Laura Lúcia dos Santos Oliveira

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PARASITOLOGIA Laura Lúcia dos Santos Oliveira Dinâmica das infecções helmínticas em ovinos submetidos a diferentes tratamentos anti-helmínticos na região Norte de Minas Gerais, Brasil, e avaliação da atividade dos extratos de Momordica charantia e Calotropis procera como anti-helmíntico Belo Horizonte - MG 2014

2 Laura Lúcia dos Santos Oliveira Dinâmica das infecções helmínticas em ovinos submetidos a diferentes tratamentos anti-helmínticos na região Norte de Minas Gerais, Brasil, e avaliação da atividade dos extratos de Momordica charantia e Calotropis procera como anti-helmíntico Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito para obtenção do grau de Doutora Orientador: Prof. Dr. Walter dos Santos Lima Belo Horizonte MG 2014

3 043 Oliveira, Laura Lúcia dos Santos. Dinâmica das infecções helmínticas em ovinos submetidos a diferentes tratamentos anti-helmínticos na região Norte de Minas Gerais, Brasil, e a avaliação da atividade dos extratos de Momordicacharantia e Calotropisprocera como anti-helmíntico [manuscrito] / Laura Lúcia dos Santos Oliveira f. : il. ; 29,5 cm. Orientador: Walter dos Santos Lima. Tese (doutorado) Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas. 1. Epidemiologia - Teses. 2. Fitoterapia. 3. Matéria médica vegetal Teses. 4. Haemonchus contortus - Teses. 5. Ovino - Teses. 6. Terapia helmíntica. 7. Parasitologia Teses. I. Lima, Walter dos Santos. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III. Título. CDU: /.89

4 À minha família Dedico

5 AGRADECIMENTOS Ao suporte financeiro da FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais) e CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior).

6 AGRADECIMENTOS A Deus por ter me proporcionado mais uma conquista. Ao meu marido, Fredson, pelo companheirismo e incentivo. E ao meu filho Pedro por ter chegado durante essa trajetória e ter sido o meu grande estimulo a cada dia. Aos meus pais, Laurizete e Francisco; aos meus irmãos Mel e Thesco, pela confiança e pelo apoio em tudo. Ao meu orientador, Prof. Walter dos Santos Lima, que foi fundamental na minha formação profissional. Obrigada pelos ensinamentos e pela compreensão. À professora Maria das Graças Lins Brandão, pela disponibilidade e contribuição a pesquisa. Aos membros da banca, Eduardo Robson Duarte, Maria das Graças Lins Brandão, Marcos Pezzi Guimarães e Ricardo Nascimento Araújo pela grande contribuição a este trabalho. Ao Programa de Pós-graduação em Parasitologia, pela oportunidade. Aos professores do Departamento de Parasitologia, em especial ao Prof. Marcos Pezzi Guimarães, Prof. Ricardo Fujiwara, Profª Debora Negrão e aos funcionários Hudson, Maria, Sumara e Sibele pela disponibilidade, ensinamentos e colaboração. Aos colegas do Programa de Pós-graduação, em especial a Paula, Lanuze, Aytube, Ruth, Tiago, Susy pelo companheirismo e amizade. Ao Laboratório de Helmintologia Veterinária/ICB/UFMG, em especial Cintia, Aytube, Lanuze, Ruth, Eveline, Raquel, Adriano por toda colaboração e amizade. Aos meus colegas e amigos de instituição, Andréia, David, Luciana, Vicente, Penha, Antônia, Dulce, Marcão, Julieta, obrigada pela amizade. Ao Laboratório de Parasitologia Animal da Unimontes, Claudia, Shirley, Letícia, Ana Luísa, Leandro, Tiago, Raul, Ananda, Natânnia, Bic- Jrs, pela dedicação e compromisso com os experimentos. Aos proprietários e funcionários das propriedades rurais, pela disponibilidade na realização do experimento. Aos amigos Freidiane, Maurício, Ninha, Marcela, Edlamour, obrigada pela amizade. A todos que colaboraram na concretização de mais uma etapa da minha vida, a minha sincera gratidão.

7 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS % Porcentagem Marca registrada C Graus Celsius cm CMO ECC EDTA g IBGE kg L1 L1 L3 mg/kg mg/ml ml ml/kg mm OPG μg/ml μl Centímetros Coloração de mucosa ocular Escore de condição corporal Ácido etilenodiaminotetracético Gramas Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Quilograma Larva de primeiro estádio Larva de primeiro estádio Larva de terceiro estágio Miligramas por quilograma Miligramas por mililitro Mililitro Mililitro por quilograma Milimetros Ovos por grama de fezes Micrograma por mililitro Microlitro

8 LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO Fig. 1: Fase de vida livre dos nematoides estrongilídeos Fig. 2: Momordica charantia L Fig. 3: Calotropis procera (Aiton) Dryand CAPÍTULO I Figura 1: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante 47 os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade A, no município de Janaúba Minas Gerais... Figura 2: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade A, no município de Janaúba Minas Gerais... Figura 3: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade B, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais... Figura 4: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade B, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais... Figura 5: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade C, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais... Figura 6: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade C, no município de Nova Porteirinha inas Gerais... Figura 7: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 da propriedade D, no município de Janaúba Minas Gerais... Figura 8: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de setembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade D, no município de Janaúba Minas Gerais... Figura 9: Valores médios das contagens de ovos de Moniezia sp. por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 em 4 propriedades, nos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha Minas Gerais... Figura 10: Valores médios das contagens de ovos de Moniezia sp. por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 em 4 propriedades, nos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha-Minas Gerais... Figura 11: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3)

9 durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade A, no 53 município de Janaúba Minas Gerais... Figura 12: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de setembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade A, no 54 município de Janaúba-Minas Gerais... Figura 13: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade B, no 54 município de Nova Porteirinha-Minas Gerais... Figura 14: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade B, no 55 município de Nova Porteirinha-Minas Gerais... Figura 15: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade C, no 55 município de Nova Porteirinha-Minas Gerais... Figura 16: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade C, no município de Nova 55 Porteirinha-Minas Gerais... Figura 17: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 da propriedade D, no 56 município de Janaúba-Minas Gerais... Figura 18: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade D, no 56 município de Janaúba-Minas Gerais... CAPÍTULO II Figura 1: Valores médios das contagens de OPG e porcentagem de hematócrito 61 durante o período periparto de ovelhas... Figura 2: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas das coproculturas de 62 ovelhas Santa Inês no período periparto... CAPÍTULO III Figura 1: Cromatografia em camada delgada para identificação de 73 flavonóide... Figura 2: Cromatografia em camada delgada para identificação de saponina Figura 3: Cromatografia em camada delgada para identificação de alcalóide Figura 4: Cromatografia em camada delgada para identificação de tanino Figura 5: (a) perfil cromatográfico do extrato de folha de M. charantia; (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (l) (m) (n) (o) (p) (q) (r) picos cromatográficos Figura 6: Porcentagem de eficácia do teste de inibição da eclodibilidade (TEO) em ovos de Haemonchus contortus... Figura 7: Porcentagem de eficácia do teste de eclodibilidade (TEO) em ovos de H. contortus em diferentes concentrações do extrato bruto de M. charantia... Figura 8: Curva da concentração-resposta do teste de eclodibilidade do extrato de Momordica charantia (mg ml -1 ) contra ovos de Haemonchus contortus... Figura 9 Eficácia do teste de desenvolvimento larvar (TDL) em larvas de Haemonchus contortus em diferentes concentrações do extrato de Momordica charantia... Figura 10: Eficácia do teste de desenvolvimento larvar (TDL) em larvas de Haemonchus contortus em diferentes concentrações do extrato de Momordica charantia e controles sulfóxido de albendazol (ABZ), água destilada e dimetilsulfóxido (DMSO)

10 Figura 11: Curva de concentração-resposta do teste de desenvolvimento larval do 83 extrato de Momordica charantia (mg ml -1 ) contra larvas de Haemonchus contortus Figura 12: Porcentagem de eficácia do teste de inibição da eclodibilidade (TEO) em 84 ovos de H. contortus em diferentes frações de extrato de M. charantia... CAPÍTULO IV Figura 1: Cromatografia em camada delgada para identificação de 94 flavonóide... Figura 2: Cromatografia em camada delgada para identificação de saponina Figura 3: Cromatografia em camada delgada para identificação de alcalóide Figura 4: Cromatografia em camada delgada para identificação de tanino Figura 5: (a) perfil cromatográfico do extrato de folha de C. procera; (b) (c) (d) (e) 97 (f) picos cromatográficos... Figura 6: Porcentagem de eficácia do teste de inibição da eclodibilidade (TEO) em 98 ovos de H. contortus em seis concentrações de extrato de C. procera... Figura 7: Porcentagem de eficácia do teste de eclodibilidade (TEO) em ovos de H. 99 contortus em diferentes concentrações do extrato de C. procera... Figura 8: Curva da concentração-resposta do teste de eclodibilidade do extrato de C. 101 procera (mg ml -1 ) Figura 9: Eficácia do teste de desenvolvimento larvar (TDL) em larvas de H. contortus em diferentes concentrações do extrato de C. 101 procera... Figura 10: Eficácia do teste de desenvolvimento larvar (LDT) em larvas de H. 102 contortus em diferentes concentrações do extrato de C. procera e controles... Figura 11: Curva de concentração-resposta do teste de desenvolvimento larval do 103 extrato de C. procera (mg ml -1 ) contra larvas de H. contortus... Figura 12: Porcentagem de eficácia do teste de inibição da eclodibilidade (TEO) em 103 ovos de H. contortus em diferentes frações de extrato de C. procera...

11 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II Tabela 1: Valores médios do escore de coloração da mucosa ocular e escore de condição corporal no periparto de ovelhas Santa Inês Tabela 2: Coeficientes de correlação entre contagem de ovos por grama de fezes (OPG), hematócrito, escore de condição corporal (ECC), coloração da mucosa ocular (CMO) em ovelhas Santa Inês CAPÍTULO III Tabela 1 -Teste de eclodibilidade (TEO) de ovos de Haemonchus contortus, com 78 extratos de Momordica charantia, e controles... Tabela 2- Médias e erros-padrão (log x+1) do número de ovos e larvas de Haemonchus contortus às 48 h de incubação com extrato de Momordica charantia e 80 controles... CAPÍTULO IV Tabela 1- Médias e erros-padrão de ovos de Haemonchus contortus no teste de 98 eclodibilidade (EHA), com extratos de C. procera e controles... Tabela 2 - Médias e erros-padrão (logx+1) do número de ovos e larvas de Haemonchus contortus às 48 h de incubação com extrato de C. procera e controles.. 100

12 SUMÁRIO Resumo Abstract Introdução Revisão de literatura Infecções helmínticas em ovinos Biologia Patogenia Epidemiologia e controle das infecções helmínticas Grupos anti-helmínticos Resistência anti-helmíntica (RA) Plantas medicinais com potencial anti-helmíntico Momordica charantia L Calotropis procera (Aiton) Dryand Justificativa Hipótese Objetivo geral Referência Bibliográfica CAPITULO I: HELMINTOSES GASTRINTESTINAIS EM OVINOS CRIADOS NO NORTE DE MINAS GERAIS Introdução Objetivo Material e métodos Propriedades estudadas Propriedade A Propriedade B Propriedade C Propriedade D Animais Coleta das amostras fecais Exames laboratoriais Resultados e discussão Conclusões Referência Bibliográfica CAPITULO II: CORRELAÇÕES ENTRE VARIÁVEIS COPROPARASITOLÓGICAS, HEMATOLÓGICA E FÍSICA DE OVELHAS SANTA INÊS PARASITADAS POR NEMATÓDEOS GASTRINTESTINAIS NO PERÍODO PERIPARTO Introdução Objetivo Material e métodos Resultados e discussão Referência Bibliográfica CAPITULO III: ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DO EXTRATO DE MOMORDICA CHARANTIA SOBRE OVOS E LARVAS DE HAEMONCHUS CONTORTUS Introdução Objetivo Material e métodos Amostras das plantas, extração e preparo dos extratos brutos (EB) Cromatografia em camada delgada (CCD) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Avaliação do extrato bruto in vitro Recuperação de ovos de Haemonchus contortus... 70

13 Teste da eclodibilidade de ovos (TEO) Teste de desenvolvimento larvar (TDL) Análise estatística Resultados Discussão Conclusão Agradecimentos Referência Bibliográfica CAPITULO IV: ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DOS EXTRATOS DE CALOTROPIS PROCERA SOBRE OVOS E LARVAS DE HAEMONCHUS CONTORTUS Introdução Objetivo Material e métodos Amostras das plantas, extração e preparo dos extratos brutos (EB) Cromatografia em camada delgada (CCD) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Avaliação do extrato bruto in vitro Recuperação de ovos de Haemonchus contortus Teste da eclodibilidade de ovos (TEO) Teste de desenvolvimento larvar (TDL) Analise estatística Resultados Discussão Conclusões Agradecimentos Referência Bibliográfica Conciderações finais ANEXO

14 Resumo As helmintoses são um dos principais fatores que interferem no desenvolvimento de ovinos, levando a grandes perdas econômicas devido a alta morbidade, mortalidade, perda de peso e gastos com medicamentos. A resistência anti-helmíntica agrava o controle dessas parasitoses. A utilização de plantas com atividade anti-helmíntica parece ser uma alternativa eficaz do ponto de vista do controle parasitário, econômico, impacto ambiental e qualidade dos produtos de origem animal. Sendo assim, a validação científica desses produtos dessas plantas é essencial para seu uso como medicamentos alternativos. Os objetivos foram observar os aspectos epidemiológicos dos helmintos na região do norte de Minas Gerais e avaliar a atividade anti-helmíntico da Momordica charantia e da Calotropis procera em Haemonchus contortus. O experimento foi realizado em propriedades dos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha, região Norte de Minas Gerais e os exames laboratoriais realizados na Unimontes e UFMG. Realizouse o levantamento epidemiológico de propriedades da região, observando a dinâmica das infecções helmínticas dos rebanhos de ovinos e a ação anti-helmíntica das plantas M. charantia e C. procera foram testadas utilizando extratos brutos e fracionados para avaliação da inibição da eclodibilidade e motilidade larval em laboratório. A analise das contagens de OPG nas propriedades estudadas mostrou influência da precipitação pluvial ocorrida em cada mês sobre esta variável. O gênero Haemonchus foi predominante em todas as propriedades. A categoria que apresentou maiores contagens de ovos de estrongilídeos e Moniezia sp. foi a das crias. Os extratos das plantas M. charantia e C. procera apresentaram atividade anti-helmíntica em ovos e larvas de Haemonchus contortus. Palavras chave: epidemiologia, ovinos, fitoterapia, Haemonchus contortus

15 Abstract The helminth infections are one of the main factors that affect the development of sheep, leading to huge economic losses due to morbidity, mortality, weight loss and medical expenses. The anthelmintic resistance worsens the control of these parasites. The use of plants with anthelmintic activity appears to be an efficient alternative from the point of view of parasite control, economic, environmental impact and quality of the animal products. Thus, the scientific validation of those plants is essential for its use as alternative medicines. The objectives were observe the epidemiological aspects of helminths in the northern region of Minas Gerais and evaluate the anthelmintic activity of Momordica charantia and Calotropis procera in Haemonchus contortus. The experiment was carried out on properties in the municipalities of Janaúba and Nova Porteirinha, North of Minas Gerais and laboratory tests were carried out in Unimontes and UFMG. We carried out the epidemiological survey of properties in the region, observing the dynamics of helminth infections of sheep flocks and the anthelmintic action of M. charantia and C. procera foram plants tested, by means of crude extracts and fractionated ones to evaluate the inhibition of hatchability and larval motility in laboratory. The analysis of OPG counts on the properties studied showed influence of rainfall occurred in every month on that variable. The Haemonchus genus predominated in all properties. The offspring presented higher counts of strongyles and Moniezia sp. eggs. The extracts of M. charantia and C. procera plants showed anthelmintic activity on Haemonchus contortus eggs and larvae. Keywords: epidemiology, sheep, phitotherapy, Haemonchus contortus

