FACULDADE DE ODONTOLOGIA DR. MÁRIO LEITE BRAGA DE PRESIDENTE PRUDENTE

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1 FACULDADE DE ODONTOLOGIA DR. MÁRIO LEITE BRAGA DE PRESIDENTE PRUDENTE ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR DO Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 EM SOLUÇÃO SALINA. DISCENTES: BIANCA CRISTINA TIOSSO DA SILVA ÉDER DA SILVA DÓLENS YARA LOYANNE DE ALMEIDA SILVA LEVI RESPONSÁVEL: PROFª. DR A. LUCIANA PRADO MAIA COLABORADORA: PROFª. DR A. FABIANA GOUVEIA STRAIOTO PRESIDENTE PRUDENTE SP 2017

2 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODO FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS RESULTADOS ESPERADOS REFERÊNCIAS... 13

3 RESUMO ANÁLISE DA VIABILIDADE DO Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 EM SOLUÇÃO SALINA. Introdução: Os probióticos são microrganismos vivos que conferem benefícios a saúde quando consumidos em quantidades adequadas, sendo indicados para prevenir e tratar doenças. Os efeitos do uso de probióticos na saúde bucal vêm sendo investigados, porém, estudos in vitro são necessários para estabelecer protocolos de utilização dessa nova abordagem terapêutica. Objetivo: O objetivo do estudo será analisar a viabilidade celular de microrganismos do gênero Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. lactis) HN019 presentes em solução salina em condições de armazenamento laboratorial (4 o C) e em condições do biotério (temperatura ambiente). Material e Métodos: Este estudo será in vitro, cego, totalmente aleatorizado, realizado em triplicata, em 3 experimentos independentes. Cepas liofilizadas de B. lactis HN019 serão reativadas e posteriormente mantidas em solução salina em temperatura ambiente, a 4 o C e 37 o C por 48 horas. Será realizado monitoramento do padrão de crescimento por meio de leitura da turbidez e contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). O crescimento do microrganismo será monitorado a cada 1 hora por meio de leitura do comprimento de onda e realização de diluição seriada do inóculo a cada leitura. Forma de Análise dos Resultados: Os dados referentes aos valores de turbidez e sua relação com o número de UFC serão tabulados e a escolha do teste estatístico será definida após a análise exploratória dos dados. O nível de significância de 5% será utilizado nas análises. Resultados Esperados: Espera-se com este estudo obter padronização para utilização de bactérias probióticas do gênero Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 em estudos in vivo em animais. Palavras-chave: Bactérias, Probióticos, Meios de Cultura.

4 4 1 INTRODUÇÃO O probiótico é definido como um suplemento alimentar contendo microrganismos vivos, os quais afetam beneficamente o hospedeiro, melhorando o balanço da microbiota intestinal, normalmente são indicados para prevenir e tratar doenças. Podendo ser encontrados em alimentos industrializados presentes no mercado, como leites fermentados e iogurtes, alimentos fermentados de forma caseira como as coalhadas, queijos, bebidas frutais. A fermentação usando probióticos é utilizada para a preservação de uma série de produtos agrícolas sem processar, como cereais, raízes, tubérculos, frutas e hortaliças, leite, carne, peixe, entre outras 1,2. Possui características potencializadoras da redução de riscos de doenças crônicas, além de proporcionar saúde e bem-estar 3. Durante a última década, a identificação de bactérias associadas à saúde e potencialmente benéficas que podem residir no sulco gengival e na cavidade oral tem sido tema de numerosos estudos focados na prevenção e tratamento de doenças 4. O consumo de probióticos pode modificar a flora bacteriana e modular a resposta imunológica 5. Pesquisas mostram a eficácia do probiótico favorecendo a atividade fagocítica inespecífica dos macrófagos alveolares, sugerindo uma ação sistêmica por secreção de mediadores que estimulariam o sistema autoimune, atuando, também, no equilíbrio da microbiota intestinal, alívio da constipação, imunomodulação, prevenção do câncer de cólon, prevenção de eczemas atópicos, atividade supressiva contra patógenos gastrintestinais, prevenção de patologias do trato urogenital feminino, desordens intestinais, entre outros, levando a um aumento da resistência contra a infecção 2,6. Esses microrganismos possuem fonte de compostos bioativos que apresentam promissores efeitos benéficos no metabolismo ósseo e muscular 1,5. Sua colonização no trato gastrintestinal através da competição por sítios de adesão, restabelece a microflora intestinal após danos quimioterápicos 6. Embora resultados promissores tenham sido relatados na literatura, é importante lembrar que os achados obtidos sobre os probióticos não podem ser generalizados, uma vez que dependem da dosagem, frequência e via de administração 2. Estudos clínicos sugerem que os probióticos são seguros para a saúde e podem ter efeitos positivos sobre a saúde bucal. A maioria dos estudos envolvendo sua utilização na saúde bucal concentram-se em medidas que visam diminuir a quantidade de Streptococcus

