PALAVRAS-CHAVE: Compostos fenólicos. Cultivares. Leguminosa.

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1 INFLUÊNCIA DO MELHORAMENTO GENÉTICO CONVENCIONAL SOBRE A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS ETANÓLICOS DE COMPOSTOS FENÓLICOS DO FEIJÃO CAUPI (VIGNA UNGUICULATA (L.) WALP) RESUMO Daisyvângela E. da S. Lima 1 Nonete Barbosa Guerra 2 Enayde de Almeida Melo 3 Clodoaldo José da Anunciação Filho 4 Considerando que o consumo de vegetais encontra-se associado à redução do risco de algumas doenças degenerativas e que o produto resultante do melhoramento genético (Esperança) pode apresentar características superiores aos grãos convencionais (IPA-2006 e Riso do Ano), especialmente no que se refere à atividade antioxidante dos compostos. Fenólicos. Esta pesquisa foi realizada com o objetivo de avaliar a influência do melhoramento genético sobre a atividade antioxidante dos compostos fenólicos presentes no feijão caupi, assim como estabelecer comparações entre as cultivares utilizadas no melhoramento genético e produto resultante. A atividade antioxidante das cultivares de feijão foi realizada por duas metodologias distintas: Oxidação acoplada do β-caroteno e ácido linoléico e capacidade de seqüestrar o radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazina (DPPH). Comparando os resultados obtidos com o DPPH e β-caroteno e ácido linoléico utilizados para a determinação da atividade antioxidante dos feijões, constatou-se diferenças. Pode-se concluir que, independente do conteúdo de fenólicos totais a atividade antioxidante das amostras foi semelhante nas três cultivares estudadas. PALAVRAS-CHAVE: Compostos fenólicos. Cultivares. Leguminosa. 1 INTRODUÇÃO O caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp), é uma dicotiledônea, pertencente à ordem Rosales, família 1 Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolinae e gênero Vigna contendo cerca de 160 espécies (ARAÚJO e WATT, 1988). Esta leguminosa recebe denominações variadas de acordo com a região: feijão de corda, feijão macassar, feijão pardo, feijão de vara, feijão de vaca. Constitui uma importante fonte protéica na dieta de uma considerável parcela da população brasileira, especialmente dos nordestinos, onde o consumo de proteína animal é limitado devido a razões econômicas (FURTUNATO, MAGALHÃES e MARIA, 2000). 1. Técnica e Graduada em Economista Doméstico, Mestra em Nutrição/UFPE e Professora Assistente do Departamento de Ciências Domésticas/UFRPE. Avenida Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, Recife, PE. daisyvangela@yahoo.com.br 2. Graduada em Nutrição, Doutora em Ciências dos Alimentos/USP e Professora Colaboradora da Pós- Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos do DCD/UFRPE. 3. Graduada em Nutrição, Doutora em Nutrição e Professora Associada do Departamento de Ciências Domésticas/UFRPE. 4. Graduado em Engenharia Agronômica, Professor do Departamento de Agronomia/UFRPE. 1

2 Tradicionalmente é consumido seco ou verde integrando sob esta última forma um prato regional, nacionalmente apreciado e difundido: carne de sol com feijão verde, estádio no qual os grãos encontram-se imaturos, com coloração verde e sabor levemente adocicado. A combinação das características supracitadas, a rápida perecibilidade e distinta coloração do grão, em função do estádio de maturação motivaram a implantação de pesquisas no Departamento de Agronomia da UFRPE, tendo em vistas a obter um melhoramento genético que conferisse ao grão maduro seco uma cor verde e maior resistência a pragas e doenças. A metodologia empregada baseou-se na transferência de gens das cultivares bettergreem e freezergreem responsáveis pela cor verde do cotilédone e de tegumentos. A nova linhagem resultante, além de apresentar aspecto mais atrativo para os consumidores/as demonstrou ter uma maior produtividade. Pesquisas têm claramente demonstrado que uma dieta rica em grãos encontra-se associada a benéficos efeitos a saúde incluindo redução de incidência de doenças cardíacas, certos tipos de câncer e diabete do tipo 2. Resta, no entanto, obter respostas quanto a possível influência deste melhoramento sobre a atividade antioxidante dos compostos fenólicos presentes no feijão caupi que foram objeto desta pesquisa. Assim como estabelecer comparações entre as cultivares utilizadas no melhoramento genético e produto resultante. 2 REVISÃO DE LITERATURA Dentre os diferentes produtos agrícolas encontrados nas regiões tropicais, o feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp.), se destaca pelo alto valor nutritivo, além do baixo custo de produção. É amplamente cultivado pelos pequenos produtores/as, constituindo um dos principais componentes da dieta alimentar, especialmente na zona rural (FROTA, SOARES e ARÊAS 2008). O consumo de vegetais tem sido associado a uma dieta saudável. Além do seu potencial nutritivo, estes alimentos contêm diferentes fitoquímicos bioativos, como carotenóides e os compostos fenólicos muitos dos quais desempenham funções biológicas, com destaque para aqueles com ação antioxidante (VELIOGLU, et. al. 1998). Estudos têm demonstrado que a presença de compostos fenólicos tem contribuído para a total capacidade antioxidante dos vegetais (MARTINEZ-VALVERDE, PERIAGO e ROS, 2000). Compostos fenólicos são fotoquímicos que apresentam em sua estrutura um anel aromático com uma ou mais hidroxilas e geralmente apresentam propriedades antioxidantes (BOBBIO e BOBBIO, 2001; MÉLO, 2002). Dentre eles destacam-se os flavonóides (antocianians, flavónois, flavanóis, flavononas, isoflavonas), os ácidos fenólicos (derivados do ácido hidroxicinâmico destacando-se os 2