16 1. Introdução A ovinocultura é uma atividade explorada em praticamente todos os continentes, a ampla difusão da espécie se deve principalmente a seu poder de adaptação a diferentes climas, relevos e vegetações. A criação ovina está destinada tanto à exploração econômica como à subsistência das famílias de zonas rurais. A China se destaca como sendo o país com maior número de animais, e a Austrália e Nova Zelândia os sistemas de produção de carne e lã de alta produtividade (Viana 2008). O efetivo brasileiro de ovinos está em torno de 16,789 milhões de animais, dos quais 55,5% estão localizados no Nordeste brasileiro, embora o principal estado produtor seja o Rio Grande do Sul com 24,45% do efetivo nacional. Em Minas Gerais, sob o ponto de vista econômico, a exploração de caprinos e ovinos de corte é encontrada, principalmente, nas regiões norte e nordeste, onde são verificadas tendências semelhantes à ovinocultura nordestina. Nesta região, os animais são criados em pastoreio extensivo, de forma consorciada, principalmente caprinos com ovinos, para produção de pele e carne, enquanto nas regiões central, oeste e sul há uma maior concentração de rebanhos leiteiros (Gouveia 2001, IBGE 2012). O crescimento do rebanho ovino em Minas Gerais teve início nos anos 2000, passando de em 2001 para em 2012 (IBGE 2012). Analisando a posição de Minas Gerais que, enquanto o rebanho brasileiro reduziu 5% no ano de 2012 comparado a 2011, o efetivo de ovinos no estado cresceu 2%, onde se concentra o 2º maior rebanho de ovinos da região sudeste, verificando-se a importância do estado no que refere à ovinocultura. Um dos principais problemas de sanidade na ovinocultura em todo o mundo são as helmintoses gastrintestinais, que causam grandes perdas econômicas devido a alta morbidade e mortalidade do rebanho. O estudo de sua importância teve impulso a partir da década de 30, quando Taylor (1935), na Inglaterra, observou a influência do período periparto nas contagens de ovos de tricostrongilídeos encontrados nas fezes de ovelhas mantidas em pastagens. Tetley (1941), na Nova Zelândia, e Gordon (1953), na Austrália, foram os precursores dos estudos sobre a epidemiologia das helmintoses gastrintestinais em ovinos. Os animais podem ser parasitados por diferentes espécies de helmintos, e as mais importantes em termos econômicos, ampla distribuição e prevalência nas regiões 15

17 tropicais são Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis, Strongyloides papillosus, Cooperia curticei e Oesophagostomum columbianum (Amarante et al., 2004) O controle desse parasitismo é realizado, basicamente, com a utilização de antihelmínticos químicos visando a reduzir os níveis de infecções dos animais e promover a descontaminação das pastagens. No entanto, falhas nesse tipo de controle são os primeiros sinais do aparecimento de resistência anti-helmíntica nos ovinos (Charles 1989, Sangster 2001, Melo et al. 2003). Estratégias de controle para diminuir o parasitismo dos animais e prevenir a contaminação no meio ambiente têm sido desenvolvidas com base nos conhecimentos epidemiológicos e na dinâmica populacional dos helmintos no rebanho e na pastagem (Vieira 2003). Os fatores ambientais como precipitação, temperatura e umidade interferem na epidemiologia desses parasitos; portanto, faz-se necessário o conhecimento epidemiológico de cada região para a implantação de estratégias específicas. Neste contexto, destaca-se a importância da difusão de métodos alternativos para o controle das verminoses, contemplando desde a utilização de antiparasitários naturais a orientações sobre práticas de manejo sustentável, objetivando cordeiros mais produtivos e carnes mais saudáveis para o consumo. 2. Revisão de literatura 2.1 Infecções helmínticas em ovinos As infecções causadas por helmintos, dependendo do grau de infecção, ocasionam diminuição do consumo e da capacidade de digestão e absorção de nutrientes, consequentemente redução no ganho de peso e no escore corporal. Todos os ovinos mantidos sob condições de pastejo estão expostos a helmintos parasitas (Coop e Angus 1981, Coltman et al. 2001, Amarante 2003). Os ovinos, no Nordeste do Brasil, são parasitados pelos nematoides gastrintestinais Haemonchus contortus e Trichostrongylus axei que se localizam no abomaso; Trichostrongylus colubriformis, Strongyloides papillosus, Cooperia punctata, Cooperia pectinata e Bunostomum trigonocephalum que parasitam o intestino delgado; 16

18 Oesophagostomum columbianum, Trichuris ovis e Trichuris globulosa parasitos do intestino grosso (Vieira, 2008). O Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis, Strongyloides papillosus e Oesophagostomum columbianum são os endoparasitas que apresentam maior prevalência e maior intensidade de infecção, sendo considerados de maior importância econômica para a exploração de pequenos ruminantes (Costa & Vieira 1984, Amarante et al. 1998, Arosemena et al. 1999, Nieto et al. 2003, Chagas et al. 2008). 2.2 Biologia O ciclo de vida dos principais nematoides gastrintestinais dos ovinos é semelhante, envolve uma fase livre e uma parasitária. A fase de vida livre inicia-se com a eliminação de ovos nas fezes dos animais parasitados. Uma larva se desenvolve no meio ambiente dentro do ovo e é liberada após a eclosão. A larva cresce e muda duas vezes, transformando-se em larva de terceiro estágio (L3), que é a forma infectante, geralmente ocorre de cinco a sete dias, em condições ambientais com temperatura e umidade adequadas. As L3, após serem ingeridas com as pastagens, realizam dois estágios no trato gastrintestinal do hospedeiro tornando-se adultos. Os parasitos adultos copulam e as fêmeas iniciam a postura entre 21 e 28 dias. O número de ovos produzidos varia de centenas a milhares a cada dia, dependendo da espécie. Por exemplo, cada fêmea de Haemonchus contortus pode produzir entre 5 e 10 mil ovos por dia. 17

19 Figura 1: Fase de vida livre dos nematoides estrongilídeos Patogenia No Brasil, a espécie mais patogênica é o H. contortus, causa os maiores prejuízos para a cadeia produtiva de pequenos ruminantes. Parasito do abomaso, caracteriza-se por ser hematófago, responsável por um quadro clínico severo de anemia. Yakstis e Johnstone (1981) relataram os diversos danos causados por parasitas nos hospedeiros, que são: mecânicos, digestivos, depletivos, alérgicos e anemiantes. Nestas condições, os animais têm menor capacidade de crescimento e podem perder peso. Bown et al. (1986) afirmaram que as parasitoses gastrintestinais de ovinos provocam um aumento de perda de proteína endógena pelo intestino delgado do animal. As infecções por nematoides gastrintestinais, geralmente, são mistas e se caracterizam por anemia das mucosas e das vísceras, degeneração gordurosa (atrofia gelatinosa), hidrotorax, hidropericárdio, ascite, caquexia e gastrenterite catarral. A mucosa do abomaso pode se apresentar espessa, edemaciada, anêmica, brilhante e com pequenas úlceras no local de fixação de H. contortus. Observa-se histologicamente, em hemoncose, edema da mucosa, submucosa e serosa abomasal, descamação de células epiteliais, ulceração e infiltração de leucócitos, com predominância de eosinófilos 18

20 (Santa Rosa, 1996). T. colubriformis, Cooperia curticei e S. papillosus, parasitos do intestino delgado, penetram na mucosa, formando túneis no epitélio das vilosidades e causam erosão epitelial. Outra espécie que merece destaque é o O. columbianum, devido à elevada patogenicidade de suas larvas histotróficas que se localizam nos intestinos delgado e grosso e causam a formação de nódulos. 2.4 Epidemiologia e controle das infecções helmínticas No Brasil, Gonçalves (1974) realizou o primeiro trabalho em epidemiologia da helmintose ovina no município de Guaíba (RS) durante os anos de 1961 a Posteriormente, Santiago et al. (1976) realizaram pesquisas em epidemiologia e controle da helmintose ovina em Itaqui (RS). Nesses trabalhos, os autores avaliaram a epidemiologia de rebanho, usando animais traçadores, isto é, os cordeiros permaneciam sempre juntos com o rebanho antes de serem abatidos. Os fatores ambientais têm grande influência sobre a composição e regulação da população parasitária (Levine 1963, Stromberg 1997), principalmente sobre estágios das larvas nas pastagens, inclusive sobre a predominância de uma ou mais espécie em determinadas regiões (Beveridge et al. 1989). A temperatura e a umidade são consideradas os mais importantes fatores responsáveis pelo desenvolvimento de ovos e larvas no ambiente (Valcarcel et al. 1999). Condições climáticas favoráveis de umidade e temperatura favorecem o desenvolvimento de um grande número de larvas infectantes que são ingeridos pelo hospedeiro, podendo ocorrer casos agudos de verminose, com manifestações de sinais clínicos evidentes: anemia, graus variáveis de edema submandibular, letargia, fezes escuras, queda na produção e perda de peso progressiva. Por outro lado, a ingestão de um número baixo de larvas infectantes de forma contínua permite que os animais se adaptem à infecção e os sinais clínicos sejam menos evidentes. Todavia, eles terão uma taxa de crescimento abaixo do seu potencial, o que poderá ser observado no próprio manejo do rebanho ou no abatedouro onde apresentarão uma carcaça de conformação inferior (Coop & Angus 1981, Urquhart et al. 1990). Borba et al. (1993) afirmaram que em um rebanho de ovinos, menos de 5% da população parasitária encontra-se no trato gastrintestinal dos animais, enquanto os mais de 95% restantes encontram-se nas pastagens. 19

21 Nas épocas do ano em que o índice pluviométrico é maior, as condições do meio ambiente são favoráveis para o desenvolvimento e migração de larvas contaminantes de nematoides gastrintestinais nas pastagens. No norte de Minas Gerais, Nogueira et al. (2009), estudando a variação sazonal em borregos e matrizes ovinas em dois rebanhos utilizando contagens de OPG e cultura de larvas, concluíram que, independentemente da variação climática ao longo do ano, os meses de maior eliminação de ovos de nematoides para as matrizes corresponderam ao período de periparto. Para os borregos, a época de maior eliminação de ovos correspondeu ao fim do período chuvoso. Os principais gêneros identificados após os cultivos foram Trichostrongylus, Haemonchus e Strongyloides, tanto para o período seco, quanto para o chuvoso. Segundo Molento et al. (2004), um dos manejos recomendados para controlar infecção dos ovinos por helmintos parasitos e protegê-los do ataque de predadores é o recolhimento de todo o rebanho em instalações com piso ripado suspenso no período noturno, voltando os animais na manhã seguinte para os piquetes. Esses mesmos autores, estudando sobre o comportamento das larvas infetantes nas gramíneas Paspalum notatum, Cynodon dactylon, Panicum maximum cv. Tanzânia, relataram que existe uma queda acentuada dessas larvas quatro horas após o nascer do sol, orientando a entrada dos ovinos no piquete. O controle de verminose gastrintestinal de ovinos tem sido baseado, na maioria das vezes, no emprego de anti-helmínticos de amplo e de pequeno espectro. Entretanto, essa prática de controle tem sido frequentemente ineficaz devido ao surgimento de populações de nematoides resistentes (Amarante 2005). A resistência que os nematoides gastrintestinais, particularmente H. contortus, Trichostrongylus sp., Oesophagostomum sp. e Cooperia sp., vem adquirindo aos antihelmínticos, tem sido uma grande limitação no controle da verminose (Kaplan et al. 2004). Os anti-helmínticos devem ser utilizados apenas de maneira complementar em esquemas de manejo a fim de minimizar a utilização dos fármacos e ao mesmo tempo maximizar a produtividade do rebanho. Esses esquemas devem ser elaborados por profissionais com sólidos conhecimentos sobre a biologia e a epidemiologia dos helmintos (Amarante 2005). Consoante Gastaldi et al. (2001), a utilização de exames para as determinações das quantidades de ovos de nematoides gastrintestinais presentes nas fezes e, quando 20

22 necessária, a realização de cultura de larvas, mensalmente, aliadas à aplicação dos dados epidemiológicos fornecidos pela pesquisa, são as ferramentas mais eficazes e viáveis economicamente para o controle das endoparasitoses. Um controle integrado deve ser adotado para que se possa obter o máximo benefício de cada aplicação anti-helmíntica, enfatizando o uso de poucos tratamentos na população susceptível, melhorando, portanto a eficiência do controle (Wyk & Bath 2002). 2.5 Grupos anti-helmínticos O controle de verminose gastrintestinal de ovinos tem sido baseado quase que, exclusivamente, no emprego de anti-helmínticos de amplo espectro (benzimidazóis, imidazotiazóis e lactonas macrocíclicas) e de pequeno espectro (salicilanilidas/fenóis substituídos e organofosforados) (Amarante 2005). Os benzimidazóis (tiabendazol, albendazol, febendazol, mebendazol, oxfendazol, oxibendazol) e pró-benzimidazóis (febantel, tiofanato, netobimim) pertencem à mesma classe, pois os pró-benzimidazóis sofrem transformação para benzimidazóis através do rúmen e do metabolismo hepático (Bogan & Armour, 1987). Esses fármacos têm como mecanismo de ação principal uma potente inibição da formação de microtúbulos do parasito, causando alterações ultraestruturais nas células intestinais de nematoides (Bruce 1987, Martin 1997). Benzimidazol Os imidotiazóis, tetramisol e levamisol, provocam uma paralisia espástica nos nematoides, determinando uma contração muscular estável, o que facilita a eliminação do parasito (Lanusse 1996). O levamisol não é ovicida, tem boa atividade contra adultos e estádios larvares em desenvolvimento, mas não contra larvas em hipobiose (Bogan & Armour 1987). 21

23 Levamisol As tetrahidropirimidinas, pirantel e morantel, também atuam como agonistas colinérgicos e têm o mesmo mecanismo de ação (Köhler 2001). Esses fármacos não são ovicidas, possuem menor atividade contra estádios larvares e alta eficácia sobre estádios adultos (Bogan & Armour 1987). Pirantel A maioria das salicilanilidas, rafoxanida, oxiclozamida e closantel, é trematodicida que atua desacoplando a fosforilação oxidativa no parasito, influenciando no mecanismo de geração de energia. Contudo, o closantel é o único composto do grupo que pode ser considerado de amplo espectro, apresenta alta eficácia contra cepas de H. contortus e tem sido uma alternativa na resistência aos benzimidazóis e ao levamisol (Prichard 1987, Lanusse 1996, Martin 1997). Salicilanilida O grupo das lactonas macrocíclicas é de fármacos classificados como endectocidas, pertencem ao grupo das avermectinas, composto pela abamectina, ivermectina e doramectina, e milbemicinas, do qual fazem parte a nemadectina e moxidectina (Lanusse & Prichard 1993). Estes compostos são fármacos antiparasitários de amplo espectro com alta eficácia contra nematoides (Mckellar 1994). São ativos contra adultos, estádios imaturos e larvas hipobióticas. Os anti-helmínticos desse grupo 22

24 possuem o mesmo modo de ação e causam uma paralisia ao abrir os canais de cloro com portão glutamato (Bogan & Armour 1987, Martin 1997, Sangster 1999). Avermectina Os organofosforados, triclorfon e haloxon, são um grupo de substâncias utilizadas como inseticidas, ectoparasiticidas e como anti-helmínticos. Seu modo de ação é a inibição da acetilcolinesterase do parasito, evitando a hidrólise da acetilcolina. Isso resulta em paralisia espástica e eliminação do nematoide do trato gastrintestinal do hospedeiro. O uso inadequado desse grupo de substâncias pode causar grandes prejuízos na pecuária, e a intoxicação ocorre por contaminação da água, alimentos, pastagens, preparação e uso de concentrações excessivas do produto. Com o surgimento de fármacos mais seletivos e seguros, os organofosforados têm sido usados com menor frequência (Boermans et al. 1984, Martin 1997, Grecco et al. 2009). Triclorfon 2.6 Resistência anti-helmíntica (RA) A maioria dos produtores realiza aplicações de anti-helmínticos sem nenhum critério técnico, e, em algumas situações, são realizadas a cada 15 dias. Esse tipo de controle baseado essencialmente com antihelminticos químicas, além de selecionar cepas resistentes, resulta na liberação de resíduos tóxicos para o animal e meio ambiente como também eleva o custo de produção (Echevarria et al., 1996). 23

25 O uso indiscriminado dos anti-helmínticos teve como consequência a seleção de populações de helmintos com resistência aos diferentes grupos químicos utilizados no tratamento dos animais. Atualmente, é comum encontrar resistência às lactonas macrocíclicas e outros grupos químicos no Brasil e no mundo. Essa situação tornou-se grave, especialmente nas criações de pequenos ruminantes nas regiões tropicais e subtropicais da América do Sul (Pomroy et al. 1992, Waller 1997, Veríssimo et al. 2012). Torres- Acosta & Hoste (2008) definiram a resistência parasitária como aumento significativo na habilidade de uma população de parasitos para sobreviver a doses de um determinado composto, que elimina a maioria dos indivíduos de uma população suscetível da mesma espécie. O aumento de resistência é o resultado de trocas gênicas causadas pelo cruzamento daqueles que sobreviveram à exposição ao fármaco. Os principais fatores operacionais promotores da disseminação de alelos para resistência são subdosagem, frequência de tratamentos, rotação rápida de princípio ativo (Hennon 1993, Echevarria1996). Os organismos resistentes passam os seus alelos para os seus descendentes. A frequência e a intensidade do tratamento, aliadas à maior ou menor disseminação dos alelos para resistência na população de parasitos, determinam a taxa de seleção da resistência (Prichard 2001). Sutherst & Comins (1979) descrevem três componentes da gênese da resistência. No início, como um evento ao acaso, existe o estabelecimento da resistência, que é influenciado pelo tamanho e pela diversidade da população parasitária. Não se tem controle quanto ao estabelecimento da resistência nesta fase. Segue-se então o desenvolvimento da resistência que é agravado com o uso de agentes selecionadores, como os componentes químicos. Caso esse processo seja contínuo e a população resistente se encontre em vantagem numérica, ter-se-á então a manifestação da resistência como um problema visível. Quanto mais elevados esses fatores, maior será a probabilidade da existência do alelo para a resistência (Geary et al. 1999). Por último, o processo de dispersão dos genes na população é realizado pela migração e fluxo gênico (Humbert et al. 2001). Logo, os processos de desenvolvimento e dispersão são influenciados pela biologia e manejo dos parasitos responsáveis pela resistência (Melo & Bevillaqua 2005). O aparecimento de cepas de nematoides resistentes a anti-helmínticos pode ser explicado pela teoria da evolução, que tem como ponto básico a seleção natural, ou seja, 24

