PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

Transcrição

1 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Estudo Cromossômico em Morcegos Hematófagos: Zoo-FISH com Sondas Cromossômicas de Carollia brevicauda e Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae - Chiroptera). Cibele Gomes de Sotero Caio Recife 2008

2 Cibele Gomes de Sotero Caio Estudo Cromossômico em Morcegos Hematófagos: Zoo-FISH com Sondas Cromossômicas de Carollia brevicauda e Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae - Chiroptera). Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Genética. Orientador: Profª. Drª. Neide Santos, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE. Co-orintador: Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE. Recife 2008

3 Sotero Caio, Cibele Gomes de Estudo Cromossômico em Morcegos Hematófagos: Zoo-FISH com Sondas Cromossômicas de Carollia brevicauda e Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae -Chiroptera). / Cibele Gomes de Sotero Caio. Recife: O Autor, folhas : il., fig. tab. Dissertação (mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, Inclui bibliografia. 1. Mamíferos - morcegos 2. homeologias cromossômicas 3. Pintura cromossômica. I. Título CDU (2.ed.) UFPE CDD (22.ed.) CCB

4

5 À minha família, dedico.

6 AGRADECIMENTOS Acima de tudo aos meus pais, pelo amor, apoio, incentivo e ensinamentos, sem os quais não teria conquistado tudo o que tenho até agora. Pelo exemplo de caráter que tem servido como referência para guiar meus passos ao longo de minha jornada. Ao meu pai José Raimundo, por não medir esforços quando se trata de participar de minhas batalhas e à minha mãe Veralúcia pela amizade e confiança nas quais se baseia nossa relação. As poucas palavras deste agradecimento estão aquém de descrever seu papel em minha vida. À minha irmã Tássia, pela amizade e carinho. Por ser responsável pelas boas risadas no dia-a-dia e em momentos difíceis. Pela companhia inigualável e pela falta que faz quando estamos separadas. Ao meu irmão Lucas, pela amizade e agradável relação fraterna apesar da distância. Aos meus avós, tios e primos, em especial à vó Iracema e ao vô Pedro, cada um de sua forma tendo um importante valor em minha vida. À minha orientadora Neide Santos, pela confiança em mim depositada, pela valiosa relação travada durante todos esses anos de convivência, mas principalmente por me fazer acreditar em meu potencial, sempre que vacilo, tornando a realização de um ideal possível. À professora Maria José por sua disponibilidade, tendo me auxiliado sempre que necessário, como minha co-orientadora. Aos professores Cleusa Nagamachi e Júlio Pieczarka pela colaboração para a realização deste trabalho. Pelo bom exemplo como profissionais e receptividade não só em seu laboratório, mas também durante minha estadia em Belém. Aos técnicos Cirlene e Francisca (UFPE) e Conceição e Jorge (UFPA) pela ajuda durante o desenvolvimento deste trabalho e a Anderson Gomes (UFPA) pelo auxílio com as hibridizações. A Rodrigo Sotero pela indispensável ajuda com o CorelDraw e dicas para a elaboração do idiograma.. Aos colegas do Laboratório de Citogenética da UFPE: Adriana, Carol, Dani, Ituza, Jefferson, Jéssica, Luzia (Luzitânia), Marcela, Merilane, Nara e Thati pela boa convivência e agradáveis conversas nos corredores do departamento. Luzia, ainda te espero na genética animal! A Diogo por ser bem mais que um companheiro de

7 laboratório, pelas experiências compartilhadas e estima que espero perdurar ao longo de nossas vidas. À minha amiga Sárah, grande companheira, presente nos momentos de alegria e tristeza, exemplo de competência que procuro seguir. À Pollyanna pela surpreendente amizade. Pelas confidências, apoio e carinho fortalecido durante os últimos dois anos. Aos colegas do Lab. de Citogenética da UFPA Adalto, Amanda, Derik, Celina, Cristiane, Fábio, Luciano, Naty, Pablo, Patrícia Baiana, Patrícia Correia, Paulinho, Ramon, Renata, Sávio (Uílame), Susana, e Thayse por permitirem minha rápida integração no laboratório, em especial a Anderson (Mardito!) e Danillo (Negão) por se revelarem verdadeiros amigos, como se conhecêssemos há muito mais tempo, fazendo com que me sentisse em casa. Aos amigos paraenses, biólogos e agregados, em especial Gleice, Patrícia Aleixo e Patrik por tornar a minha estadia em Belém mais prazerosa. À família Correia, Sra. Amélia, Cristina, Sr. Manoel e Patrícia pela hospedagem em sua residência. Serei eternamente grata pelo acolhimento. Aos colegas da pós graduação, principalmente Edilene (fitness), Esteban e Carlos cuja amizade significa muito para mim. A Iêda (Mamãe), Eduardo (Búbus), Fagner (Bill), Bruno (Prego), Demétrio, Dimas, Leandro, Rafael (Rafaééh) pela amizade e momentos de desestresse ao longo desses dois anos. A Thaís Lira pelo auxílio na coleta e identificação taxonômica das espécies analisadas. Pela amizade, companheirismo e momentos morcegáticos passados e futuros. A Bruno Tavares pelo apoio e compreensão incondicionais. Por me fazer conhecer o amor verdadeiro a partir de uma relação baseada em carinho, confiança e amizade. Ao CNPq pelo apoio financeiro através da bolsa de mestrado, durante o desenvolvimento deste projeto. A todos que de alguma forma contribuíram para que eu pudesse chegar até aqui.

