana, M; Patil, B.R. Calorimetric assay method for determination of tannin acyl hidrolase activity. Analytics Biochemistry, v. 295, p , MURUGAN, K.; S. Saravanababu, M.; M. Arunachalam. Screening of tannin acyl hydrolase (E.C ) producing tannery effluent fungal isolates using simple agar plate and SmF process. Bioresource Technology, v. 98, p PINTO, G. A. S.; Couri, S.; Leite, S. G. F.; Brito, E. S. de. Tanase: conceitos, produção e aplicação. Boletim do Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos, Curitiba, v.23, n.2, p

15 PITT, J.I. A laboratory Guide to Common Penicillium Species. North Wales: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization Division of Food Processing ROZANE, D. E.; Darezzo, R. J.; Aguiar, R. L.; Aguilera, G. H. A.; Zambolin, L. Manga, produção integrada, industrialização e comercialização. 1 Ed., Suprema Gráfica e Editora, p. 604, SABU, A. A; Pandey, A. A; Jaafar Daud, M. B; Szakacs, G. Tamarind seed powder and palm kernel cake: two novel agro residues for the production of tannase under solid state fermentation by Aspergillus niger ATCC Bioresource Technology, v. 96, p , SAMSON, R.A.; FRISVAD, J.C. Penicillium Subgenus Penicillium: new Taxonomics Schemes, Mycotoxins and Other Extrolites. Studies in Mycology, v.49, p , SELWAL, M.K.; Selwal, K.K. High-level tannase production by Penicillium atramentosum KM using agro residues under submerged fermentation. Annais Microbiology, p. 1-10, SHARMA, S., BHAT, T.K.; DAWRA, R.K. A spectrophotometric method for assay of tannase using rhodanine. Analytical Biochemistry. v. 279, p , TREVIÑO-CUETO, B.; Luis, M.; Contreras-Esquivel; Rodrigues, R.; Aguilera, A.; Agilar, C.N. Gallic acid and tannase accumulation during fungal solid state culture of a tannin-rich desert plant (Larrea tridentate Cov.). Bioresource Technology, v. 98, p ,