PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS

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1 PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS Disciplinas de Investigação do Mestrado Integrado em Medicina Orientador responsável (docente ou investigador doutorado da FMUC): Cláudia Maria Fragão Pereira Centro/Serviço/Instituto: Instituto de Bioquímica, Faculdade de Medicina, UC Área Temática do Projecto: Neurociências Duração do projecto: Três anos. No primeiro ano do projecto o aluno deverá fazer uma pesquisa bibliográfica sobre o tema proposto no projecto e familiarizar-se com as metodologias a usar, nomeadamente com a cultura de células endoteliais obtidas de vasos sanguíneos do cérebro de rato. Serão ainda iniciados alguns dos estudos propostos usando este modelo in vitro, que prosseguirão durante o segundo ano de execução do projecto. Durante o terceiro ano, pretende-se que o aluno desenvolva trabalho no Serviço de Neurologia e no Laboratório de Neuroquímica dos HUC em que seguirá uma amostra de doentes com o intuito de correlacionar parâmetros neurológicos com alterações bioquímicas, tendo por base os resultados obtidos durante os estudos in vitro realizados no primeiro e segundo anos do projecto. (indicar especificamente se o projecto é susceptível de ser continuado ao longo do tempo do curso) Financiamento: Sim Não Agência Financiadora: ---- Exigência de competências prévias aos alunos? Sim Não 1

2 Quais? (não aplicável a alunos do 1º e 2º anos do mestrado integrado) Título do projecto: Papel da homocisteína na disfunção endotelial induzida pelo peptídeo betaamilóide: relevância para as alterações vasculares associadas à doença de Alzheimer. Resumo (Max. de 300 palavras): O objectivo deste projecto é investigar se o stress do retículo endoplasmático (RE) está envolvido na morte apoptótica das células endoteliais após exposição ao peptídeo beta-amilóide (Aβ) e avaliar o efeito do aminoácido homocisteína (HC) na disfunção endotelial induzida por Aβ. Deste modo, pretende-se esclarecer os mecanismos moleculares responsáveis pelas alterações vasculares associadas à doença de Alzheimer (DA) e o papel que o aumento dos níveis de HC tem no desenvolvimento desta doença. Após o estabelecimento das condições de cultura de células endoteliais cerebrais (CECs) isoladas de microvasos do cérebro de rato, serão determinadas as concentrações e tempos de incubação para os quais o peptídeo Aβ1-40 é tóxico e induz apoptose nas CECs, assim como a dose de HC que potencia a disfunção endotelial induzida por Aβ1-40. Para investigar o envolvimento de stress do RE na toxidade e morte apoptótica induzidas por Aβ1-40, será testado o efeito do salubrinal, um inibidor deste processo. Posteriormente, o stress do RE será caracterizado nas CECs tratadas com Aβ1-40, na ausência ou na presença de HC, determinando os níveis de PERK, ATF6 e IRE1α, marcadores das três vias envolvidas na resposta a stress do RE, e de GRP78/BiP, um chaperone do RE. A activação da caspase-12, uma caspase residente do RE, e do factor de transcrição pró-apoptótico Gadd153/CHOP, que ocorre em condições de stress do RE prolongado ou intenso, irão também ser analisadas. As consequências do stress do RE induzido pelo peptídeo Aβ1-40 nas CECs, assim como o efeito da HC, serão avaliadas determinando, na ausência e na presença de salubrinal ou de sirna que silenciem especificamente a PERK, ATF6 ou IRE1α, vários parâmetros de stress oxidativo, libertação de citocinas pró-inflamatórias e expressão e libertação de VEGF, um factor de crescimento endotelial com características angiogénicas. Finalmente, será feita a correlação dos níveis de HC com alterações cognitivas, níveis de Aβ1-40, de citocinas pró-inflamatórias, parâmetros de stress oxidativo, e níveis do factor vascular VEGF em doentes de Alzheimer e 2