8 As I stand at the crossroad, I see the sun sinking low... With my cross of indecision, I can't tell which way to go... Now I have seen the seven wonders And I have sailed the seven seas, I've walked and talked with angels, And danced all night with gypsy queens... All in all it's been a rocky road, Twists and turns along the way... But, I still pray for tomorrow, All my hopes, my dreams Don't fade away... Don't fade away... I have painted many portraits, Memories of love and pain, Though cut down by life's deceptions I found the strength to start again... All in all it's been a rocky road, Twists and turns along the way... But, I still pray for tomorrow, All my hopes, my dreams Don't fade away... Don't fade away. Heaven help a man Trying to make up his mind, With the darkness closing in, I feel I'm running out of time... Shine a light for me, Help me find the way to go, And take me where I've never been before... And so I stand at the crossroad, Watching the sun sinking low... With my cross of indecision, Trying to find the way to go... David Coverdale

9 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS RESUMO INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA ORDEM CHIROPTERA ASPECTOS GERAIS ORIGEM E FILOGENIA FAMÍLIA PHYLLOSTOMIDAE SUBFAMÍLIA DESMODONTINAE: ASPECTOS ECOLÓGICOS E EVOLUTIVOS CITOGENÉTICA E EVOLUÇÃO IMPORTÂNCIA DOS ESTUDOS CITOGENÉTICOS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DE CHIROPTERA TÉCNICAS CLÁSSICAS: UMA ABORDAGEM HISTÓRICA HIBRIDIZAÇÃO IN SITU PINTURA CROMOSSÔMICA (CHROMOSOME PAINTING) EVOLUÇÃO CARIOTÍPICA NA FAMÍLIA PHYLLOSTOMIDAE SUBFAMÍLIA DESMODONTINAE REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO CONCLUSÕES ABSTRACT ANEXOS INSTRUÇÕES PARA AUTORES CHROMOSOME RESEARCH FOTOGRAFIAS DAS ESPÉCIES ANALISADAS 108

10 LISTA DE FIGURAS Figura Revisão da Literatura Fig. 1: Árvore de total-evidência proposta por Wetterer et al. (2000) construída a partir de análise de máxima parcimônia usando 150 caracteres. À direita, classificação proposta por esses autores para a família Phyllostomidae. Decay values e valores de bootstrap correspondem aos números acima e abaixo dos ramos, respectivamente. Fig. 2: Filograma mostrando as relações de divergência de seqüências entre os gêneros de Phyllostomidae, apresentado por Baker et al. (2003). À direita, classificação proposta por esses autores. Página Manuscrito de Artigo Científico Fig. 1: Cariótipos haplóides G-bandeados e idiogramas mostrando os segmentos cromossômicos correspondentes entre as espécies Phyllostomus hastatus-pha (a), Diphylla ecaudata-dec (b), Diaemus youngi-dyo (c) e Desmodus rotundus-dro (d). Os pontos pretos nos cromossomos marcados com asteriscos correspondem às RONs. Bandeamentos G cedidos por Varella-Garcia et al. (1989), Santos et al. (2001) e Pieczarka et al. (2005). Barra = 5 µm. Fig. 2: Cariótipos haplóides G-bandeados e idiogramas mostrando os segmentos cromossômicos correspondentes entre as espécies Carollia brevicauda- CBR (a), Diphylla ecaudata-dec (b), Diaemus youngi-dyo (c) e Desmodus rotundus-dro (d). Os pontos pretos nos cromossomos marcados com asteriscos correspondem às RONs. Bandeamentos G cedidos por Varella-Garcia et al. (1989), Santos et al. (2001) e Pieczarka et al. (2005). Barra = 5 µm Fig. 3: Pintura cromossômica em metáfases mitóticas de Desmodus rotundus (ac), Diphylla ecaudata (d-f) e Diaemus youngi (g-i) com sondas de Phyllostomus hastatus: (a, g) PHA8, (b, h) PHA11, (c) PHAX, (d) PHA7, (e) PHA10, (f) PHA14 e (i) PHA15. Barras = 10 µm. Fig. 4: Zoo-FISH com sondas de Carollia brevicauda em metáfases mitóticas de Desmodus rotundus (a-c), Diphylla ecaudata (d-f) e Diaemus youngi (g-i): CBR3 (a), CBR6 (b), CBR9 (c, e, h), CBR8 (d, g) e CBRY 2 (f, i). Barras = 10 µm

