DESENVOLVIMENTO DE UM BIOENSAIO PARA QUANTIFICAR RICINA EM SEMENTES DE MAMONA PARA FINS DE MELHORAMENTO

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Armando Gabeira
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1 DESENVOLVIMENTO DE UM BIOENSAIO PARA QUANTIFICAR RICINA EM SEMENTES DE MAMONA PARA FINS DE MELHORAMENTO Carlos Alberto Rauer Demant 1, Dick Auld 2, Michael San Francisco 2, Mauricio Dutra Zanotto 1, Aline Rodriguez de Melo Demant 2 1 UNESP-FCA, carlosdemant@terra.com.br, zanoto@fca.unesp.br, 2 TTU, dick.auld@ttu.edu, michael.sanfrancisco@ttu.edu, Aline_rml7@msn.com RESUMO - O objetivo deste trabalho é a criação e validação de um teste que verifique a quantidade de ricina e medir a toxidez da mesma sobre os organismos de maneira prática, sem a necessidade de produzir soros em animais, não necessitando de reagentes e equipamentos caros e de maneira confiável. Para isto, utilizou-se um organismo que tem sido testado na indústria farmacêutica para teste de medicamentos e toxidez de produtos, Caenohabitis elegans que é multiplicado em meio simples contendo colônias de E. Coli. Os organismos foram submetidos a extratos aquosos de sementes contendo diferentes quantidades conhecidas de ricina e apresentaram correlação nos resultados de 87,2%, pois as sementes foram testadas por Radio-imuno-difusão que tem sua margem de erro, assim como Elisa que mede a quantidade total, não somente a parte tóxica da mesma, uma vez que a RCA também é quantificado, é menos tóxico do que a ricina. Palavras-chave: Caenohabitis elegans, ricina, Ricinus communis. INTRODUÇÃO A mamona é uma planta muito explorada desde a antiguidade principalmente pelos diferentes usos de seu óleo, podendo ser tanto medicinal como industrial, porém toxinas hidrosoluveis conhecidas por ricina, mas que na verdade é um complexo de duas cadeias de ricina e algumas aglutiminas, com alta toxidez, paralizando os ribossomos e interrompendo assim a produção de proteínas (OLSNES, 1975), tornando as sementes desta planta perigosas ao consumo humano e animal, (INTERNATIONAL OIL ASSOCIATION, 1989) restringindo assim o seu uso, uma vez que não pode ser utilizadas como alimento animal sem passar por um processo de desintoxicaçao prévia. Neste estudo objetivou-se desenvolver um bioensaio para quantificar a ricina da mamona, pois é de conhecimento que a relação entre as análises feitas por diferentes métodos de quantificaçao da mesma nem sempre refletem a toxidez real, podendo ocorrer de sementes que teriam menos ricina e ser mais tóxica do que sementes que tem mais ricina, e para isto procurou-se um ser vivo que tivesse as semelhanças no modo de reação a medicamentos e toxinas como o ser humano, por isto usou-se Caenohabiditis elegans que tem sido amplamente utilizado na industria farmacêutica.

2 MATERIAL E MÉTODOS O trabalho desenvolveu-se no departamento de Ciências de Plantas e Solo da Texas Tech University em conjunto com o departamento de Microbiologia da mesma Universidade localizada na cidade de Lubbock, no Estado do Texas nos Estados Unidos. Analisou-se os padrões de ricina nos teses de Pinkerton, 1999 e Lowery, 2005.Para o desenvolvimento do teste utilizou-se duas estirpes de C.elegans denominadas como AB1 e N2, a fim de verificar qual seria a estirpe apropriada para o teste, utilizou-se os seguintes acessos de mamona do banco de germoplasma da USDA para determinar a funcionalidade do processo PI VNIIMK N1651 Russia, com 2,4% de ricina, PI Turquia, com 5,6% de ricina, PI Karchak Iran, com 6,5% de ricina, PI Acik Kahverengi Turquia, com 7,6% de ricina, PI Kahverengi Turquia, com 8,1% de ricina, PI Erari Índia com 9,2% de ricina, PI Divela Índia, com 10,3% de ricina, PI Erari Índia, com 10,8% de ricina, e a variedade Hale EUA, com 12,4% de ricina. Com auxilio de um bisturi, realizou-se um corte transversal na semente logo abaixo da localização do embrião como mostra a Figura 1, retirou-se em seguida a casca, a parte anterior foi semeada em uma bandeja contendo substrato para cultivo de hortaliças, e levou-se a casa de vegetação com irrigação controlada, a fim de preservar e recuperar a planta que está sendo analisada. Colocou-se na parte posterior um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e completou-se com água destilada autoclavada até atingir o volume de 1 ml para realizar-se a extração da ricina. Procedimentos de extração de ricina Com auxilio de uma ponta de homogeneizador modelada e uma furadeira, processou-se a parte posterior da semente até obter uma solução leitosa. Testou-se 4 procedimentos diferentes de extração de ricina: Procedimento 1: A solução leitosa decantou-se por 5 minutos, onde inseriu-se um disco de papel filtro, o qual absorveu a solução por 5 minutos. Procedimento 2: A solução leitosa decantou-se por 5 minutos, onde retirou-se 200µl da porção mediana de como mostra a figura 1. Procedimento 3: Levou-se a solução leitosa a um banho-maria com água a 45 C e agitação regulada 70 rpm por 3 horas, em seguida o material decantou-se por 5 minutos e retirou-se a porção mediana (fig.1)

