FABRICAÇÃO DE CORPO POROSO ESTRUTURAL CERÂMICO APLICÁVEL À ENGENHARIA DE TECIDOS

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1 1 FABRICAÇÃO DE CORPO POROSO ESTRUTURAL CERÂMICO APLICÁVEL À ENGENHARIA DE TECIDOS F.H. Monaretti (1) ; C.C. Camilo (1) ; R.A. Ikegami (1) ; C.A. Fortulan (1) ; B. de M. Purquerio (1). purqerio@sc.usp.br (1) LAMAFE - LCC Laboratório de Componentes Cerâmicos Departamento de Engenharia Mecânica-EESC-USP Av. Trabalhador São-carlense, CP São Carlos SP. RESUMO A Engenharia de Tecidos está conceituada na cultura prévia de células com proteínas morfogenéticas em Corpos Porosos Estruturais - CPE s (Scaffolds) de biomateriais, que simulam a matriz extracelular, oferecendo suporte para o crescimento celular na formação do tecido maduro. Este trabalho estuda a manufatura de corpos-de-provas em alumina através do método de incorporação sistematizada de partículas de sacarose e naftaleno como agentes formadores de poros orgânicos fugitivos, objetivando a obtenção de porosidade específica quanto ao tamanho, volume, morfologia, interconectividade e reprodutibilidade de processo. Optou-se pela a cerâmica de alumina devido às suas características universais de manufatura e baixo custo. Os CPE s foram caracterizados qualitativa e quantitativamente quanto à morfologia e macroestrutura através de microscopia eletrônica de varredura - MEV e porosimetria de mercúrio. Verificou-se a viabilidade dos métodos de manufatura empregados na obtenção das características desejáveis para a aplicação proposta. Palavras-chave: Corpos porosos estruturais, Scaffolds, engenharia de tecidos, cerâmica, alumina. INTRODUÇÃO A substituição dos tecidos ósseos em decorrência de patologias e traumatologias ortopédicas e odontológicas tem alavancado pesquisas em busca de materiais para substituições ósseas e dentárias. No passado, quando não havia recursos para restaurar ou substituir danos no tecido ósseo, os membros ou partes eram amputados. Em meados do século XVII, FALLOPIUS (1600) (1) implantou uma placa de ouro para restaurar um defeito craniano. Desde então, têm sido utilizados enxertos e implantes para a substituição de partes ósseas danificadas, com a

2 2 utilização de técnicas de enxertos ósseos e de vários tipos de materiais. Atualmente, a área de Engenharia de Tecidos (ET), que faz uso de enxertos e implantes sintéticos e biológicos de estrutura porosa (scaffolds) através da cultura de tecidos tem contribuído com avanços tecnológicos e científicos que possibilitou o desenvolvimento de novas aplicações dos biomateriais, dentre os quais se destaca a utilização das estruturas cerâmicas e poliméricas porosas. Os três requisitos necessários para a engenharia de tecido são: fatores de crescimento celular, células em cultura e o corpo poroso estrutural (CPE) ou estrutura porosa (scaffold) (2). As pesquisas com biomateriais cerâmicos são de grande importância por serem materiais bioinertes ou bioativos podendo ser fabricados com estrutura densa ou porosa (3). Aplicações de biocerâmicas para implantes encontram-se nas mais diversas áreas da medicina e odontologia, como a ortopedia, neurologia, bucomaxilo-facial e implantodontia, ou seja, para a substituição de articulações, de dentes, reparações patológicas periodontais, reconstrução maxilo-facial, substituição e estabilização da mandíbula, fusão espinhal, implantes de articulações, enxertos ósseos e suportes para enzimas. A primeira biocerâmica com uso difundido na década de 70 foi a alumina densa (α-al 2 O 3 ) que se apresenta como bioinerte (4, 3, 5). Quando fabricada na forma de uma estrutura porosa, como os Corpos Porosos Estruturais CPE s (Scaffold) deste trabalho, deve possuir cinco fatores, dentre outros, considerados como características desejáveis. São eles: a superfície do Scaffold precisa permitir a adesão e o crescimento celular; nenhum componente ou subproduto de sua degradação deve provocar reações inflamatórias ou de toxidade; o material tem de ser manufaturado em estrutura tridimensional; a porosidade deve ser da ordem de 90% com elevada área superficial para interação célula - Scaffold, espaço para regeneração superficial da matriz extracelular e mínima constrição de difusão durante cultura in vivo e taxa de regeneração ajustável para combinar com a taxa de regeneração do tecido de interesse (6). Vários materiais cerâmicos para Scaffolds têm sido investigados para engenharia de tecido ósseo tais como a hidroxiapatita, zircônia, alumina, vidro bioativo, entre outros. O comportamento mecânico de um material pode ser descrito através de sua porosidade, que se caracteriza pela quantidade de vazios existentes no seu volume total. No entanto, a literatura traz informações sobre o tamanho de poros para que haja osteocondutividade (7), A porosidade ótima das biocerâmicas está relacionada à necessidade de fornecer um suprimento sanguíneo ao tecido

