SEMEADURA IN VITRO DE ORQUÍDEAS PARA PROPAGAÇÃO MASSAL

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1 SEMEADURA IN VITRO DE ORQUÍDEAS PARA PROPAGAÇÃO MASSAL Vasco Luiz Altafin Milena O. Menezes Ricardo R. Lima. F. Leonardo M. Pitombo Boletim Técnico n o 7 FUNDAÇÃO PINHALENSE DE ENSINO Centro Regional Universitário de Espírito Santo do Pinhal - SP

2 ÍNDICE INTRODUÇÃO PÁG. 01. Características botânicas das orquídeas Fecundação das sementes Propagação vegetativa de orquídeas Produção de plantas livres de vírus Propagação por cultivo de meristemas Outros métodos de propagação Vantagens da propagação in vitro Escolha das matrizes Meios de cultura Incubação das plântulas Aclimatação das mudas Ilustrações Referências Bibliográficas... 14

3 INTRODUÇÃO As orquídeas sempre representaram um das ornamentais mais cobiçadas pelas pessoas, no Brasil e no mundo todo, devido a exuberância de suas flores perfeitas e suas cores delicadas. Por este motivo, muitas pessoas praticam o extrativismo, que consiste em retirada desordenada de orquídeas silvestres da mata tropical, conduzindo assim algumas espécies à beira da extinção. Existem espécies, que devido sua raridade, chegam a custar preços altíssimos que podem atingir facilmente U$ 500,00 a unidade, mas existem outras mais comuns cujo preço nas floriculturas variam em torno de U$ 10,00. O objetivo deste trabalho foi o de produção massal de orquídeas em laboratório para fins de retornar à mata o maior número de plantas adaptadas ao ambiente externo. As plantas produzidas em laboratório possuem alto vigor fisiológico, devido a sua nutrição balanceada nas fases iniciais de desenvolvimento, e isto se traduz em rápido crescimento e maior tolerância a condições adversas de meio ambiente, bem como ao ataque de doenças e pragas. As plantas produzidas em laboratório, adaptadas ao ambiente externo, são colocadas nas copas de algumas árvores nativas e assim fazem parte do habitat natural da floresta, podendo se propagar naturalmente através de simbiose com certas espécies de fungos. Desta forma, estas plantas tão exuberantes e maravilhosas estariam garantindo sua ocupação no ambiente nativo de onde vieram. 1. CARACTERÍSTICAS BOTÂNICAS DAS ORQUÍDEAS A família das orquidáceas compõe 7% de todas as espécies do planeta. Considerando as plantas já catalogadas, são aproximadamente 35 mil espécies naturais, nas suas 2 subfamílias, 2 divisões, 5 tribos, 2 séries, 2 subséries, 85 subtribos e mais de 2500 gêneros, sem contar a infinidade de híbridos, naturais e artificiais. As orquídeas, ao contrário do que alguns pensam, são todas autotróficas, e vegetam como epífitas (desenvolvem-se em árvores), terrestres (desenvolvem-se sobre o solo), rupículas (crescem sobre pedras) e também, quase mitologicamente, as saprófitas (vegetam no subsolo e são desprovidas de clorofila).

4 No geral, as flores possuem 3 sépalas, uma dorsal e duas laterais, 3 pétalas, duas laterais e uma modificada, chamada labelo. O centro do labelo é onde se projeta a coluna, órgão resultante da fusão dos órgãos masculinos (estames) e femininos (carpelos). Na antera ficam agrupados os grãos de pólen (políneas) que se dispõem de 2 a 8. Logo abaixo da antera fica o estigma, o órgão receptivo feminino, de superfície viscosa onde são depositadas as políneas, ocorrendo assim, a polinização. Como segmento da coluna, temos o ovário, onde, após a fecundação, desenvolve a cápsula das sementes, com até dezenas de milhares de minúsculas sementes. Entretanto, também há suas exceções como a de plantas que produzem, por floração, somente flores masculinas, somente flores femininas e raramente flores masculinas com femininas ou hermafroditas. Isso ocorre com a subtribo catasetinae, por exemplo, por influência climática, principalmente. 2. FECUNDAÇÃO DAS SEMENTES Na tabela 1 estão relacionados alguns gêneros de orquídeas e os dias necessários à maturação de suas sementes. O processo de fertilização pode ser dividido nas seguintes etapas: a) o ovário se torna maior b) a flor murcha c) o estigma cicatriza d) forma-se uma cápsula amarelecida Tabela 1. Gêneros de orquídeas e os dias necessários à maturação de suas sementes. Gêneros Dias Laelias e Cattleyas Oncidiuns Sophronitis 90 Miltônias Cymbidiuns 360 Rodriguezias Dendrobiuns Phalaenopsis