5 5 mutans, cuja presença é considerada um importante fator de risco para o desenvolvimento de cárie 7. Na doença periodontal, os probióticos podem minimizar a aderência de bactérias patogênicas, assim como seu estabelecimento, multiplicação e integração. Além de modular a resposta imune-inflamatória desencadeada pelos patógenos periodontais 6,8. Os principais microrganismos utilizados como probióticos são bactérias dos gêneros Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus e Bifidobacterium 6,9 11. Até o momento, estudos que investigaram os efeitos dos probióticos sobre doenças periodontais utilizaram principalmente microorganismos do gênero Lactobacillus 8. No entanto, surgiram relatos que identificaram os Lactobacillus associados com condições clínicas patológicas, como bacteremia12 e, ocasionalmente, endocartite e abscesso 13, apesar de ser improvável que os Lactobacillus fossem os agentes causais nesses casos 13. De qualquer forma, essas observações, juntamente com a emergência de cepas resistentes à vancomicina na prática clínica14, resultaram em uma preocupação quanto a segurança do seu uso. Nesse contexto, outros potenciais probióticos merecem ser investigados. A Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. Lactis) possui propriedades imunomodulatórias e antimicrobianas 15, geralmente está presente na microbiota intestinal, e apresenta um relacionamento simbiótico com o hospedeiro 16. Alguns estudos demonstraram que a B. Lactis pode diminuir o crescimento de Streptococcus mutans sem causar efeitos adversos, contribuindo na prevenção da cárie dentária 17. Pode também inibir o crescimento de periodonto patógenos na cavidade oral 18, reduzir a quantidade de biofilme bacteriano nas superfícies dentárias, bem como o índice de placa e o índice gengival em indivíduos saudáveis6, sendo considerada um probiótico promissor. Apesar das evidências, são poucos os estudos que têm avaliado os efeitos da suplementação probiótica com bactérias do gênero Bifidobacterium na periodontite. O microrganismo B. lactis HN019 (Dupont de Nemoursand Company, Wilmington, DE, EUA) foi introduzido mais recentemente como probiótico, sendo comercializado como um ingrediente para suplementação dietética e produtos fermentados e está disponível em diferentes produtos (formato de liberação, dose, combinado com outros ingredientes ativos. O B. lactis HN019 foi isolado de um iogurte comercial e mantido como cepa e consiste em um bastonete Gram-positivo com morfologia irregular 19. Estudos in vitro reportaram

6 6 propriedades anti-infecciosas e de melhora na resposta imunológica 20 23, além de não exibirem toxicidade oral ou patogenicidade em ratos ou humanos 20,24. Considerando que os B. lactis possam ser um importante aliado na prevenção e no tratamento de doenças bucais, a determinação de um protocolo de manutenção destes microrganismos viáveis para desenvolvimento de estudos experimentais em animais que visem garantir a reprodutibilidade, qualidade dos ensaios e a credibilidade dos resultados é de suma importância para a estruturação dos futuros pilares da terapia probiótica. Previamente à utilização desse microorganismo probiótico em estudos experimentais em animais, é importante padronizar as condições de manutenção e armazenamento da solução contendo probiótico, considerando a necessidade de otimização de tempo dos experimentos e uso racional do microrganismo com finalidade de reduzir custos.