26 os indivíduos mais adaptados sobrevivem para se reproduzir. A população susceptível de nematoides contém uma subpopulação de indivíduos com capacidade genética para sobreviver ao tratamento que originará a próxima geração de nematoides dessa população. O desenvolvimento da resistência a um fármaco geralmente acontece dentro de cinco a oito gerações após a introdução da nova classe do composto (Prichard et al. 1980, Griffiths et al. 1998, Grant 2001). Outro fator determinante na problemática da criação de ovinos é a resistência dos parasitas, em especial do H. contortus, a vários fármacos (Van Wyk & Malan 1988, Echevarria et al. 1996, Souza 1997). Um dos fatores que contribuem para o agravamento da resistência é o fato de que a maioria dos produtores não promove o tratamento adequado dos seus rebanhos, usando subdosagens ou periodicidade inadequada, o que, consequentemente, leva ao desenvolvimento da resistência por parte dos parasitos (Viera et al. 1999). O primeiro relato de resistência a anti-helmínticos no Brasil foi ao tiabendazol, composto benzimidazol, no Rio Grande do Sul (Dos Santos & Gonçalves 1967). A partir de então, a resistência aos benzimidazóis tem se disseminado drasticamente (Vieira et al. 1989). Acredita-se que a RA tem distribuição mais ampla entre os benzimidazóis, devido aos genes para resistência estarem presentes antes mesmo desses fármacos serem lançados no mercado (Roos et al. 1990). Apesar de os rebanhos terem características regionais diferentes, os resultados de RA em nematoides de ovinos da região nordeste (Melo et al., 2003) são semelhantes àqueles obtidos na região sul do Brasil (Echevarria et al., 1996; Farias et al. 1997). Nessas regiões, os anti-helmínticos de largo espectro (benzimidazóis, levamisol e ivermectina) têm baixa eficácia, sendo necessárias estratégias urgentes para reestruturar o controle dos parasitos (Echevarria et al. 1996, Melo et al. 2003). Thomaz-Soccol et al. (2004) mostraram a gravidade do problema ao constatarem, em diferentes regiões do estado do Paraná, o aparecimento de resistência de helmintos gastrintestinais a diversos anti-helmínticos. A ivermectina foi lançada no mercado em No Brasil, o primeiro relato de resistência a esse fármaco, em nematoides de ovinos, ocorreu na região sul (Echevarria & Trindade, 1989). Uma pequena população de nematoides em refugia, aliada à utilização de tratamentos nos períodos mais secos possibilita que a RA se desenvolva rapidamente (Sangster 2001). Esse poderia ser o motivo pelo qual a RA se disseminou nos rebanhos 25

27 de ovinos. Trabalhos realizados no Ceará indicam que as prováveis causas do desenvolvimento da RA são a frequência de tratamentos anti-helmínticos e a rotação rápida de princípio ativo (Melo et al. 1998). Ramos et al. (2002) afirmam que o uso intensivo de anti-helmínticos, muitas vezes, em subdoses, aliado a problemas de manejo, tem selecionado estirpes resistentes a vários produtos, principalmente Haemonchus spp., Trichostrongylus spp. e Ostertagia spp. de origem ovina no estado de Santa Catarina. H. contortus é o maior responsável pelo rápido desenvolvimento da resistência em nematoides de pequenos ruminantes (Sangster 2001), provavelmente, pelo seu alto potencial biótico (Echevarria & Trindade 1989), grande variabilidade genética e por albergar o alelo que causa a diminuição da susceptibilidade a um fármaco (Blackhall et al. 1998). Melo et al. (2003), em um estudo realizado no estado do Ceará, verificaram que a prevalência de nematoides resistentes a oxfendazol, levamisol e ivermectina em ovinos foi de 88%, 41% e 59%, e em caprinos de 87.5%, 75% e 37.5%, respectivamente. Observaram também que o gênero Haemonchus foi o mais prevalente na população resistente a todos os anti-helmínticos, tanto em ovinos quanto em caprinos, seguido pelo gênero Trichostrongylus e Oesophagostomum. Atualmente, os programas de controle de vermes de caprino visam, não só apenas curar as doenças nas formas clínicas, as quais se caracterizam por apresentarem altas taxas de mortalidade, mas, principalmente, reduzir os prejuízos provocados pelo parasitismo subclínico (Sangster 1996). Tentativas de minimizar o problema parasitário vêm sendo conduzidas através do controle integrado nas pastagens, em práticas como a rotação de piquetes, uso de diferentes espécies animais no mesmo piquete, cultivo de plantas menos propícias ao desenvolvimento das fases jovens dos parasitas e horário de pastejo. Segundo Soccol et al. (1996), outra alternativa para o controle da verminose ovina seria a seleção de animais geneticamente resistentes aos parasitas gastrintestinais. Herd (1996) e Vieira (2004) citam também a identificação de fitoterápicos com efeito anti-helmíntico. Vieira (2004) refere-se ao uso de homeopatia e o controle biológico por meio de fungos predadores das fases pré-parasitárias. Em virtude dessa situação, vários estudos têm sido realizados na busca de alternativas para o controle da verminose em pequenos ruminantes, dentre eles, destacase o controle biológico, redução na frequência de tratamentos anti-helmínticos, a 26

28 utilização de plantas com atividades antiparasitárias que tem sua origem na medicina etnoveterinária, seleção de raças mais resistentes a parasitos e manejo de pastagens (Waller 1999, Athanasiadou et al. 2007). A vantagem de se utilizar animais geneticamente resistentes é que aqueles mais resistentes às infecções e aos seus efeitos contribuiriam para reduzir a contaminação do ambiente. Além disso, haveria uma menor necessidade de tratamentos anti-helmínticos, retardando o surgimento de resistência (Miller & Gray 1996). Vale salientar que nos rebanhos em que já existem a RA aos produtos químicos, os tratamentos antihelmínticos seriam com a utilização dos fitoterápicos. As técnicas de manejo que visam a diminuir a contaminação da pastagem com larvas infectantes representam um importante avanço no controle das verminoses, reduzindo o uso de antiparasitários para a profilaxia das helmintoses. Da mesma forma, as pastagens com baixa contaminação pelas larvas infectantes dos nematoides gastrintestinais beneficiam, principalmente, as categorias mais suscetíveis à verminose, como animais jovens e fêmeas no periparto (Amarante, 2004) Plantas medicinais com potencial anti-helmíntico As plantas são usadas como uma fonte de alimento e medicamento nas Américas por milênios. Registros históricos demonstram que os ameríndios usavam várias plantas como o abacate (Persea americana L.), a batata (Ipomoea batatas (L.) Lam.), o mate (Ilex paraguariensis A. St.-Hil.) e o cacau (Theobroma cacao L.) (Ferrão 2004, Wolters 1992). Os colonizadores levaram várias dessas plantas para a Europa no século XVI, quando também eles começaram a investigar as crenças nativas sobre as doenças, e as plantas que as curavam. Remédios de plantas brasileiras, como a copaíba (Copaifera spp.), jaborandi (Pilocarpus spp.), ipecacuanha (Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes) e curares (Chondrodendron spp.), se expandiram para várias partes do mundo e ainda hoje são usados na clínica. As plantas medicinais são amplamente utilizadas hoje em áreas rurais e urbanas do Brasil. No entanto, a intensa miscigenação de culturas, ocorrida ao longo dos últimos séculos, popularizou mais o uso de plantas exóticas e importadas na medicina popular brasileira. Grande parte das plantas usada na medicina caseira e oficial são espécies 27

29 introduzidas aqui pelos povos que colonizaram o país, especialmente os europeus e os africanos. Apesar do vasto uso das plantas, a validação científica é uma etapa inicial obrigatória para a utilização correta de plantas medicinais ou de seus compostos ativos. Muitos esforços vêm sendo feito em todo o mundo buscando validar as plantas e desenvolver produtos de fonte natural. Devido à grande importância econômica dos tricostrongilídeos na produção pecuária, associada ao alto custo de tratamento e ao poder de resistência aos produtos químicos existentes, assim como da possibilidade de gerar resíduos na carne, leite ou no meio ambiente, torna-se imprescindível buscar alternativas para seu controle. A utilização de plantas com propriedades anti-helmínticas parece ser uma alternativa eficaz, tanto do ponto de vista do controle parasitário quanto pelo seu baixo impacto ambiental. A fitoterapia pode contribuir para aumentar os lucros da criação, uma vez que reduz o uso de anti-helmínticos convencionais, além de estender a vida útil dos produtos químicos disponíveis (Vieira et al. 1999). Muitos autores ressaltam a importância dos extratos de plantas serem uma promissora alternativa para o controle das doenças parasitárias (Akhtar et al. 2000, Paramita et al. 2006). Githiori et al. (2006) reportam que as plantas com atividade antihelmíntica moderada ainda devem ser consideradas, não como única alternativa para os fármacos anti-helmínticas, mas como parte de um sistema integrado para alcançar um desenvolvimento sustentável de controle de parasitas em sistemas de produção de ruminantes Momordica charantia L. É uma espécie pertencente à família das cucurbitáceas, da qual muitas espécies são comestíveis e reúnem importante valor econômico no Brasil, especialmente aquelas dos gêneros Cucurbita, Momordica, Fevillea e Sechium (Di Stasi 2002). Planta nativa das Américas é uma espécie vegetal silvestre comumente encontrada em áreas urbanas e rurais, conhecida popularmente como Melão-de-São- Caetano. A planta é tolerante a um número variável de ambientes (Lim, 1998) e pode crescer em climas tropicais e subtropicais (Reyes et al., 1994). É usada tradicionalmente na medicina popular em países como Brasil, China, Colômbia, Cuba, Gana, Haiti, Índia, México, Malásia, Nova Zelândia, Nicarágua, Panamá e Peru (Grover 2004). 28

30 As partes utilizadas da Momordica charantia, Melão-de-São-Caetano, são principalmente, as folhas e, em menor escala, os talos e os frutos (Matos, 1994). Os frutos, embora comestíveis, não são recomendáveis para consumo, pois podem produzir aborto, diarréia, hipoglicemia e vômitos. Existem relatos da utilização da planta como antihelmíntico, antitérmico, hipotensor, hipoglicemiante, analgésico intestinal, e contra a febre provocada pela malária, diarréia e reumatismo (Gonzales et al. 1995). Virdi et al. (2003) relatam a utilização do extrato aquoso do fruto no tratamento da diabetes mellitus, devido ao efeito anti-hiperglicêmico. Nesse estudo o extrato foi testado em ratos diabéticos e não apresentou quaisquer sinais de nefrotoxicidade e hepatotoxicidade na avaliação histológica e nos parâmetros bioquímicos. Sharma et al. (1971) descreveram efeito significativo in vitro do extrato de diversas plantas, dentre elas a M. charantia sobre a mortalidade de H. contortus de origem caprina. Lal et al. (1976) constataram também ação desta planta contra Ascaridia galli em aves caipira. Paramita et al. (2006) ressaltaram que, em todo mundo, as propriedades das plantas medicinais são avaliadas quanto ao seu potencial farmacológico, nível de toxicidade e viabilidade econômica. Na medicina tradicional indiana, muitas plantas são utilizadas para tratar infecções parasitárias, e, no estudo realizado, o extrato da M. charantia apresentou o melhor efeito anti-helmintico, com 96% de mortalidade dos nematoides. Volpato et al. (2009) mostraram que imigrantes haitianos e seus descendentes que vivem na província de Camaguey (Cuba) consideram a M. charantia como uma das plantas medicinais mais importantes. É utilizada para tratar parasitas intestinais, além de pruridos de sarampo e varíola, infecções de pele, como furúnculos e aliviar coceira. Em Togo, na África Ocidental, esta planta é utilizada tanto para rituais como para praticas medicinais. O extrato da M. charantia demonstrou elevada atividade antiviral contra Herpes simples tipo I e atividade anti-helmintica contra Caenorhabditis elegans (Beloin et al. 2005) Batista et al. (1999) verificaram ação inibitória de 50% na eclosão de ovos de H. contortus obtidos de ovinos no estado do Ceará, tratados com extrato aquoso de M. charantia. Costa et al. (2006), utilizando a fração acetato de etila, constataram até 100% de inibição da eclosão dos ovos do mesmo parasita. 29

31 Figura 2: Momordica charantia L Calotropis procera (Aiton) Dryand. A Calotropis procera é um arbusto da família Asclepiadaceae e ocorre naturalmente na África e na Ásia (Brandes 2005). Possui ampla distribuição geográfica, se disseminando com muita facilidade por regiões áridas e semiáridas onde a dispersão é favorecida por apresentar sementes aladas envolta por uma plumagem que facilita seu transporte pelo vento (Joly 1997, Souto et al. 2008), sendo comum na região nordeste do Brasil (Rangel et al. 2011). Conhecida popularmente como Algodão-de-Seda, Leiteiro, Queimadeira, Ciúme e Saco de Velho, produz grande quantidade de látex, que é facilmente coletado de suas partes verdes quando sofrem algum dano. Sharma (2011) relata a importância desta planta na India desde tempos antigos, sendo mencionada por antigos escritores hindus, conhecida como Arka. Diferentes partes da C. procera têm sido utilizadas em muitas enfermidades de humanos e animais na medicina tradicional da Índia, como analgésicos, antiinflamatórios, agentes purgativos, anti-helmínticos, anti-microbianos, larvicidas, nematocidas, anti-cancerígenos, no tratamento das úlceras gástricas, nas doenças 30

32 hepáticas e como antídoto de envenenamento por serpentes (Khan & Malik 1989, Basu et al. 1992, Tanira et al. 1994). No Brasil, a C. procera foi introduzida, provavelmente, como ornamental, em época desconhecida, de acordo com Corrêa (1939). Posteriormente, essa planta passou a se comportar como invasora de áreas de pastagens, devido à grande disseminação de suas sementes pelo vento. É encontrada nos estados da região Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste, especialmente, nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo, Mato Grosso, Goiás, e Distrito Federal (Ferreira 1973, Ferreira & Gomes 1974/76). Estudos in vitro do extrato bruto aquoso e do extrato bruto metanólico de flores da C. procera sobre H. contortus evidenciaram mortalidade ou paralisia temporária. Nos estudos in vivo, as flores da C. procera foram administradas na forma de pó bruto, extrato bruto aquoso e extrato bruto metanólico em ovinos naturalmente infectados com diversas espécies de nematoides gastrintestinais. A redução no OPG foi de 88,4 e 77,8% em ovinos tratados com extrato bruto aquoso e o pó bruto, 3g Kg -1 de peso vivo no dia 7 e 10 pós-tratamento, respectivamente. O extrato bruto metanólico foi menos eficaz, com 20,9% de redução do OPG no sétimo dia pós-tratamento. Sugere-se que novas pesquisas sejam realizadas com doses mais elevadas do que as utilizadas nesse estudo, a identificação de princípios ativos e a padronização da dose para o desenvolvimento do fármaco (Iqbal et al. 2005). 31

33 Figura 3: Calotropis procera (Aiton) Dryand. 3. Justificativa O estudo epidemiológico das helmintoses gastrintestinais de uma região é de fundamental importância para o sucesso do controle desses parasitos, pois dependerá da dinâmica populacional na fase de vida livre no meio ambiente e na fase parasitária nos animais que diferenciam de acordo com as condições climáticas de cada região. O controle das helmintoses baseado na utilização de anti-helmínticos químicos eleva os custos da produção, resulta na liberação de resíduos tóxicos na carne, no leite e no meio ambiente, além de selecionar populações de helmintos resistentes aos diferentes grupos de anti-helmínticos químicos. Diante dessa situação que ocorre em todo o mundo, novas informações são essenciais para maximizar o controle e retardar o desenvolvimento da resistência a anti-helmínticos químicos. 32

34 Considerando a importância dos helmintos gastrintestinais na produção de ovinos, bem como o conhecimento da epidemiologia para o programa de controle e o desenvolvimento de populações de nematoides resistentes aos anti-helmínticos, torna-se necessário investir em pesquisas que visem à busca de alternativas de controle, que sejam de baixo custo e menos nocivas à saúde humana e ao meio ambiente. Dentre estas alternativas, consideram-se como mais promissora, merecendo, portanto, maior atenção no que tange ao investimento em pesquisa, o desenvolvimento de fitoterápicos com efeito anti-helmíntico. No entanto, poucos desses produtos foram estudados de acordo com os protocolos científicos modernos. A maioria não pode, portanto, ser aceita como medicamento ético de prescrição livre porque, em geral, são produtos sem eficácia comprovada e sem estudos da eventual toxicidade (Simões et al., 1999). Muitas plantas são tradicionalmente conhecidas como possuidoras de atividade anti-helmíntica nas espécies animais, necessitando, dessa forma, que sejam validadas cientificamente. Assim, a validação cientifica desses produtos é essencial para seu uso como medicamentos alternativos. Os extratos das plantas, Momordica charantia e Calotropis procera, caso seja comprovada a ação anti-helmíntica, permitirão reduzir o uso de produtos químicos ou prolongar a vida útil desses e até mesmo a utilização nas criações de animais de forma orgânica. 4. Hipótese Os ovinos na região do norte de Minas são infectados por helmintos gastrintestinais, e ocorre variação sazonal na intensidade deste parasito. Os extratos do Melão de São Caetano (Momordica charantia) e da Flor-de-Seda (Calotropis procera) possuem atividade contra nematoides gastrintestinais de ovinos. 5. Objetivo geral Observar aspectos epidemiológicos das helmintoses na região do norte de Minas Gerais e avaliar o efeito anti-helmíntico da Momordica charantia e da Calotropis procera em Haemonchus contortus, e contribuir para a redução do problema da verminose a partir do uso de fitoterápicos em ovinos. 33

