Bolsista de iniciação científica FAPESP/EEL-USP, discente do curso de Engenharia Bioquímica

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1 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL DE CÉLULAS DE CANDIDA GUILLIERMONDII NA PRODUÇÃO DE XILOSE REDUTASE A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR 1 Thais S. S. Milessi, 2 Adriano S. L. Moraes, 3 Ricardo de F. Branco, 4 Sílvio S. da Silva 1 Bolsista de iniciação científica FAPESP/EEL-USP, discente do curso de Engenharia Bioquímica 2 Bolsista de iniciação científica PIBIC/EEL-USP, discente do curso de Engenharia Bioquímica 3 Bolsista de doutorado direto FAPESP/EEL-USP 4 Professor Doutor da Escola de Engenharia de Lorena - EEL-USP 1,2,3,4 Universidade de São Paulo Escola de Engenharia de Lorena (EEL - USP) Depto. de Biotecnologia Grupo de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos. Estrada Municipal do Campinho, s/nº, Lorena SP, Caixa Postal 116, CEP silvio@debiq.eel.usp.br RESUMO O estabelecimento de condições adequadas para a produção da enzima xilose redutase vem ganhando importância visto que esta enzima catalisa a conversão de xilose a xilitol. As vias tradicionais de obtenção deste poliálcool são compostas de processos que exigem etapas de purificação e de custos elevados, e uma possível produção enzimática depende da obtenção desta enzima. O presente trabalho teve por objetivo verificar a influência da concentração inicial de células de Cândida guilliermondii na produção de xilose redutase em biorreator de bancada em processo de batelada, utilizando hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como fonte e carbono. Foram realizadas fermentações variando-se apenas as concentrações de inóculo inicial (1 g.l -1 e 4 g.l -1 ). Observou-se uma diferença entre os ensaios na produção de xilose redutase. A máxima atividade específica da enzima (2,5 U.mg -1 ) foi observada no ensaio com 1 g.l -1 de células iniciais, enquanto no outro ensaio, uma atividade de 1,3 U.mg -1 foi obtida. Tal variação demonstra uma provável interferência do inóculo inicial empregado e ressalta a importância de seu estudo, uma vez que a otimização do processo de obtenção desta enzima é um fator crucial para que a produção enzimática de xilitol possa futuramente tornar-se viável. Palavras-Chave: xilose redutase, xilitol, produção enzimática INTRODUÇÃO Resíduos ou subprodutos lignocelulósicos, como por exemplo palha de arroz, cavaco de eucalipto, bagaço de cana-de-açúcar e sabugo de milho, ocasionam problemas de poluição e perda de valiosos recursos ao serem acumulados no ambiente. Uma alternativa para o aproveitamento destes materiais é seu uso como matéria prima de produtos de interesse industrial (Carvalho et al, 2003). No Brasil, um dos resíduos lignocelulósicos mais abundantes é o bagaço de cana-de-açúcar. No processamento da cana-de-açúcar são gerados cerca de 270 kg de bagaço por tonelada de matéria-prima, sendo que 50% do total de bagaço gerado destina-se à demanda de energia da usina sucroalcooleira (Frollini & Pimenta, 1997), o acúmulo do bagaço restante é considerado um problema ambiental, pois pode desencadear combustão espontânea, oferecendo riscos à usina e regiões vizinhas (Dawson et a,l 1990). Por se tratar de uma rica fonte de recursos naturais industrialmente reutilizáveis, vários estudos têm sido desenvolvidos em busca de uma utilização sustentável do bagaço de cana-deaçúcar. Este subproduto libera açúcares como xilose, glicose e arabinose quando submetido à um mecanismo de hidrólise, podendo ser utilizados como substrato em processos fermentativos na obtenção como o xilitol (Lavarack et al, 2002; Mosier et al., 2005). O Xilitol é um poliálcool, de fórmula