STEM. (Scanning-transmission electron microscopy) Marcos Farina Instituto de Ciências Biomédicas-UFRJ
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- Walter Alcântara Ribas
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1 STEM (Scanning-transmission electron microscopy) Marcos Farina Instituto de Ciências Biomédicas-UFRJ
2 Nesta figura estão mostradas as duas modalidades fundamentais de observação através do MET. Com a lente de difração (INT 1), podemos focalizar o plano da primeira imagem (esquema à esquerda), ou o plano focal posterior da lente objetiva (esquema à direita), gerando na tela de observação, uma imagem aumentada do objeto ou uma figura de difração, respectivamente. Adaptado de Loretto & Smallman, 1975
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4 Mass-thickness
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6 CAMPO ESCURO
7 Na modalidade varredura as lentes do microscópio são utilizadas para reduzir o tamanho do probe, formando um spot diminuto. O feixe varre a amostra ponto a ponto. Poderíamos pensar que a resolução seria determinada pelo tamanho do probe, entretanto ela depende também do número de elétrons no feixe e da capacidade do sistema ser capaz de detectar uma determinada estrutura contra um back-ground de ruido.. Razão sinal/ruído = N/ N. Razão mínima para detecção de um detalhe contra b.g. estatisticamente variável = 5/1. Mais aceitável. = 10/1. Para conseguir imagem de boa qualidade comparável à do MET... = 100/1. Considerando 100/ elétrons por ponto da imagem. Para um bom display 1000 pontos em 1000 linhas, ou seja, 10 6 pontos imagem.. Portanto elétrons carga de x1,6x10-19 C = 1,6x10-9 C Se o tamanho do probe é de 1nm (ou seja 10-7 cm de diâmetro), a densidade de carga na amostra será (1,6x10-9 )/(10-14 ) = 1,6x10 5 C/cm 2 O brilho máximo de um filamento de tungstênio a 100kV é de 10 5 A/cm 2 /sr e o máximo ângulo sólido x10-4 sr corrente disponível no probe 10 5 x x10-4 A/cm 2 = 31,4A/cm 2 O tempo para atingir a densidade de carga de 1,6x10 5 C/cm 2 com este probe será 1,6x10 5 /31,4 = 500s (o que equivale a 80 minutos ou 1:20 horas para formar uma imagem!!) Isto explica a limitação da resolução do microscópio baseado no filamento de tungstênio em 5nm. Usando filamento LaB 6 o brilho aumenta 10x resolução vai para 2nm Usando Field-emission gun cujo brilho é 10 3 ou 10 4 x maior resolução muito melhor 0,2nm com tempos de varredura por imagem curtos.
8 STEM a partir de 1971 grande potencial para alta resolução após observação direta de átomos pesados (Crewe et al., Visibility of Single Atoms. Science 168: , 1970). Em 1978 apenas 5 destes microscópios demonstravam a mesma habilidade. O requisito mínimo para ver átomos pesados individuais sobre um substrato fino de carbono, é uma resolução de ponto 4Å. A visibilidade de átomos melhora aproximadamente com o inverso do quadrado do poder de resolução, e eles se tornam relativamente fáceis de serem observados a aproximadamente 2,5Å. A característica principal do STEM é sua capacidade de trabalhar eficientemente no modo de campo escuro. Neste modo estamos no contexto da resolução de ponto. Neste caso, um objeto pequeno (átomo por exemplo) terá a aparência do próprio probe e o poder de resolução será FWHM. A outra definição de resolução é a capacidade de resolver imagens de rede cristalina. Neste modo podemos integrar informação de uma região larga da amostra. Microscópios resolvem imagens de rede cristalina com uma resolução melhor do que a resolução de ponto. O sistema STEM foi desenvolvido como sistema totalmente dedicado; pela modificação de microscópios de varredura pré-existentes; pela conversão de microscópios eletrônicos de transmissão de alta resolução (HRTEM) (com canhão field-emission ) em STEMs. A adaptação de acessório de varredura a microscópios convencionais com filamento de tungstênio apresenta sempre baixa resolução, por exemplo 10 a 25Å. A conversão do HRTEM em STEM envolve: 1) Uso de elementos básicos do HRTEM (lentes eletronicamente estáveis, lentes concentradoras do feixe para formar um spot, com baixo Cs, sistema de deflexão do feixe, alta estabilidade mecânica, etc.) 2) Possibilidade de operar com voltagens maiores do que os SEMs usuais. 3) Sistema ótico abaixo do plano do objeto, apropriado para detectar a distribuição de espalhamento tanto de elétrons elásticos como inelásticos, pois cada um carrega informações específicas 4) A flexibilidade da ótica eletrônica do TEM permite a introdução de diferentes modos de operação no STEM e a possibilidade de otimizar o controle dos parâmetros básicos como spot size e divergênca do feixe 5) A introdução do sistema STEM em um TEM provê a base para extender a capacidade deste último como uma ferramenta científica. Varrer um feixe de elétrons finamente focalizado através de uma amostra fina permite informação estrutural com alta resolução com alta eficiência, explorando tanto elétrons de espalhamento elástico como inelástico.