5 3. PROPAGAÇÃO VEGETATIVA DE ORQUÍDEAS As orquídeas podem se multiplicar tanto de forma vegetativa quanto sexual. Quando se utiliza a propagação vegetativa, a descendência é idêntica a planta-mãe, e quando se utiliza a propagação através de sementes, raramente se obtém uma descendência semelhante à planta-mãe. Quando se propaga orquídea cultivada, obtida por cruzamentos, a descendência é ainda menos semelhante à planta-mãe. Em princípio, com orquídeas cultivadas, a propagação deve ser vegetativa. A partir de 1960 ocorreu uma revolução na propagação de orquídeas. Morel obteve através de cultura de meristemas, Cymbidium livre de vírus, isolando ápices de brotos in vitro. A partir destes ápices, foram obtidos protocormos que eram extremamente parecidos aos que se formam depois da germinação da semente. Às vezes ocorre divisão espontânea destes protocormos, mas geralmente isto acontece cortando o protocormo em porções (Morel, 1965). No caso de Cymbidium se pode produzir de 6-8 novos protocórmos a partir de um único, em um período de 6 semanas. Após esta etapa de multiplicação que pode às vezes ser indefinida, ocorre o desenvolvimento no protocormo de folhas e raízes. Desta forma, Morel produziu milhares de plantas em um ano, a partir de um único ápice de um broto (um meristema com alguns primórdios foliares). A clonagem de orquídeas por cultivo de meristemas se converteu assim na primeira aplicação comercial da propagação vegetativa in vitro. Este método que originalmente se desenvolveu para Cymbidium, foi modificado mais tarde e adaptado para Cattleya e muitos out ros gêneros de orquídeas. A mericlonagem de orquídeas (propagação vegetativa por cultivo de meristemas), atualmente é realizada em grande escala, no mundo todo. Os protocormos que se desenvolvem após a germinação de uma semente de orquídea, tem um estado morfológico que se encontra à metade do caminho entre um embrião indiferenciado e um broto. Com a propagação vegetativa por meio de cultivo de meristemas, se formam também corpos protocormicos, significando que o ápice do broto de um planta adulta se rejuvenesce (passa da fase adulta à juvenil). Os protocórmos obtidos por germinação de sementes têm muitas semelhanças com os produzidos a partir de ápices isolados de brotos (Champagnat, 1877). A propagação vegetativa por cultivo de meristemas pode ser dividida em 3 fases: transformação de um meristema em um corpo protocormico, a propagação dos protocórmos

6 dividindo-os em fragmentos, e a conversão destes protocórmos em brotos com raízes (Teo, ). 4. PRODUÇÃO DE PLANTAS LIVRES DE VÍRUS Uma das condições necessárias para a propagação, é que as plântulas obtidas devem estar livres de vírus. Para tanto, deve-se utilizar como explante um meristema de aproximadamente 1mm de comprimento com dois primórdios foliares. O vírus que se encontra com mais freqüência nas orquídeas é uma cepa especializada do vírus do mosaico do tabaco (TMV-O), conhecido antes como vírus da mancha anelada do Odontoglossum. Este vírus se transloca pela seiva e a contaminação se dá pelas mãos ou algum objeto cortante. Produz mancha em forma de anel nas folhas de Cattleya e também afeta a forma e a cor das flores em muitas outras orquídeas (Hakkaart & Van Balen, 1980). 5. PROPAGAÇÃO POR CULTIVO DE MERISTEMAS De acordo com Champagnat (1977), Rao (1977), e Fast (1980), deve-se utilizar como material inicial, para cultivo de meristemas, brotos jovens em crescimento de cm de comprimento que acabaram de desenvolver suas folhas. Qualquer resíduo de solo se lava bem em água corrente, e se retiram as folhas de maneira que se possam ver as gemas axilares. Banha-se o broto sem folhas em álcool (70% v/v), e depois se esteriliza durante 10 minutos em hipoclorito de sódio a 10% v/v. Preparam-se então as gemas axilares depois de tê-las colocadas em água esterilizada para retirada dos resíduos de cloro. Esteriliza-se uma vez mais (10 minutos em hipoclorito 3-10% (v/v), contendo Tween 20 ou 80), tornando-as em água esterilizada. Cortam-se as bases das gemas menores e em câmara de fluxo laminar se realiza a inoculação. No caso das gemas maiores se retiram algumas folhas para o processo de inoculação propriamente dito. Passado algum tempo (6-10 semanas) formamse os primeiros corpos protocormicos. Ocorrendo isto, os protocórmos devem ser separados e repicados. Atualmente se inoculam gemas maiores (com pelo menos 3-4 primórdios foliares). No caso de cultivo de meristemas de Cattleya, se produz muito mais rapidamente uma coloração marrom nos tecidos lesionados; por esta razão se recomenda freqüentemente