3 3 conectivo em crescimento, fator que ocorre em poros maiores que 100 µm, os quais permitem o desenvolvimento de um sistema de vasos capilares entremeado com a cerâmica porosa (8). Outros autores afirmam que poros maiores que 100 µm e menores que 200 µm são necessários para obtenção de uma estrutura porosa para implante (10, 11). Conforme alguns autores (12, 13), para que ocorra osteointegração, os poros devem ser maiores do que 50 a 100 µm ou próximos de 250 a 300 µm. O tamanho mínimo dos poros é de 100 µm mas, para que ocorra osteocondução, são necessários tamanhos maiores que 200 µm (14). O tamanho limite de um macroporo está a cerca de 400 µm (11). Por outro lado, o volume total de poros da cerâmica tem variado de 20% a 60% e o tamanho pode ser de 5 µm a 400 µm; nessa estrutura ocorreram variações nas respostas à força compressiva e as estruturas com poros maiores apresentaram menor resistência à força de compressão (15). Das pesquisas avaliadas, observou-se uma importância fundamental na morfologia dos poros, seja ela esférica ou oblonga, no tamanho e na distribuição dos poros, na sua interconectividade e na sua relação com as propriedades mecânicas. O objetivo fundamental, no entanto, é obter uma porosidade em torno de 60 a 90% com a melhor resistência mecânica possível. Para obtenção de corpos cerâmicos porosos são empregadas diversas técnicas, as mais difundidas são: adição de um componente degradável e volátil com a temperatura, uso de peróxido de hidrogênio em barbotina, gelcasting, método da esponja, fabricação em ambiente de microgravidade, produção de estrutura em cera perdida pela técnica de prototipagem rápida e prototipagem rápida pela técnica de impressão 3D (3D printing). Neste trabalho foi empregado o método de adição de componentes formadores de poros pela decomposição durante a sinterização. Foram conformados corpos-deprovas em alumina. Os CPE s foram caracterizados qualitativa e quantitativamente quanto à morfologia e macroestrutura através de MEV, porosimetria de mercúrio e densidade aparente. A viabilidade dos métodos de manufatura empregados foi avaliada na obtenção das características desejáveis para a aplicação proposta. MATERIAIS E MÉTODOS O método selecionado de formação de poros foi o da adição de agentes formadores de poros, que se decompõe com a temperatura e ainda podem ser

4 4 lixiviados ou sublimados à verde. Esta decisão está diretamente vinculada ao processo de conformação proposto, que é o da prensagem isostática. Consegue-se através deste método fabricar homogêneos e passíveis de usinagem em estado ainda à verde ou de pré queima, entretanto, características de baixa resistência mecânica são abordadas na literatura e são intuitos de análise. Materiais Como componente estrutural dos corpos-de-provas foi utilizada a Alumina Calcinada CT-3000, (Alcoa & Chemicals Ltda) diâmetro médio equivalente de partícula de 0,6 µm, área superficial de 6 a 8 m 2 /g. A seleção da alumina deve-se ao seu comportamento tido como universal, de propriedades e manufatura conhecidas e passíveis de serem reproduzidas por outros materiais. Como agentes formadores de poros, foram utilizados a sacarose comercial (Usina da Barra S.A.) e o Naftaleno PS (Vetec Química Fina Ltda); como componente ligante da barbotina foi utilizado o poli-vinil-butirol (PVB / Butvar B-98), na forma de pó e como solventes foram utilizados o álcool isopropílico PA - ACS (Labsynth Ltda) e água deionizada para lixiviação dos cristais de sacarose. Manufatura A mistura, desaglomeração e homogeneização das matérias-primas no preparo da barbotina foram realizadas em moinho vibratório de jarros, com jarro de polietileno de alto peso molecular (HDPE) de 150ml de capacidade volumétrica total e contendo 400 g de cilindros de alumina ( =12mm, h=12mm). A barbotina foi composta por alumina a 30vol%; PVB a 5 vol% e álcool isopropílico a 65 vol%. Esta suspensão foi mantida em vibração por 24 horas. As partículas dos agentes formadores de poros (porogênicos) foram submetidas ao processo de moagem com almofariz e pistilo, sendo classificadas e selecionadas na faixa de 150 a 600 µm, conforme ilustra a Tabela 1. Tabela 1 Classificação de tamanho das partículas. Tamanho de Partículas Denominação 100% de 150 a 300 µm Tamanho 1 100% de 301 a 600 µm Tamanho 2 50% Tamanho 1 e 50% Tamanho 2 Tamanho P

