PRODUÇÃO DE XILANASE E CELULASE PELO PATÓGENO Rizoctonia solani AG1-IA EM CULTURA DE SOJA

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1 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 17 PRODUÇÃO DE XILANASE E CELULASE PELO PATÓGENO Rizoctonia solani AG1-IA EM CULTURA DE SOJA XYLANASE AND CELLULASE PRODUCED BY PATHOGEN Rhizoctonia solani AG1-IA ISOLATED FROM SOY CROP Erica Aparecida de Oliveira Santos (1 ) Aline Aparecida Reis (2) Caroline de Lima Frachia (3) Paulo César Ceresini (4) Heloiza Ferreira Alves do Prado (5) Abstract The fungus Rhizoctonia solani AG - 1 IA is one of the most important pathogens affecting soybean in Brazil, causing the aerial or foliar blight. For a pathogen to infect a plant is that it must be able to penetrate and colonize the tissues of its host for the pathogen that is used to substances such as enzymes, toxins and hormones. The cellulolytic and hemicellulolytic enzymes produced by microorganisms have attracted great attention in the last decade, due particularity its biotech traits in various industrial processes such as food industries, animal feed, ethanol and pulp and paper. Thus these work strains of the fungus R. solani isolates from soybean from different regions of Brazil were analyzed. These were analyzed for enzyme production profile under solid state fermentation using wheat bran residue as substrate. Enzyme activities were determined for xylanase, CMCase and Avicelase. The best activity for xylanase enzyme obtained from isolated MT_S085 with 40,52 U g -1, after 96 hours of culture. Keywords: Fungi. Microbial enzymes. Pathogen. Xylanase. Rhizoctonia solani. 1 Doutoranda pela Univ. Estadual Paulista UNESP, Campus de São José do Rio Preto, Rua Cristovão Colombo nº 2265, São José do Rio Preto, , Brasil. (2) Mestranda pela Univ. Estadual Paulista UNESP, Campus de São José do Rio Preto, Rua Cristovão Colombo nº 2265, São José do Rio Preto, , Brasil. (3) Graduanda pela Univ. Estadual Paulista UNESP, Faculdade de Engenharia, Campus de llha Solteira, Avenida Brasil nº 56, Ilha Solteira, (4,5) Docentes da Univ. Estadual Paulista UNESP, Faculdade de Engenharia, Campus de llha Solteira, Avenida Brasil nº 56, Ilha Solteira, contato: eriquinhabb@gmail.com

2 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP Introdução Rhizoctonia solani é um fungo cosmopolita que habita o solo, com vasto número de hospedeiros, e causa importantes doenças na maioria das plantas cultivadas em todo o mundo. É uma espécie complexa, com muitos biotipos que diferem quanto à patogenicidade, aos hospedeiros, à distribuição na natureza e à aparência em meio de cultura (BOTELHO et al., 2001). O fungo Rhizoctonia solani pertencente ao grupo de anastomose 1 IA (AG-1 IA) e é um dos patógenos mais importantes afetando a cultura da soja no Brasil. Este fungo causa queima da folha e/ou mela em soja, para a qual medidas de manejo cultural são consideradas alternativas importantes para controle antes do estabelecimento da doença (BASSETO et al., 2007). Fungos fitopatogênicos (que causam doenças em plantas) produzem enzimas durante o processo de infecção, assim como fungos endofíticos (que colonizam as plantas de forma assintomática) produzem enzimas para penetrar na planta hospedeira ou durante a competição com fungos fitopatogênicos (ORLANDELLI et al., 2012). A enzima, uma vez elaborada, poderá atuar independentemente da célula que a produziu, mesmo in vitro, desde que o ph, a temperatura e o substrato, entre outros fatores, sejam adequados (COLEN, 2006). As enzimas apresentam características peculiares que favorecem seu emprego em processos biotecnológicos, sendo relevantes as vantagens de conversões enzimáticas nos processos industriais (COLEN, 2006). Enzimas degradadoras de parede celular de plantas (EDPCP) compreendem um grupo de enzimas que são produzidas por muitos organismos, a fim de desfazer o complexo estrutural presente na parede celular das plantas. A celulase e as hemicelulases são as enzimas de maior importância econômica para setor de papel e celulose, alem de sua utilização em varias processos biotecnológicos em diversas indústrias como de alimento, biocombustível, têxtil, farmacêutica, etc. Para essas indústrias, a aplicação de tecnologia enzimática reduz custos operacionais, aumenta a qualidade do produto, utilizando processos limpos que contribuem para diminuir os impactos ambientais (MAYRINK, 2010). 2. Objetivo Avaliar a produção de enzimas degradadoras de parede celular pelo patógeno Rhizoctonia solani, isolado a partir de culturas de soja.