11 LISTA DE TABELAS Tabela Página Revisão da Literatura Tabela 1. Classificação tradicional da Ordem Chiroptera. 17 Tabela 2. Algumas das classificações propostas para a ordem Chiroptera. 22 Tabela 3. Algumas das classificações propostas para a família Phyllostomidae. 26 Tabela 4. Classificações atualmente adotadas para a família Phyllostomidae. 27 Manuscrito de Artigo Científico Tabela 1. Espécies analisadas 93 Tabela 2. Correspondências cromossômicas entre Phyllostomus hastatus (PHA), Carollia brevicauda (CBR), Diphylla ecaudata (DEC), Diaemus youngi (DYO) e Desmodus rotundus (DRO) obtidas através da pintura cromossômica comparativa com sondas das duas primeiras espécies. 94

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AgNO 3 Ag-RON BA(OH) 2 CBG Conv. Cy3 DAPI DEC DNA DNAr DOP-PCR DRO dutp DYO F Fig. FISH FITC g GTG HC HCl HIS Hz LINE M m ml mm N Nitrato de prata Coloração com nitrato de prata Hidróxido de bário Técnica de Bandeamento C Convencional Cyanine dye 4-6-diamidino-2-fenil-indol Cromossomo de Diphylla ecaudata Ácido desoxirribonucléico DNA ribossomal Degenerate oligonucleotide primed PCR Cromossomo de Desmodus rotundus 2 -deoxyuridine 5 -triphosphate Cromossomo de Diaemus youngi Sexo feminino Figura Fluorecence in situ hybridization Fluorescein isothiocyanate Grama Técnica de bandeamento G Heterocromatina constitutiva Ácido clorídrico Hibridização in situ Hertz Long Interspersed element Sexo masculino Metro Mililitro Milímetro Concentração Normal

13 NF Número fundamental ph Potencial de hidrogênio RNA Ácido ribonucléico RNAr Ácido ribonucléico ribossomal RON Região organizadora de nucléolo S Svedberg (medida de velocidade de sedimentação de uma partícula) SSC Solução de citrato de sódio TTAGGG Repetição telomérica de nucleotídeos Zoo-FISH Pintura cromossômica em animais 2n Número diplóide C Grau Celsius % Porcentagem µg Micrograma µl Microlitro

14 RESUMO A família Phyllostomidae constitui a terceira maior dentre os Chiroptera, sendo caracterizada por exibir mais variações morfológicas do que qualquer outro grupo de mamíferos, o que gera considerável discordância no estabelecimento de suas relações sistemáticas e evolutivas. Citogeneticamente é caracterizada por cariótipos conservados entre espécies proximamente relacionadas, bem como por intensa variabilidade intergenérica, o que dificulta o estabelecimento de suas relações evolutivas por bandeamentos clássicos. A partir da análise comparativa de cariótipos com bandeamento G tem-se tentado estabelecer relações entre as várias espécies da família. Entretanto, a similaridade entre bandas não homeólogas dificulta o esclarecimento da história evolutiva de segmentos cromossômicos. Recentes estudos têm contornado este problema através do emprego da pintura cromossômica para a detecção de segmentos sintênicos entre espécies. Dessa forma, neste trabalho foi realizada a pintura cromossômica comparativa para a identificação de homeologias cromossômicas entre cinco espécies, pertencentes a três subfamílias de Phyllostomidae. A partir do emprego de sondas cromossômicas totais de Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae) foram enfatizados os prováveis eventos ocorridos na diferenciação dos cariótipos de Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi (Desmodontinae). As sondas de P. hastatus detectaram 23, 22 e 21 segmentos conservados nos cariótipos de D. rotundus, D. ecaudata e D. youngi, respectivamente, enquanto 28, 27, e 27 segmentos conservados foram respectivamente detectados com sondas de C. brevicauda. Os dados obtidos evidenciaram certa conservação cariotípica entre os membros de Desmodontinae, com D. rotundus apresentando o cariótipo mais rearranjado das três espécies. Com base nas relações evolutivas propostas por dados moleculares, morfológicos e citogenéticos são apresentadas as possíveis seqüências de eventos que ocorreram durante a evolução cromossômica dos morcegos hematófagos. Adicionalmente, o estudo comparativo entre as cinco espécies permitiu concluir que Desmodontinae se apresenta mais proximamente relacionada à subfamília Phyllostominae do que a Carolliinae. Palavras-chave: Desmodus, Diaemus, Diphylla, homeologias cromossômicas, pintura cromossômica.