molecular C 5 H 12 O 5, altamente solúvel em água, cuja estrutura encontra-se representada na Figura 3. Este composto possui grande importância nas indústrias alimentícia, odontológica e farmacêutica devido à interessantes propriedades, como poder adoçante, metabolismo independente de insulina e propriedades anticariogênicas (Gurpilhares et al, 2005). VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 Figura 3 - Fórmula estrutural do xilitol O xilitol é tradicionalmente produzido por via química envolvendo o emprego de altas pressões e temperaturas e ainda a necessidade de um alto nível de purificação tanto no upstream quanto no downstream (Branco et al., 2008). A produção biotecnológica deste composto apresenta grande potencial e vantagens em relação ao processo químico por apresentar um menor custo por não necessitar destas condições extremas (Canilha et al, 2008). Vias biotecnológicas alternativas vêm sendo amplamente estudadas, sendo a produção enzimática deste composto vista como uma tecnologia promissora. Para tal via de produção, pode-se empregar a xilose redutase de Candida guilliermondii FTI 20037, uma levedura que tem sido bastante relatada para a produção por via fermentativa deste poliálcool (Lima et al, 2004; Santos et al, 2005 Silva et al, 2005; Branco et al, 2006). A xilose redutase (XR, E.C ) é uma enzima intracelular responsável pela conversão bioquímica da xilose a xilitol (Branco et al, 2008), reação esquematizada na Figura 1. A XR, por possuir estrutura similar, é pertencente à família das aldoses redutases e está presente em algumas linhagens de leveduras e fungos filamentosos (Woodyer et al, 2005). Figura 1 - Reação catalisada pela xilose redutase, bioconversão de xilose a xilitol. Quanto à conformação espacial da xilose redutase, estudos recentes comprovaram que são possíveis diversos tipos de XR quanto à estrutura, podendo ser monomérica ou dimérica (Wilson et al, 2003). A enzima que se faz presente na Candida guilliermondii, segundo Cortez (2002), é composta por duas unidades, e possui massa molecular próxima a 37KDa. Outro microrganismo que possui em seu sistema enzimático a xilose redutase é a Candida tenuis, esta proteína, apresentada na Figura 2, foi proposta por Wilson (2003). Figura 2 - Modelo da holoenzima xilose redutase de Candida tenuis, segundo WILSON (2003) Assim sendo, estudos sobre a obtenção de XR vêm sendo desenvolvidos visando otimizar a obtenção desta enzima. Gurpilhares et al (2005), observaram significativa influência da concentração de inóculo em enzimas similares a xilose redutase. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da concentração de inóculo inicial na produção de xilose redutase pela levedura Candida guilliermondii FTI em biorreator de bancada utilizando hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado e tratado como fonte de xilose. MATERIAIS E MÉTODOS Obtenção do hidrolisado hemicelulósico O hidrolisado hemicelulósico foi obtido em reator de aço inox com capacidade de 30 litros equipado com camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica, localizado no Departamento de Biotecnologia da EEL. O bagaço foi percolado com H 2 SO 4 98 % de pureza como catalisador em uma razão de 100 mg de H 2 SO 4 por grama de matéria seca durante 10 minutos à temperatura de 121º C, empregando-se uma proporção de 1/10 entre massa seca de bagaço e volume da solução de H 2 SO 4 (ou sólido-líquido). O hidrolisado foi concentrado (fator de concentração igual a 2) sob pressão reduzida, a fim de se obter a concentração de xilose da ordem de 30 g.l -1, e tratado conforme a seguinte metodologia: 1ª.Fase: Elevação do ph até 7,0 com óxido de cálcio;