3 ácidos caféico, ferrúlico, sináptico, p-cumárico; e derivados do ácido hidroxibenzóico, destacando-se os ácidos vanílico, siríngico, gentísico, salicílico, eglágico, gálico), o tocoferol como os mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural (SHAHIDI e WANASUNDARA, 1992; BOBBIO e BOBBIO, 2001; MÉLO, 2002). Dentro do grupo dos polifenóis podem ser citados os taninos, glicosídios amplamente distribuídos em vegetais (VILLAVICENCIO, 2000). São substâncias não cristalinas, de cores que podem variar de branco ao marrom claro, e que formam com água soluções coloidais. Os taninos encontrados em maior quantidade e de maior importância em alimentos são os denominados de taninos condensados. A estrutura química básica dos taninos condensados é relacionada à estrutura da catequina (LAJOLO et. al., 1996; BOBBIO e BOBBIO, 2001). Em leguminosas, os taninos são os polifenóis de maior importância, pois além de possíveis efeitos sobre a disponibilidade de minerais, a sua importância nutricional parece estar mais associada à sua influência sobre a digestibilidade das proteínas. Os taninos do feijão possuem a capacidade de formar complexos com a faseolina in vitro, basicamente por meio de interações hidrofóbicas, produzindo uma diminuição significativa na digestibilidade dessa proteína, tanto na forma nativa como na desnaturada, mesmo em concentrações elevadas de proteases (LAJOLO et. al., 1996). O conteúdo de polifenóis em leguminosas varia de acordo com a coloração da casca onde se encontram. Em feijões marrons, pretos, vermelhos e brancos, o teor médio foi de 7,8; 6,6; 12,6 e 2,3 mg/g de equivalentes de catequina, respectivamente (BRESSANI, 1993) 2. METODOLOGIA 2.1. Material Os feijões das cultivares IPA (feijão mulato), Esperança (feijão verde geneticamente modificado), Riso do Ano (feijão branco) em um mesmo estádio de maturação foram cedidos pelo Departamento de Agronomia UFRPE, imediatamente transportado ao Laboratório de Experimentação e Análises de alimentos (LEAAL) do Departamento de Nutrição da UFPE Métodos Preparo das amostras 3

4 Foram trituradas, tamisadas de 80 mesh, e a farinha uniforme resultante armazenada, para a realização dos ensaios analíticos Determinação da Atividade Antioxidante dos compostos fenólicos O extrato etanólico foi obtido por processo de extração seqüencial. Os feijões caupi (mulato, verde geneticamente modificado e branco) desidratados (15g) foram mantidos por 60 minutos, sob agitação, em álcool etílico a 80%, a temperatura ambiente (25 C) e em seguida filtrado. Foi procedida a remoção parcial do solvente utilizado para a obtenção do extrato etanólico, sob pressão reduzida a 55 C. Os extratos foram centrifugados a 4000 rpm por 15 minutos para a separação dos resíduos sólidos restantes. O sobrenadante foi aferido com a solução extratora (etanol 80%) para um volume de 50 ml e colocados em tubos âmbar, fechados e mantidos sob congelamento ( 18 C), até o momento das análises Atividade Antioxidante A atividade antioxidante foi realizada por duas metodologias distintas conforme a seguir. a) Oxidação acoplada do β-caroteno e ácido linoléico, segundo metodologia descrita por Marco (1968), modificada por Hammerschmidt e Pratt (1978), como segue: A solução de β-caroteno (4 ml), preparada pela dissolução de 10 mg de β-caroteno em 25 ml de clorofórmio, foi colocada em um balão de fundo redondo, contendo 80mg de ácido linoléico e 800mg do emulsificante Tween 20. Após a remoção do clorofórmio, em evaporador rotatório a 50 C, 200 ml de água destilada foram adicionados sob agitação vigorosa. Alíquotas (5 ml) desta emulsão foram transferidas para uma série de tubos de ensaios contendo 0,2 ml do extrato dos feijões mulato, verde modificado e branco, com concentração de fenólicos totais de 98, 21, 30,71 e 21,62mg, respectivamente. Em seguida os tubos foram colocados em banho-maria a 50 C e, após 105 minutos, a absorbância foi lida a 470nm. A atividade antioxidante, expressa como percentual de inibição da oxidação, foi calculada em relação a 100% da oxidação do controle (sem antioxidante). b) Capacidade de seqüestrar o radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazina (DPPH), segundo método descrito por Brand-Williams et. al. (1995), modificado por Miliauskas et. al. (2004). Alíquotas (0,2ml) dos extratos etanólicos dos feijões mulato, verde modificado e branco, com concentrações de 4