15 1. INTRODUÇÃO A Ordem Chiroptera é representada pelos morcegos, um grupo de mamíferos voadores que apresentam várias adaptações morfológicas e fisiológicas para explorar diferentes tipos de refúgios e de alimentos. Em muitas regiões tropicais e subtropicais, os morcegos constituem a maior parte da fauna de mamíferos, não apenas em número de espécies, mas também de indivíduos. A ordem compreende 18 famílias e duas subordens: Megachiroptera e Microchiroptera. A subordem Megachiroptera está representada por uma única família, Pteropodidae, enquanto Microchiroptera abrange 17 famílias, nove das quais ocorrem nas Américas, estando todas representadas no Brasil: Emballonuridae, Furipteridae, Molossidae, Mormoopidae, Natalidae, Noctilionidae, Phyllostomidae, Thyropteridae e Vespertilionidae (Simmons, 2005; Reis et al., 2007). A família Phyllostomidae possui o maior número de gêneros e espécies entre os Chiroptera Neotropicais, incluindo 57 gêneros e cerca de 160 espécies. Considerável discordância existe no que diz respeito às suas relações de parentesco, por conta da sua ampla gama de adaptações aos mais diversos nichos ecológicos. A citogenética por sua vez, representa uma das áreas de estudo que procura reconstruir a história filogenética do grupo com base em sua evolução cariotípica, usando diferentes técnicas de identificação e coloração cromossômicas (Varella-Garcia e Taddei, 1989; Simmons, 2005; Reis et al., 2007). As técnicas de análise cromossômica mais utilizadas no estudo de morcegos têm sido o bandeamento G, que permite a identificação de cromossomos homólogos, homeólogos e de seus eventuais rearranjos, além do bandeamento C e da marcação com nitrato de prata (AgNO 3 ) que marcam regiões de heterocromatina constitutiva (HC) e

16 regiões organizadoras de nucléolos (RONs), respectivamente. Adicionalmente, a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNA repetitivo tem sido empregada em morcegos, permitindo a detecção precisa da localização dessas seqüências nos cromossomos. Recentemente, uma variação da FISH vem sendo utilizada para a análise de homeologias cromossômicas entre diferentes espécies com maior precisão. Esse método, designado Zoo-FISH, utiliza sondas cromossômicas totais de uma espécie hibridizadas em cariótipos de outras, na tentativa de determinar as regiões cromossômicas conservadas correspondentes (Varella-Garcia e Taddei, 1989, Baker et al. 1992, Pieczarka et al., 2005). A subfamília Desmodontinae compreende apenas as três espécies de morcegos hematófagos existentes: Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi. Para a maioria dos estudos filogenéticos da família Phyllostomidae, esta subfamília aparece como um grupo bem estabelecido, sendo um dos únicos cuja monofilia é apoiada a partir de diferentes classes de dados e representando um dos clados mais basais dentro da família. De acordo com a teoria mais amplamente aceita, derivada de estudos morfológicos e moleculares, as espécies D. rotundus e D. youngi aparecem como taxa irmãos que divergiram logo após a linhagem que deu origem a D. ecaudata. Contudo, estudos cromossômicos clássicos (principalmente dados gerados pela técnica de bandeamento G) mostram diferentes resultados, nos quais D. rotundus parece estar mais proximamente relacionado à D. ecaudata, com D. youngi apresentando um cariótipo mais próximo ao cariótipo ancestral da família Phyllostomidae (Baker et al., 1988; Wetterer et al., 2000). Essa diferença está provavelmente relacionada às dificuldades de interpretação dos resultados derivados de bandeamento G, como por exemplo, problemas no que diz

17 respeito à identificação de homeologias e distinção de caracteres primitivos e derivados, de forma que bandas G similares são equivocadamente consideradas homeólogas, não fornecendo a verdadeira história evolutiva de segmentos cromossômicos, dificultando, portanto, a reconstrução filogenética do grupo. Como até o presente não foram utilizadas técnicas de identificação cromossômica mais acuradas nos cariótipos dos Desmodontinae, no presente trabalho foi realizada a Zoo-FISH com sondas cromossômicas totais de Carollia brevicauda (2n=21,XY 1 Y 2 ) e Phyllostomus hastatus (2n=32,XX) nos cariótipos de Desmodus rotundus, Diaemus youngi e Diphylla ecaudata, na tentativa de elucidar suas verdadeiras homeologias cariotípicas, para a reconstrução dos eventos que levaram aos cariótipos apresentados atualmente por essas espécies. Além disso, pela comparação entre os cariótipos dessas cinco espécies, tentouse estabelecer quais cromossomos estariam presentes no cariótipo ancestral da família Phyllostomidae, para a reconstrução futura de suas relações evolutivas por métodos citogenéticos.