7 cortar o meristema em líquido, e cultivá-lo depois em meio líquido, na qual a coloração marrom se difunde com mais facilidade (Fast, 1980). O meio que se utiliza para Cattleya é mais complicado do qual é utilizado para Cymbidium (Fast, 1980; Champagnat, 1977); acrescentando-se as vezes auxina, citocinina, leite de coco e peptona. A formação de protocórmos em Cattleya necessita de bastante tempo e geralmente limpeza nas bases das folhas mais velhas. Miltonia, Odontonia e Odontoglossum oferecem o mesmo tipo de resposta que a Cattleya (regeneração na base das folhas), e se cultivam também em meio relativamente rico. A resposta destes 3 gêneros é muito mais rápida que a de Cattleya (Champagnat, 1977). Até o momento o cultivo de meristemas com o gênero Paphiopedilum tem sido fracassado, devido à rápida coloração necrosada que se produz quando se isola o meristema apical. O meio para o cultivo de meristemas é muito semelhante e relativamente simples, que se utiliza para a inoculação dos diferentes gêneros. Cymbidium e Miltonia (que são relativamente fáceis de se multiplicar), se cultivam freqüentemente no meio de Knudsom C (1946) ou sobre o meio modificado de Vacin & Went (1949). Cattleya e alguns outros gêneros necessitam de um meio especial (Morel, 1974). O tipo de meios para os diferentes gêneros tem sido descrito por: Bergman (1972), Whitner (1974), Arditti (1977), Fast (1980). Os meios Murashige & Skoog (MS) (1962), e Wimber (1963) foram utilizados mais tarde (De Bruyne & Deberg, 1974). O isolamento de meristemas geralmente é feito em meio sólido, com exceção da Cattleya; a propagação de protocórmos geralmente é feita em meio líquido e o crescimento de protocórmos até o estádio de plântula, novamente em meio sólido (Leffring, 1968). A composição dos meios, em 3 etapas diferentes da propagação das orquídeas é freqüentemente diferente. O ph do meio varia de 4,8-5,8. A fonte de açúcar é a sacarose na proporção de 1-3% (p/v), ou às vezes glucose 1,5% acrescido de frutose 1,5%. A adição de reguladores vegetais não é geralmente necessária (Homes et al. 1972), ocorrendo altas taxas de mutações gênicas em sua presença. Fonnesbech (1972) encontrou efeitos positivos das auxinas sobre Cymbidium, Cattleya e Aranda. Reinert & Mohr (1967) e Pierik & Steegmans (1972), indicaram um efeito estimulador da citocinina em Cattleya. Cheng-Haw