3 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP Material e Métodos Nesse estudo foi realizado o cultivo de vinte e cinco isolados de Rhizoctonia solani AG-1 IA, os quais foram obtidos de culturas de soja. Estes fungos foram isolados de diferentes regiões do País como Roraima, Rondônia, Pará, Maranhão, Tocantins e Mato Grosso. A produção das xilanases, CMCases e avicelases extracelulares foram analisadas utilizando-se a fermentação em estado sólido (FES) que foi realizada em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 5,0 g de substrato, o qual foi umedecido com 5 ml de solução de minerais (1.5 g l -1 (NH 4 ) 2 SO 4, 2.0 g l -1 KH 2 PO 4, 0.3 g l -1 uréia, 0.03 g l -1 CaCl 2, 0.2 g l -1 MgSO 4.7H 2 O), visando um teor de umidade inicial em torno de 50%. Após a esterilização dos frascos, esse material sólido foi umedecido com solução salina, inoculado com a cultura microbiana e incubado a 25 C por 92h. Ao final da fermentação, a solução enzimática bruta foi extraída adicionando-se 40mL de água estéril em cada frasco e filtrando, obtendo uma solução livre de células, a qual foi utilizada para as análises enzimáticas. A determinação da atividade CMCase, avicelase e xilanase foram determinadas pela formação de açúcares redutores a partir dos substratos carboximetilcelulose, celulose microcristalina (avicel) e xilana, respectivamente. A mistura de reação contendo 0,25 ml da enzima bruta foi incubada a 40 C em banho maria com 0,225 ml de uma solução contendo 1,0% de substrato em tampão acetato 100 mm a ph 6,0. Após incubação a 40 C por 10 min., o açúcar redutor liberado foi quantificado pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) (MILLER, 1959). Os controles foram preparados com a adição da enzima após a adição do reagente DNS. 3. Resultados e Discussão No presente estudo pode-se observar a produção das enzimas celulolíticas e hemicelulíticas pelo fungo patógeno Rhizoctonia Solani (Tabela 1). A melhor atividade de xilanase foi obtida pelos isolados MT_S085, TO_064 e MA_159, respectivamente. A atividade CMCase foi maior para os isolados MT_S085, MT_S004 e TO_034, respectivamente. A atividade Avicelase foi maior para os isolados MA_217, TC98BR_S_053 e TC98BR_S_037, respectivamente.

4 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 20 Tabela 1. Isolados R. solani cultivado sob fermentação em estado sólido usando farelo de trigo como substratos, por 96 horas de fermentação. Linhagens Atividade enzimática (U g -1 ) Atividade enzimática (U g -1 ) Linhagens Xilanase CMCase Avicelase Xilanase CMCase Avicelase TC98BR_S_037 4,71 2,18 14,18 TO_058 10,03 3,45 13,47 TC98BR_S_053 11,72 5,03 18,38 TO_062 17,06 3,61 8,25 MT_S001 19,25 1,90 9,65 MA_192 14,03-0,08 6,96 MT_S_121 18,17 1,77 5,14 MA_217 14,87 2,28 33,11 MT_S004 11,89 12,62 9,04 MA_283 14,23 3,47 10,84 MT_S007 19,53 1,08 5,90 MT_S085 40,52 13,27 12,10 MT_S018 23,52 2,57 12,35 TO_064 30,30 2,50 3,21 PA_002 19,28 4,22 3,25 TO_136 13,90 2,97-2,57 MA_159 25,39 4,31 8,71 MA_278 20,43 0,34-1,66 MA_170 18,30 1,31 8,15 MA_275 1,95 0,34-0,94 TO_022 19,34 4,13 14,58 MA_281 13,62 5,00 6,21 TO_033 8,14 4,54 10,96 MA_005 8,38 0,51 2,99 TO_034 10,35 5,82 14,03 A atividade enzimática para xilanase foi alta quando comprada à outros trabalhos encontrados na literatura (Figura 1). Isto é um indicativo que R. solani tem um potencial para produzir bons níveis de xilanase. Figura 1. Isolados de Rhizoctonia solani que apresentaram maior produção enzimática (U g -1 ).