18 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. ORDEM CHIROPTERA Aspectos gerais A ordem Chiroptera está representada pelos morcegos, um dos grupos mais diversificados e bem sucedidos de mamíferos placentários. Esses animais apresentam características singulares como o vôo impulsionado, capacidade de ecolocalização, hibernação e torpor. Além disso, a ordem é caracterizada por uma ampla variação morfológica, relacionada aos seus hábitos, que permitiram que seus membros ocupassem os mais variados nichos ecológicos, tornando-os indispensáveis para a manutenção das relações tróficas nos ecossistemas. Compreendem o segundo maior grupo da classe Mammalia, sendo superados apenas pela ordem Rodentia (Simmons, 2005). O nome Chiroptera, proveniente do grego cheir (mão) e pteron (asa), sugere a principal adaptação morfológica sofrida por esses animais, que apresentam asas como membros anteriores. O alongamento dos ossos metacarpais e falanges para o auxílio e controle de uma membrana alar (o patágio) foi um evento crucial para o desenvolvimento do vôo sustentado, apresentado por esses organismos. Além disso, em comparação a outros mamíferos, os morcegos são diferenciados por uma complexa série de modificações estruturais no esqueleto axial juntamente com a clavícula e escápula, bem como reorientação lateral dos membros posteriores, características que estão relacionadas à capacidade de vôo e à postura invertida adotada por estes animais quando em repouso (Jones, 2002; LaVal e Rodríguez-H., 2002; Gunnell e Simmons, 2005). Tradicionalmente, a ordem tem sido dividida em duas subordens: Megachiroptera, representada por uma única família (Pteropodidae) com 42 gêneros e

19 185 espécies e Microchiroptera, que por sua vez, abrange 17 famílias, 157 gêneros e 928 espécies (Simmons, 2005). A Tabela 1 apresenta dados sobre as famílias que compõem as subordens, destacando as encontradas no Brasil, com o respectivo número de espécies registradas para o país. Tabela 1. Classificação tradicional da ordem Chiroptera. Classificação Ordem Chiroptera Número de espécies brasileiras Subordem Megachiroptera Pteropodidae - Subordem Microchiroptera Rhinolophidae - Hipposideridae - Megadermatidae - Rhinopomatidae - Craseonycteridae - Emballonuridae 15 Nycteridae - Myzopodidae - Mystacinidae - Phyllostomidae 90 Mormoopidae 04 Noctilionidae 02 Furipteridae* (1) 01 Thyropteridae 04 Natalidae 01 Molossidae 26 Vespertilionidae 24 Fonte: Simmons (2005); Reis et al. (2007).

20 Devido à similaridade de sua face com a das raposas, os Megachiroptera são popularmente denominados raposas voadoras. São morcegos de médio a grande porte, podendo alcançar até 1,5 kg e 1,7 m de envergadura, sendo encontrados apenas nos trópicos e subtrópicos do velho mundo. A maioria desses morcegos possui hábito frugívoro e depende principalmente da visão e do olfato para a detecção de alimento. Apenas algumas espécies do gênero Rousettus utilizam um tipo de ecolocalização com ultra-sons de baixa freqüência para a orientação, baseada em estalidos produzidos pela língua (Findley, 1993; Reis et al., 2007). Morfologicamente, as raposas voadoras são caracterizadas pela presença de olhos grandes, que conferem uma capacidade visual extremamente desenvolvida. As asas e caracteres anatômicos relacionados ao vôo são bem menos especializados do que as de Microchiroptera, bem como os caracteres associados à ecolocalização. As orelhas apresentam-se pequenas, simples e destituídas de especializações para a intensificação sonora. Além disso, os Megachiroptera apresentam cauda curta, rudimentar ou ausente, uropatágio reduzido, garras no polegar e, na maioria dos gêneros, garras adicionais no segundo dedo (Nowak, 1994). A subordem Microchiroptera abrange os morcegos que, ao contrário dos Megachiroptera, apresentam a capacidade de ecolocalização com ultra-sons de alta freqüência (acima de 15 khz). Em estreita associação a esta capacidade, esses morcegos apresentam nas orelhas um trago com extrema sensibilidade com função de receber e intensificar ondulações sonoras. Em muitas espécies, o pavilhão auditivo apresenta uma forte proeminência longitudinal (quilha) em seu centro e um outro aparato membranoso (antitrago) em sua base. Várias adaptações nos ouvidos interno e médio estão também relacionadas à percepção de sonar nesses morcegos. A ocorrência de Microchiroptera

21 abrange praticamente todas as regiões do globo, exceto as regiões polares e ilhas muito afastadas de áreas continentais. No Brasil, são conhecidas nove famílias, 64 gêneros e 167 espécies (Tabela 1), distribuídas por todos os estados, ocorrendo nos mais diversos biomas (Jones, 2002; Airas, 2003; Reis et al., 2006; 2007).