3 indivíduos com defeito cognitivo ligeiro, que é considerado uma fase inicial da DA. (área, importância, meios, metodologias, etc.) Objectivos (Max de 500 palavras): Evidências crescentes sugerem que factores de risco vasculares, como a hiperhomocisteinémia, poderão estar envolvidos na patofisiologia da DA. No entanto, o mecanismo pelo qual o aumento dos níveis de homocisteína (HC) contribui para o desenvolvimento desta doença neurodegenerativa permanece obscuro. O peptídeo beta amilóide (Aβ), que se deposita no cérebro de doentes de Alzheimer, induz lesão neuronal através de vários mecanismos, nomeadamente da indução de stress do retículo endoplasmático (RE), como mostrámos recentemente usando neurónios corticais em cultura (Ferreiro et al., 2004, 2006). Evidências recentes mostram que o peptídeo Aβ, em particular o peptídeo Aβ1-40, também induz lesão nas células endoteliais podendo contribuir para a degenerescência vascular e para o desenvolvimento de angiopatia cerebral amilóide (Wisniewski et al., 2000). Apesar da Aβ induzir morte em células endoteliais em cultura com características sugestivas de apoptose (Yin et al., 2001, 2006), os mecanismos moleculares subjacentes permanecem por esclarecer. O objectivo deste projecto é investigar se o stress do RE está envolvido na morte apoptótica das células endoteliais após exposição ao peptídeo Aβ e avaliar o efeito do aminoácido HC na disfunção endotelial induzida por Aβ. Deste modo, pretende-se esclarecer os mecanismos moleculares responsáveis pelas alterações vasculares associadas à DA e o papel do aumento dos níveis de HC nesta doença. Os objectivos específicos são analisar, utilizando culturas primárias de células endoteliais obtidas de microvasos do cérebro de rato, tratadas com o peptídeo Aβ, em particular com a isoforma Aβ1-40, na ausência ou na presença de HC: 1. A viabilidade celular e morte por apoptose e o envolvimento do stress do RE. 2. O stress do RE, determinando os níveis de marcadores das três vias envolvidas na resposta ao stress do RE (PERK, ATF-6 e IRE1α), do chaperone Grp78 e a activação de caspase-12 e do factor de transcrição CHOP/GADD As consequências que o stress do RE tem no stress oxidativo, inflamação e na produção e libertação de VEGF, um factor de crescimento endotelial 3