35 6. Referência Bibliográfica Akhtar MS, Iqbal Z, Khan MN, Lateef M Anthelmintic activity of medicinal plants with particular reference to their use in animals in the Indo-Pakistan subcontinent. Small Ruminant Res 38: Amarante AFT Controle da verminose ovina. Revista CFMV- Brasília/DF Ano XI- n 34. Amarante, AFT, Amarante MRV Breeding sheep for resistance to nematode infections. J AnimVet Adv 2: Amarante, AFT, Barbosa MA Comparison between pasture sampling and tracer lambs to evaluate contamination of sheep pastures by nematode infective larvae. Rev Bras Parasitol Vet 7, 2; Amarante AFT, Bricarello PA, Rocha RA, Gennari SM Resistence of Santa Inês, Suffolk and Ile de France lambs to naturally acquired gastrointestinal nematode infections. Vet Parasitol 120: Athanasiadou S, Githiori J, Kyriazakis, I Medicinal plants for helminth parasite control: facts and fiction. Animal 1, 9: Arosemena, NAE, Bevilaqua CML, Melo ACFL, Girão MD Seasonal variations of gastrointestinal nematodes in sheep and goats from semi-arid area in Brazil. Rev Med Vet 150: Basu A, Sen T, Ray RN, Chaudhuri AKN Hepatoprotective effects of Calotropis procera root extrat on experimental liver damage in animals. Fitoterapia 63, 6: Batista LM, Bevilaqua CML, Moraes SM, Vieira LS In vitro ovicidal and larvicidal effect of the plants Spigelia anthelmia and Momordica charantia against the nematode Haemonchus contortus. Ciênc Anim Bras 9: Beloin N, Gbeassor M, Akpagana K, Hudson J, Soussa K, Koumaglo K, Arnason JK 2005 Ethnomedicinal uses of Momordica charantia (Cucurbitaceae) in Togo and relation to its phytochemistry and biological activity. J Ethnopharmacol 96: Beveridge I. et al Effects of temperature and relative humidity on development an survival of the free-living stages of Trichostrongylus colubriformis, T. rugatus and T. virinus. Vet Parasitol 33, 2: Bevilaqua CML, Melo ACFL Eficácia de antihelmínticos a base de oxfendazol e ivermectin em ovinos no Estado do Ceará. In: Seminário Brasileiro de Parasitologia Veterinária, 1999, Salvador, BA. Anais... Salvador: Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária

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43 CAPITULO I: HELMINTOSES GASTRINTESTINAIS EM OVINOS CRIADOS NO NORTE DE MINAS GERAIS 1. Introdução As discussões sobre o controle de helmintos estão focadas no princípio de que a população parasitária deve ser manejada de forma a não causar problemas clínicos nos hospedeiros ou perdas na produção. Entretanto, essa abordagem não tem sido utilizada de maneira adequada para a redução do uso do anti-helmíntico nas propriedades. Embora tratamentos táticos, ou de acordo com a necessidade, devam ser preferencialmente utilizados nos tratamentos de rotina ou profiláticos (Marley et al., 2006), observa- se a existência de poucos recursos e informações epidemiológicas para apoiarem tomadas de decisão no tratamento dos animais (Chagas et al. 2008). O sucesso de um programa de controle parasitário em ovinos depende do conhecimento da dinâmica populacional da fase de vida livre no meio ambiente e na fase parasitária nos animais (Maciel et al. 2006). Em animais criados a pasto, a maioria das infecções são mistas (Souza et al. 2012), o impacto dessas infecções depende da intensidade e do estado imunológico e fisiológico do hospedeiro. Implementação de práticas de gestão adequadas para promover a saúde animal é um verdadeiro desafio para os criadores em todo o mundo. Uso de tratamento antihelmíntico tem sido questionado por causa do surgimento de estirpes de parasitas resistentes aos medicamentos comumente usados (Melo et al. 2003). Pouco se conhece sobre a epidemiologia das helmintoses em ovinos criados sob condições do semiárido tropical Duarte et al. (2012) e da dinâmica das infecções nas diferentes categorias. 2. Objetivo Determinar a ocorrência e acompanhar a dinâmica das infecções helmínticas do rebanho ovino em diferentes propriedades nos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha, na região norte de Minas Gerais. 42

44 3. Material e métodos O trabalho foi realizado em propriedades rurais na região norte de Minas Gerais nos laboratórios de Helmintologia Veterinária do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais e de Parasitologia Animal da Universidade Estadual de Montes Claros, no período de agosto de 2010 a dezembro de As propriedades se localizam nos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha, inseridas na mesorregião norte do Estado de Minas Gerais, Brasil. Com 15º48 09 de latitude Sul, Janaúba 43º18 32 de longitude e Nova Porteirinha 43º de longitude Leste de Greenwich e 533 m de altitude. Conforme a classificação de Köppen, o clima predominante no polígono das secas é o do tipo Bsh (semi-árido) de agosto de 2010 a dezembro de 2012 a temperatura média máxima foi 32,12 C, a temperatura média mínima de 19,61 C, pluviosidade média mensal de mm e umidade relativa de 56,75%. Os dados meteorológicos foram obtidos da estação convencional no município de Janaúba do INMET (Instituto Nacional e Meteorologia). 3.1 Propriedades estudadas Propriedade A O rebanho possuía dois reprodutores Dorper e 80 animais mestiços Santa Inês com Dorper, sem grau de sangue definidos. Os ovinos receberam água e mistura mineral ad libitum, foram mantidos em piquetes com pastagem de Cynodon. A entrada no piquete acontecia quando o capim era rebaixado, aproximadamente, a 40 cm, após as vacas produtoras de leite, principal atividade nessa propriedade, fossem transferidas para o novo piquete. Na época seca do ano, receberam silagem de sorgo. Não ocorria estação de monta, havendo parições em todas as épocas do ano. E os cordeiros foram mantidos junto às mães até o desmame, sem interferência do homem. Os animais foram vendidos para o abate de acordo a demanda do produto, muitas vezes, sendo mantidos por longo tempo na propriedade. Segundo o proprietário, responsável pelo manejo do rebanho, a aplicação de anti-helmíntico aconteceu no início dos períodos chuvosos, dezembro de 2010, 43

45 novembro de 2011 e outubro de Em março de 2012 foi realizado um teste de resistência anti-helmíntica na propriedade 12 animais foram vermifugados. Os antihelmínticos utilizados foram albendazol 1,9% (Farmazole ovinos -Fagra) e ivermectina 1% (Ivermectina - Ourofino). Propriedade B Possuía reprodutores da raça Dorper em 2010 e 2011, ¾ Dorper com Santa Inês em 2012, e aproximadamente 80 mestiços dessas raças sem grau de sangue definidos. Os animais receberam água e mistura mineral ad libitum, foram mantidos em piquetes com pastagem de Cynodon. Na época seca do ano, alimentaram-se de algaroba, leucena, fubá de milho, tronco de mamão picado. Não foram realizadas estações de monta, as parições aconteceram ao longo do ano. O controle parasitário foi por meio da aplicação de anti-helmínticos químicos quando foram observados sintomas nos animais, como edema submandibular e apatia. No período estudado ocorreram aplicações em dezembro de 2010, outubro e dezembro de 2011; março e outubro de Os anti-helmínticos utilizados foram à base de albendazol 1,9% (Farmazole ovinos -Fagra) e ivermectina 1% (Ivermectina 1% - Ourofino). Propriedade C Os animais durante o dia foram colocados em áreas de cultura de banana e próximo ao aprisco com pastagem de Cynodon., na época de seca recebiam concentrado nos cochos. A água e o sal mineral foram ad libitum; o sal mineral foi fornecido nos cochos junto ao produto homeopático, utilizado como forma de controle dos nematoides gastrintestinais na propriedade, os cordeiros não tinham acesso ao produto, devido à altura dos cochos. As fêmeas próximo ao parto ficaram em baias de alvenaria onde foi fornecido volumoso nos cochos, água ad libitum, sal mineral e o produto homeopático. Possuía reprodutores das raças Dorper e Santa Inês, e 150 animais mestiços dessas raças sem grau de sangue definidos. 44

46 Não foram realizadas estações de monta, as parições aconteciam ao longo do ano. Os cordeiros foram mantidos junto às mães até o desmame, sem interferência do homem. Os animais foram vendidos para o abate de acordo a demanda do produto, muitas vezes, sendo mantidos por longo tempo na propriedade. O controle das helmintoses era realizado por meio do produto homeopático ao longo do ano e aplicações de anti-helmínticos químicos. No período estudado, houve aplicações em dezembro de 2010, outubro de 2011 e setembro de Em janeiro de 2012 foi realizado um teste de resistência anti-helmíntica na propriedade e 6 animais foram vermifugados com albendazol 1,9% (Farmazole ovinos -Fagra) e 6 animais com ivermectina 1% (Ivermectina 1% - Ourofino). Propriedade D O objetivo da ovinocultura nesta propriedade é a comercialização de reprodutores das raças Dorper e Santa Inês. O que ocorre em grande fluxo de comercialização dos animais neste rebanho, variando de 100 a 150 animais. Na época do desmame, as crias são selecionadas pelas características raciais, e transportadas para uma outra propriedade. Os animais receberam água e mistura mineral ad libitum, foram mantidos em piquetes com pastagem de Cynodon. Na época seca do ano, alimentaram-se de capimelefante picado no cocho, e banana e casca de banana, subprodutos de uma indústria de doce de banana localizada no município. Não foram realizadas estações de monta, as parições aconteceram ao longo do ano. O controle parasitário é por meio da administração de anti-helmínticos químicos antes da venda de animais, para a participação em exposições agropecuárias e no período chuvoso. No período estudado, as aplicações ocorreram em dezembro de 2010, maio e outubro de 2011; maio, agosto e novembro de 2012 e o anti-helmíntico utilizados foi a doramectina 1% (Dectomax Pfizer). 3.2 Animais Os animais submetidos às coletas foram tomados ao acaso, correspondendo a aproximadamente 50% do rebanho de cada propriedade e divididos em diferentes 45

47 categorias: fêmeas lactantes, fêmeas gestantes e vazias, machos (acima de seis meses de idade) e crias (fêmeas e machos até seis meses de idade). 3.3 Coleta das amostras fecais As coletas das fezes foram diretamente da ampola retal dos animais, acondicionadas em coletor universal individualmente e transportadas em caixas térmicas, contendo cubos de gelo. A consistência da matéria fecal foi verificada logo após a coleta e classificada de acordo com os seguintes itens: Peletes (com cíbalos firmes e bem formadas); 2 semipeletes (cíbalos amolecidas com forma não definidas e agrupadas umas as outras); 3. pastoso, semidiarréico (fezes pastosas mais amolecidas quase fluidas); 4. diarréia, conforme Berriatua, Green e Morgan (1994). 3.4 Exames laboratoriais Contagem de ovos por grama de fezes Foram realizadas as contagens de ovos por grama de fezes (OPG) de cada animal, conforme a técnica de Gordon & Whitlock modificada, descrita por Ueno & Gonçalves (1998). Coprocultura Foi realizada a cultura das fezes para a obtenção das larvas de estrongilídeos e Strongyloides em amostras fecais dos ovinos, conforme técnica de O Sullivan modificada, conforme descrita por Ueno & Gonçalves (1998). A identificadas foi de até 100 larvas de cada amostra das culturas, seguindo-se Keith (1953) e Wyk, Cabaret e Michael (2004). 4. Resultados e discussão A análise dos dados das contagens de OPG nas propriedades estudadas mostrou influência da precipitação pluvial ocorrida em cada mês sobre esta variável. Na propriedade A, as médias das contagens de OPG variaram de 0 a nas diferentes categorias. Pode-se observar que o pico das contagens de OPG do rebanho foi 46

48 em fevereiro de 2011, com contagem média de OPG (Figuras 1 e 2). Ocorreu a aplicação do anti-helmíntico à base de ivermectina no início do período chuvoso, em novembro de 2010, o que permitiu o controle dos nematoides gastrintestinais até o mês de janeiro do ano seguinte. A elevação das contagens de OPG também foi influenciada pela quantidade de fêmeas gestantes e em lactação no rebanho, sendo as fêmeas lactantes a categoria mais afetada, apresentando picos nos meses de setembro de 2010 (1.667), fevereiro de 2011(3.134), julho de 2012 (850). Nogueira et al. (2009) relataram que matrizes, independente da variação climática ao longo do ano, os meses de maior eliminação de ovos de nematoides corresponderam ao período periparto na região semiárida Norte Mineira. Foi observado também um aumento na contagem de OPG nos machos no mês de fevereiro de 2011 (2.133), quando todas as categorias elevaram as contagens. Nos meses de novembro de 2011, janeiro, março, maio e dezembro de 2012 a categoria de machos foi a mais acometida. Isso pode ter ocorrido por causa do baixo número de machos adultos mantidos nos rebanhos e também por fazerem parte dessa categoria os reprodutores da raça Dorper, já que o restante do rebanho eram mestiços Dorper e Santa Inês. Raças importadas com maior produtividade, ovinos Dorper, apresentam maior susceptibilidade à infecção por helmintos comparada as raças nativas, Santa Inês. Figura 1: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade A, no município de Janaúba Minas Gerais 47

49 Figura 2: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade A, no município de Janaúba Minas Gerais As médias das contagens de OPG na propriedade B variaram de 0 a nas diferentes categorias (Figuras 3 e 4). Pode-se observar que as contagens de OPG elevaram nos meses de fevereiro, abril e novembro de 2011 e fevereiro de 2012, após o aumento da precipitação pluvial na região. Foi constatado também um aumento nas contagens de OPG na categoria de machos nos meses de julho de 2011 (9.700) e fevereiro de 2012 (7.250) devido o pequeno número de animais no rebanho, um animal que apresente contagens altas de OPG pode elevar a média da categoria. O aumento na categoria das crias foi observado em abril de 2011(8.040) e janeiro de 2012(3.454). Isso se justifica porque animais jovens são mais susceptíveis do que os adultos, que são menos predispostos devido à imunidade estabelecida pelas infecções anteriores (Girão et al. 1980, Ahid et al. 2008). 48

50 Figura 3: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade B, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais Figura 4: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade B, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais As médias das contagens de OPG variaram de 0 a nas diferentes categorias na propriedade C (Figuras 5 e 6). Pode-se verificar que os picos das contagens de OPG do rebanho aconteceram em novembro e dezembro de 2010 e dezembro de 2011, em decorrência do aumento da precipitação pluvial na região. 49

51 Figura 5: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade C, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais Figura 6: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade C, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais Na propriedade D, as médias das contagens de OPG variaram de 0 a nas diferentes categorias (Figuras 7 e 8). Pode-se observar que o pico nas contagens de OPG do rebanho foi em março de 2011, com contagens de OPG de 3.778,1, o período chuvoso iniciou em outubro de 2010 e a aplicação do anti-helmíntico no mês de dezembro de 2010 ocasionou o retardado nas contagens de OPG. 50

52 A categoria que apresentou contagens mais altas foi a das crias, nos meses de março (10.300) e abril de 2011(12.288). Figura 7: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 da propriedade D, no município de Janaúba Minas Gerais Figura 8: Valores médios das contagens de ovos de estrongilídeos por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de setembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade D, no município de Janaúba Minas Gerais Foi observado um aumento nas contagens de OPG nas fêmeas lactantes da propriedade A, o que já foi relatado por alguns autores (Chagas et al, 2008; Chauhan et al., 2003) e inclusive a ocorrência da doença clínica em animais não tratados. No entanto, Sievers et al. (2002) constataram variação na eliminação fecal de ovos de helmintos em fêmeas em lactação. 51

53 A análise das médias das contagens de OPG de Moniezia sp. mostrou variação com o aumento do índice pluviométrico e de acordo com as diferentes categorias do rebanho (Figuras 9 e 10). A categoria das crias foi a mais afetada, apresentando picos nas contagens de OPG no mês de novembro de 2010, com média de 1.406, fevereiro e março de 2011, com médias de e 1.796, respectivamente, e em julho de As baixas contagens de OPG de Moniezia e a ausência nas categorias acimas de 6 meses de idade, demonstram que os ovinos adquirem mecanismos de defesa contra esse helminto. As prevalências de Moniezia sp. variaram nas propriedades A, B, C e D de 4.7, 7.5, 9 e 8%, consecutivamente em todo período estudado. As maiores prevalências mensais ocorreram no ano de 2012, em janeiro nas propriedades A (40,6%) e B (27,5%), em abril na propriedade C com 33,3% e em julho com 70,4% na propriedade D. Isto ocorreu devido o maior número de crias infectadas em relação ao total do rebanho. Figura 9: Valores médios das contagens de ovos de Moniezia sp. por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 em 4 propriedades, nos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha Minas Gerais 52