22 2.1.2 Origem e Filogenia Os registros fósseis mais antigos de representantes da ordem Chiroptera datam do início do Eoceno (49-53 milhões de anos). Este período revela uma fauna de morcegos extremamente rica, compreendendo centenas de espécimes fósseis, completos em boa parte dos casos, abrangendo cerca de 24 gêneros (Simmons e Geisler, 1998). A reunião de informações sobre todos os fósseis encontrados até o presente indica que os morcegos viventes no Eoceno apresentavam conjuntos de adaptações ao vôo e ecolocalização, o que sugere uma origem mais antiga para o grupo, uma vez que a este ponto seu ancestral já havia evoluído para as formas atuais (Speakman, 2001). Apesar da abundância de fósseis do Eoceno, a ausência de amostras provenientes de períodos mais antigos tem dificultado consideravelmente estudos sobre a história natural do grupo (Teeling et al., 2005). Até o início dos anos 80, dados de estudos morfológicos vinham propondo a monofilia da ordem, bem como das duas subordens, o que implicava em uma única origem para a ecolocalização laringiana e o vôo em morcegos. Contudo, estudos realizados por Smith e Madkour (1980), Hill e Smith (1984), Pettigrew (1986; 1995) e Pettigrew et al. (1989), baseados em morfologia do pênis e sistema nervoso, propuseram a polifilia para a ordem, na denominada hipótese do primata voador. Segundo esses autores, Megachiroptera estaria mais proximamente relacionada à Dermoptera e aos primatas do que à Microchiroptera. Essa proposta resultou no interesse dos sistematas mastozoólogos, o que desencadeou uma série de estudos independentes para a resolução das controvérsias. Como conseqüência, estudos baseados em morfologia, bioquímica, e genética molecular acabaram por refutar esta última hipótese, confirmando a monofilia da ordem. Esses novos trabalhos, entretanto,

23 têm mostrado que uma considerável incerteza permanece no que diz respeito às relações entre os morcegos e outras ordens de mamíferos, além de ter gerado recentes questionamentos sobre a monofilia da subordem Microchiroptera (Jones et al., 2002; Van Den Bussche e Hoofer, 2004; Gunnel e Simmons, 2005). A origem filogenética da ordem Chiroptera permanece não resolvida. Organismos intermediários evolutivos entre os morcegos e seu ancestral não voador são ainda desconhecidos no registro fóssil. Com base em evidências morfológicas, Chiroptera tem sido considerada como pertencente à superordem Archonta, juntamente com Dermoptera, Primata e Scadentia. Contudo, estudos moleculares têm fornecido suporte para a inclusão de Chiroptera no grupo Laurasiatheria, compartilhado pelas ordens Cetartiodactyla, Perissodactyla, Carnivora, Pholidota e Eulipothypla (Nikaido et al. 2000; Lin e Penny 2001; Madsen et al. 2001; Murphy et al. 2001a,b; Van Den Bussche e Hoofer, 2004). Segundo Van den Bussche e Hoofer (2004), as características morfológicas que reúnem Archonta como um grupo monofilético são variáveis dentro das ordens que o compõe, não revelando um forte suporte para sua monofilia. Devido a essas controvérsias, esta questão permanece ainda em aberto. Em relação à monofilia das duas subordens, dados morfológicos e moleculares têm gerado hipóteses contrastantes (Tabela 2). Tradicionais hipóteses filogenéticas resultantes de análises morfológicas propõem a divisão da ordem Chiroptera em duas subordens monofiléticas, Mega e Microchiroptera. Além disso, Microchiroptera estaria subdividida em duas infraordens, Yinochiroptera, composta pelas superfamílias Rhinolophoidea (Rhinolophidae, Hipposideridae, Nycteridae e Megadermatidae) e Emballonuroidea (Rhinopomatidae, Craseonycteridae e Emballonuridae) e Yangochiroptera, formada pelas superfamílias Noctilionoidea (= Phyllostomoidea)