3 2ª.Fase: Redução do ph até 5,5 com ácido fosfórico; 3ª.Fase: Adição de carvão ativo na proporção 2,5% m/v, sendo a mistura mantida em incubadora de movimento rotatório a 200 rpm sob 30 C durante 1 hora. Após cada uma das fases do tratamento o hidrolisado foi filtrado à vácuo sendo, depois das três fases, autoclavado sob pressão manométrica de 0,5 atm (110 ºC) por 15 min. Tal metodologia foi estabelecida por Alves et al (1998). Fermentações Foram realizados ensaios fermentativos em reator de bancada BIOFLO III de 1,25 L, sob mesmas condições (30 ºC; ph 5,5; aeração de 1,0 vvm, 30 g.l -1 de xilose inicial, 10% v/v de extrato de farelo de arroz, 1g.L -1 de CaCl 2, 3g.L -1 de (NH 4 )SO 4 e 0,1% v/v de anti-espumante) variando-se apenas as concentrações de inóculo inicial (1g.L -1 e 4g.L -1 ). O hidrolisado hemicelulósico utilizado foi previamente tratado e o inóculo empregado foi preparado em meio sintético sob mesmas condições nutricionais a serem utilizadas nas fermentações e foi submetido em incubadora a 30ºC e 200 rpm durante 24 h. Obtenção do Extrato Enzimático As células microbianas foram rompidas sob agitação em vórtice com auxílio de pérolas de vidro em tubos cônicos de 15 ml de volume útil sob condições de rompimento pré-determinadas por Gurpilhares et al, Ao final, os fragmentos celulares (débris) foram removidos por centrifugação a x g por 15 minutos, sob 4 ºC. O sobrenadante foi retirado para os ensaios de atividade enzimática. Métodos analíticos Concentração celular: A concentração de células livres foi determinada por turbidimetria em espectrofotômetro BECKMAN 640B, a 600nm, e correlacionada com o peso seco de células (g.l -1 ) através de uma curva de calibração correspondente. As medidas foram feitas em suspensões celulares devidamente diluídas, após centrifugação, lavagem e ressuspensão das células em água destilada. Quantificação de açúcares: A determinação das concentrações de xilose foi verificada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em cromatógrafo SCHIMADZU-LC 10 AD, equipado com coluna BIO-RAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8mm), acoplado a um detector de índice de refração RID-6A, com eluente ácido sulfúrico 0,01N a um fluxo de 0,6 ml.min -1, temperatura da coluna de 45 ºC e volume de amostra injetado de 20µL. Antes de se efetuar as leituras em CLAE, as amostras foram filtradas em filtro Sep Pak C18. Atividades de XR: Para a determinação das atividades enzimáticas de XR foi usada a metodologia apresentada na Tabela 1. Tabela 1 Meio reacional para a análise da enzima Xilose redutase. Reagentes Quantidade Tampão TRIS/HCl de 350µL potássio 71 mm ph 7,2 Solução de NADPH+H + 0,24mM Solução de Xilose 0,5mM Extrato Enzimático 150µL Volume final 600µL *O branco da reação foi determinado com água destilada. Uma Unidade (U) de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 µmol de cofator por minuto à temperatura de 25 ºC. As atividades volumétricas são expressas em U.L -1 e as atividades específicas em U por miligrama de proteína (U.mg -1 ). As análises de proteínas totais foram realizadas pelo método de BRADFORD. RESULTADOS E DISCUSSÕES As atividades específicas de XR ao longo dos ensaios fermentativos encontram-se na Tabela 2. Tabela 2 Atividade de XR ao longo dos ensaios fermentativos Tempo de 1 g.l -1 fermentação (h) iniciais 4 g.l -1 iniciais (U.mg -1 ) (U.mg -1 ) 0 1,0 0,6 6 1,5 1,1 12 2,5 1,3 18 1,9 0,9 24 1,2 0,6 Sob essas condições observou-se uma considerável atividade específica de XR, desta maneira produção da enzima não foi prejudicada pelo emprego de hidrolisado hemicelulósico como matéria prima. Lima et al (2004) obtiveram atividade específica máxima de 0,75 U.mg -1 sob condições fermentativas semelhantes em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-deaçúcar. Tal diferença pode ser atribuída à procedência do bagaço utilizado como matéria prima. Observou-se uma diferença significativa na produção de XR entre as duas condições de

