Doutora em Bioquímica pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. Endereço eletrônico: 6

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1 IMOBILIZAÇÃO DE COBRE COM ISOLADO BACTERIANO DE ÁREA DE MINERAÇÃO DETENTION OF COPPER BY AN INSOLATE OF MINING AREA. Michelli Inácio Gonçalves Funnicelli (1) Resumo Tatiane Fernanda Leonel (2) Erica Mendes Lopes (3) Camila Cesário Fernandes (4) Luciano Takeshi Kishi (5) Eliana G. de Macedo Lemos (6) A constante contaminação de solos e recursos hídricos por fontes antropogênicas tem se tornado uma importante preocupação ambiental, em especial, a contaminação por altas concentrações de metais pesados. A utilização de microrganismos em processos de recuperação de áreas contaminadas tem sido fundamental para o reestabelecimento destas áreas, já que os microrganismos são responsáveis pela manutenção ecológica de ciclos biogeoquímicos e constituem-se uma importante fonte de produtos naturais com grande potencial biotecnológico. O presente trabalho avaliou a capacidade de biorremoção e bioacumulação do isolado CP08 em meio PGE líquido suplementado com cobre nas concentrações de 0,35 mmol L -1 e 0,70 mmol L -1, para possível biorremediação em áreas contaminadas com cobre. Os resultados deste estudo demonstraram que o isolado CP08 (Bacillus sp), constitui-se um biossorvente com elevada capacidade na remoção de cobre em solução aquosa uma vez que essa remoção de íons metálicos pode ocorrer por compostos metabólicos extracelulares o que justifica altas taxas, entretanto os processos de acumulação são processos dependentes do metabolismo sendo processos mais lentos e com menor eficiência Palavras-chave: Metais pesados, Bactéria, Biotecnologia, Biorremediação Abstract The constant contamination of soil and water resources through anthropogenic sources has become a major environmental concern, where one of the characteristics of these contaminants is associated with high metal concentrations present in contamined environments. The use of microorganisms in contamined areas is a processes that has been extremely important in re-establishment of these areas. Microorganisms are responsible for ecological maintenance of biogeochemical cycles and constitutes an essential source of natural products with great biotechnological potential. This study evaluated the capacity of 1 Mestranda em Microbiologia Agropecuária pela Universidade de Ciência Agrárias e Veterinária - UNESP/JABOTICABAL. Endereço eletrônico: michelligf@gmail.com 2 Mestranda em Microbiologia Agropecuária pela Universidade de Ciência Agrárias e Veterinária - UNESP/JABOTICABAL. Endereço eletrônico: erica_mendeslopes@yahoo.com.br 3 Doutora em Microbiologia Agropecuária pela Universidade de Ciência Agrárias e Veterinária - UNESP/JABOTICABAL. Endereço eletrônico: erica_mendeslopes@yahoo.com.br 4 Doutora em Microbiologia Agropecuária pela Universidade de Ciência Agrárias e Veterinária - UNESP/JABOTICABAL. Endereço eletrônico: camila.fernandes@fcav.unesp.br 5 Doutora em Bioquímica pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP. Endereço eletrônico: egerlle@fcav.unesp.br 6 Doutor em Microbiologia Agropecuária pela Universidade de Ciência Agrárias e Veterinária - UNESP/JABOTICABAL. Endereço eletrônico: luciano.kishi@gmail.com

2 biorreduction and bioaccumulation of isolated CP08 in PGE liquid medium supplemented with copper in 0.35 mmol.l-1 and 0.70 mmol.l-1 concentrations for potential use in bioremediation in contamined areas with copper. The results showed that the isolated CP08 constitutes a biosorbent with high-performance in removal copper in aqueous solution,since such removal of metal ions can occur by extracellular metabolic compounds which justifies high rates though the accumulation processes are dependent metabolism processes are slower processes with lower efficiency Keywords: Heavy metals, Bacteria, Biotechnology, Bioremediation 1. Introdução A contaminação de solos e recursos hídricos por metais pesados tem sido uma importante preocupação ambiental e geralmente está associada a fontes antropogênicas, tais como, fundições, mineração, agricultura bem como a aplicação de pesticidas que contenham metais, fertilizantes, lodo de esgoto e rejeitos de atividades industriais (PEREIRA; LIMA; FIGUEIRA, 2006). O cobre (Cu) constitui-se um metal essencial, que em baixas concentrações é requerido como nutriente, é um componente importante no rastreio de uma variedade de oxidases,que juntamente com as proteínas de transferência eletrônica, está associada a muitas reações redoxes (MOHAMAD et al., 2012; BRUINS; KAPIL; OEHME, 2000). O metal cobre possui grande utilidade em diversas atividades e aplicações. No entanto, certos níveis de cobre podem ser tóxicos e poluentes para solos e águas, pois o Cu tem potencial de bioacumulação em tecidos vivos (MOHAMAD et al., 2012). Os microrganismos e compostos metabólicos gerados interagem com metais e seus compostos, sendo um processo dependente dos componentes estruturais gerados e de atividades metabólicas de seus compostos nos ambientes que eles se encontram. Os organismos vivos, em especial os microrganismos, estão intimamente associados com os ciclos biogeoquímicos e elementos associados, através de atividades que podem resultar na mobilização e imobilização dos metais dependendo do mecanismo envolvido e de microambiente onde o organismo está localizado (GADD, 2010). Devido às funções de manutenção dos ciclos bigeoquímicos, a capacidade adaptativa e a combinação dos potenciais genéticos e desenvolvimento de mecanismos associados a seleção, devido a pressão que o ambiente exerce sobre os microrganismos, estes constituemse de uma fonte de recursos biotecnológicos. Portanto, a biorremediação tem sido um processo alternativo que oferece a possibilidade de destruir ou tornar inofensivos vários contaminantes, usando atividade biológica natural a partir de microrganismos capazes de realizar esta atividade, através de reações como parte de seus processos metabólicos