5 fenólicos totais de 98, 21, 30,71 e 21,62mg, respectivamente foram colocadas em diferentes tubos de ensaio. Em seqüência, 3,9 ml da solução de DPPH em metanol ( M) foram adicionados e, após agitação, os tubos foram deixados em repouso ao abrigo da luz. Ao final de 15, 30, 45 e 60 minutos a absorbância foi medida a 517 nm e a atividade antioxidante expressa como percentual de inibição, calculada em relação a 100% da oxidação controle (sem antioxidante). Como termo de comparação foi utilizado a atividade antioxidante do BHT (100mg/ml) determinada nas mesmas condições dos dois ensaios acima descritos. 3 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todas as determinações foram efetuadas em triplicata. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e Teste de Tukey ao nível de significância de 5%, utilizando o programa estatístico "STATISTICA for Windows". 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Ao utilizar a metodologia, oxidação acoplada do β-caroteno e ácido linoléico para avaliar a capacidade antioxidante das cultivares IPA-206, Riso do Ano e Esperança foi obtido os seguintes percentuais de inibição 66,80; 64,29 e 61,07% respectivamente (gráfico 1). % de Inibiçaõ da oxidação IPA-206 Esperança Riso do Ano BHT Gráfico 1. Atividade antioxidante de extratos etanólicos de feijões mulato, verde geneticamente modificado e branco, contendo 98, 21, 30,71 e 21,62mg de fenólicos totais/ 0,2 ml, respectivamente, determinada pelo método de oxidação acoplada do β-caroteno e ácido linoléico 5

6 Constatou-se mais uma vez a inexistência de diferenças significativas entre a atividade antioxidante das amostras e que todas foram inferiores a do BHT. Cardador-Martínez, Loarca-Pina. e Oomah (2002), utilizando esta mesma metodologia para avaliar a capacidade antioxidante de extratos metanólicos de feijões sem casca encontraram reduzido percentual, 15,3, 7,2 3,2 e 1,2% de inibição, enquanto que os resultados os extratos metanólicos das cascas destes feijões alcançaram 44,1, 31,6, 31,9 e 16,6% de inibição. Os teores de fenólicos determinados para estas frações foram 12mg/g e de 55,30mg/g em equivalente de catequina para os cotilédones decorticados e cascas respectivamente. Evidencia-se, portanto, que a casca é a principal fonte de polifenóis responsáveis pela atividade antioxidante dos feijões. As diferenças encontradas nas quantidades destes compostos encontram-se relacionadas às técnicas de cultivo, às características genéticas da planta e a cor do tegumento. Acredita-se, portanto que nos cultivares Riso do Ano e Esperança existam outros fenólicos em maior concentração, pois se sabe que em vegetais são encontrados vários tipos de compostos fenólicos, a exemplo de flavonóides, ácidos fenólicos, taninos entre outros. Comparando os resultados obtidos com o DPPH e β-caroteno e ácido linoléico utilizados para a determinação da atividade antioxidante dos feijões, constatou-se diferenças. Embora o sistema DPPH tenha apresentado valores mais elevados Giada e Mancini-Filho (2004) ressalta limitações deste ensaio decorrentes do fato do radical DPPH interagir com outros radicais (aquil) e da curva resposta/tempo para atingir o estado constante que não é linear com diferença proporção antioxidante. Por outro lado Koleva et. al. (2004), referem que o exato mecanismo do antioxidante no sistema β-caroteno e ácido linoléico é de difícil explicação, especialmente matrizes complexas, como os extratos de vegetais. Aos compostos fenólicos é atribuída uma considerável ação antioxidante por serem excelente doadores de hidrogênio, originando um radical estável (fenoxil). Esta função é dependente da estrutura molecular e, mais especificamente da posição e do grupo grau de hidroxilação do anel aromático que de acordo com Shahidi; Janitha; Wanasundara (1992) e Ou et. al. (2002), têm influência direta sobre a atividade antioxidante destes compostos. Considerando a importância desta propriedade na redução do radical livre foi medida a capacidade dos extratos etanólicos dos feijões caupi em seqüestrar o radical DPPH, expressa em percentual de inibição cujos resultados encontram-se no gráfico 1. Com base nestes dados evidencia-se que a ação do (s) composto (s) dos extratos não foi diferenciada, não obstante os diferentes teores de fenólicos totais determinados para as amostras. Aos 15 minutos todas as amostras apresentaram um percentual de inibição da oxidação, superior a 70%. Observa-se que estes feijões diferem estatisticamente do 6

