UTILIZAÇÃO DE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA DETECÇÃO DO VÍRUS DA DOENÇA DE NEWCASTLE EM AMOSTRAS DE AVES SILVESTRES RECEBIDAS PELO SAAS - UNICENTRO

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1 UTILIZAÇÃO DE IMUNOHISTOQUÍMICA PARA DETECÇÃO DO VÍRUS DA DOENÇA DE NEWCASTLE EM AMOSTRAS DE AVES SILVESTRES RECEBIDAS PELO SAAS - UNICENTRO Marcos Vinicius Almeida Morais (PIBIC/Af- Araucária), Jéssica Cristina de Oliveira Lapczak (PIBIC/Af- Araucária), Jyan Lucas Benevenute (Graduando em Medicina Veterinária), Priscila Ikeda (Programa de Aprimoramento / UNICENTRO), Lucinéia Vitchemech Rudiak (Graduanda em Medicina Veterinária), Adriano de Oliveira Torres Carrasco (Orientador), adriano.carrasco@gmail.com Universidade Estadual do Centro Oeste /Departamento de Medicina Veterinária/Guarapuava, PR. Ciências Agrárias - Medicina Veterinária Palavras-chave: imunodiagnóstico, paramyxovírus, aves selvagens. Resumo: A Doença de Newcastle é uma enfermidade viral de ampla distribuição mundial e rápido poder de disseminação. Pode ocorrer tanto em aves silvestres quanto em domésticas. Os sinais clínicos variam conforme a estirpe viral e a espécie do hospedeiro. O diagnóstico para a Doença de Newcastle pode ser realizado por meio de isolamento viral, técnicas moleculares, como a RT-PCR, ou por técnicas imunológicas, como a Inibição da Hemaglutinação ou a Imunohistoquímica. No presente estudo, a imunohistoquímica (IHQ) se mostrou eficaz para detecção do agente, realizada a partir de amostras de traqueia e baço parafinados. Das 25 aves que vieram a óbito, 16 foram positivas, sendo que 12 apresentaram marcações positivas para o Vírus da Doença de Newcastle (VDN) em amostra de traqueia, 10 no baço e seis apresentaram marcações nos dois tecidos. Isso demonstra que a técnica de IHQ pode ser uma ferramenta viável no diagnóstico post mortem desta enfermidade, podendo em alguns casos, substituir a necessidade de isolamento viral. Introdução A Doença de Newcastle é uma enfermidade de notificação obrigatória, causada por um vírus pertencente à Ordem Mononegavirales, família Paramyxoviridae, subfamília Paramyxovirinae e gênero Avulavírus, sendo conhecido por Paramixovírus Aviário tipo 1 (APMV-1). O agente já foi descrito em 241 espécies de aves, contando com 27 das 50 ordens de aves existentes como hospedeiros. Possui alta capacidade de disseminação, na qual aves silvestres atuam como potenciais transmissores (PAULILLO e DORETTO JUNIOR, 2009). Os sinais clínicos observados nas aves infectadas dependem da estirpe viral envolvida, a espécie do hospedeiro e sua idade, o ambiente entre outros. Em termos

2 gerais, os sinais clínicos podem ser de apatia, prostração, diarreia, sinais nervosos e respiratórios (ALEXANDER, 2000). O diagnóstico para a Doença de Newcastle pode ser realizado por meio de isolamento viral, por testes moleculares como a RT-PCR, ou ainda através de técnicas imunológicas, como a Inibição da Hemaglutinação ou a Imunohistoquímica. A técnica de imunohistoquímica identifica os antígenos do VDN a partir de cortes de tecidos post mortem parafinados, através de ligação antígeno-anticorpo com o devido uso de cromógeno específico (WAKAMATSU et al., 2007). O objetivo do presente trabalho foi detectar a presença do Vírus da Doença de Newcastle pela técnica de Imunohistoquímica em amostras de baço e traqueia, colhidos post mortem de aves do Serviço de Atendimento a Animais Selvagens, SAAS, da UNICENTRO. Material e métodos Para realização da técnica de imunohistoquímica, foram colhidas amostras de baço e traqueia, provenientes de 25 aves que vieram a óbito no Serviço de Atendimento a Animais Selvagens SAAS, da Unicentro. As aves não apresentaram sinais clínicos, bem como lesões macro e microscópicos compatíveis com a infecção pelo VDN. Após a colheita, as amostras foram fixadas em formol 10% por 24 horas e depois mantidas em álcool 70% até realização das lâminas histológicas. Para a realização da imunohistoquímica foi utilizado o kit EasyLink One da marca Erviegas, conforme recomendação do fabricante. O anticorpo primário utilizado foi anticorpo policlonal anti-vdn, produzido em coelhos (IgG de coelho), na sua dose de reatividade ótima. As lâminas foram contra coradas com Hematoxilina de Harris e posteriormente observadas no microscópico óptico, em aumento de 40x. Na sequência, as lâminas foram avaliadas para verificação da presença de imunomarcações, caracterizada por marcações de cor amarronzada se destacando da cor roxa produzida pelo contra corante, evidenciando ligação antígeno x anticorpo, presente no tecido. Resultados e Discussão Os resultados obtidos com o trabalho estão dispostos na Tabela 1. As 25 aves amostradas estão divididas em seis ordens aviárias e 18 espécies, e que dessas, observou-se 64% (16/25) de animais positivos para VDN, sendo encontrada marcação positiva em 48% (12/25) das amostras de traqueia, 40% (10/25) nas amostras de baço e 24% (6/25) para os dois tecidos, depois de submetidas à reação de imunohistoquímica. Tabela 1 Resultado da presença do vírus da Doença de Newcastle em amostras de traqueia e baço submetidas à reação de imunohistoquímica.