4 inóculo empregadas. A máxima atividade específica da enzima (2,5 U.mg -1 ) foi observada no ensaio com 1 g.l -1 de células iniciais, enquanto o ensaio com 4 g.l -1 apresentou uma atividade de 1,3 U.mg -1. Tal diferença encontra-se representada graficamente na Figura 4. Observa-se que a variação da concentração de inóculo inicial não ocasionou variação no consumo de xilose. Resultados semelhantes foram observados por Roberto et al (1996) que sob condições fermentatias semelhantes não observaram variação no consumo de xilose para diferentes valores de inóculo de Candida guilliermondii. O crescimento de biomassa ao longo das fermentações encontra-se detalhado na Figura 6, a partir da qual se observa que em ambos os ensaios a levedura cresceu livremente. Porém, é notável que no ensaio fermentativo com inóculo inicial de 4 g.l -1 houve um maior crescimento microbiano. Figura 4 Atividade específica da enzima xilose redutase ao longo das fermentações. Desta maneira, a concentração inicial de inóculo mostrou-se um possível fator influente na produção da enzima XR, e a concentração de 1g.L -1 mostrou-se mais favorável à obtenção da enzima. Resultados semelhantes foram obtidos por Gurpilhares et al (2005), onde uma menor concentração de inóculo inicial mostrou-se mais favorável á produção de glicose-6-fosfato desidrogenase. O consumo de xilose observado nos ensaios fermentativos está apresentado na Figura 5. Concentração (g/l) tempo (h) Xilose - Fermentação 1 Xilose - Fermentação 2 Figura 5 Concentração de xilose durante as fermentações 1 ( 1g.L -1 ) e 2 ( 4g.L -1 ). Concentração (g/l) Células - Fermentação 1 Células - Fermentação 2 Polinômio (Células tempo (h) Figura 6 Crescimento de biomassa durante as fermentações 1 (1g.L -1 ) e 2 (4g.L -1 ). Deve-se ressaltar que, em ambos os ensaios fermentativos, as atividades enzimáticas máximas foram observadas com 12 horas de fermentação. Para um aperfeiçoamento da produção de XR, novos estudos devem ser realizados utilizando planejamento de experimentos, uma vez que o inóculo inicial demonstrou ser uma possível variável significativa na obtenção da enzima. CONCLUSÃO A enzima xilose redutase possui grande potencial e viabilidade podendo ser obtida a partir de resíduos lignocelulósicos. A variação na obtenção da XR indica que o inóculo inicial provavelmente exerce significativa interferência em sua produção, merecendo ser melhor estudado com o emprego de planejamento experimental. A otimização do processo de obtenção da XR, por se tratar da enzima-chave do metabolismo de xilose em xilitol, é um fator crucial para que a produção enzimática de xilitol futuramente tornese viável.. Além disso, o estudo de enzimas de

5 leveduras como a Candida guilliermondii é uma ferramenta importante da Engenharia metabólica para a utilização da xilose na obtenção de produtos de interesse para a indústria biotecnológica. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVES, L.A.; FELIPE, M.G.A.; SILVA, J.B.A.; SILVA, S.S.; PRATA, A.M.R., Pre treatment of sugarcane bagasse hemicellulose hydrolisate for xylitol production by Candida guilliermondii, Applied Biochemistry and Biotechnology, 70/72, BRANCO, R.F.; SANTOS, J.C.; SARROUH, B.F.; RIVALDI, J.D.; PESSOA Jr., A.; SILVA, S.S., Profiles of xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylitol production under different oxygen transfer volumetric coefficient values, Publicado online na Wiley Interscience. BRANCO, R.F.; SANTOS, J.C.; MURAKAMI, L.Y.; MUSSATTO, S.I.; DRAGONE, G.; SILVA, S.S., Xylitol