9 STEM é uma boa alternativa para obter imagens de materiais biológicos, que são susseptiveis ao dano do feixe, e permite guardar a informação de forma a ser processada digitalmente no futuro. Para amostras finas (T<< livre caminho médio λ), a razão entre o número total de elétrons de espalhamento elastico e os inelásticos, é aproximadamente proporcional ao número atômico Z. Há duas razões principais que justificam o STEM como ferramenta analítica quantitativa: (1) os diversos sinais gerados pela interação de região nanométrica com o probe, podem ser coletados pelos detetores altamente otimizados; (2) a aquisição sequencial dos sinais leva diretamente ao uso de métodos de processamento digital. Em contraste, imagens por CTEM são difíceis de analizar devido ao efeito de contraste de fase, mesmo que contenham alta resolução. STEM foi desenvolvido por Crewe. Contém field emission source de alto brilho, consistindo de ponta fina de tungstênio submetida a um campo elétrico intenso. Elétrons da ponta podem tunelar para o vácuo resultando numa fonte de tamanho reduzido. Após serem acelerados, os elétrons do feixe podem ser focalizados pelas lentes condensadoras e pela objetiva num spot sub-nanométrico. O STEM pode ser melhor conceitualizado como um instrumento para medida de eventos de espalhamento: sinais de uma variedade destes eventos podem ser obtidos simultaneamente por detecttores específicos, provendo informações diferentes sobre a amostra. Uma contribuição do STEM em biologia é a medida de massa molecular (Brian Andrews, R.D. Leapman, Wall, Engel, ). A técnica mass mapping que é baseada no fato de que a intensidade de espalhamento elástico em qualquer pixel, é diretamente proporcional à massa molecular projetada, é normalmente obtida em material processado por congelamento rápido e secagem a vácuo, como no caso de macromoléculas purificadas. STEM também tem alto potencial microanalítico, que pode chegar à sensibilidade de detecção de um único átomo, pela análise das perdas de energia do feixe de elétrons transmitidos após interagir com amostra fina (exemplos: ferritina, átomos de cálcio, detecção de elementos traço contaminantes, aplicações em fisiologia celular, uso de acessório de crio-transferência recentemente otimizados).
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11 Modos de imageamento por STEM:. O STEM fornece vários tipos específicos de informação, que vão da distribuição da massa em agregados supramoleculares, às concentrações totais de íons em pequenas organelas. A imagem mais facilmente interpretável em STEM é originada do espalhamento elástico pelos núcleos atômicos e é capturada pelo detetor de campo escuro anular (ADF). Pelo fato de que sinal no ADF é integrado sobre uma faixa angular grande, o mecanismo de contraste pode ser considerado incoerente e esta é a razão pela qual, diferente do CTEM, os efeitos de contraste de fase podem ser desprezados no STEM. Há vantagens em ter dois detetores ADF para permitir algum tipo de contraste devido ao número atômico, pois o espalhamento angular causado por átomos mais pesados é maior do que o causado por átomos mais leves (HAADF ).. Elétrons que passam pela abertura do detector ADF podem entrar em um espectrômetro EELS. O sinal EELS permite obter informação de eventos de espalhamento inelástico nos quais o elétrons do feixe perde energia pela excitação de estados eletrônicos no espécime.. O espectro EELS provê muitos tipos de informação sobre o espécime incluindo sua composição química (excitação de eletrons de valência em energias E < 30eV) e composição elementar (excitação de elétrons internos, E > 30eV).. Uma vantagem importante do STEM é que o canhão field-emission tem dispersão de energia menor do que 0,5 ev, comparado com fonte convencional termoiônica que é maior do que 1 ev. Outra vantagem de EELS, na análise de material biológico, é que apresenta maior sensibilidade para elementos leves quando comparado à microanálise de raios x. Contraste Z Utilizando o espectrômetro EELS para elimiar a componente elástica do espectro ( zero-loss ) e a componente de elétrons não espalhados, a imagem de elétrons inelásticos totais pode ser obtida. Esta pode ser combinada digitalmente com a imagem do detetor ADF, para fornecer informação quantitativa sobre o número atômico médio de compostos na amostra, os quais podem estar relacionados com a distribuição de proteínas, ácidos nucleicos, lipídeos, etc.