4 angiogénico. Finalmente, em indivíduos com defeito cognitivo ligeiro (DCL) e em doentes de Alzheimer, os níveis de HC serão determinados e procurar-se-á estabelecer uma correlação entre os níveis deste aminoácido e as alterações cognitivas, os níveis de Aβ1-40, parâmetros de stress oxidativo, inflamação e com os níveis de VEGF. Ferreiro E, Resende R, Costa R, Oliveira CR, Pereira CM (2006) An endoplasmicreticulum-specific apoptotic pathway is involved in prion and amyloid-beta peptides neurotoxicity. Neurobiol Dis. 23: Ferreiro E, Oliveira CR, Pereira C (2004) Involvement of endoplasmic reticulum Ca2+ release through ryanodine and inositol 1,4,5-triphosphate receptors in the neurotoxic effects induced by the amyloid-beta peptide. J Neurosci Res. 76: Wisniewski HM, Wegiel J, Vorbrodt AW, Mazur-Kolecka B, Frackowiak J (2000) Role of perivascular cells and myocytes in vascular amyloidosis. Ann N Y Acad Sci. 903:6-18. Yin KJ, Hsu CY, Hu XY, Chen H, Chen SW, Xu J, Lee JM (2006) Protein phosphatase 2A regulates bim expression via the Akt/FKHRL1 signaling pathway in amyloid-beta peptide-induced cerebrovascular endothelial cell death. J Neurosci. 26: Yin KJ, Lee JM, Chen SD, Xu J, Hsu CY (2002) Amyloid-beta induces Smac release via AP-1/Bim activation in cerebral endothelial cells. J Neurosci. 22: Plano de trabalhos (Max de 1500 Palavras): A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa progressiva caracterizada pela perda irreversível da memória e das funções cognitivas. Evidências crescentes sugerem que factores de risco vasculares como a hipertensão, a diabetes ou a hiperhomocisteinémia, poderão estar envolvidos na patofisiologia da DA (de la Torre, Ann N Y Acad Sci., 977: , 2002). Neuropatologicamente, a DA caracteriza-se pela perda neuronal selectiva e pela formação de tranças neurofibrilhares e de placas senis compostas pelo peptídeo beta amilóide (Aβ), principalmente Aβ1-40 e Aβ1-42 (Selkoe, Nature 399:A23-31, 1999), que estão implicados na patogenia da DA (Yankner, Neuron 16: , 1996). Em neurónios, a Aβ altera a homeostasia iónica, potencia a excitotoxicidade, induz a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e promove a apoptose (Yankner et al., Science 245: , 1989). Além da degenerescência neuronal, o peptídeo Aβ, em particular a Aβ1-40, induz lesão nas células endoteliais podendo contribuir para a degenerescência cerebrovascular e para o desenvolvimento de angiopatia cerebral amilóide (Wisniewsky et al., Ann N Y Acad Sci. 903:6-18, 2000). Apesar da Aβ induzir morte em CECs em cultura com características sugestivas de apoptose (Yin et al., J Neurosci. 22: , 2002; Yin et al., J Neurosci. 26: , 2006), os mecanismos moleculares subjacentes 4

5 permanecem por esclarecer. FASES DO PROJECTO Primeira fase (Setembro 2007-Julho 2008) Objectivos e calendarização: Pesquisa e leitura de bibliografia relevante para o projecto científico face ao estado actual do conhecimento (Setembro a Dezembro 2007) Estabelecimento das condições de cultura de células endoteliais isoladas de microvasos do cérebro de rato (Janeiro a Abril 2008) Análise do envolvimento de stress do retículo endoplasmático (RE) na perda de viabilidade celular e activação de morte celular apoptótica induzidas pelo peptídeo Aβ1-40, na ausência ou presença de homocisteína (HC) (Maio a Julho 2008) Metodologias: As culturas primárias de células endoteliais cerebrais (CECs) serão preparadas pela primeira vez no nosso laboratório, de acordo com o protocolo detalhado gentilmente cedido por Yan Xu, dos Estados Unidos (Xu et al., 2002), a partir de preparações de microvasos do cérebro de rato. As culturas celulares proliferativas de CECs de rato serão mantidas em meio DMEM com elevada concentração de glicose e com L-glutamina, ao qual se adicionarão soro fetal bovino a 10%, heparina e suplementos de crescimento de células endoteliais. Nestas condições, esperam-se obter culturas de CECs com uma pureza >95% que será avaliada por imunocitoquímica usando marcadores para o factor VIII, vimentina e receptores para a bradiquinina. O peptídeo Aβ1-40 será adicionado (na forma solúvel ou fibrilhar) a culturas 85-95% confluentes de CECs, na ausência ou na presença de HC. Após exposição, durante diferentes períodos de tempo, a diferentes concentrações de Aβ1-40 ± HC, a viabilidade celular será analisada pelo teste colorimétrico do MTT e através da determinação da libertação da enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH). Nestas condições serão também avaliados vários parâmetros de morte celular por apoptose, nomeadamente a fragmentação do ADN por microscopia de fluorescência, usando as sondas Hoechst e iodeto de propídeo e o ensaio TUNEL, assim como a actividade da caspase-3, uma caspase efectora do processo apoptótico, que será medida determinando a clivagem de um substrato colorimétrico. Deste modo, será possível 5