5 5 Durante o processamento, a barbotina é transferida para um béquer onde são adicionados os agentes formadores de poros na concentração e tamanhos selecionados e agitados mecanicamente através de hélices por 2 minutos, conforme descreve a Tabela 2. Tabela 2 Composições volumétricas das misturas. Materiais Corpo-de-prova Equivalente em alumina na Barbotina (vol %) Naftaleno (Tamanho P) (vol %) APN Sacarose (Tamanho P) (vol %) APS BPN BPS CPN CPS Após a mistura dos agentes formadores de poros com a barbotina, o solvente é evaporado com o auxílio de um soprador de ar quente e simultaneamente desaglomerado em partículas menores até passar em malha de abertura 600µm. A secagem dos grânulos é finalizada em estufa a 80ºC por 30 minutos. Prensaram-se uniaxialmente pastilhas com dimensões de 15 x 4 mm (0,9g da mistura) com pressão de 20 MPa. Em seguida, as pastilhas foram embaladas a vácuo em balões elastoméricos e foram submetidas à prensagem isostática de 100 MPa durante 1 minuto. Os corpos foram sinterizados em forno elétrico com taxas de aquecimento específicas para cada mistura até atingir a temperatura máxima de 1600ºC, permanecendo nesta temperatura durante 2,0 h. A taxas de aquecimento foram determinadas pela análise termogravimétrica dos componentes formadores de poros. Ensaios Foram realizadas análises termogravimétricas dos materiais fugitivos e do componente ligante, objetivando-se a programação das curvas de aquecimento para

6 6 a sinterização. As amostras analisadas foram o naftaleno de tamanho P, a sacarose de tamanho P. As análises termogravimétricas foram feitas em um equipamento Shimadzu modelo TGA 51, montado sobre bancada de granito espesso sobre suporte metálico com amortecedores de vibrações externas. As amostras foram submetidas a uma taxa de aquecimento de 10ºC/ min, até a temperatura máxima de 600ºC em atmosfera de ar sintético a uma vazão de 50 cm³/min. A análise macroestrutural e microestrutural dos poros foi obtida pela microscopia eletrônica de varredura MEV, auxiliada pela determinação da densidade aparente e porosidade aparente por medidas de peso por imersão, usando o princípio de Archimedes, e medidas de porosidade por porosimetria de mercúrio (Micromeritics Poresizer 9320). Na preparação das amostras para MEV os corpos fraturados tiveram seus poros preenchidos com resina epóxi e após a cura da resina foram submetidos ao lixamento e polimento. RESULTADOS E DISCUSSÃO Análise termogravimétrica As curvas termogravimétricas obtidas dos materiais voláteis analisadas são apresentadas na Figura 1. Os resultados de maior relevância ao estudo, foram o intervalo de temperatura de perda de massa (faixa de temperatura em que sofrem decomposição total), o intervalo de temperatura de maior perda de massa e o pico da derivada termogravimétrica (DTG) do maior evento de decomposição. Verifica-se que, para o naftaleno (Figura 1A), a perda de massa se dá no intervalo de 58 a 216ºC, enquanto que para sacarose (Figura 1B), se dá entre 243ºC até uma temperatura superior a 600ºC. Já em relação ao pico da DTG do maior evento, as amostras apresentaram picos de 211ºC para o naftaleno, 256ºC para a sacarose. A Tabela 3 resume os dados obtidos pela análise. Tabela 3 Dados de perda de massa dos voláteis. Amostras Naftaleno Sacarose Intervalo de perda de massa 58 a 216ºC 243 até temperatura superior a 600ºC Intervalo de maior perda de massa 58 a 216ºC 243 a 435ºC Pico da derivada (DTG) do maior evento 211ºC 256ºC

7 7 Figura 1 Curvas Termogravimétricas das amostras: A) naftaleno e B) sacarose. Programação de curvas características de sinterização A programação do forno baseado nos dados da Tabela 3 e está apresentada na Figura 2, sendo comuns as taxas 1ºC/min da T amb até 370ºC, 5ºC/min até atingir a temperatura de 600ºC, e 10ºC/min até 1600ºC com patamar de 120 minutos. Figura 2 Curva de aquecimento do forno para sinterização dos corpos-de-prova: A) naftaleno e B) sacarose. Densidade aparente (Dap), porosidade aparente (Pap) Através da análise realizada pelo teste de imersão (princípio de Arquimedes), obteve-se as médias dos valores de Dap, Pap, Fração de componente estrutural ep porosidade total (porosidade aberta e porosidade fechada) ilustrados pela Figura 3.