12 Este modo de formação de imagem é chamado de razão, ou contraste Z pois a razão entre o espalhamento elástico e o inelástico é proporcional ao número atômico Z.. OBS: EDX dá informação sobre concentração elementar e é complementar à obtida por EELS. Exemplos de aplicações: Para amostras muito finas, o sinal no ADF é proporcional à massa projetada. Amostras de grupos macromoleculares isolados são depositadas sobre filmes extremamente finos de carbono (<3nm) suportados por filmes de carbono com buracos, depositados por sua vez sobre grade de microscopia eletrônica. A amostra é congelada rápidamente por imersão, transferida a frio para o microscópio, e deixada no interior do microscópio para remoção de água pelo efeito do vácuo (freeze-drying). Após aquisição digital, da imagem ADF a baixas doses (< 10 3 e/nm 2 ) estruturas de interesse são selecionadas digitalmente, a intensidade total na região selecionada é computada, o back-grund devido ao filme suporte de carbono é subtraido, e o resultado é comparado com um padrão de calibração apropriado introduzido na amostra. Virus mosaico do tabaco são comumente usados para a calibração. A sensibilidade do mapeamento de massa por ADF pode ser de até 500Daltons/contagem, enquanto a resolução pode se aproximar de 2nm, sendo ótimo na faixa de nm, o que torna esta técnica ideal para estudar a organização de macromoléculas e agregados macromoleculares. Caso da cinesina: Imagens STEM de moléculas individuais da proteina motora cinesina revelam a estrutura em três domínios esperada a partir de estudos bioquímicos e moleculares, com um peso molecular total de 379±15 kd consistente com a sequência de aminoácidos conhecida. A distribuição de massa pode também ser avaliada indicando qual das extremidades é geradora de força e qual fica presa à carga transportada pela molécula. Imagens ADF de agregados de cinesina com microtúbulos revelaram a organização de microtúbulos alinhados ligados a intervalos irregulares por pontes que são < 25nm. Estas pontes têm massa de 360±15 kd a qual, junto com a forma e o tamanho da ponte indica que as mesmas são de moléculas únicas de cinesina. O achado de que a molécula de cinesina pode ligar microtúbulos por ambas extremidades, tem a implicação interessante de que a cinesina pode desempenhar um papel antes desconhecido, no deslocamento de microtúbulos, um processo de extrema importância em mitose e provavelmente na extensão de processos celulares..
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15 Rutherford Scattering
16 High Angle Annular Dark Field (HAADF) STEM Tomography Conventional electron tomography utilises BF contrast, due to is biological origins, however for materials specimens BF images can be unsuitable due to non monotonic contrast, such as that generated by diffraction or Fresnel fringes. As such alternative contrast mechanims must be used. One suitable mechanism is Z-contrast imaging, generated by high angle annular dark field (HAADF) scanning transmission electron microscopy (STEM). By using a STEM detector with a large inner radius, a HAADF detector, electrons are collected which are not Bragg scattered. As such HAADF images show little or no diffraction effects, and their intensity is approximately proportional to Z 2. This imaging technique proves ideal for tomographic reconstruction as it generates strong contrast that has a fully monotonic relationship with thickness. Magnetite crystals in bacteria strain MV-1, in this preperation the cell is preserved surrounding the crystals. The tilt series was acquired from +76 degrees to - 76 degrees. Each crystal is ~60nm long. The quality of the reconstruction allows both the crystallites (yellow) and the exterior cell wall (green) to be to be resolved. Click to view animation of this reconstruction.