8 et al. ( ), indicaram também um efeito positivo deste regulador vegetal em Cattleya e Epidendrum. Finalmente Fonnesbech (1972), indicou que o GA 3 induzia o crescimento por alongamento em Cymbidium. A temperatura ótima para o crescimento das orquídeas se encontra entre 22 e 28 0 C. Utiliza-se geralmente a luz fluorescente entre 12 e 16 horas de luz e 12 e 8 de escuro. As vezes se utiliza luz contínua. Pode-se utilizar uma baixa irradiância na inoculação, mas deve-se aumentar quando as plântulas se formam a partir dos protocórmos. Em princípio a multiplicação das orquídeas por cultivo de meristemas pode ser realizada por duas formas: 1) sobre um meio sólido; 2) em um meio líquido em movimento, que se mantém assim por ação de um aparelho rotatório (Wimber, 1963). Sua velocidade é extremamente variável, mas a maior parte dos pesquisadores prefere uma velocidade lenta (2-5 rotações por minuto). A propagação e o crescimento são, geralmente, melhores em um meio em movimento do que em um meio sólido. Nos meios líquidos ocorre uma melhor oxigenação e um transporte de nutrientes mais eficiente para o explante. Quando as plântulas com 3 ou 4 folhas são suficientemente grandes (5-7 cm de altura), após várias repicagens, pode-se aclimatá-las em estufa. Deve-se manter um nível de umidade alta nas primeiras semanas e também uma luminosidade reduzida utilizando-se sombrite 70 e 50%. Geralmente se utiliza como substrato para aclimatação e desenvolvimento de orquídeas, a fibra e/ou pó de xaxim, mas atualmente o substrato que vem ganhando comércio é a fibra de côco, pois além de possuir ótima aeração, imprescindível no crescimento das plantas, é também ecologicamente correto. 6. OUTROS MÉTODOS DE PROPAGAÇÃO Com o passar dos anos, foram desenvolvidos outros métodos de propagação de orquídeas dentre eles destacam-se: a) Utilização de folhas jovens: As folhas jovens e os ápices de folhas, por exemplo, de Cattleya, formam calos em suas bases, a partir dos quais podem ser formados protocórmos, que se utiliza para subsequente multiplicação (Champagnat, 1977; Champagnat & Morel, 1969). Churchill et al. (1971 a, 1971b, 1973) descobriram também a regeneração de plântulas obtidas a partir da formação de calos e protocormos, de folhas jovens e ápices foliares

9 de Laeliocattleya e Epidendrum. Vij et al. (1984) reproduziram a espécie Rhynchostylis resulta por organogênese direta, a partir de cultivos de segmentos de folha. b) Tanaka & Sakanishi (1977, 1985) indicaram que se podia desenvolver corpos protocormicos sobre fragmentos de folhas de brotos jovens de Phalaenopsis sobre a influência de BAP, NAA e adenina. A partir destes corpos protocormicos se obtinham plântulas. Os brotos jovens por sua vez procediam de gemas isoladas de uma inflorescência. c) Gemas dormentes: Pode-se obter brotos a partir de primórdios jovens de gemas florais, ou de gemas basais, vegetativas dormentes, de inflorescências de Dendrobium, Vanda, Phalaenopsis, Oncidium, Phragmipedium, Epidendrum, e Thunia (Rao, 1977; Fast, 1980; Singh & Prakash, 1984). De acordo com Teo ( ), Rotor, em 1949 foi o primeiro pesquisador que clonou Phalaenopsis desta forma. d) Inflorescências jovens: Intuwong & Sagawa (1973) desenvolveram um método para propagar Vascostylis, Neostylis, e Ascofinetia in vitro, a partir de explantes de inflorescências jovens. Estes explantes regeneravam tecidos, que se transformavam em protocormos, quando se cultivavam em meio especial. e) Calo: Champagnat & Morel (1972) regeneraram tecido caloso a partir de tecido procedente de rizoma de Ophrys que podia formar protocormos. O mesmo experimento pode ser realizado com Aranda (Chiang-Shiang et al., ). f) Plântulas jovens: Estas podem ser induzidas a regenerar como foi demonstrado por Pierik & Steegmans (1972), com Cattleya aurantiaca, sendo a citocinina o fator indutor. g) Estiolamento: São induzidas a estiolarem por baixa irradiância ou ausência de luz, plântulas de Paphiopedilum, cultivadas in vitro, através de segmento nodal, e propagadas.

10 7. VANTAGENS DA PROPAGAÇÃO IN VITRO A propagação in vitro tem como vantagens, a produção de um grande número de mudas em curto espaço de tempo quando comparado com métodos tradicionais, sendo estas com alta qualidade fitossanitária. A diminuição do tempo de produção destas mudas se torna de grande importância, pois algumas espécies que atingem maturidade apresentando o primeiro florescimento com 5-7 anos podem florescer com 3-4 anos de idade. Uma produção massal de mudas também é muito interessante, uma vez que naturalmente as sementes de orquídeas apenas germinam quando ocorre a interação simbiótica com certos gêneros de fungos. Na propagação in vitro as sementes são colocadas em condições ideais para germinarem e não se faz necessário a simbiose com o fungo. A produção de mudas isenta de doenças é uma das vantagens mais expressivas da micropropagação, pois as plantas sadias produzidas possuem maior vigor fisiológico apresentando uma maior capacidade de desenvolvimento melhor florescimento. 8. ESCOLHA DAS MATRIZES Para que o processo de propagação in vitro se estabeleça com alta eficiência e os objetivos sejam alcançados, garantindo uma boa produção de mudas sadias, deve-se ter como premissa a escolha de uma matriz que apresente todas as boas qualidades da planta, assim como, bom desenvolvimento vegetativo e reprodutivo e, quando possível, boas condições fitossanitárias. 9. MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura ou de cultivo para o desenvolvimento de orquídeas in vitro são constituídos de macro e micronutrientes, vitaminas, açúcar e ainda podem ser acrescidos de reguladores vegetais pertencentes aos grupos da auxina, citocinina e da giberelina. Abaixo estão relacionados os meio de cultivo que servem para o desenvolvimento das orquídeas in vitro. A tabela 2 apresenta o meio MS (Murashige & Skoog, 1962), e a tabela 3 apresenta a composição de vitaminas do meio de cultura de Morel (1960).