8 8 Figura 3 (A) Dap média dos CPE s; B) Pap média dos CPE s. Observou-se uma perda de volume de poros em relação à entrada de agentes formadores de poros e a porosidade obtida. A Figura 4 mostra a fração volumétrica total contra a fração densa. Entretanto esta perda foi menor com o aumento da fração volumétrica dos agentes formadores. Observa-se uma tendência maior de formação de poros fechados nos CPE s de naftaleno. Figura 4 Percentual médio de componente estrutural e Porosidade total média dos CPE s. Microscopia eletrônica de varredura As imagens obtidas por MEV foram analisadas através do programa Image- Pro Plus 4.5, foi verificado o tamanho médio, a distribuição e a fração volumétrica de macroporos. De acordo com a análise das imagens, os CPE s APS (figura 5A) apresentaram poros com tamanho médio de 192,3µm (+ 159,4). Os CPE s BPS (Figura 5B) apresentaram poros com tamanho médio de 226,6µm (+ 215,5). Já os CPE s CPS (Figura 5C) apresentaram poros com tamanho médio de 232,5µm (+ 157,3).

9 9 Figura 5 Imagens: A) CPE APS 200x; B) CPE BPS 200x e C) CPE CPS 200x. De acordo com a análise das imagens, os CPE s APN (figura 6A) apresentaram poros com tamanho médio de 101,7 µm (+ 94,4), Os CPE s BPN (Figura 6B) apresentaram poros com tamanho médio de 94,4 µm (+ 106,4). Já os CPE s CPN (Figura 6C) apresentaram poros com tamanho médio de 93,9 µm (+ 96,8). A variação de tamanho de poros pelo desvio padrão foi maior nos CPE s APS, BPS e CPS. No entanto, os CPE s APN, BPN e CPN apresentaram percentuais de macroporosidade menores do que os apresentados pelos CPE s APS, BPS e CPS, porém, com maior número de poros, visto que os primeiros apresentaram menores valores de tamanho médio de poros. Figura 6 Imagens MEV dos CPE s: A) CPE APN 200x; B) CPE BPN 200x e C) CPE CPN 200x. Através da análise das imagens, verifica-se que os CPE s APS, BPS e CPS apresentaram o componente estrutural cerâmico mais denso, quando comparado ao apresentado pelos CPE s APN, BPN e CPN, pois estes apresentaram grande número de pequenos poros. Porosimetria de mercúrio A análise das amostras dos CPEs por porosimetria de mercúrio, teve o intuito de verificar o tamanho médio e a distribuição mensurou dos poros intrínsecos e dos

10 10 poros induzidos com diâmetros menores que 10 µm nos CPEs. Para isto foi determinada uma classificação por faixas de variação de diâmetros de poros, a saber: Faixa a diâmetros entre 0,0050 a 0,0999 µm; Faixa b diâmetros entre 0,1 a 0,9999 µm e Faixa c diâmetros entre 1 a 9,999 µm. De acordo com esta classificação, os CPE s APS, BPS e CPS apresentaram poros com diâmetro médio de 0,9290 µm (+ 2,3379), 0,7735 µm (+ 2,1045) e 0,8303 µm (+ 2,2061), respectivamente. Já os CPE s APN, BPN e CPN apresentaram poros com diâmetro médio de 0,7675 µm (+ 2,0868), 0,9268 µm (+ 2,3331) e 1,0458 µm (+ 2,5211), respectivamente. A distribuição do tamanho de poros de cada CPE, é apresentada na figura 7. Número de poros (%) ,9 17,9 14,3 69,3 69,3 67,9 68,8 66,9 18,2 17,5 17,9 18,1 12,4 13,1 14,3 13,0 APS APN BPS BPN CPS CPN 17,6 15,5 Faixa a Faixa b Faixa c CPE s Figura 7 - Distribuição do tamanho de poros de acordo com análise de porosimetria de mercúrio. CONCLUSÃO O método de formação de poros pela adição de agentes que se decompõe com a temperatura, seguida pela conformação por prensagem isostática oferece corpos com porosidade uniforme e nas dimensões desejadas. Entretanto encontra-se uma enorme fração de poros pequenos que torna a superfície da fase densa irregular e com poros que sugerem micro trincas superficiais. O uso de naftaleno, empregado para a obtenção de poros nos CPE s, promoveu a formação de muitos poros de pequenas dimensões em torno de 1µm,