3 Ordem Aviária Espécie Nome popular Baço Traqueia

4 Passeriformes Furnarius rufus João-de-barro - - Pitangus sulphuratus Bem-te-ví - - Psephotus Red Rumped - - haematonotus Saltator similis Trinca ferro - - Sporophila Coleirinho - + caerulescens Sporophila spp. Coleiro - + Turdus amaurochalinus Sabiá-poca + - Turdus amaurochalinus Sabiá-poca + - Turdus rufiventris Sabiá-laranjeira + - Strigiformes Athene cunicularia Coruja-buraqueira - - Megascops choliba Corujinha-do-mato + + Tyto furcata Coruja Suindara - - Tyto furcata Coruja Suindara + - Tyto furcata Coruja Suindara + + Tyto furcata Coruja Suindara Piciformes Psittaciformes Agapornis spp. Agapornis - - Pyrrhura perlata Tiriba-de-barrigavermelha - + Pyrrhura spp. Tiriba - + Pelecaniformes Nycticorax nyctcorax Savacu + + Theristicus caudatus Curucaca - - Accipitriformes Rupornis magnirostris Gavião Carijó - + Em estudos de Benevenute et al., (2013), nas amostras provenientes da traqueia, foi encontrada uma positividade de 51,06% (24/47), sendo valores próximos aos do presente trabalho. Já, quando avaliadas amostras de baço, foi encontrada uma menor positividade, 12,76% (06/47), quando comparado aos resultados do presente estudo. Uma maior quantidade de marcações positivas na traqueia, comparada ao baço, pode demonstrar um tropismo pelo trato respiratório, por este ser a principal porta de entrada para infecção. Benevenute et al,. (2003) também dividiu entre ordens aviárias, em que a ordem Passeriforme teve maior número de positivos, assim como também observado neste trabalho. Isto provavelmente ocorreu devido ao maior número de exemplares pertencerem a esta ordem. Brown et al., (2013), estudou a presença de APMV-1 mediante a imunohistoquímica em traqueias de frangos infectados de maneira experimental e natural. Foram colhidas amostras de traqueia de 26 frangos e apenas 30,76% (8/26) das traqueias foram positivas para IHQ. Nas traqueias restantes, embora houvesse lesão e evidencia de traqueíte, não foi encontrado antígeno do APMV-1 pela IHQ. Nakamura et al., (2008) realizou estudos, no qual 25 frangos de corte com a doença de Newcastle foram avaliados, tanto histopatologicamente quanto imunohistologicamente. Histopatologicamente, foi observado atrofia bursal, manchas

5 brancas no pâncreas, e descoloração e alargamento dos rins e baço. Realizando a imunohistoquímica, antígenos do vírus da ND foram detectados nestes órgãos onde as lesões foram encontradas. Conclusões Através do presente trabalho, foi possível perceber como o diagnóstico post-mortem da Doença de Newcastle a partir de amostras submetidas à imunohistoquímica é efetivo. Observou-se que amostras de baço e traqueia são de grande importância para detectar a doença. Como a técnica de imunohistoquímica consegue detectar o agente em amostras teciduais, fica clara sua vantagem, podendo, em alguns casos, substituir o isolamento viral, não necessitando de laboratórios com altos níveis de biossegurança e assim reduzindo os custos do diagnóstico. Referências Alexander, D.J. Newcastle Disease and other Paramyxovirus Infections. Rev Sci Tech Off Int Epiz. 2000, 19, Benevenute, J. L.; Alves, M. H.; Seki, M. C.; Morais; M. V. A.; Peres, J. A.; Carrasco, Adriano O.T. Utilização de Imunohistoquímica para Detecção do Vírus da Doença de Newcastle em Amostras de Aves In: XXIII EAIC - Encontro Anual de Iniciação Científica, Londrina, 2014, Vol. 1, p Brown, C. C.; Sullivan, L.; Dufour-zavala, L.; Kulkarni, A.; Williams, S.; Susta; Zhang, J.; Sellers, H. Comparing Presence of Avian Paramyxovirus-1 Through Immunohistochemistry in Tracheas of Experimentally and Naturally Infected Chickens. Avian Dis. Kennett Square, 2013, 57, Nakamura, K.; Ohtsu, N.; Nakamura, T.; Yamamoto, Y.; Yamada, M.; Mase, M.; Imai, K. Pathologic and Immunohistochemical Studies of Newcastle Disease (ND) in Broiler Chickens Vaccinated with ND: Severe Nonpurulent Encephalitis and Necrotizing Pancreatitis. Vet Pathol, 2008, 45, Paulillo, A. C.; Doretto Júnior, L. Doença de Newcastle. In: Doenças das aves, Berchieri Junior, A. Ed: Facta, São Paulo, 2009, Wakamatsu, N; King, D. J.; Seal, B. S.; Brown, C. C. Detection of Newcastle Disease Virus RNA by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Using Formalin- Fixed, Paraffin-Embedded Tissue and Comparison with Immunohistochemistry and in situ Hybridization. J Vet Diagn Invest, 2007, 19,