5 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 21 Alberton, 2004 obteve resultados inferiores aos observados nos ensaios aqui apresentados, uma vez que a atividade xilanase produzida por Schizophyllum commune quando cultivado sob fermentação em estado sólido, utilizando farelo de trigo como substrato foi de 22,70 U g -1, e em Trichoderma hamatumi foram obtidas 7,0 U g -1. Melhores resultados foram encontrados para a atividade de xilanase utilizando farelo de trigo como substrato para o fungo Trichoderma harzianum, 319 Ug -1 de xilanase, porém em 144 horas de cultivo, já o fungo Trichoderma polysporum teve a produção de 226,2 U g -1 de xilanase também em 144 horas de cultivo (DELABONA et al., 2009). Ruegger e Tornisielo (2004) obtiveram atividade de xilanase de até 232,8 U/g por linhagens de T. harzianum em FES utilizando farelo de trigo como substrato sem nenhuma suplementação. 4. Conclusão Linhagens fungicas de R. solani isoladas de culturas de soja, apresentam grande potencial na degradação de resíduos agroindustriais. Pelo seu baixo custo de produção torna-se economicamente importante para vários processos biotecnológicos em diversos pólos industriais.

6 X CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP 22 Referências ALBERTON, L. R. Produção de xilanase em resíduos agroindustriais por Streptomyces viridosporus T7A e aplicação do extrato bruto em veterinária f. Tese (Doutorado em Processos Biotecnológicos) Universidade Federal do Paraná, Curitiba-PR, BASSETO, M.A. CERESINI, P.C. VALÉRIO FILHO, W.V. Severity of the foliar blight of the soybean caused by Rhizoctonia solani AG-1 IA infunction of doses of potassium. Summa Phytopathologica, v.33, n.1, p.56-62, BOTELHO, S. A. RAVA, C. A. LEANDRO, W. M. COSTA, J. L. DA S. Supressividade natural de solos da região centro-oeste a Rhizoctonia solani Kühn. Pesquisa Agropecuária Tropical, v. 31, n.2, p , COLEN, G. Isolamento e seleção de fungos filamentosos produtores de lípases f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, DELABONA, P. da S. PIROTA, R. D. P. B. PINTO, G. A. S. FARINAS, C. S. Produção e celulases e xilanases por duas linhagens de Trichoderma visando a aplicação na produção de Etanol celulósico. In: CONGRESSO INTERNACIONAL DE BIOENERGIA, 4.; CONGRESSO BRASILEIRO DE GERAÇÃO DISTRIBUÍDA E ENERGIAS RENOVÁVEIS. 1., 2009, Curitiba. Anais... Curitiba: Fupef; UFPR, CD-ROM. ORLANDELLI, R. C. SPECIAN, V. FELBER, A. C. PAMPHILE, J. A. Enzimas de interesse industrial: produção por fungos e aplicações. SaBios: Rev. Saúde e Biol. v.7, n.3, p , MAYRINK, M. I. C. B. Produção de enzimas fúngicas e avaliação do potencial das celulases na sacarificação da celulose f. Tese (Doutorado em Bioquímica Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG, MILLER, G. L. Use of dinitrossalycilic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem., Washington, v. 31, p , RUEGGER, M. J. S.; TORNISIELO, S. M. T. Atividade da celulase de fungos isolados do solo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil. Revista Brasil. Bot., v. 27, p , 2004.