7 7 2 OBJETIVO O objetivo do estudo será analisar a viabilidade celular de microrganismos do gênero Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. lactis) HN019 presentes em solução salina em condições de armazenamento laboratorial (4 o C), em condições do biotério (temperatura ambiente) e em condições de cultivo normal (37 o C).

8 8 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Desenho experimental Este estudo será in vitro, cego (um dos pesquisadores criará um código de identificação dos grupos experimentais que será desconhecido pelos operadores), totalmente aleatorizado. Com objetivo de garantir a reprodutibilidade e padronização dos experimentos, os mesmos serão realizados em quadruplicata, em 3 experimentos independentes (ou seja, realizados em dias diferentes) (n=12). Cepas liofilizadas de B. lactis HN019 serão reativadas e resuspendidas em solução salina em temperatura ambiente, a 4 o C e 37 o C por 48hs. Será realizado monitoramento do padrão de crescimento por meio de leitura da turbidez e contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC). 3.2 Reativação dos Microrganismos Cepas de estoque liofilizadas de B. lactis HN019 (HOWARU TM Bifido, E. I. Dupont de Nemoursand Company) serão reativadas em 10 ml de caldo MRS (Man Rogosa and Sharpe, Difco, Sparks, MD, USA. Deste caldo serão coletadas alçadas para serem semeadas em placa de petri, contendo Agar MRS enriquecido com L-cisticina (Difco), pela técnica do esgotamento, a fim de isolar colônias e verificar sua pureza. Estas placas serão armazenadas por 48h a 37ºC em condições anaeróbicas para favorecer o crescimento da colônia, decorrido esse tempo a placa contendo a cultura será armazenada em resfriamento a 2ºC Monitoramento da viabilidade celular: Para a análise de viabilidade celular da população bacteriana B. lactis HN019 em salina será realizada curva de crescimento por meio de mensurações sequenciais (intervalos de 1 hora) da turbidez de solução contendo microrganismo em espectrofotômetro com comprimento de onda igual a 600nm 25. Para cada hora de leitura será realizada a quantificação de UFC estabelecendo a relação do valor da leitura de espectrofotometria x número de células durante 48 horas de acordo com as seguintes condições experimentais: Grupo 1: solução salina em temperatura ambiente Grupo 2: solução salina a 4 o C

9 9 Grupo 3: solução salina em 37 o C em anaerobiose (controle) Para início do experimento colônias do microrganismo serão individualmente ressuspensas 1,5 x 10 8 unidades formadoras de colônia (UFC)4 em 10 ml de salina e armazenado de acordo com a condição experimental de cada grupo. A suspensão será agitada por 15 segundos e a turbidez imediatamente verificada por meio de espectrofotômetro (DU -65, Beckman, Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) a 600 nm. Dessa forma será possível determinar o período que a cepa em questão entra na fase estacionária, a qual é caracterizada por diminuição significativa da taxa de crescimento devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo, mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. 3.4 Quantificação de Microrganismos A quantificação do microrganismo será por meio da contagem de UFC e os valores obtidos por espectrometria. A suspensão após a leitura em espectrofotômetro contendo os microrganismos será vortexada por 1 minuto e a suspensão será diluída serialmente até a proporção de 1: (10-8 ) em solução salina. Para isto, uma amostra inicial de cada repetição de grupo experimental (100 μl) obtida em cada 1 hora de crescimentos dos grupos experimentais deverá ser diluída de forma seriada em microtubos com salina contendo 900 μl de solução salina estéril. O processo será repetido no mínimo em 6 diluições para que a concentração de microrganismos diminua, dando origem a colônias suficientemente separadas, possibilitando assim a contagem. Para a determinação do número de microrganismos da amostra original multiplica-se o número de colônias formadas a partir da amostra diluída, pelo volume de diluição. Uma diluição é uma expressão de concentração, não de volume. As diluições serão semeadas em placas de petri contendo o meio de cultura Agar MRS para determinação do microrganismo. A semeadura será realizada pela deposição de