6 estabelecer as concentrações e tempos de incubações para os quais a Aβ1-40 é tóxica e induz apoptose nas CECs em cultura, assim como determinar a dose de HC que potencia a disfunção endotelial induzida pelo peptídeo Aβ1-40. Com o intuito de investigar o envolvimento de stress do RE na toxidade induzida por Aβ1-40 nas CECs, os parâmetros acima mencionados serão analisados na presença de salubrinal, um inibidor do stress do RE (Boyce et al., 2005, Science 307: ). Nestas condições, espera-se que a perda de viabilidade e a activação da morte por apoptose induzidas por Aβ1-40, assim como o efeito potenciador da HC, sejam prevenidas, parcial ou totalmente, demonstrando o envolvimento do stress do RE neste processo. Segunda fase (Setembro Julho 2009) Objectivos e calendarização: Caracterização do stress do RE induzido por Aβ1-40, na ausência ou presença de HC (Setembro 2008 a Fevereiro 2009) Análise das consequências do stress do RE induzido por Aβ1-40, na ausência ou presença de HC, no stress oxidativo, inflamação e características angiogénicas das células endoteliais em cultura (Março a Julho 2009) Metodologias: O stress do RE será analisado nas culturas de CECs tratadas com Aβ1-40 ± HC, determinando por western blotting (WB) os níveis proteicos de PERK, ATF6 e IRE1α, marcadores das três vias envolvidas na resposta a inductores de stress do RE. Os níveis de GRP78/BiP, um chaperone do RE, também será determinada por WB e a actividade da caspase-12, uma caspase residente do RE, será medida determinando a clivagem de um substrato colorimétrico específico. A activação do factor de transcrição pró-apoptótico Gadd153/CHOP, uma consequência da activação da PERK, ATF6 e IRE1α em condições de stress do RE, irá ser analisada por WB e por RT-PCR, medindo os níveis de expressão e de mrna. Em culturas de CECs expostas a Aβ1-40 espera-se detectar um aumento dos níveis de PERK, ATF6 e IRE1α, assim com de GRP78/BiP. Nestas condições deverá observar-se aumento da actividade da caspase-12 e activação do factor de transcrição Gadd153/CHOP. Finalmente, espera-se que o stress do RE induzido por Aβ1-40 seja potenciado na presença de HC. Com o objectivo de avaliar as consequências do stress do RE induzido pelo peptídeo Aβ1-40 nas CECs em cultura, assim como o efeito potenciador da HC, vários parâmetros de stress oxidativo, inflamação e angiogénese serão 6