24 (Mystacinidae, Noctilionidae, Mormoopidae e Phyllostomidae) e Vespertilionoidea (Vespertilionidae, Natalidae, Furipteridae, Thyropteridae, Myzopodidae e Molossidae) (Koopman, 1994; Fenton, 1995; Altringham, 1996). Simmons e Geisler (1998) conduziram novas análises baseadas em dados morfológicos de espécies existentes e exemplares fósseis e propuseram uma classificação que reteve boa parte dos agrupamentos prévios. Dessa forma, as duas subordens permaneceram como grupos monofiléticos sendo mantida a divisão de Microchiroptera em dois clados. Entretanto, segundo esses autores, Microchiroptera estaria dividida em sete superfamílias: Emballonuroidea (Emballonuridae), Rhinopomatoidea (Rhinopomatidae e Craseonycteridae), Rhinolophoidea (Rhinolophidae, Nycteridae e Megadermatidae, tendo Hipposideridae sido convertida a uma subfamília de Rhinolophidae), Noctilionoidea (Noctilionidae, Mormoopidae e Phyllostomidae), Nataloidea (Natalidae, Furipteridae, Thyropteridae, Myzopodidae), Molossoidea (Molossidae e uma nova família, Antrozoidae) e Vespertilionoidea (Vespertilionidae). Segundo esta classificação, apenas Rhinopomatoidea e Rhinolophoidea apareceriam compondo a infraordem Yinochiroptera. As superfamílias remanescentes seriam parte de Yangochiroptera ou permaneceriam como incertae sedis. Além disso, Mystacinidae não aparece em uma superfamília definida (Tabela 2). Os dados moleculares, por sua vez, sugerem a monofilia de Rhinopomatoidea e Rhinolophoidea (a partir da exclusão da família Nycteridae) e a sua união à família Pteropodidae em um clado denominado Yinpterochiroptera ou Pteropodiformes. Todas as famílias remanescentes são agrupadas em Yangochiroptera (Tabela 2). Dessa forma, as subordens deixariam de existir como grupos monofiléticos, cedendo lugar a esta classificação (Van Den Bussche e Hoofer, 2004; Hoofer e Van Den Bussche, 2004; Eick et al., 2005; Teeling et al., 2005).

25 Tabela 2. Algumas das classificações propostas para a ordem Chiroptera. Classificações de Chiroptera Altringham (1996) Simmons e Geisler (1998) Ordem Chiroptera Subordem Megachiroptera Pteropodidae Subordem Microchiroptera Infraordem Yinochiroptera Superfamília Rhinolophoidea Rhinolophidae Hipposideridae Nycteridae Megadermatidae Superfamília Emballonuroidea Rhinopomatidae Craseonycteridae Emballonuridae Infraordem Yangochiroptera Superfamília Noctilionoidea Mystacinidae Noctilionidae Mormoopidae Phyllostomidae Superfamília Vespertilionoidea Vespertilionidae Natalidae Furipteridae Thyropteridae Myzopodidae Molossidae Teeling et al. (2005) Ordem Chiroptera Subordem Megachiroptera Pteropodidae Subordem Microchiroptera Superfamília Emballonuroidea Emballonuridae Infraordem Yinochiroptera Superfamília Rhinopomatoidea Craseonycteridae Rhinopomatidae Superfamília Rhinolophoidea Nycteridae Megadermatidae Rhinolophidae (inclui Hipposiderinae) Infraordem Yangochiroptera Mystacinidae Superfamília Noctilionoidea Phyllostomidae Mormoopidae Noctilionidae Superfamília Nataloidea Myzopodidae Furipteridae Thyropteridae Natalidae Superfamília Molossoidea Antrozoidae Molossidae Superfamília Vespertilionoidea Vespertilionidae Ordem Chiroptera Subordem Yinpterochiroptera Pteropodidae Superfamília Rhinolophoidea Rhinolophidae Megadermatidae Craseonycteridae Rhinopomatidae Subordem Yangochiroptera Superfamília Emballonuroidea Emballonuridae Nycteridae Superfamília Noctilionoidea Phyllostomidae Mormoopidae Noctilionidae Furipteridae Thyropteridae Mystacinidae Myzopodidae Superfamília Vespertilionoidea Vespertilionidae Molossidae Natalidae Fonte: Altringham (1996); Simmons e Geisler (1998); Teeling et al. (2005).

26 As conseqüências relativas aos estudos filogenéticos na ordem pelos diferentes métodos são marcantes. A monofilia da ordem, apoiada por todas as classes de dados, corrobora a hipótese de que a capacidade de vôo evoluiu apenas uma vez dentro da classe Mammalia. Por outro lado, os estudos relativos às subordens e famílias implicam em interpretações diferentes para a origem da ecolocalização laringiana em morcegos. Se os dados gerados por morfologia estiverem corretos, a ecolocalização evoluiu apenas uma vez dentro da ordem (apenas em Microchiroptera). Contudo, se os indícios moleculares forem aceitos, a ecolocalização passa a ser uma característica que apareceu duas ou mais vezes independentemente durante a evolução do grupo, ou foi perdida em Pteropodidae. De fato, a ampla variação dessa característica entre as famílias de Chiroptera têm dificultado consideravelmente a definição de um tipo de ecolocalização ancestral em morcegos, a maioria delas mostrando sinais de evolução convergente ao longo de toda a árvore filogenética (Teeling et al., 2002; Jones e Teeling, 2006).