54 Figura 10: Valores médios das contagens de ovos de Moniezia sp. por grama de fezes (OPG) nas quatro categorias de ovinos da raça Santa Inês e mestiços durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 em 4 propriedades, nos municípios de Janaúba e Nova Porteirinha Minas Gerais Os resultados das coproculturas (Figura 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) mostraram que o principal gênero de nematoides gastrintestinais encontrado nos rebanhos durante o estudo, foi Haemonchus, seguido de Trichostrongylus, Oesophagostomum e Strongyloides. Entretanto, estudando ovinos criados também na região norte do estado de Minas Gerais, Nogueira et al. (2009) relataram a predominância do gênero Trichostrongylus, seguido de Haemonchus, Strongyloides e Cooperia. Na Propriedade A (Figura 11), onde os ovinos eram colocados no piquete posteriormente aos bovinos, foi observado o gênero Cooperia, 0,14%. Figura 11: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade A, no município de Janaúba Minas Gerais 53

55 Figura 12: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de setembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade A, no município de Janaúba Minas Gerais Figura 13: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade B, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais. 54

56 Figura 14: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade B, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais. Figura 15: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 na propriedade C, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais Figura 16: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade C, no município de Nova Porteirinha Minas Gerais 55

57 Figura 17: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de agosto de 2010 a outubro de 2011 da propriedade D, no município de Janaúba Minas Gerais Figura 18: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas nas coproculturas (L3) durante os meses de novembro de 2011 a dezembro de 2012 na propriedade D, no município de Janaúba Minas Gerais 5. Conclusões A variação nas contagens de OPG das propriedades estudadas pode estar relacionada às diferentes condições de manejo nutricional, genética e instalações dos animais. As categorias das fêmeas lactantes e das crias apresentam maiores contagens de OPG. A categoria dos machos requer uma melhor avaliação quando apresentar contagens de OPG elevada. Os principais gêneros de helmintos que parasitam os ovinos das propriedades estudadas são Haemonchus e Trichostrongylus. 56

58 6. Referência Bibliográfica Ahid SMM, Suassuna ACD, Maia MB, Costa VMM, Soares HS Parasitos gastrintestinais em caprinos e ovinos da região oeste do Rio Grande do Norte, Brasil. Ciênc Anim Bras 9(1): Berriatua E, Green LE, Morgan KL 1994 A descriptive epidemiological study of coccidiosis in early lambing housed flocks. Vet Parasitol 54: Chagas ACS, Oliveira MCS, Esteves SN, Oliveira HN, Giglioti R, Giglioti C, Carvalho CO, Ferrezini J, Shiavone DC Parasitismo por nematóides gastrintestinais em matrizes e cordeiros criados em São Carlos, São Paulo Rev Bras Parasitol Vet 17, Supl. 1: Chauhan KK, Susceptibility to natural gastro-intestinal nematode infection in different physiological stages in Jamunapari and Barbari goats in the semi-arid tropics. Small Ruminant Res 50: Duarte ER, Silva RB, Vasconcelos VO, Nogueira FA, Oliveira NJF Diagnóstico do controle e perfil de sensibilidade de nematódeos de ovinos ao albendazol e ao levamisole no norte de Minas Gerais. Pesq Vet Bras 32: Girão E.S., Girão R.N. & Medeiros L.P Prevalência e variação estacional de helmintos gastrintestinais de caprinos no município de Valença do Piauí. Circ.Téc.1, Embrapa-CPAMN, Teresina. 5p Keith, R.K The differentiation on the infective larvae of some common nematode parasites of cattle. Aust J Zool 1: Maciel FC, Ahid SMM, Moreira FRC Manejo sanitário de caprinos e ovinos. In: Lima GFC, Holanda Júnior EV, Maciel FC, Barros NN, Amorim MV, Confessor Júnior AA, organizadores. Criação familiar de caprinos e ovinos no Rio Grande do Norte: orientações para viabilização do negócio rural. Natal: SINTEC: Marley CL, Fraser MD, Davies DA, Rees ME, Vale JE, Forbes AB 2006 The effect of mixed or sequential grazing of cattle and sheep on the faecal egg counts and growth rates of weaned lambs when treated with anthelmintics. Vet Parasitol 142,1-2: Melo ACFL, Reis IF, Bevilaqua CML, Vieira LS, Echevarria FAM, Melo LM Nematódeos resistentes a anti-helmínticos em rebanhos de ovinos e caprinos do estado do Ceará, Brasil. Ciênc Rural 33: Nougueira FA, Rocha FT, Ribeiro GC, Silva NO, Geraseev LC, Almeida AC, Duarte ER Variação sazonal da contaminação por helmintos em matrizes ovinas e borregos submetidos a controle integrado e criados em pastagens tropicais. Ciênc Rural 39:

59 Sievergs G, Estudio anual de La eliminación de huevos y ooquistes de parásitos gastrintestinales y larvas de nematodos pulmonares em ovinos de uma estância em Magallanes, Chile. Arch Med Vet 34, n1: Souza MF, Pimentel-Neto M, Silva RM, Farias ACB, Guimarães MP Gastrointestinal parasites of sheep, municipality of Lajes, Rio Grande do Norte, Brasil. Rev Bras Parasitol Vet 21(1): Ueno H, Gonçalves PC Manual para diagnóstico das helmintoses de ruminantes. 4 ed, Tókio: Japan International Cooperation Agency, Wyk JA, Cabaret J, Michael LM Morphological identification of nematode larvae of small ruminants and cattle simplified. Vet Parasitol 119(4):

60 CAPITULO II: CORRELAÇÕES ENTRE VARIÁVEIS COPROPARASITOLÓGICAS, HEMATOLÓGICA E FÍSICA DE OVELHAS SANTA INÊS PARASITADAS POR NEMATÓDEOS GASTRINTESTINAIS NO PERÍODO PERIPARTO 1. Introdução As helmintoses gastrintestinais são responsáveis por grandes perdas econômicas observadas em criações de ovinos, levando a menor capacidade de crescimento, redução do potencial produtivo, inclusive com a morte de animais. Os ovinos mantidos em manejo extensivo e semi extensivo, geralmente, são parasitados por diferentes espécies de helmintos gastrintestinais concomitantemente e as mais freqüentes nas regiões tropicais são: Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis, Strongyloides papillosus, Cooperia spp. e Oesophagostomum columbianum. Dentre estes o gênero Haemonchus, parasito hematófago do abomaso, é considerado o mais importante em ovinos nas diferentes regiões do Brasil e do mundo (Troell et al. 2005, Santos et al. 2012) por ser o mais patogênico e o mais prevalente; esta relacionado com o aumento nas contagens de OPG, com aparecimento de sinais clínicos como anemia edema submandibular e abdominal, emagrecimento e morte dos animais. Outros aspectos, também interferem na fisiopatologia e epidemiologia dessas helmintoses, por exemplo, o efeito do período periparto na carga parasitaria e consequentemente nas contagens de ovos por grama de fezes (OPG) (Acevedo-Ramírez et al. 2012). Estas helmintoses podem acarretar perda de peso e da condição corporal, sendo que a correlação entre o peso vivo e o escore de condição corporal é de média magnitude (r = 0,365). Portanto, o escore corporal pode ser utilizado para avaliar a resistência dos animais aos parasitos (Quirino et al. 2011). 2. Objetivo Avaliar a relação entre as contagens de OPG, hematócrito, escore de condição corporal (ECC), coloração de mucosa ocular e larvas cultivadas das fezes de ovelhas Santa Inês no período periparto antes e após tratamento anti-helmíntico. 59

61 3. Material e métodos Foram utilizadas 34 ovelhas com idade de 1 a 2 anos da raça Santa Inês sincronizadas por esponja intravaginal contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MAP) e inseminadas artificialmente. O diagnóstico de gestação foi realizado através da ultra-sonografia após 35 dias de inseminação, para confirmação da prenhez. Os animais estavam infectados naturalmente por Haemonchus (68%) Trichostrongylus (26,%), Oesophagostomum (5,7%), e Strongyloides (0,3%) e foram mantidos em sistema de produção extensivo em piquetes de Brachiaria mutica, com lotação média 0,75 UA/ha. Foram realizadas nos dias 30 e 15 antes do parto, no dia do parto e 7, 15, 30, 45 e 60 dias após o parto, coletas de fezes, sangue, avaliado o escore de condição corporal e a coloração da mucosa ocular de cada ovelha. As avaliações do escore de condição corporal (ECC) foram feitas utilizando-se uma escala de 1 a 6, onde 1 é muito magra e 6 obesa, com intervalos em 0,5, por meio de inspeção e palpação dos processos espinhosos e transversos para observação da camada de gordura e músculos adaptado de Russel et al. (1969). O aspecto da coloração observado no exame das mucosas oculares foi conferido por pontuação com escore de 1 a 4; sendo 1 (muito pálida), 2 (pálida), 3 (rósea claro), 4 (rósea) (Van Wyk and Bath, 2002). Todas as avaliações de score foram feitas pelo mesmo avaliador. Utilizou-se para contagens de (OPG) a técnica de Gordon and Whitlock modificada (Ueno and Gonçalves, 1998) enquanto que na coprocultura a de O sullivan modificada (Ueno and Gonçalves, 1998) sendo as larvas recuperadas, conservadas em tubos de ensaio sob refrigeração 4ºC e identificadas posteriormente. Nestes mesmos dias foram realizadas coletas de amostras sanguíneas de todos os animais através de punção da veia jugular em tubos vacutainer estéreis, contendo EDTA a10%, para determinação do volume globular pelo método de microhematócrito. Quando as contagens médias ultrapassaram 1800 ovos realizou-se o tratamento de todos os animais com ivermecina 1% (IVOTAN Intervet) para manter o bem estar dos animais. Foi realizada correlação simples de Pearson as variáveis contagens de OPG, hematócrito, score de condição corporal, coloração da mucosa e larvas por meio do software estatístico Prisma 5. 60

62 4. Resultados e discussão Na figura 1 encontram-se os valores médios das contagens de OPG e hematócrito nas diferentes coletas antes e após o parto. No dia do parto as contagens médias de OPG atingiram e o hematócrito de 23,4% quando foram tratadas com ivermectina, como pode ser observado, as menores porcentagens de hematócrito coincidiram com o pico das contagens de OPG. Os resultados corroboram com Kawano et al. (2001) em cordeiros. Figura 1: Valores médios das contagens de OPG e porcentagem de hematócrito durante o período periparto de ovelhas Sete dias após o parto houve a queda de 81,4% nas contagens de OPG como conseqüência da administração da ivermectina nos animais logo após o parto, mas, não houve negativação dessas contagens devido provavelmente a presença de resistência parcial ao referido anti-helmíntico. Esta resistência foi observada em todos os gêneros, ou seja, Haemonchus, Trichostrongylus, Oesophagostomum, Strongyloides (Figura 2). Outros fatores que também podem ter favorecido o aumento das contagens de OPG nas coletas subseqüentes foram a reinfecção dos animais e a queda de imunidade que ocorre no período periparto e em animais em lactação como descrito por vários autores (Santiago et al. 1970; Amarante et al. 1992, Lima & Guimarães 1992). O gênero 61

63 Trichostrongylus aumentou após a administração do anti-helmíntico, sugerindo resistência anti-helmíntica desses parasitos. Figura 2: Porcentagem de larvas de helmintos recuperadas das coproculturas de ovelhas Santa Inês no período periparto Os valores do micro hematocrito diminuíram à medida que as contagens de OPG aumentaram atingindo o menor valor de 23,4 no dia do parto, deve-se ressaltar que após o tratamento anti-helmíntico, com a queda das contagens de OPG, esses valores aumentaram demonstrando a influencia desses helmintos na redução dos valores hematológicos, provavelmente, devido à expoliação sanguínea e hemorragia nos pontos de fixação dos helmintos, à resposta hematopoiética lenta como já foi sugerido por Rahman & Collins (1992). Na tabela 1, encontram-se os valores médios do escore da coloração da mucosa ocular que variou de 2,47 a 3,1 e o de condição corporal entre 3,69 a 4,47. Os escores mais baixos ocorreram no dia do parto quando as contagens de OPG estavam mais altas e foi realizado o tratamento anti-helmíntico e permaneceram baixos ate sete dias após. A partir do 15º dia pós-parto, a coloração da mucosa ocular e o score de condição corporal aumentaram, em resposta a utilização da ivermectina, porque as infecções causadas por helmintos, normalmente, ocasionam diminuição do consumo de alimentos, da capacidade de digestão e absorção dos nutrientes, consequentemente redução no ganho de peso e no escore de condição corporal e anemia, que leva a alteração na coloração da mucosa. 62

64 Tabela 1 Valores médios do escore de coloração da mucosa ocular e escore de condição corporal no periparto de ovelhas Santa Inês Dias Coloração de mucosa ocular Escore de condição corporal -30 2,74 3, ,91 4 Parto 2,56 3,69 7 2,47 3, ,81 3, , ,1 4, ,61 4,19 Os resultados da cultura de larvas nos diferentes dias de coletas (Figura 2) demonstram a predominância de larvas do gênero Haemonchus, principalmente no préparto e no parto. Pode-se observar o aumento percentual das larvas de Trichostrongylus e Strongyloides após a utilização da ivermectina no pós-parto, provavelmente devido à menor eficácia deste fármaco sobre estes helmintos ou mesmo pela presença de resistência a ela. A tabela 2 apresenta os coeficientes de correlação de Pearson estudados em ovelhas Santa Inês naturalmente infectadas por helmintos gastrintestinais. Tabela 2 Coeficientes de correlação entre contagem de ovos por grama de fezes (OPG), hematócrito, escore de condição corporal (ECC), coloração da mucosa ocular (CMO) em ovelhas Santa Inês OPG Hematocrito ECC CMO OPG -0.46** -0.19* -0.43** Hematocrito -0.46** 0.44** 0.59** ECC -0.19* 0.44** 0.44** CMO -0.43** 0.59** 0.44* * P<0.05, ** P< O coeficiente de correlação para as contagens de OPG e hematócrito foi negativo (-0,46) e entre OPG, indicando que a diminuição do volume globular nos animais ocorreu quando aumentou as contagens de OPG, em parte pelo parasitismo causado pelo gênero Haemonchus. Esta evidência é corroborada pelo coeficiente de 63

65 correlação entre OPG e coloração da mucosa ocular que também foi negativo (-0,43) e altamente significativo (P< 0,0001), em que um sinal clínico de anemia, dentre outros pode se dar pela diminuição da coloração das mucosas do animal. Esses resultados estão de acordo com os encontrados por vários autores que observaram a correlação entre a coloração da mucosa ocular, o valor do hematócrito e a incidência do parasita hematófago, H. contortus Van Wyk et al. (1997). Foi observado entre hematócrito e coloração de mucosa ocular coeficiente de correlação médio e positivo (0,59), no entanto, Van Wyk et al. (1997) encontraram valores maiores quando associaram os valores de hematócrito com diferentes colorações da conjuntiva ocular e comprovaram que cinco graus de anemia preestabelecidos com auxílio de computação gráfica apresentaram correlação de 0,8 com grau de confiabilidade, superior a 95%, para infecções causadas por H. contortus. A correlação entre as contagens de OPG e ECC foi baixa e negativa (-0,19) o que mostra a capacidade de alguns animais adultos suportarem altas cargas parasitárias, já que o OPG é o teste mais aplicado para diagnóstico parasitário em ruminantes, porém com significativa margem de variação. Dessa forma, o ECC não é uma variável que pode-se correlacionar com a contagem de OPG de um animal. Valores baixos do hematócrito, assim como da coloração de mucosas oculares em ovinos, devem ser avaliados associado a contagem de OPG e cultura de larvas, visto a interação do parasitismo gastrintestinal sobre estes parâmetros. 5. Referência Bibliográfica Acevedo-Ramírez PMC, Quiroz-Romero H, Cruz-Mendoza I, Ulloa-Arvizu R, Ibarra- Velarde F Gastrointestinal nematodes in rotationally grazing ewes in the mountainous region of central Mexico. J Helminthol 87, : 1-7. Amarante AFT, Barbosa MA, Oliveira M, Siqueira ER Eliminação de ovos de nematódeos gastrintestinais por ovelhas de quatro raças durante diferentes fases reprodutivas. Pesq Agro Bras 27, Kawano EL, Yamamura MH, Ribeiro ELA Efeitos do tratamento com antihelmíntico em cordeiros naturalmente infectados com helmintos gastrintestinais sobre os parâmetros hematológicos, ganho de peso e qualidade da carcaça. Arq Fac Vet 29:

66 Lima WS, Guimarães MP Comportamento das infecções helmínticas em vacas de rebanho de corte durante a gestação e a lactação. Arq Bras Med Vet Zootec 44: Quirino CR, Carneiro-Silva RM, Costa RLD, Madella-Oliveira AF Correlações entre peso, escore de condição corporal, Famacha, volume globular e ovos por grama de fezes em ovelhas Santa Inês. Act Ibe Con Ani 1: Rahman WA, Collins GH An association of faecal eggs counts and prolactin concentration in sera of periparturient Angora goats. Vet Parasitol 43: Russel AJF, Doney JM, Gunn RG Subjective assessment of body fat in live sheep. J Agr Sci 72: Santiago M, Gonzales JC, Benevenga S O aumento súbito do número de ovos de nematódeos nas fezes das ovelhas na época do parto. Ver Med Vet 5: Santos MC, Silva BF, Amarante FT Environmental factors influencing the transmission of Haemonchus contortus. Vet Parasitol 188: Troell K, Waller P, Hoglund J The development and overwintering survival of free- living larvae of Haemonchus contortus in Sweden. J Helminthol 79: Ueno H.; Gonçalves PC Manual para diagnóstico das helmintoses de ruminantes. 4 ed, Tókio: Japan International Cooperation Agency, Van Wyk JA, Malan FS., Randles, J. L., How long before resistance makes it impossible to control some field strains of Haemonchus contortus in South Africa with modern anthelmintics. Vet Parasitol 70, Van Wyk JA, Bath G The FAMACHA system for managing Heamonchosis in sheep and goats by clinically identifying individual animals for treatment. J Vet Res 33:

67 CAPITULO III: ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DO EXTRATO DE MOMORDICA CHARANTIA SOBRE OVOS E LARVAS DE HAEMONCHUS CONTORTUS 1. Introdução Um dos principais problemas limitantes da ovinocultura são as helmintoses gastrintestinais. Além de diminuir a produtividade do rebanho, esses parasitos causam elevada mortalidade, principalmente durante o período chuvoso (Pinheiro et al. 2000). Geralmente, os produtores e técnicos, na tentativa de controlar as infecções helmínticas nos animais, utilizam de forma indiscriminada os anti-helmínticos químicos, os quais são vendidos sem restrições nas lojas do seguimento agropecuário. Esta utilização desordenada desencadeia um grande problema para as criações, a resistência anti-helmíntica. O uso de plantas com propriedades anti-helmínticas parece ser uma alternativa eficaz, tanto do ponto de vista do controle parasitário quanto ao impacto ambiental de resíduos em relação aos produtos químicos existentes no mercado. O emprego da fitoterapia pode aumentar os lucros, reduzindo o uso de anti-helmínticos convencionais e prolongando a vida útil dos produtos anti-helmínticos disponíveis (Chagas et al. 2008). A validação científica da atividade anti-helmíntica de plantas medicinais sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes é baseada na realização de testes in vitro e in vivo. Para isto, são preparados extratos ou frações enriquecidas em determinadas substâncias das plantas para os testes (Athanasiadou et al. 2007). O protocolo utilizado na preparação desses extratos varia desde metodologias simples, onde o solvente utilizado é água, até metodologias complexas, onde uma série de solventes orgânicos é usada (Watherman & Mole, 1994). Embora diversas plantas sejam tradicionalmente utilizadas como antihelmínticos, suas propriedades medicinais devem ter validação científica para comprovar a segurança de administração aos animais e eficácia sobre os parasitos (Athanasiadou & Kyriazakis, 2004). Entre as plantas usadas como anti-helmínticos na medicina popular estão a Momordica charantia pertencente à família das cucurbitáceas (Melão-de-São-Caetano). 66

68 Em estudo etnobotânico realizado na Índia relatou-se a utilização do suco de M. charantia contra diabetes (PATTANAIK et al. 2008). O extrato aquoso de M. charantia apresentou atividade antifúngica contra Cryptococcus neoformans (Sousa e Matos, 1991) e as sementes demonstraram propriedades anti-inflamatórias e importante uso para a medicina tradicional tibetana (Fang et al. 2007). Vieira et al (1999) demonstraram ação in vivo das hastes de M. charantia contra nematoides em caprinos. Batista et al (1999) relataram que o extrato de M. charantia possuía ação ovicida e larvicida in vitro em Haemonchus contortus e ressaltou a necessidade da ratificação e complementação experimental para a validação científica. 2. Objetivo Avaliação da composição química do extrato bruto da Momordica charantia e eficiência anti-helmíntica em ovos e larvas de Haemonchus contortus. 3. Material e métodos Amostras das plantas, extração e preparo dos extratos brutos (EB) A coleta da planta Momordica charantia foi realizada no município de Janaúba, Norte de Minas Gerais no período de setembro e outubro de 2012, respectivamente. As amostras foram processadas no laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFMG, sob orientação da Profª. Drª. Maria das Graças Lins Brandão. As referências estão depositadas no Banco de Drogas Vegetais, DATAPLAMT, no Museu de História Natural e Jardim Botânico da UFMG. O processo utilizado para a produção do extrato bruto (EB) da planta foi percolação a frio. Para a produção desse extrato, foram separadas as partes aéreas (folhas e galhos) da M. charantia; após secagem em estufa a 40ºC, o material foi reduzido a pó em moinho de facas tipo Willey. Os pós foram então extraídos por percolação a frio, usando álcool etílico a 80 GL como solvente extrator. Após o processo de percolação, o percolato foi concentrado a vácuo até a eliminação do álcool, obtendo-se o extrato bruto concentrado. Em seguida, esse extrato foi submetido à liofilização em Becker de vidro até que o material secasse, objetivando eliminar resíduos de água e promover estabilidade dos compostos bioativos presentes no extrato. Os extratos brutos foram separados em frascos, identificados e armazenados em dessecador de vidro com sílica azul, fechado à vácuo. 67

69 Para a obtenção das frações, uma porção de extrato bruto de cada espécie foi separadamente diluída em água destilada, e submetida à partição líquido-líquido em funil de separação. A partição com diclorometano forneceu a fração em diclorometano. As frações aquosas resultantes do procedimento anterior foram submetidas à partição com n-butanol saturado com água. Obteve-se assim a fração n-butanol e a fração aquosa. As soluções obtidas das partições foram evaporadas a temperatura máxima de 55 C em rotavapor. As frações obtidas foram mantidas refrigeradas a -1ºC Cromatografia em camada delgada (CCD) Para caracterização química das plantas, foram realizados testes de identificação de flavonoides, saponinas, alcalóides e taninos por cromatografia em camada delgada (CCD). Aproximadamente, 10 mg de cada amostra foram dissolvidos em 1 ml de metanol. Uma pequena alíquota (10 20 μl) foi aplicada em uma placa de alumínio coberta com sílica gel. Essa placa foi colocada em uma cuba cromatográfica contendo o eluente específico para cada classe de substância. Após a eluição, as placas foram retiradas das cubas e evaporadas à temperatura ambiente. Em seguida, as placas foram borrifadas com o revelador específico para a identificação das possíveis substâncias. a) Flavonoides: Para a identificação de flavonoides, o eluente utilizado foi uma mistura de acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético glacial: água (100: 11: 11: 26). A placa foi revelada com difenilboratoetilamina 1% em metanol (NP) seguido de polietilenoglicol % em etanol (PEG). A placa foi aquecida por 5 min, a 105 ºC e, em seguida, visualizada em luz ultravioleta (UV) a 365 nm. Foram utilizadas amostras de referências de ácido clorogênico e rutina. b) Saponinas: A identificação de saponinas foi realizada utilizando uma mistura dos eluentes clorofórmio: ácido acético glacial: metanol: água (64: 32: 12: 08) e o revelador anisaldeído sulfúrico. A placa foi aquecida por 5 min, a 105 ºC e, em seguida, visualizada no visível. A amostra de referencia foi a saponina comercial. c) Alcaloides: Para avaliar a presença de alcaloides, a mistura de eluente utilizada foi tolueno: metano: dietilamina (40: 5: 5). A placa foi revelada com Dragendorff e seca ao ar frio. Utilizou-se boldina como amostra de referencia. 68

70 d) Taninos: Para a caracterização do tanino, o eluente utilizado foi uma mistura de acetato de etila: tolueno: acido fórmico: água (60:20:20:15). A placa foi revelada com cloreto férrico. A placa foi aquecida e visualizada no visível. Foram utilizadas as amostras de referências Hamamelis e ácido gálico Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 1-Preparo de extrato bruto M. charantia 10mg/mL: foram diluídos em metanol e filtrados em unidade filtrante de 0,45μm, diretamente para vial. 2- Preparo de Padrões: Todos os padrões fora diluídos em metanol e filtrados em unidade filtrante de 0,45μm, diretamente para vial. Concentração: -Ácido clorogênico (0,025 mg/ml) - Ácido cafeico (0,025 mg/ml) - Rutina (0,07mg/ml) - Quercetina (0,07 mg/ml) - Ácido gálico (1mg/mL) - Epicatequina (1mg/mL) Condições cromatográficas: O cromatógrafo utilizado é provido de detector ultravioleta a 220 nm; pré-coluna empacotada com sílica octadecilsilanizada, coluna de 250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, empacotada com sílica octadecilsilanizada (5 µm); fluxo da fase móvel de 1,2 ml/minuto e temperatura do forno de 40ºC. Volume de injeção 10 μl. Fase Móvel: Eluente A: Ácido Fosfórico - Água (0,5: 99,5) v/v. Eluente B: Ácido Fosfórico- Acetonitrila (0,5: 99,5) v/v. 69

71 Gradiente de Concentração: Tempo (min) Fase móvel A (% V/V) Fase móvel B (% V/V) Avaliação do extrato bruto in vitro Recuperação de ovos de Haemonchus contortus Dois ovinos, com 1 ano e 3 meses de idade, livres de infecção helmíntica avaliados por contagens de OPG e coprocultura foram mantidos em baias e inoculados por via oral com larvas de terceiro estágio (L3) de Haemonchus contortus. As fezes para recuperação dos ovos de H. contortus foram coletadas diretamente do reto dos animais após 21 dias da infecção experimental, apresentando contagem média de OPG de A técnica para recuperação dos ovos foi adaptada a metodologia descrita por Bizimenyera et al (2006). As fezes foram misturadas, maceradas, lavadas e filtradas em peneiras com 100 e 55 μm, onde receberam água sob pressão para posteriormente serem recolhidos os ovos na peneira de 25 μm. Os ovos foram distribuídos em tubos Falcon para centrifugação em 300 g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionado solução saturada de NaCl para suspensão dos ovos e centrifugados novamente. Para a retirada da solução saturada realizou-se três lavagens com água destilada com centrifugações. O volume total de ovos obtidos foi ajustado para 100 ovos em 20 μl Teste da eclodibilidade de ovos (TEO) Foi dissolvido 5000 mg do extrato bruto liofilizado em DMSO 3% e em seguida realizado várias diluições seriadas a fim de diluir o DMSO que acima da concentração 0.5% é toxico para células de mamíferos e que também poderia interferir no desenvolvimento embrionário dos ovos de Haemonchus contortus. Posteriormente foi colocado 2000 mg em 1 ml de água destilada, na sequência adicionou-se mais 1 ml de 70

72 água destilada ficando agora com uma solução 1000 mg ml -1 de extratos brutos em 0.75% de DMSO. Na interação in vitro foi colocado um volume final de 240 μl, na primeira concentração que foi 100 mg ml -1, sendo necessário colocar 24 μl de extrato bruto, 206 μl de água destilada, e por último 10 μl da solução contendo 100 ovos de Haemonchus contortus. Nas outras concentrações 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg.ml -1 acrescentou-se respectivamente 12, 6,3, 1.5, 0.75μL de extrato bruto acertando o volume para 230 μl com água destilada e finalmente adicionando os 10 μl da solução de ovos. O diluente utilizado, DMSO, ficou na concentração final de 0.075, 0.03, 0.018, 0.009, 0.004, 0.002% nos teste de , 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1, respectivamente. Testou-se in vitro a concentração de DMSO 0.03%, controle negativo, em ovos de H. contortus e não se observou interferência na embriogênese. O controle positivo utilizado foi o sulfóxido de Albendazol (0,04 mg.ml -1 ) e o controle negativo água destilada e DMSO (0,03%). Os testes foram realizados em placas de transferência com 96 poços, estas placas foram incubadas a 27ºC em BOD (Nova Ética- 411/D-155) durante 24 e 48 h. Após este período, identificaram-se e quantificaram-se larvas e ovos em microscópio óptico. As variáveis quantificadas foram: ovo blastomerado (OB), ovo com embrião deformado (OED), ovo larvado (OL), ovo com larva destruída (OLD), larva com motilidade (LCM), larva sem motilidade (LSM). Foram realizadas 6 repetições com 4 réplicas para cada concentração do extrato e para os controles. A eficiência (E) para o TEO por poço foi calculada de acordo a fórmula: E = (ovos + L1) L1/ ovos + L1 x Teste de desenvolvimento larvar (TDL) Para obtenção de larvas de primeiro estádio (L1) foi incubado uma solução contendo aproximadamente ovos em 20 ml de água destilada por 24 horas a 27ºC em incubadora BOD (Nova Ética- 411/D-155). As larvas L1 após a eclosão dos ovos foram concentradas com auxílio de uma peneira de 25 µm de modo que o restante de ovos ficou retido na malha da peneira. Adicionou-se 100 L1 em 100 μl de água 71

73 destilada, 50 μl de uma solução contendo Escherichia coli, fonte de alimento aos parasitos, a cada poço da placa estéril (Microplaca de transferência com 96 poços) e incubadas por 24 e 48 h a 27ºC em incubadora BOD (Nova Ética- 411/D-155) na presença dos extratos de 100 μl brutos de M. charantia e seus respectivos controles. As concentrações finais dos extratos foram 100, 50, 25, 12.5, 6.25 mg ml -1. A diluição do extrato foi realizada como já descrito no item e a interação in vitro constituída da seguinte forma: O volume final de 250 μl foi estabelecido com 100 μl de L1 de H. contortus, 50 μl de E. coli e foi colocado, na primeira concentração de 100 mg ml -1, 25 μl de extrato bruto, 75 μl de água destilada. As outras concentrações 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1 acrescentou-se respectivamente 12.5, 6.25,3.12, 1.56, 0.78 μl de extrato bruto acertando o volume para 250 μl com água destilada. O diluente utilizado, DMSO, ficou na concentração final de 0.075, 0.03, 0.018, 0.009, 0.004, 0.002% nos teste de , 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1, respectivamente. Testou-se in vitro a concentração de DMSO 0.03%, controle negativo, em ovos de H. contortus e não se observou interferência na embriogênese. O controle positivo utilizado foi o sulfóxido de Albendazol (0,04 mg ml -1 ), e o controle negativo água destilada e DMSO (0,03%). A eficiência (E) para o TDL por poço foi calculada de acordo a fórmula: E = larvas sem motilidade / total de larvas x Análise estatística Como as médias não apresentaram distribuição normal, se fez a transformação utilizando-se log x+1, após a conversão, as médias atenderam a aditividade e a normalidade. Aplicou-se o teste Tukey a 5% de probabilidade para comparar os controles com as concentrações dos extratos de M. charantia. Também realizou-se o estudo de regressão a 5% de probabilidade para avaliar o comportamento das crescentes concentrações do extrato. Utilizou-se o software estatístico Prisma 5 para a execução de ambos os testes. Foi utilizado o SAS Probit analylis para estimar as concentrações letais de 50% e 75% (CL50 e CL75) para ovos e de 50% e 90% (CL50 e CL90) para larvas. 72

74 4. Resultados O rendimento obtido a partir da percolação a frio das partes aéreas de M. charantia secas e moídas foi 1.118,74 gramas o que corresponde a 18,15% do peso inicial. A cromatografia de camada delgada sugere a presença de saponinas, alcaloides e taninos ao extrato bruto das folhas de M. charantia. A Figura 1 mostra o perfil cromatográfico, em CCD, do EB das partes aéreas da M. charantia. As bandas amareladas fluorescentes, com Fator de Retenção (Rf) entre 0,55 e 0,72 encontradas nos EB da M. charantia indicam a presença de flavonóides. A amostra referência de rutina, flavonóide utilizado como padrão, apresentou fluorescência amarela no Rf 0,55. O padrão de referência de ácido clorogênico, no Rf 0,62, de coloração azul fluorescente não foi observado, indicando ausência de ácidos fenólicos. A B C Figura 1: Cromatografia em camada delgada para identificação de flavonóide. A, EB de M. charantia; B, padrão ácido clorogênico; C, padrão rutina. Eluente, acetato de etila: ácido fórmico; ácido acético glacial: água (100:11:11:26); revelador, difenilboratoetilamina a 1% em metanol seguido de polietilenoglicol 4000 a 1% em etanol (PEG); visualização, luz ultravioleta a 365 nm A figura 2 mostra o perfil cromatográfico em CCD para saponinas. O padrão de referencia, saponina comercial, apresentou duas manchas de coloração roxo claro, nos Rf 0,32 e Rf 0,41, que foram observadas também nos EB de M. charantia com Rfs de 0,80. Estas colorações sugerem a presença de terpenos e/ou saponinas. 73

75 A B Figura 2: Cromatografia em camada delgada para identificação de saponina. A, EB de M. charantia; B, padrão saponina comercial. Eluente, clorofórmio: ácido acético glacial: metanol: água (64:32:12:08); revelador, anisaldeído sulfúrico. visualização, luz visível, após aquecimento A Figura 3 mostra o cromatograma obtido para alcalóides. A amostra de referencia de boldina apresentou bandas de coloração violeta, que não foi observada no EB da planta. No entanto, a coloração avermelhada observada com a revelação com reagente Draggendoff, específico para alcalóides, indica a presença dessas substâncias na amostra. Figura 3: Cromatografia em camada delgada para identificação de alcalóide. A, EB de M. charantia; B, padrão boldina. Eluente, tolueno: metano: dietilamina (40:5:5); revelador, dragendorff; visualização A Figura 4 mostra o perfil comatrográfico em CCD para taninos. Foram observadas bandas de coloração azul escuro nos Rfs 0,48 e 0,71 para as amostras 74