7 determinados na ausência ou na presença de salubrinal ou de sirna que silenciem especificamente a PERK, ATF6 ou IRE1α. O stress oxidativo será analisado determinando os níveis de espécies reactivas de oxigénio (ROS) bem como os níveis/actividade de defesas antioxidantes endógenas. Os níveis citosólicos de ROS serão medidos espectrofluorimetricamente usando a sonda DCFH 2 -DA. Para estudar a contribuição das defesas antioxidantes, não enzimáticas e enzimáticas, para o aumento dos níveis de ROS, os níveis de glutationa reduzida (GSH) serão quantificados espectrofluorimetricamente, e a actividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (Cu/Zn-SOD), catalase, glutationa peroxidase e glutationa reductase será determinada por ensaios colorimétricos. A lesão oxidativa de várias biomoléculas (lípidos, proteínas e do ADN), resultante do aumento de ROS nas células, será avaliada. A presença de grupos carbonilo será usada como medida da oxidação de proteínas. Em lisados celulares, os grupos carbonilo serão marcados com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), e serão detectados por WB usando um anticorpo anti-dnp. Os produtos da peroxidação dos lípidos membranares malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal (4-HNE) serão quantificados utilizando um ensaio colorimétrico. A lesão oxidativa do ADN será avaliada por microscopia óptica com um anticorpo específico que detecta a presença de 8-oxoguanina. A produção de espécies reactivas de nitrogénio (RNS) será também analisada. Assim, em CECs tratadas com Aβ1-40, na ausência ou na presença de HC, os níveis de NO, superóxido e peroxinitrito serão medidos. A formação de NO será avaliada pelo método de Griess que determina os níveis de nitritos. As determinações de anião superóxido serão feitas com a sonda fluorescente dihidroetidina (DHE). O peroxinitrito será detectado através da sua capacidade de nitrosilar resíduos proteicos de tirosina por WB, usando um anticorpo anti-3-nt. A activação da isoforma endotelial da sintetase do óxido nítrico (enos) sera investigada por WB medindo a fosforilação desta enzima no resíduo estimulatório Ser(1177). A resposta inflamatória desencadeada nas CECs em cultura após exposição a Aβ1-40, na presença ou ausência de HC será estudada determinando a libertação de vários marcadores inflamatórios por ELISA, em particular de IL- 1β, IL-6, IL-8 and TNFα. Em CECs tratadas com Aβ1-40, na ausência ou na presença de HC, os níveis de mrna e de expressão de VEGF serão medidos por RT-PCR e por análise WB, respectivamente. Além disso, a libertação de VEGF será analisada determinando a proteína acumulada no meio de cultura por ELISA. Os resultados obtidos permitirão avaliar quais as vias activadas por stress do RE desencadeado pelo peptídeo Aβ1-40 que estão envolvidas na indução de 7

8 stress oxidativo, libertação de citocinas pró-inflamatórias e expressão e libertação de factores angiogénicos, em particular de VEGF. Além disso, será possível determinar se a HC potencia o efeito da Aβ1-40 nestes parâmetros associados à disfunção endotelial. Terceira fase (Setembro Julho 2010) Objectivos e calendarização: Correlação dos níveis de HC com alterações cognitivas, parâmetros de stress oxidativo, níveis de Aβ1-40, citocinas pró-inflamatórias e VEGF em indivíduos com defeito cognitivo ligeiro (DCL) e em doentes de Alzheimer (Setembro 2009 a Julho 2010). Metodologia: Esta fase do projecto será realizada no serviço de Neurologia dos HUC, sob orientação da Professora Doutora Isabel Santana e no Laboratório de Neuroquímica dos HUC, sob a orientação da Doutora Inês Baldeiras, sendo a metodologia utilizada aquela que é vulgarmente aplicada nestes laboratórios. Espera-se observar um aumento dos níveis de HC em MCI e em doentes de Alzheimer, sendo este mais elevado no último grupo. É também esperada uma correlação negativa entre os níveis de HC e os de Aβ1-40 e uma correlação negativa entre os níveis de HC e as alterações cognitivas, stress oxidativo, e níveis de citocinas pró-inflamatórias e VEGF. (fases, objectivos, metodologias, resultados de cada fase, calendarização, etc.) Competências específicas do projecto a adquirir pelo aluno: Após a conclusão do projecto, o aluno deverá saber: Pesquisar e interpretar bibliografia relevante; Formular uma hipótese científica e desenhar um projecto científico original face ao estado actual do conhecimento; Planear experiências científicas aplicando protocolos específicos adequados às experiências propostas; Tratar dados e imagens e elaborar gráficos usando programas computacionais adequados; Fazer o tratamento estatístico adequado dos resultados; 8

9 Interpretar e discutir de forma crítica os resultados obtidos; Descrever e expor oralmente os resultados obtidos, quer em português quer em inglês; Escrever um artigo científico. (Entre outros requisitos, os alunos deverão ser capazes de formular uma hipótese científica; ser capazes de desenhar um projecto científico e identificar a sua relevância face ao estado do actual do conhecimento; saber desenhar experiências científicas aplicando protocolos específicos; saber interpretar e discutir de forma crítica os resultados obtidos; descrever e expor oralmente os resultados obtidos.) 9