3 (VIDALI, 2001). O presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de biorremoção e bioacumulação de cobre pelo isolado CP08, para possível utilização do mesmo em processo de biorremediação. 2. Material e Métodos 2.1 Biorremoção Capacidade de remoção de metais por células bacterianas Através do teste de resistência em diferentes concentrações de cobre (Cu 2+ ), cromo (Cr 6+ ) e níquel (Ni 2+ ), foram realizados com 19 isolados da área de preservação ambiental mantida pela VALE S.A., conhecido como Centro de Conservação e Pesquisa em Biodiversidade (CEBIO), localizado na região de Sabará, MG, Brasil. O isolado CP08, foi selecionado para o presente estudo de imobilização, por apresentar maior tolerância às concentrações testadas anteriormente (FUNNICELLI et al, 2015). Este isolado foi identificado como Bacillus sp. e foi submetido ao crescimento bacteriano em meio PGE líquido suplementado com Cu 2+ nas concentrações de 0,35 mmol L -1 e 0,70 mmol L -1, mantidos sob agitação constante, em agitador orbital a 140 g, 28 C por 144 h, todos os testes foram feitos em triplicata. As células foram centrifugadas nos tempos de 48, 96, 144 h para avaliar a capacidade de acumulação. As análises de biorremoção foram realizadas com o sobrenadante com concentrações de células de aproximadamente 0,1 g L -1 de peso seco, as amostras foram agitadas a 150 g a 28 C por 144 h e posteriormente submetidas à digestão nitroperclórica, diluindo 50x. (MOHAMAD et al., 2012; XIE et al., 2013). A concentração residual de Cu 2+ no sobrenadante foi determinada por espectrometria de absorção atômica AAS, nos tempos de 48, 96 e 144 h após centrifugação a g durante 10 min. Os valores da capacidade de biorremoção e taxa de remoção de Cu 2+, foram avaliados da seguinte forma (CHEN et al., 2008): onde qe é a capacidade de biorremoção do Cu 2+ pelas células do isolado bacteriano (mg g -1 ); C0 é a concentração inicial de íon metálico (mg L -1 ); Ce é a concentração residual do metal na solução em equilíbrio com o biossorvente (mg L -1 ) Capacidade de acumulação de metal por células bacterianas

4 Para os ensaios da capacidade de bioacumulação do isolado CP08 alíquotas do item 1.1 foram separadas nos tempos de 48, 96 e 144 h de cultivo e centrifugadas a g. As células foram lavadas e submetidas à digestão nitroperclórica, diluindo-se 50x. O conteúdo da digestão foi submetido à leitura por espectrofotômetro de absorção atômica ASS para avaliar a presença de íons metálicos. 2.2 Análise estatística Os dados obtidos dos padrões de comparação dos processos de remoção e da capacidade de acumulação foram analisados pelo Software R, submetidos à análise de variância ANOVA e ao teste de Tukey a 5% de probabilidade, para comparação entre médias de tratamento. 3 Resultados e Discussão Os solos de Sabará-Minas Gerais apresentam grande concentração de metais, visto que sua localização compreende a região do qualdrilátero ferrífero, consistindo-se num habitat com grande potencial para busca de organismos que apresentam resistência para remoção de metais. O isolado CP08 (Bacillus sp), pertencente a área de solo de rejeito de mineração com capim da região do CEBIO, apresenta resistência ao cobre em concentrações tóxicas, por isso pode ser utilizado para aplicação na imobilização de íons metálicos, como pode ser visto na Tabela 1. Tabela 1 - Valores médios da taxa de remoção de cobre no sobrenadante nas concentrações de 0,35 mmol L -1 e 0,70 mmol L -1 nos tempos de 48, 96 e 144 (Tukey 0,05% e ANOVA). Concentração Cu² Taxa de remoção (%) Tempo (h) ,35 mmol L -1 99,99 ± 0,0004 a 99,99 ± 0,00004 ab 99,99 ± 0,0002 ab 0,70 mmol L -1 99,99 ± 0,0003 ab 99,99 ± 0,0001 b 99,99 ± 0,0004 b ** p<0,01; * p<0,05; ns p0,05; Resultados repetidos de letras iguais, dentro do mesmo fator, não diferem entre si pelo Teste de Tukey (p0,05). Os resultados de biorremoção apresentados na Tabela 1 demonstraram que a taxa de remoção de cobre no sobrenadante foi elevada, com 99,99% de remoção para todos os tempos e concentrações avaliadas, constatando-se a elevada eficiência do isolado CP08 como biossorvente de cobre. Na Tabela 2, são apresentados os resultados de bioacumulação de cobre em células. Na concentração de 0,35 mmol L -1 a acumulação do metal na célula foi maior, comparada a