76 referência de hamamelis e ácido gálico, respectivamente. Manchas na cor azul claro foram visualizadas no Rf 0,19 para a referência hamamelis e para o EB das partes aéreas de M. charantia, após revelação com cloreto férrico e aquecimento, indicando a presença de taninos na amostra. A B C Figura 4: Cromatografia em camada delgada para identificação de tanino. A, EB de M. charantia; B, padrão Hamamelis; C, padrão ácido gálico. Eluente, acetato de etila: tolueno: acido fórmico: água (60:20:20:15); revelador, cloreto férrico. visualização, luz visível, após aquecimento Na cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de ultravioleta DAD (CLAE/DAD) vários picos foram observados no extrato bruto das partes aéreas de M. charantia (figura 5a). Pelas análises no comprimento de onda ultravioleta, a presença de flavonoides se destacou como demonstrado nos tempos de retenção 5.93 e 7.75 (figura 5c, d) sendo que o perfil do UV foi semelhante ao padrão verificado para rutina. 75

77 5a 5b 5c Figura 5: (a) perfil cromatográfico do extrato de folha de M. charantia; (b) (c) picos cromatográficos Quando o extrato bruto de folhas de M. charantia foi adicionado in vitro aos ovos e larvas de primeiro estádio (L1) de H. contortus notou-se alteração no padrão biológico do parasito. Os extratos de M. charantia, nas concentrações 3.12, 6.25, , e mg ml -1, foram avaliados 24 e 48 horas (Figura 6). A inibição do desenvolvimento embrionário e consequentemente queda na eclosão dos ovos foi proporcional à dose de extrato bruto testado. Em 24h de incubação in vitro na concentração 3.12 mg ml -1, a maioria das L1 já havia eclodido (95,7%). As concentrações de 50 e 100 mg ml -1 inibiram a taxa de eclodibilidade dos ovos de H. contortus em 21% e 37%, respectivamente. Tendência também observada ao analisar os dados das concentrações 6.25 mg ml -1 e mg ml -1, que apresentaram uma porcentagem de inibição de 27% quando comparados com a concentração 5n de mg ml -1. Analisando o efeito entre as mesmas concentrações durante o período, notou-se que de 24 para 48h a eficiência do extrato de M. charantia diferiram estatisticamente 76

78 apenas com 3.12 mg ml -1, que foi 3 vezes maior ao final do teste in vitro. Também, entre a concentração 100 mg ml -1, notou-se tal diferença, com aumento da inibição da eclodibilidade no tempo 24h. Eficácia do teste TEO (%) a a a b a b a b a b Extrato M. charantia (mg ml -1 ) a b 24h 48h Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente na mesma concentração pelo Teste de Tukey (P 0,05) Figura 6: Porcentagem de eficácia do teste de inibição da eclodibilidade (TEO) em ovos de Haemonchus contortus. A Tabela 1 mostra a eficácia média de inibição da eclosão de ovos de H. contortus em EB de M. charantia. A concentração de mg ml -1 de M. charantia apresentou inibição na eclosão de ovos semelhante ao sulfóxido de Albendazol e diferentes em relação à água destilada e o DMSO 0.03%. As concentrações abaixo de 12.5 mg ml -1 não diferiram da água e DMSO, 25.0 e 50.0 mg ml -1 também foram semelhantes. A diferença entre o controle positivo e 50.0 mg ml -1 foi de 49%. 77

79 Tabela 1 Teste de eclodibilidade (TEO) de ovos de Haemonchus contortus, com extratos de Momordica charantia, e controles. Controles Eficácia (erro-padrão) ABZ (mg ml -1 ) (0.31) e Água 5.16 (1.48) a DMSO 0.03% 9.34 (0.19) a Extratos (mg ml -1 ) (1.76) a (8.19) ab (8.40) ab (3.02) bc (12.83) cd (4.43) de Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey (P 0,05). Sulfóxido de Albendazol (ABZ), água destilada e dimetilsulfóxido (DMSO) Quanto maior a concentração do extrato de M. charantia, maior foi o efeito inibitório na eclosão das larvas de H. contortus (Figura 7). Y= X R 2 = 0.72 P<0.050 Eficácia do teste TEO (%) Extrato M. charantia (mg ml -1 ) (48h) Figura 7: Porcentagem de eficácia do teste de eclodibilidade (TEO) em ovos de H. contortus em diferentes concentrações do extrato bruto de M. charantia. Diferenças significativas foram observadas entre as médias de ovos com embrião deformado, ovos larvados, ovos com larvas destruídas, larvas com motilidade e sem motilidade nas diferentes concentrações do extrato de M. charantia e controles. As larvas móveis encontradas nas concentrações de 3.12 mg ml -1 foram estatisticamente 78

80 semelhantes as dos controles negativos, enquanto que as concentrações de 6.25, 12.50, 25.0, 50.0, mg ml -1 foram similares ao controle positivo. Os ovos com embrião deformado e ovos com larva destruída foram diferentes em todas as concentrações testadas do extrato e da água e DMSO. Os ovos larvados encontrados na concentração de mg ml -1 diferenciaram dos de 3.12 mg ml -1 e dos controles. As larvas de primeiro (L1) e segundo estádio (L2) que não apresentaram motilidade em 12.5 mg ml -1 foram semelhantes as demais concentrações e diferentes dos controles. 79

81 Tabela 2 Médias e erros-padrão (log x+1) do número de ovos e larvas de Haemonchus contortus às 48 h de incubação com extrato de Momordica charantia e controles Desenvolvimento de H. contortus Controles OB OED OL OLD LCM LSM ABZ 10.51(0.31)a 56.86(0.03)a 1.00(0.13)a 48.23(0.07)a 0.00(0.00)a 1.02(0.14)a Água 5.01(0.14)a 0.00(0.00)b 0.64(0.11)a 0.00(0.00)b 89.67(0.03)b 0.51(0.09)a DMSO 4.64(0.07)a 0.13(0.03)b 9.06(0.12)a 0.00(0.00)b 86.17(0.02)b 0.00(0.00)a M. charantia (mg ml -1 ) (0.24)a 0.00(0.00)b 0.00(0.00)a 0.00(0.00)b 82.04(0.06)b 20.91(0.51)ab (0.14)a 1.21(0.16)b 32.25(0.39)ab 0.37(0.09)b 8.87(0.32)a 52.23(0.39)ab (0.07)a 0.28(0.06)b 31.87(0.30)ab 0.00(0.00)b 0.39(0.08)a 59.86(0.38)b (0.15)a 0.17(0.04)b 37.95(0.18)ab 0.63(0.12)b 0.00(0.00)a 55.45(0.37)ab (0.19)a 0.06(0.22)b 55.93(0.13)ab 0.05(0.02)b 0.09(0.03)a 36.68(0.34)ab (0.20)a 0.81(0.14)b 67.83(0.06)b 1.77(0.20)b 0.00(0.00)a 24.91(0.30)ab OB ovo blastomerado, OED ovo embrião deformado, OL ovo larvado, OLD ovo com larva destruída, LCM larva com motilidade, LSM larva sem motilidade.

82 A CL50 e CL75 do TEO para o extrato de M. charantia foi de 25,86 (24,33-27,50) e 108,32 (97,38-121,90) mg ml -1, respectivamente (Figura 8) P r o b a b i l i t y DOSE Figura 8: Curva da concentração-resposta do teste de eclodibilidade do extrato de Momordica charantia (mg ml -1 ) contra ovos de Haemonchus contortus. Quando as larvas de primeiro estádio de H. contortus foram incubadas em 6.25, 12.50, 25.00, 50.00, e mg ml -1 de extrato bruto de M. charantia, a inibição de motilidade variou de 75 a 100% nas diferentes concentrações testadas em 24 e 48h, mostrando ação evidenciada já nas primeiras 24h do extrato de M. charantia (Figura 9). Eficácia do teste TDL (%) a a a a a a a a a a h 48h Extrato M. charantia (mg ml -1 ) Figura 9: Eficácia do teste de desenvolvimento larvar (TDL) em larvas de Haemonchus contortus em diferentes concentrações do extrato de Momordica charantia.

83 a a a a a a b b Eficácia do teste TDL (%) ABZ DMSO Extrato M. charantia (mg ml -1 ) Água Letras iguais na coluna não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey (P 0,05) Figura 10: Eficácia do teste de desenvolvimento larvar (TDL) em larvas de Haemonchus contortus em diferentes concentrações do extrato de Momordica charantia e controles sulfóxido de albendazol (ABZ), água destilada e dimetilsulfóxido (DMSO) No entanto, quando comparado aos controles negativo e positivo algumas diferenças entre o padrão de motilidade de L1 foram verificadas (Figura 10), as diferentes concentrações dos extratos de M. charantia 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, mg ml -1 foram semelhantes ao controle positivo e diferentes dos controles negativos. A curva de concentração-resposta do teste de desenvolvimento larval de H. contortus para o extrato de M. charantia na CL50 e CL95 foi de 0,67 (0,39-0,98) e 5,68 (4,89-6,42) mg ml -1, respectivamente (Figura 11). 82

84 P r o b a b i l i t y Figura 11: Curva de concentração-resposta do teste de desenvolvimento larval do DOSE extrato de Momordica charantia (mg ml -1 ) contra larvas de Haemonchus contortus. Quando o extrato bruto de M. charantia foi fracionado em hexano, diclorometano, butanol e água observou-se padrões diferentes de alteração na embriogênese de ovos de Haemonchus contortus (Figura 12), após 24 horas de incubação in vitro. No tratamento com água destilada e DMSO 0.01% o processo de embriogênese foi verificado em 65% dos ovos sendo possível notar uma porcentagem de 38% de larvas livres e vivas no meio, no sulfóxido de albendazol 95% dos ovos ainda estavam em embriogênese e as larvas (L1) estavam mortas. O processo de alteração da embriogênese verificado nas subfrações dos extratos de M. charantia foi 73% para o hexano, e 77% para o butanol, para fração aquosa 70% o que corresponde a taxas de 8,2%, 12%, 5% maiores que o padrão observado nos controles negativos, água destilada e DMSO 0.01%, e consequentemente inferiores ao do controle positivo sulfóxido de albendazol. Já as larvas L1 presentes no meio apresentaram motilidade serpentiformes em todos os tratamentos com a subfrações. Sendo que a fração do diclometano apresentou 7% de larvas mortas. 83

85 Haemonchus contortus (%) ovos L1 vivas L1 mortas Fração Hexano Fração Diclorometano Fração Butanol Fração Aquosa ABZ(SO) DMSO 0.01% água destilada Figura 12: Porcentagem de eficácia do teste de inibição da eclodibilidade (TEO) em ovos de H. contortus em diferentes frações de extrato de Momordica charantia 5. Discussão A capacidade de inibição da eclosão dos ovos pode ser de importância epidemiológica significativa, porque pode ajudar a diminuir o risco das helmintoses, limitando a infecção em pastos manejados com ruminantes (Max, 2010). Testes in vitro com estágios de vida livre de H. contortus foram realizados com metodologia semelhante à deste trabalho para avaliação preliminar de plantas com atividade anti-helmíntica (Cala et al. 2012, Silveira et al. 2012). Resultados diferentes deste experimento foram encontrados por Batista et al (1999) utlizando o extrato aquoso de M. charantia, os autores obteveram 50% de inibição da eclosão em H. contortus com 0,10 mg ml -1. Porcentagem de ovos viáveis menor do que as encontradas neste trabalho foram relatadas por Gomes et al (2010) (70,37%), utilizando concentração de 50 mg ml -1 do extrato de folha, caule e fruto de M. charantia. Esses autores utilizaram o fruto da planta na preparação do extrato. Portanto, sugere-se que a diferença na viabilidade dos ovos se deu pela inclusão do fruto no extrato. 84

86 Os diferentes estágios do desenvolvimento do H. contortus encontrados neste experimento, após 48h de incubação, demostraram atividade ovicida e larvicida. Patel & Campbell (1998) também encontraram ação simultânea de um anti-helmíntico sobre larvas e ovos em uma mesma geração do nematoide Caenorhabditis elegans, a porcentagem de larvas que eclodiam morreram sob a ação do anti-helmíntico. Assim, segundo Batista et al (1999), o retardamento da eclosão de ovos e atuação sobre larvas podem resultar numa inviabilização do total de ovos eliminados pelo parasito. Contudo, nota-se que o efeito ovicida e larvicida da M. charantia nessa pesquisa ocorreu em concentrações mais altas quando se compara com outras plantas com o mesmo efeito, a exemplo do trabalho de Cala et al (2012) que utilizaram µg ml -1 em extrato hexânico de Melia azedarach e µg ml -1 de extrato metanólico de Trichilia claussenii para inibir a eclodibilidade de ovos de H. contortus. A eficiente ação larvicida da M. charantia deste trabalho encontrada pelo teste TEO foi confirmada quando se utilizou o teste TDL, em 24 ou 48h de leitura. Cordeiro et al (2010) relataram valores médios de larvas viáveis maiores que as encontradas neste trabalho 91.43, 96.00, 72.13, 51.53, 13.28% nas concentrações de 3, 6, 12, 25 e 50 mg ml -1, respectivamente, após 72h da incubação de ovos de nematoides com extrato etanólico de M. charantia. A variação de resultados em diferentes trabalhos científicos, a exemplo do citado acima, deve-se, segundo Chagas e Vieira (2007) & Cala et al. (2012), há uma dificuldade em diminuir os erros-padrão na eficácia dos testes, porque, num extrato, as substâncias bioativos não podem ser distribuídas homogeneamente no interior do material ou pode ser afetada pela técnica ou processo utilizado na produção do extrato Ao demonstrar ação ovicida e larvicida, fazem-se necessários a identificação dos compostos do extrato fracionado e estudos in vivo sobre a planta M. charantia. Para o controle parasitário eficiente, leva-se em consideração que uma população parasitária seja controlada a uma quantidade que não cause danos ao seu hospedeiro. Consequentemente, pode haver desaceleração do desenvolvimento da resistência antihelmíntica, já que os produtos químicos poderão ser menos utilizados (Batista et al. 1999, Cordeiro et al. 2010, Ferreira et al. 2013). 85

87 6. Conclusão O extrato de Momordica charantia apresentou ação ovicida e larvicida sobre Haemonchus contortus nos testes in vitro, sendo uma promissora alternativa para o controle das helmintoses. 7. Agradecimentos Ao suporte financeiro da FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais) e CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). 8. Referência Bibliográfica Athanasiadou S, Githiori J, Kyriazakis I Medicinal plants for helminth parasite control: facts and fiction. Animal 1, 9 : Athanasiadou, S.; Kyriazakis I Plant secondary metabolites: antiparasitic effects and their role in ruminant production systems. Proc Nutr Soc 63: Batista LM, Bevilaqua CML, Moraes SM, Vieira LS Atividade ovicida e larvicida in vitro das plantas Spigelia anthelmia e Momordica charantia contra o nematódeo Haemonchus contortus. Ciênc Animal 9, 2: Cala AC, Chagas ACS, Oliveira MCS, Matos AP, Borges, LMF, Sousa LAD, Souza FA, Oliveira GP In vitro Anthelmintic effect of Melia azedarach L. and Trichilia claussenii C.against sheep gastrointestinal nematodes Exp Parasitol 130: Chagas ACS, Vieira LS, Freitas AR, Araújo MR, Araújo-Filho JA, Aragão WR, Navarro AMC Anthelmintic efficacy of neem (Azadirachta indica a. juss) and the homeopathic product Fator Vermes in Morada Nova sheep. Vet Parasitol 151: Chagas ACS, Vieira LS Ação de Azadirachta indica (Neem) em nematódeos gastrintestinais de caprinos. Braz J Vet Res Anim Sci 44, 1: Cordeiro LN, Athayde ACR, Vilela VLR, Costa JGM, Silva WA, Araujo MM, Rodrigues OG Efeito in vitro do extrato etanólico das folhas do melão-de- São-Caetano (Momordica charantia L.) sobre ovos e larvas de nematóides gastrintestinais de caprinos Rev Bras Pl Med 12, 4: Fang QM, Zhang H, Caob Y, Wang C Anti-inflammatory and free radical scavenging activities of ethanol extracts of three seeds used as Bolengguazi J Ethnopharmacol 114:

88 Ferreira LE, Castro PMN, Chagas ACS, França SC, Beleboni RO In vitro anthelmintic activity of aqueous leaf extract of Annona muricata L. (Annonaceae) against Haemonchus contortus from sheep. Exp Parasitol 134 : Gomes RVRS, Araújo MM, Gomes EM, Vilela VLR, Athayde ACR Ação antiparasitária in vitro dos extratos etanólicos de Operculina hamiltonii (batata de purga) e Momordica charantia (melão de são caetano) sobre ovos e larvas de nematóides gastrintestinais de caprinos do semi-árido paraibano. Acta Vet Brasilica 4, 2: Max RA Effect of repeated wattle tannin drenches on worm burdens, faecal egg counts and egg hatchability during naturally acquired nematode infections in sheep and goats. Vet Parasitol 169: Pattanaik C, Sudhakar Reddy C, Murthy MSR 2008 An ethnobotanical survey of medicinal plants used by the Didayi tribe of Malkangiri district of Orissa, India Fitoterapia 79: Patel MR, Campbell WC Inhibitory effect of chlorpromazine on nematode eggs and larvae. J Parasitol 84: Pinheiro RR, Gouveia AMG, Alves FSF, Haddad JP Aspectos epidemiológicos da caprinocultura cearense. Arq Bras Med Vet Zoo 52: Silveira RX, Chagas ACS, Botura MB, Batatinha, MJM, Katiki LM, Carvalho CO, Bevilaqua CML, Branco A, Machado EAA, Borges SB, Almeida MAO Action of sisal (Agave sisalana, Perrine) extract in the in vitro development of sheep and goat gastrointestinal nematodes Exp Parasitol 131: Sousa MP, Matos FJA Constituintes químicos de plantas medicinais brasileiras. Imprensa Universit aria/ufc, Fortaleza: Vieira LS Métodos alternativos de controle de nematóides gastrintestinais em caprinos e ovinos. Rev Tecnol Ciên Agropec 2: Watherman PG, Mole S Extraction and chemical quantification. In: Lawton, J. H.; Likens, G. E. Analysis of Phenolic Plant Metabolites. Blackwell Sci Publicat

89 CAPITULO IV: ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DOS EXTRATOS DE CALOTROPIS PROCERA SOBRE OVOS E LARVAS DE HAEMONCHUS CONTORTUS 1. Introdução As helmintoses gastrintestinais provocam grandes prejuízos na criação de ovinos por acarretarem retardo no crescimento, diminuição do consumo de alimento e, consequente, perda em peso, podendo levar a morte de animais. A principal forma de controle das helmintoses é a utilização de anti-helmínticos químicos. A má utilização destes produtos químicos desencadeou a resistência antihelmíntica. Para evitar que novos compostos e aqueles que ainda têm eficácia em uma população de pequenos ruminantes venham ser descartados em função da resistência anti-helmíntica são necessárias medidas que prolonguem a vida útil desses fármacos (Molento et al 2013). Algumas limitações do uso de medicamentos, como altos custos de alguns produtos disponíveis no mercado, resíduos nos alimentos, risco de poluição ambiental, desenvolvimento de resistência aos anti-helmínticos pelos nematoides e redução da eficiência produtiva em animais de produção favorece o estudo de plantas com propriedades medicinais para o controle de diversas doenças (Prichard 1990, Waller et al. 1995, Herd 1995, Fox 1997, Hammond et al. 1997, Vieira et al. 1999, Githigia et al. 2001, Melo et al. 2003,Camurça-Vasconcelos et al. 2005). A utilização de plantas com ação anti-helmíntica é uma alternativa para o controle das helmintoses gastrintestinais. Entre as plantas utilizadas como antihelmínticos na medicina popular estão a Calotropis procera (Algodão-de-Seda). Sendo necessários estudos científicos que possam validar e quantificar sua ação como antihelmíntico. A Calotropis procera, popularmente conhecida no Nordeste brasileiro como flor-de-seda, possui diversos nomes de acordo com as regiões do Brasil, entre eles: Algodão-de-Seda, Algodão-da-Praia, Leiteira, Paininha-de-Seda, Leiteiro, Queimadeira, Pé-de-Balão, Janaúba e Ciúme. Pertencente à família Asclepiadaceae, esta espécie vegetal possui porte arbustivo ou subarbustivo, podendo chegar a 3,5 m de altura, ereta e perene com poucas ramificações (Rangel & Nascimento 2011; Silva et al. 2013). 88

90 2. Objetivo Avaliação da composição química do extrato bruto da Calotropis procera e eficiência anti-helmíntica em ovos e larvas de Haemonchus contortus. 3. Material e métodos Amostras das plantas, extração e preparo dos extratos brutos (EB) A coleta da planta Calotropis procera foi realizada no município de Janaúba, Norte de Minas Gerais no período de setembro e outubro de 2012, respectivamente. As amostras foram processadas no laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da UFMG, sob orientação da Profª. Drª. Maria das Graças Lins Brandão. As referências estão depositadas no Banco de Drogas Vegetais, DATAPLAMT, no Museu de História Natural e Jardim Botânico da UFMG. O processo utilizado para a produção do extrato bruto (EB) das plantas foi percolação a frio. Para a produção desse extrato, foram separadas as folhas da C. procera; após secagem em estufa a 40ºC, o material foi reduzido a pó em moinho de facas tipo Willey. Os pós foram então extraídos por percolação a frio, usando álcool etílico a 80 GL como solvente extrator. Após o processo de percolação, o percolato foi concentrado a vácuo até a eliminação do álcool, obtendo-se o extrato bruto concentrado. Em seguida, esse extrato foi submetido à liofilização em Becker de vidro até que o material secasse, objetivando eliminar resíduos de água e promover estabilidade dos compostos bioativos presentes no extrato. Os extratos brutos foram separados em frascos, identificados e armazenados em dessecador de vidro com sílica azul, fechado à vácuo. Para a obtenção das frações, uma porção de extrato bruto de cada espécie foi separadamente diluída em água destilada, e submetida à partição líquido-líquido em funil de separação. A partição com diclorometano forneceu a fração em diclorometano. As frações aquosas resultantes do procedimento anterior foram submetidas à partição com n-butanol saturado com água. Obteve-se assim a fração n-butanol e a fração aquosa. As soluções obtidas das partições foram evaporadas a temperatura máxima de 55 C em rotavapor. As frações obtidas foram mantidas refrigeradas a -1ºC. 89

91 3.2- Cromatografia em camada delgada (CCD) Para caracterização química da planta, foram realizados testes de identificação de flavonoides, saponinas, alcalóides e taninos por cromatografia em camada delgada (CCD). Aproximadamente, 10 mg de cada amostra foram dissolvidos em 1 ml de metanol. Uma pequena alíquota (10 20 μl) foi aplicada em uma placa de alumínio coberta com sílica gel. Essa placa foi colocada em uma cuba cromatográfica contendo o eluente específico para cada classe de substância. Após a eluição, as placas foram retiradas das cubas e evaporadas à temperatura ambiente. Em seguida, as placas foram borrifadas com o revelador específico para a identificação das possíveis substâncias. a) Flavonoides: Para a identificação de flavonoides, o eluente utilizado foi uma mistura de acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético glacial: água (100: 11: 11: 26). A placa foi revelada com difenilboratoetilamina 1% em metanol (NP) seguido de polietilenoglicol % em etanol (PEG). A placa foi aquecida por 5 min, a 105 ºC e, em seguida, visualizada em luz ultravioleta (UV) a 365 nm. Foram utilizadas amostras de referências de ácido clorogênico e rutina. b) Saponinas: A identificação de saponinas foi realizada utilizando uma mistura dos eluentes clorofórmio: ácido acético glacial: metanol: água (64: 32: 12: 08) e o revelador anisaldeído sulfúrico. A placa foi aquecida por 5 min, a 105 ºC e, em seguida, visualizada no visível. A amostra de referencia foi a saponina comercial. c) Alcaloides: Para avaliar a presença de alcaloides, a mistura de eluente utilizada foi tolueno: metano: dietilamina (40: 5: 5). A placa foi revelada com Dragendorff e seca ao ar frio. Utilizou-se boldina como amostra de referencia. d) Taninos: Para a caracterização do tanino, o eluente utilizado foi uma mistura de acetato de etila: tolueno: acido fórmico: água (60:20:20:15). A placa foi revelada com cloreto férrico. A placa foi aquecida e visualizada no visível. Foram utilizadas as amostras de referências Hamamelis e ácido gálico. 90

92 3.3- Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 1-Preparo do extrato bruto de C. procera folhas 2mg/mL: foram diluídos em metanol e filtrados em unidade filtrante de 0,45μm, diretamente para vial. 2- Preparo de Padrões: Todos os padrões foram diluídos em metanol e filtrados em unidade filtrante de 0,45μm, diretamente para vial. Concentração: -Ácido clorogênico (0,025 mg/ml) - Ácido cafeico (0,025 mg/ml) - Rutina (0,07mg/ml) - Quercetina (0,07 mg/ml) - Ácido gálico (1mg/mL) - Epicatequina (1mg/mL) Condições cromatográficas: O cromatógrafo utilizado é provido de detector ultravioleta a 220 nm; pré-coluna empacotada com sílica octadecilsilanizada, coluna de 250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro interno, empacotada com sílica octadecilsilanizada (5 µm); fluxo da fase móvel de 1,2 ml/minuto e temperatura do forno de 40ºC. Volume de injeção 10 μl. Fase Móvel: Eluente A: Ácido Fosfórico - Água (0,5: 99,5) v/v. Eluente B: Ácido Fosfórico- Acetonitrila (0,5: 99,5) v/v. Gradiente de Concentração: Tempo (min) Fase móvel A (% V/V) Fase móvel B (% V/V) Avaliação do extrato bruto in vitro Recuperação de ovos de Haemonchus contortus Dois ovinos, com 1 ano e 3 meses de idade, livres de infecção helmíntica avaliados por contagens de OPG e coprocultura foram mantidos em baias e inoculados por via oral com larvas de terceiro estágio (L3) de Haemonchus contortus. As fezes para 91

93 recuperação dos ovos de H. contortus foram coletadas diretamente do reto dos animais após 21 dias da infecção experimental, apresentando contagem média de OPG de A técnica para recuperação dos ovos foi adaptada a metodologia descrita por Bizimenyera et al (2006). As fezes foram misturadas, maceradas, lavadas e filtradas em peneiras com 100 e 55μm, onde receberam água sob pressão para posteriormente serem recolhidos os ovos na peneira de 25μm. Os ovos foram distribuídos em tubos Falcon para centrifugação em 300 g por 5minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionado solução saturada de NaCl para suspensão dos ovos e centrifugados novamente. Para a retirada da solução saturada realizou-se três lavagens com água destilada com centrifugações. O volume total de ovos obtidos foi ajustado para 100 ovos em 20 μl Teste da eclodibilidade de ovos (TEO) Foi dissolvido 5000mg do extrato bruto liofilizado em DMSO 3% e em seguida realizado várias diluições seriadas a fim de diluir o DMSO que acima da concentração 0.5% é toxico para células de mamíferos e que também poderia interferir no desenvolvimento embrionário dos ovos de Haemonchus contortus. Posteriormente foi colocado 2000 mg em 1mL de água destilada, na sequência adicionou-se mais 1 ml de água destilada ficando agora com uma solução 1000 mg.ml -1 de extratos brutos em 0.75% de DMSO. Na interação in vitro foi colocado um volume final de 240 μl, na primeira concentração que foi 100 mg ml -1, sendo necessário colocar 24 μl de extrato bruto, 206 μl de água destilada, e por último 10 μl da solução contendo 100 ovos de Haemonchus contortus. Nas outras concentrações 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1 acrescentou-se respectivamente 12, 6,3, 1.5, 0.75μL de extrato bruto acertando o volume para 230 μl com água destilada e finalmente adicionando os 10 μl da solução de ovos. O diluente utilizado, DMSO, ficou na concentração final de 0.075, 0.03, 0.018, 0.009, 0.004, 0.002% nos teste de , 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1, respectivamente. Testou-se in vitro a concentração de DMSO 0.03%, controle negativo, em ovos de H. contortus e não se observou interferência na embriogênese. O controle positivo utilizado foi o sulfóxido de Albendazol (0,04 mg ml -1 ) e o controle negativo água destilada e DMSO (0,03%). 92

94 Os testes foram realizados em microplacas estéreis com 96 poços, estas placas foram incubadas a 27ºC em BOD (Nova Ética- 411/D-155) durante 24 e 48 h. Após este período, identificaram-se e quantificaram-se larvas e ovos em microscópio óptico. As variáveis quantificadas foram: ovo blastomerado (OB), ovo com embrião deformado (OED), ovo larvado (OL), ovo com larva destruída (OLD), larva com motilidade (LCM), larva sem motilidade (LSM). Foram realizadas 6 repetições com 4 réplicas para cada concentração do extrato e para os controles Teste de desenvolvimento larvar (TDL) Para obtenção de larvas de primeiro estádio (L1) foi incubado uma solução contendo aproximadamente ovos em 20 ml de água destilada por 24 horas a 27ºC em incubadora BOD (Nova Ética- 411/D-155). As larvas L1 após a eclosão dos ovos foram concentradas com auxílio de uma peneira de 25 µm de modo que o restante de ovos ficou retido na malha da peneira. Adicionou-se 100 L1 em 100 μl de água destilada, 50 μl de uma solução contendo Escherichia coli, fonte de alimento aos parasitos, a cada poço da placa estéril (Microplaca de transferência com 96 poços) e incubadas por 24 e 48 h a 27ºC em incubadora BOD (Nova Ética- 411/D-155) na presença dos extratos de 100 μl brutos de C. procera e seus respectivos controles. As concentrações finais dos extratos foram 100, 50, 25, 12.5, 6.25 mg ml -1. A diluição do extrato foi realizada como já descrito no item e a interação in vitro constituída da seguinte forma: O volume final de 250 μl foi estabelecido com 100 μl de L1 de H. contortus, 50 μl de E. coli e foi colocado, na primeira concentração de 100 mg ml -1, 25 μl de extrato bruto, 75 μl de água destilada. As outras concentrações 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1 acrescentou-se respectivamente 12.5, 6.25,3.12, 1.56, 0.78 μl de extrato bruto acertando o volume para 250 μl com água destilada. O diluente utilizado, DMSO, ficou na concentração final de 0.075, 0.03, 0.018, 0.009, 0.004, 0.002% nos teste de , 50.00, 25.00, 12.50, 6.25, 3.12 mg ml -1, respectivamente. Testou-se in vitro a concentração de DMSO 0.03%, controle negativo, em ovos de H. contortus e não se observou interferência na embriogênese. O controle positivo utilizado foi o sulfóxido de Albendazol (0,04 mg ml -1 ), e o controle negativo água destilada e DMSO (0,03%). 93

95 A eficiência (E) para o TDL por poço foi calculada de acordo a fórmula: E = larvas sem motilidade / total de larvas x Analise estatística Como as médias não apresentaram distribuição normal, se fez a transformação utilizando-se log x+1, após a conversão, as médias atenderam a aditividade e a normalidade. Aplicou-se o teste Tukey a 5% de probabilidade para comparar os controles com as concentrações dos extratos de C. procera. Também realizou-se o estudo de regressão a 5% de probabilidade para avaliar o comportamento das crescentes concentrações do extrato. Utilizou-se o software estatístico Prisma 5 para a execução de ambos os testes. Foi utilizado o SAS Probit analylis para estimar as concentrações letais de 50% e 75% (CL50 e CL75) para ovos e de 50% e 90% (CL50 e CL90) para larvas. 4. Resultados O rendimento obtido da extração de folhas de C. procera secas e moídas foi de 572,19 g o que equivale a 16,77% a partir da percolação a frio seguida de completa evaporação do solvente. A B C Figura 1: Cromatografia em camada delgada para identificação de flavonóide. A, EB da folha de C. procera; B, padrão ácido clorogênico; C, padrão rutina. Eluente, acetato de etila: ácido fórmico; ácido acético glacial: água (100:11:11:26); revelador, difenilboratoetilamina a 1% em 94

96 metanol seguido de polietilenoglicol 4000 a 1% em etanol (PEG); visualização, luz ultravioleta a 365 nm A figura 2 mostra o perfil cromatográfico em CCD para saponinas dos EBs das plantas. O padrão de referencia, saponina comercial, apresentou duas manchas de coloração roxo claro, nos Rf 0,32 e Rf 0,41, que foram observadas também nos EB de M. charantia e na folha de C. procera, com Rfs de 0,80 e 0,72, respectivamente. Estas colorações sugerem a presença de terpenos e/ou saponinas. A B Figura 2: Cromatografia em camada delgada para identificação de saponina. A, EB da folha de C. procera; B, padrão saponina comercial. Eluente, clorofórmio: ácido acético glacial: metanol: água (64:32:12:08); revelador, anisaldeído sulfúrico. visualização, luz visível, após aquecimento A Figura 3 mostra o cromatograma obtido para alcalóides. A amostra de referencia de boldina apresentou bandas de coloração violeta, que não foi observada no EB da planta. No entanto, a coloração avermelhada observada com a revelação com reagente Draggendoff, específico para alcalóides, indica a presença dessas substâncias na amostra. 95

97 Figura 3: Cromatografia em camada delgada para identificação de alcalóide. A, EB da folha de C. procera; B, padrão boldina. Eluente, tolueno: metano: dietilamina (40:5:5); revelador, dragendorff; visualização A Figura 4 mostra o perfil comatrográfico em CCD para taninos. Foram observadas bandas de coloração azul escuro nos Rfs 0,48 e 0,71 para as amostras referência de hamamelis e ácido gálico, respectivamente. Manchas na cor azul claro foram visualizadas no Rf 0,19 para a referência hamamelis e para o EB das partes aéreas de M. charantia não foi observado após revelação com cloreto férrico e aquecimento, não indicando a presença de taninos na amostra. A B C Figura 4 : Cromatografia em camada delgada para identificação de tanino. A, EB da folha de C. procera; B, padrão Hamamelis; C, padrão ácido gálico. Eluente, acetato de etila: tolueno: acido 96