17 123º 123º 122º 125º 125º 124º 1,8 º 2,5 º
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28 Tecnai F20 Specifications Imaging Modes: TEM/STEM Accel. Voltage: 200KV Cs: 1.2mm PTP Resolution: 0.24nm Information Limit: 0.14nm Source: Field Emission Tilt Range: ± 30 (normal holder) Tilt Range: ± 70 (special holder) Ancillary Equipment CCD Camera Video Camera GatanTM Imaging Filter Environmental Cell Single-Tilt Heating Stage Double-Tilt Heating Stage (800 C) Techniques Energy Filtered Imaging Environmental Cell Microscopy EELS HRTEM Z-contrast Imaging
29 JEOL JEM 4000EX Specifications Imaging Modes: TEM Accel. Voltage: 400kV Cs: 1.0mm PTP Resolution: 0.17nm Source: LaB6 Tilt Range: ±25 Ancillary Equipment CCD Camera Top-entry Double-tilt Holder TV Camera Techniques HRTEM
30 LEO 912-Omega Specifications Imaging Modes: TEM Accel. Voltage: 100KV Cs: 2.7mm PTP Resolution: 0.35nm Source: LaB6 Tilt Range: ± 60 Ancillary Equipment Omega Filter Double-Tilt Liquid Nitrogen Holder CCD Camera Techniques CBED Energy Filtered Imaging EELS
31 Philips CM200-FEG Specifications Imaging Modes: TEM/STEM Accel. Voltage: 200KV Cs: 1.2mm PTP Resolution: 0.25nm Focused Probe: 0.5nm Source: Schottky Field Emission Tilt Range: ± 25 Ancillary Equipment CCD Camera PEELS Detector X-Ray Detector Double-Tilt Holder Lorentz Lens Electrostatic Biprism ES VisionTM Acquisition System Techniques HRTEM Nanodiffraction Electron Holography Lorentz Imaging Z-contrast Imaging
32 JEOL JEM 2000FX Specifications Imaging Modes: TEM Accel. Voltage: 200kV Cs: 2.0mm PTP Resolution: 0.28nm Source: LaB6 Tilt Range: ± 60 Ancillary Equipment Side-Entry Double-Tilt Holder Eucentric Stage Double-Tilt Cryostage TV Camera X-Ray Detector Techniques CBED EDX
33 JEOL JEM-2010F Specifications Imaging Modes: TEM/STEM Accel. Voltage: 200KV Cs: 0.5mm PTP Resolution: 0.19nm Focused Probe: 0.2nm Source: Schottky Field Emission Tilt Range: ± 15 Ancillary Equipment CCD Camera Enfina PEELS Detector X-Ray Detector Double-Tilt Holder Gatan and EDAX Acquisition System Techniques EDX EELS HAADF HRTEM Nanodiffraction Z-contrast Imaging
34 of LaB 6 filament Operates at voltages up to 200KV Cs = 2.26 mm It has a room-temperature, 70-degree, tilt sample holder. It has two Gatan, 70-degree-tilt, cryotransfer holders and a cryotransfer station. These are necessary for inserting vitrified samples into the microscope and recording data of them. A Gatan Dry Pumping Station is used for pumping out the cryoholders for improved performance. It has a Gatan Ultrascan 1000 UHS CCD camera that was designed for a 200KV electron source. The camera has a 4 mega-pixel (2k X 2k, 14 micron pixel size), Peltier-cooled, CCD chip and it is equipped with an ultra-high sensitivity phosphor scintillator. The camera is mounted on-axis under the microscope column and it is connected via an optical cable to the computer of the microscope. The microscope will soon also have a Gatan TV rate camera. A standard film camera that holds 56 sheets of film is also available It has a cryo package that allows the user to collect data on extremely beam-sensitive, vitrified samples without damaging the sample. The package includes an improved anticontaminator, Low Dose software, and a cryo-protection cycle for the ion getter pump. It has Gatan Digital Micrograph software for operating the CCD camera and for manipulating the resultant images. It has two, NEC 20 in. LCD color monitors. These allow the operator to monitor and control the conditions of the microscope in the numerous windows of the operating system as well as view the collected digital data. It has FEI Tomography and Xplore3D tomographic software. This software allows the researchers to collect three-dimensional data on samples by taking successive images at various degrees of tilt and computing a three-dimensional reconstruction from the data. It has Gatan HREM Autotune software for automatic correction imaging parameters with the CCD camera. It has Tecnai Scripting and Photomontage software.
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