5 concentração de 0,70 mmol L -1, o que indica uma possível saturação dos sítios de ligação do metal a superfície das células, impedindo a acumulação intracelular. Em geral, as atividades metabólicas de todos os microrganismos afetam a distribuição de metal e biodisponibilidade, em virtude da essencialidade metabólica de muitos metais e a existência de mecanismos bioquímicos específicos para a sua acumulação celular, decomposição e biodeterioração de substratos orgânicos e inorgânicos (GADD, 2010). Tabela 2 - Valores médios de bioacumulação de cobre nas células do isolado CP08 nas concentrações de 0,35 mmol L -1 e 0,70 mmol L -1 nos tempos de 48, 96 e 144 h (Tukey 0,05% e ANOVA). Concentração Cu² Bioacumulação (mg ml -1 ) Tempo (h) ,35 mmol L -1 0,00039 ± 0,00001 a 0, ± 0, a 0, ± 0, a 0,70 mmol L -1 0, ± 0, b 0, ± 0, b 0, ± 0, b ** p<0,01; * p<0,05; ns p0,05; Resultados repetidos de letras iguais, dentro do mesmo fator, não diferem entre si pelo Teste de Tukey (p0,05). 4 Conclusões O isolado CP08 possui elevada capacidade na remoção de cobre em solução aquosa e acumula o metal numa concentração de até 0,70 mmol L -1, a partir do exposto, conclui-se que este isolado apresenta potencial para aplicação em processo de remoção de íons metálicos, principalmente o cobre, sugerindo assim, sua aplicabilidade em processos de biorremediação de áreas contaminadas. 5 Agradecimentos/Apoio financeiro Os autores agradecem o Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP), do Departamento de Tecnologia da FCAV/UNESP e o CNPq por ter concedido a bolsa de iniciação científica. Referências BRUINS, Mark R.; KAPIL, Sanjay; OEHME, Frederick W. Microbial resistance to metals in the environment. Ecotoxicology and environmental safety, v. 45, n. 3, p , GADD, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology, v. 156, n. 3, p , CHEN, W.M., WU C.H., JAMES E.K., AND CHANG. J.S. Metal biosorption capability of Cupriavidus taiwanensis and its effects on heavy metal removal by nodulated Mimosa pudica. J. Hazard. Mater. v.151, p , FUNNICELLI, M. I. G; LOPES, E. M; CAPANHARO, J. C; LEMOS, E. G. L; KISHI, L. T. AVALIAÇÃO DE BACTÉRIAS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE CROMO, COBRE E NÍQUEL.Ciência & Tecnologia, v. 7, n. esp., 2015.

6 GADD, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology, v. 156, n. 3, p , MOHAMAD, O. A.; HAO, X.; XIE, P.; HATAB S.; LIN Y.; WEI, G. Biosorption of Copper (II) from Aqueous Solution Using Non-Living Mesorhizobium amorphaestrain CCNWGS0123. Microbes Environmental, v.27, n.3, p , PEREIRA, S. I.; LIMA, A. I.; FIGUEIRA, E. M. Heavy metal toxicity in Rhizobium leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal contamination: Effects on protein expression. Appl. Soil Ecology. v.33, p , VIDALI, M. Bioremediation. An overview: Pure and Applied Chemistry, v. 73, n. 7, p , 2001 XIE, P.; HAO, X.; MOHAMAD, O.A.; LIANG, J.; WEI, G Comparative Study of Chromium Biosorption by Mesorhizobium amorphae Strain CCNWGS0123 in Single and Binary Mixtures. Appl Biochem Biotechnol. v.169, p , 2013.