11 11 isto provavelmente devido a microfraturas durante o processo de prensagem e sua solubilidade com o solvente durante a mistura com a barbotina. Poros pequenos são indesejáveis, pois podem comprometer a resistência mecânica dos produtos. Os corpos fabricados a partir de sacarose resultaram em uma maior quantidade relativa de poros abertos e uma menor quantidade de poros pequenos. As morfologias dos poros encontradas nos corpos derivadas do naptaleno apresentaram forma com tendências esféricas e/ou oblongas quando comparados aos de sacarose. A análise das imagens de MEV, satisfez a necessidade de mensurar os diâmetros dos poros na faixa selecionada de 10 a 600 µm ou mais. Além disso, a classificação estabelecida de faixas de diâmetros de poros, demonstrou ser eficaz para classificar e diferenciar a formação de poros promovida por cada tipo de agente porogênico utilizado. A análise das amostras por porosimetria de mercúrio, satisfez a necessidade de mensurar os diâmetros dos poros menores de 10 µm. REFERÊNCIAS 1. FALLOPIUS, G. Opera omnia Francofurti. Weccheli A, de. v. 1, FISHER, J. P.; REDDI, A. H.; Chapter 8 Functional Tissue Engineering of Bone: Signals and Scaffolds in TOPICS IN TISSUE ENGINEERING vol 1 N. Ashammakhi e P. Ferretti, HENCH, L.L.; Bioceramics: from concept to clinic. Americam Ceramic Society Bulletin. vol. 72, n4, 1993, pp.93-98,. 4. BOSE, S. et al. Processing and characterization of porous alumina scaffolds. 5. Journal of materials science: materials in medicine. v. 13, (2002), pp. 3-28, 6. HULBERT, S. F.; COOKE, F. W.; Biomed. Mater. Symp. 1970, 4, LEE, et al. Patente Nο.: US 6,544,290 B1. Apr GOMIDE, V. S.; ZAVAGLIA C. A. C. Estudo da porosidade do compósito zircônia- hidroxiapatita através da análise por MEV para aplicação em implante craniomaxilofacial. Anais do III Congresso Latino Americano de órgãos artificiais e biomateriais. Campinas Brasil

12 12 9. HENCH, L. L.; ETHRIDGE, E. C.; In Biomaterials: an interfacial approach; Noordergraaf, A., Ed.; Academic Press; New York, 1982; p HULBERT, S. F.; YOUNG, F. A.; J. Biomed. Mater. Res. 4, 1970, LIU, D. M.; Influence of porosity and pore size on the compressive strength of porous hydroxyapatite. Ceramics International. n. 23, p KLAWITER et al. An evaluation of bone growth into porous high density polyethylene. Journal biomed. Mater. Res. v. 10, 1976, pp DACULSI, G.; PASSUTI N. Effect of the macroporosity for osseous substitution of calcium phosphate ceramics. Biomaterials. v.11, pp HULBERT, S. F. et al. In Ceramics in severe environments. Ed. W. W. Kriegel & H. Palmour, Palmour, Plenum Press, New York. 1971, p LÊ HUEC et al. Influence of porosity on the mechanical resistance of hydroxyapatite ceramics under compressive stress. Biomaterials. v. 16, 1995, pp MANUFACTURE OF CERAMIC SCAFFOLDS APPLICABLE TO TISSUE ENGINEERING ABSTRACT Tissue Engineering is concerned with the previous culture of cells with morphogenetics proteins grown factors in biomaterials Scaffolds (Structural Porous Bodies - CPE s) which simulate the extracellular matrix, offering support for the cellular growth in the formation of the mature tissue. This work studies the manufacture of alumina samples by the method of systematized incorporation of sugar cane and naphthalene particles as fugitive organic agents for pores generation, aiming the obtaining of specific porosities with size to volume relationship, morphology, connective porous and process repetitively. Alumina ceramic was selected due to its universal manufacture characteristics and its low cost. Scaffolds were characterized qualitative and quantitatively with relationship to the porous morphology and macrostructure using scanning electronic microscopy - SEM and porosity measurement. The viability of the selected manufacture methods was fulfilled by the obtaintion of desirable characteristics for the application proposal. Key Words: Structural porous bodies, Scaffolds, tissue engineering, ceramic, alumina.