10 10 alíquotas (20 μl) destas diluições em duplicata nas placas. As placas serão incubadas em estufa a 37º C por 48h em anaerobiose. As unidades formadoras de colônia (UFC) serão contadas nas diluições que permitam a visualização das colônias isoladas e os resultados serão expressos em UFC/ml. (Figura 1) 26.. Figura 1: Placas após semeadura e crescimento dos microrganismos para contagem e cálculo das UFC/ml.

11 11 4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS Os dados referentes aos valores de turbidez e sua relação com o número de UFC serão tabulados e a escolha do teste estatístico será definida após a análise exploratória dos dados. Se observada distribuição normal, será utilizado Teste T para comparações entre os grupos. No caso de distribuição não-normal será utilizado o teste de Mann Whitney. O nível de significância de 5% será utilizado nas análises.

12 12 5 RESULTADOS ESPERADOS Espera-se com este estudo determinar por quanto tempo o microrganismo probiótico B. lactis HN019 ficará viável em solução salina em condições de armazenamento laboratoriao (4 o C) e em condições do biotério (temperatura ambiente), com finalidade de obter padronização e eficiência da aplicação desses microrganismos para estudos in vivo em animais, estabelecendo assim, um protocolo para execução de pesquisa com estes microrganismos na instituição.

13 13 REFERÊNCIAS 1. Santos FL, Ferreira MA, Pires EA, Oliveira FS de, Silva CFG, Vieira RB. Análise das patentes de tecnologias relacionadas aos probióticos, prebióticos e simbióticos no Brasil. Brazilian J Food Technol. 2014;17(3): Ranadheera RDCS, Baines SK, Adams MC. Importance of food in probiotic efficacy. Food Res Int. 2010;43(1): Haytac MC, Kunin AA, Belenova IA. Probiotics and oral-periodontal health. EPMA J. 2014;5(Suppl 1):A Messora MR, Pereira LJ, Foureaux R, Oliveira LFF, Sordi CG, Alves AJN, Npimoga MH, Nagata MJH, Ervolino E, Furlaneto FAC. Favourable effects of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis on experimental periodontitis in rats. Arch Oral Biol. 2016;66: Aljewicz M, Cichosz G. The effect of probiotic Lactobacillus rhamnosus HN001 on the invitro availability of minerals from cheeses and cheese-like products. LWT - Food Sci Technol. 2015;60(2): Whitford EJ, Cummins AG, Butler RN, Prisciandaro LD, Fauser JK, Yazbeck R, Lawrence A, Cheah KY, Wright TH, Lymn KA, Howarth GS. Effects of Streptococcus thermophilus TH-4 on intestinal mucositis induced by the chemotherapeutic agent 5- Fluorouracil (5-FU). Cancer Biol Ther. 2009;8(6): Toiviainen A, Jalasvuori H, Lahti E, Gursoy U, Salminen S, Fontana M, Flannagan S, Eckert G, Kokaras A, Paster B, Söderling E. Impact of orally administered lozenges with Lactobacillus rhamnosus GG and Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 on the number of salivary mutans streptococci, amount of plaque, gingival inflammation and the oral microbiome in healthy adults. Clin Oral Investig. 2015;19(1): Dhingra K. Methodological issues in randomized trials assessing probiotics for periodontal treatment. J Periodontal Res. 2012;47(1): Teughels W, Durukan A, Ozcelik O, Pauwels M, Quirynen M, Haytac MC. Clinical and microbiological effects of Lactobacillus reuteri probiotics in the treatment of chronic periodontitis: A randomized placebo-controlled study. J Clin Periodontol. 2013;40(11):

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