production in a bubble column bioreactor: Influence of the aeration rate and immobilized system concentration, Process Biochemistry, PR BI CANILHA, L.; CARVALHO, W.; FELIPE, M.G.A.; ALMEIDA e SILVA, J.B., Xylitol production from wheat straw hemicellulosic hydrolysate: hydrolysate detoxification amd carbon source used for inoculum preparation, Brazilian Journal of Microbiology, 39, CARVALHO, W.; SILVA, S.S.; SANTOS, J.C., CONVERTI, A., Xylitol production by Ca-alginate entrapped cells: comparison of different fermentation systems, Enzyme and Microbial Technology, 32, CORTEZ, E. V., PESSOA JR., A., FELIPE, M. G. A., ROBERTO, I. C., VITOLO, M., Optimized extraction by cetyl trimethyl ammonium bromide reversed micelles of xylose reductase and xylitol dehydrogenase from Candida guilliermondii homogenate, Journal of Chromatography B, 807 (1), CORTEZ, E. V., Extração líquido-líquido de xilose redutase e xilitol desidrogenase por micelas reversas, Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, São Paulo-SP (Tese de Doutorado), 144p. DAWSON, M., DIXON, T., INKERMAN, P., Proceedings of the Australian society of Sugar Cane Technologists, 199p. FROLLINI, F., PIMENTA, M. S. A., Lignin: Utilization as a macromonomer in the synthesis of phenolic type resins. Anais da Associação Brasileira de Química, 46 (1), GURPILHARES, D. B., HASMANN F. A., PESSOA Jr. A., ROBERTO I.C., Optimization of glucose-6-phosphate dehydrogenase releasing from Candida guilliermondii by disruption with glass beads, Enzyme and Microbial Technology, 39, GURPILHARES, D.B.; PESSOA JR., A.; ROBERTO, I.C., Glucose-6-phosphate dehydrogenase and xylitol production by Candida guilliermondii FTI using statistical experimental design, Process Biochemistry, 41, LAVARACK, B. P.; GRIFFIN, G. J.; RODMAN, D., The acid hydrolysis of sugarcane bagasse hemicellulose to produce xilose, arabinose, glucose and other products, Biomass and Bioenergy, 23, LIMA, L.H.A.; FELIPE, M.G.A.; VITOLO, M.; TORRES, F.A.G., Effect of acetic acid present in bagasse hydrolysate on the actiities of xylose reductase and xylitol dehydrogenase in Candida guilliermondii, Applied Microbial and Botechnology, 65, MOSIER, N., WYMAN, C., DALE, B., ELANDER, R., LEE, Y. Y., HOLTZAPPLE, M., LADISCH, M., Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technology, 96, ROBERTO, I.C.; SATO, S.; MANCILHA, I.M., Effect of inoculum level on xylitol production from rice straw hemicellulose hydrolysate by Candida guilliermondii, Journal of Industrial Microbiology, 16, SANTOS, J. C.; CONVERTI, A; CARVALHO, W; MUSSATO, S I; SILVA, S S., Influence of aeration rate and carrier concentration on xylitol production from sugarcane bagasse hydrolyzate in immobilized-cell fluidized bed reactor, Process Biochemistry, 40 (1), SILVA, D.D.V.; FELIPE, M.G.A.; MANCILHA, I.M.; SILVA, S.S., Evaluation of inoculum of Candida guilliermondii grown in presence of glucose on xylose reductase and xylitol dehydrogenase activities and xylitol production during batch fermentation of sugarcane bagasse hydrolysate, Applied Biochemistry and Biotechnology, , WILSON, D. K., KAVANAGH, K. L., KLIMACEK, M., NIDETZKY, B., The xylose reductase (AKR2B5) structure: homology and divergence from other aldo_/keto reductases and opportunities for protein engineering, Chemico-Biological Interactions, 143/144,

6 WOODYER, R.; SIMURDIAK, M.; VAN DER DONK, W.A.; ZHAO, H., Heterologous expression, purification and characterization of a highly active xylose reductase from Neurospora crassa, Applied and Enviromental Microbiology, 71 (3), AGRADECIMENTOS Agradecimentos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica da USP (Pibic).