3 Procedimento 4: Levou-se a solução leitosa a um banho-maria com água a 45 C e agitação regulada a 70 rpm por 3 horas, em seguida a suspensão, centrifugou-se por 5 minutos a 5000 rpm, então retirou-se a porção mediana (fig.1) Metodologia de exposição do nematóide a ricina Testou-se básicamente 3 métodologias de exposição do nematóide a ricina. Metodologia 1: Utilizou-se discos de papel filtro como veículo para ricina, efoi inseriu-se em placas de petri contendo nematóide a fim de verificar sua reação. Metodologia 2: Com auxilio de um furador de rolhas fez-se uma cavidade de 4mm de diâmetro no meio de cultura das placas de petri contendo C. elegans com E. coli, em seguida, colocou-se 200 µl da solução resultante da extração nesta cavidade,levou-se as placas a uma estufa a 15 ºC para continuidade do ciclo de vida do nematóide. Após 24 horas, retirou-se as placas da estufa para ser analisadas. Metodologia 3: As placas de petri contendo C.elegans e E.coli, com 1ml de água destilada autoclavada lavou-se as placas, em um Becker recolheu-se esta suspensão préviamente autoclavada, do mesmo retirou-se 200µl da suspensão de nematóides, que transferiu-se para uma placa de 24 poços, e em seguida adicionou-se 200 µl da solução de ricina resultante da extração, este procedimento repetiu-se para cada poço utilizado. Levou-se a placa a uma estufa de 15 ºC para que os nematóide continue a reproduzir-se. Após 18 horas, retirou-se as placa da estufa para ser analisadas. O trabalho contou com 8 experimentos cujos tratamentos estão descritos na Tabela 1. Todos os experimentos, contou-se com 4 repetições e instalou-se em duas épocas diferente, e utilizou-se a análise do teste de Kurskal Wallis a 5%. RESULTADOS E DISCUSSÃO O experimento 1, mostrou-se ineficiente por não apresentar nematóides mortos. O experimento 2, apresentou nematóides mortos e a estirpe que mostrou-se melhor é a N2 com correlação entre os números de nematóides mortos e % de ricina de 0,855 e 0,927, tamanho do halo de 0,945 e 0,916 enquanto a AB1 apresentou correlação abaixo de 0,5, e não diferiu-se da testemunha ao ser analisada por Kurskal Walli, enquanto N2 apresentou diferença significativas. O experimento 3, confirmou os dados apresentados no experimento 2, e mostrou que o melhor momento de análise dos dados é após 18 horas de exposição.

4 O experimento 4, testou-se três procedimentos de extração diferentes, mostrou que o procedimento 3 não diferiu da testemunha, enquanto que o procedimento 2 e 4 diferira-se, sendo que o procedimento 4 mostrou-se proporcional a semelhanças do procedimento 2, por ter análise mais fácil, devido a carregar um número menor de impurezas na solução, passou-se a adotar como padrão nos demais experimentos. No experimento 5, a correlação entre ricina e mortos para a estirpe N2 é de 0,79629, mostrouse que mesmo frente a diversos teores de ricina o método permanece eficiente. No experimento 6, testou-se a metodologia 3 que apresentou dados semelhantes ao da metodologia 2, porém com muito mais fácil leitura, tendo a correlação para N2 de 0, e 0,79841 e correlação negativa para AB1, dados estes que confirmou-se no experimento 7, com correlação de 0,40448 e 0, para N2 e negativa para AB1 e no experimento 8, com correlação de0,78071 e 0, CONCLUSÃO Os dados acima nos mostram que o método desenvolvido é eficiente quando feito em placas com 24 poços, utilizando-se a estirpe N2, o procedimento 4 para extração de ricina, e a metodologia 3 para exposição do nematóide à ricina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS INTERNATIONAL CASTOR OIL ASSOCIATION. The processing of castor meal for detoxication and de-alergenation. New Jersey, p. (Boletim Técnico). LOWERY C. C Evaluation and selection of castor (Ricinus communis L) for reduced levels of toxins f. Dissertação (Mestrado) - Texas Tech University, Corpus Christ. OLSNES, S. Closing in on ricin action. Nature, New York, v. 328, p PINKERTON, S. D.; ROLFE, R.; AULD, D. L. Selection of castor for divergent concentrations of Ricin and Ricinus communis. agglutinin. Crop Science, v. 39, p , 1999.

5 Figura 1. Esquema da semente de mamona mostrando o local onde foi realizado o corte para a análise e do tubo de microcentrífuga mostrando a porção mediana. Tabela 1. Procedimentos dos experimentos. Exp. Procedimento Metodologia papel filtro 1 - papel filtro Tempo de exposição(h) decantação 2 - petri decantação 2 - petri decantação 3 - banho-maria 4 - centrífuga Característica avaliada estirpe % ricina nas sementes 24,48,72 Nem. mortos N2, AB1 0-2,4-12,4 12,14,16,18, 20,22,24 Halo de mortos N2, AB1 0-2,4-12,4 N2, AB1 0-2,4-12,4 2 - petri 18 N2, AB1 0-2,4-12, centrífuga 2 - petri 18 N2, AB centrífuga 3-24 poços 18 % centrífuga 3-24 poços 18 N2, AB centrífuga 3-24 poços 18 % N2, AB1 0-2,4-12,4 N2, AB1

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