11 Tabela 2. Composição do meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962). COMPONENTES [mg.l -1 ] NH 4 NO KNO Mg SO 4. 7H 2 O 370 K H 2 PO Ca Cl2. 2H2O 440 Mn SO 4. 4H 2 O 22,3 Zn SO 4. 7H 2 O 8,6 H 3 BO 3 6,2 KI 0,83 Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0,25 Cu SO 4. 5H 2 O 0,025 Co Cl 2. 6H 2 O 0,025 Na2 EDTA. 2H2O 37,3 Fe SO4. 7H2O 27,8 Tiamina HCl 0,1 Piridoxina HCl 0,5 Ácido nicotínico 0,5 Glicina 2,0 Myo-inositol 100 Agar Sacarose

12 Tabela 3. Composição de vitaminas do meio de cultura de Morel (1960). COMPONENTES [mg.l -1 ] Tiamina HCl 1 Piridoxina HCl 1 Ácido nicotínico 1 Myo-inositol 100 Biotina 0,01 Pantotenato de Ca INCUBAÇÃO DAS PLÂNTULAS O desenvolvimento das plântulas deve ser em um ambiente climatizado, com controle de temperatura, que geralmente está ao redor dos 27 0 C e com controle do fotoperíodo, que pode ser de 16/8 ou 12/12 de luz/escuro. Esta climatização ga rante uma uniformidade maior das plântulas em seu desenvolvimento, e facilita na observação de qualquer problema que alguma muda apresente. As boas condições de instalação são fundamentais para se conseguir uniformidade de produção e garantir um fornecimento de mudas para viveiristas. 11. ACLIMATAÇÃO DAS MUDAS As mudas propagadas in vitro devem ser adaptadas às condições onde estarão no futuro, e para isto se torna necessário à utilização de ambientes semi-climatizados, onde se procura fornecer umidade e luminosidade adequadas. Quando as mudas saem do laboratório e são levadas para estas estufas semi-climatizadas, devem ser protegidas da luz solar direta, utilizando-se sombrites que deixam passar apenas 80-50% da irradiação solar. Nas primeiras semanas de adaptação, deve-se fornecer muita quantidade de água, pois as folhas das orquídeas recém produzidas apresentam uma fina camada de cutícula e podem desidratar-se com facilidade. Gradativamente, deve-se adaptá-las às condições de campo, diminuindo a quantidade no fornecimento de água. A luminosidade adequada para o desenvolvimento da maioria das orquídeas é equivalente a 50% da irradiação solar, e por este motivo, deve-se colocá-las sempre sob sombrite ou ripado.

13 12. ILUSTRAÇÕES Figura 1. Plântulas in vitro Figura 2. Aclimatação das orquídeas Figura 3. Orquídeas em desenvolvimento Figura 4. Viveiro de mudas

14 13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS PIERIK, R. L. M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid: Ediciones Mundi-Prensa, p , RAMOS, M. S. S. As Orquídeas e sua reprodução pela semente, edição da Fazenda Anhumas,: Campinas, ENDSFELDZ, W. F. Orquídeas, Editora Europa:São Paulo, 3ª edição, CAMPOS, D. M. Orquídeas Manual prático de cultura, editora Expressão e Cultura: Rio de Janeiro, 2ª edição, CAMPOS, D. M. Orquídeas Manual prático de cultura, editora Expressão e Cultura: Rio de Janeiro, 2ª edição, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 1, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 2, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 3, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 7, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 13, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 13, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 15, ENDSFELDZ, W. F. O Mundo das Orquídeas, On Line editora: São Paulo, no 18, 2002.