7 antioxidante sintético BHT o qual apresentou 89,00% de inibição. Entre 30 e 45 minutos ocorreu uma elevação para 78,98 a 83,21% de inibição sendo o máximo alcançado aos 60 minutos quando a ação seqüestrante foi comparável a do BHT diferindo, portanto do registrado nos tempos anteriores nos quais este antioxidante apresentava significativa diferença em relação aos demais. 100 Capacidade de sequestrar radical DPPH (%) min 30min 45min 60min IPA-206 Esperança Riso do Ano BHT tempo da reação (min) Gráfico 2. Atividade antioxidante de extratos etanólicos de feijões mulato, verde geneticamente modificado e branco, contendo 98, 21, 30,71 e 21,62mg de fenólicos totais/ 0,2 ml, respectivamente, determinada pelo método de DPPH. Este método também foi utilizado por Cardador-Martínez, Loarca-Pina e Oomah (2002), que evidenciaram uma maior ação antioxidante nos extratos metanólicos das cascas dos feijões (>60% de inibição). Embora vários autores tenham demonstrado de forma conclusiva que existe uma forte relação positiva entre o teor de fenólicos totais e a atividade antioxidante de feijões os resultados obtidos nesta pesquisa ratificam os de Heinonen, Lehtonen e Hopla (1998) os quais afirmam que a atividade de um extrato não pode ser explicada apenas com base em seu teor de fenólicos totais, requer também a caracterização da estrutura dos compostos ativos. 5 CONCLUSÃO Os resultados obtidos nas condições na qual este trabalho foi desenvolvido permitem concluir que, independente do conteúdo de fenólicos totais a atividade antioxidante das amostras foi semelhante nas três cultivares estudadas. 7

8 REFERÊNCIAS ARAÚJO, J. P. P.; WATT, E. E. O caupi no Brasil. Brasília: Embrapa, p. BOBBIO, P. A.; BOBBIO, F. O. Química do Processamento de Alimentos. 30 ed. Varela: São Paulo. 143p BRESSANI, R. Grain quality of common beans. Food Reviews International, New York, v. 9, p , CARDADOR-MARTÍNEZ, A.; LOARCA-PINA, G.; OOMAH, B. D. Antoxidant activity in common beans (Phaseolus vulgaris L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. v.50, p FROTA, K. M. G.; SOARES, R. A. M.; ARÊAS, J. A. G. Composição química do feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp), cultivar BRS-Milênio. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Jun 2008, vol.28, no.2, p FURTUNATO, A. A; MAGALHÃES M. M. dos A; MARIA, Z. L. Estudo do feijão verde (Vigna unguiculata (L) Walp) minimamente processado. Ciência e Tecnologia de Alimentos. V.20 nº.3, p GIADA, M. L. R.; MANCINI-FILHO, J. Avaliação da atividade antioxidante in vitro de compostos fenólicos de alimentos. Nutrire: Revista Sociedade Brasileira de Alimentos e Nutrição. São Paulo, v.28, p MAIA, F. M. M. et. al. Caracterização bioquímica e nutricional de genotipos de Vigna unguiculata, (L.) Walp. Geneticamente melhorados e não melhorados. In: Avanços Tecnológicos no feijão caupi, 5, 2001, Teresina. Anais... Teresina: Embrapa Meio-Norte, 2001, p MARTIÍNEZ-VALVERDE, I.; PERIAGO, M. J.; ROS, G. Significado nutritional de los compuestos fenólicos de La dieta. Archivos Latinoamericanos de Nutrition, v. 50, n.1, p MÉLO, E. A. Ação antioxidante de compostos fenólicos naturalmente presentes em alimentos. Boletim, SBCTA, Campinas, v.36, p.1-11, OU, B.; HUANG, D.; HAMPSCH-WOODILL, M.; FLANAGAN, J. A.; DEEMER, E. K. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity 8

9 (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: a comparative study. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v.50, p , SHAHIDI, F.; JANITHA, P. K.; WANASUNDARA, P. D. Phenolic antioxidants. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. Vol.32, n. 1, p VELIOGLU, Y.S.; MAZZA, G.; GAO, L.; OOMAH, B. D. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables, and grain products. Journal. Agricultural Food Chemistry. n. 46, v.10, p