27 2.2. FAMÍLIA PHYLLOSTOMIDAE Os morcegos do Novo Mundo, membros da família Phyllostomidae apresentam como característica mais evidente um apêndice dérmico em formato de folha se estendendo a partir do aparato nasal. As únicas exceções são os morcegos vampiros e uma única espécie da subfamília Stenodermatinae (Centurio scenex), nos quais esta característica aparece de forma modificada e rudimentar, respectivamente (LaVal e Rodrigues-H, 2002). Os Phyllostomidae variam em tamanho desde diminutos como Choeroniscus minor, um nectarívoro que pesa cerca de 9 g, até o maior morcego das Américas, Vampyrum spectrum, cujo peso pode ultrapassar 100 g. O comprimento corpóreo varia de 40 a aproximadamente 135 mm e do antebraço de 31 a 105 mm. A cauda, quando presente, apresenta-se bastante reduzida, variando em comprimento desde quatro até 55 mm (Nowak, 1996). Das 17 famílias de Microchiroptera, Phyllostomidae constitui a terceira mais numerosa, sendo endêmica do Novo Mundo, com registros que abrangem desde o sudoeste dos Estados Unidos da América até o norte da Argentina. Segundo Simmons (2005), a família compreende 160 espécies distribuídas em 57 gêneros. No Brasil, por sua vez, são encontradas 90 espécies representantes de 40 gêneros. A diversidade trófica observada nesse grupo não encontra precedentes dentre as demais famílias de mamíferos, sendo encontradas as mais variadas adaptações morfológicas a uma série de nichos ecológicos. Os representantes da família podem ser insetívoros, carnívoros, frugívoros, nectarívoros, folívoros, granívoros, onívoros ou hematófagos. Esta heterogeneidade tem motivado inúmeros estudos no que concerne às relações entre os Phyllostomidae, no intuito de esclarecer a origem evolutiva desses hábitos alimentares (Freeman, 2000; Reis et al., 2006).

28 Historicamente, o grupo tem sofrido uma série de alterações no que diz respeito à sua classificação em subfamílias, sem um consenso entre as diferentes pesquisas. Registros de árvores filogenéticas obtidas a partir das mais diversas classes de dados mostram que o número de subfamílias de Phyllostomidae tem variado de um mínimo de duas a um máximo de 11. Observa-se, na maioria dos casos, que as classificações obtidas apresentam a tendência de agrupar as espécies com hábitos alimentares semelhantes, bem como adaptações morfológicas similares associadas a esses hábitos (Wetterer et al., 2000; Baker et al., 2003). Diversos trabalhos, entretanto, forneceram importantes contribuições que gradualmente conferiram relativa estabilidade à classificação da família (Tabela 3) (Wetterer et al., 2000). Gervais (1854, 1856) (apud Wetterer et al., 2000 ) foi o primeiro pesquisador que restringiu o uso do termo Phyllostomidae aos morcegos de folha nasal do Novo Mundo e aplicou nomes às subdivisões propostas. Miller (1907) propôs uma classificação que permaneceu estável até meados de As principais modificações posteriores a este arranjo foram: (1) o reconhecimento dos membros de Sturnirinae como pertencentes à subfamília Stenodermatinae (Baker, 1967); (2) a inclusão da família Desmodontidae como subfamília (Desmodontinae) de Phyllostomidae (Forman et al., 1968) e (3) a exclusão de Chylonycterinae para a família Mormoopidae, grupo irmão de Phyllostomidae (Smith, 1972). Baker et al. (1989) propuseram uma classificação baseada em uma análise cladística de múltiplos dados (morfológicos, bioquímicos e cromossômicos), com o intuito de eliminar indesejáveis arranjos parafiléticos e polifiléticos. Nesta classificação, apenas três subfamílias foram reconhecidas: Desmodontinae, Vampyrinae e Phyllostominae. Koopman (1994), entretanto, apresentou uma classificação de

29 Phyllostomidae que incluía oito subfamílias e duas tribos dentro de Stenodermatinae. Estas duas últimas classificações foram as mais utilizadas até recentemente, quando duas novas propostas emergiram. Tabela 3. Algumas das classificações propostas para a família Phyllostomidae. Classificações de Phyllostomidae Miller (1907) Koopman (1994) Phyllostomidae Phyllostomidae Chilonycterinae (=Mormoopidae) Phyllostominae Phyllostominae Lonchophyllinae Glossophaginae Brachyphyllinae Hemiderminae (=Carolliinae) Phyllonycterinae Sturnirinae Glossophaginae Stenoderminae (inclui Brachyphylla) Carolliinae Phyllonycterinae Stenodermatinae Desmodontidae Sturnirini Stenodermatini Baker et al. (1989) Desmodontinae Phyllostomidae Macrotus (incertae sedis) Micronycteris (incertae sedis) Vampyrinae Chrotopterus, Trachops, Vampyrum Phyllostominae (todas as tribos sedis mutabilis) Phyllostomini [inclui Phyllostomus (mais Phylloderma), Tonatia, Mimon, Lonchorhina, Macrophyllum] Glossophagini (inclui Lonchophyllinae, Phyllonycterinae e Brachyphylla) Stenodermatini (inclui Carollia e Rhinophylla) Desmodontinae Fonte: Wetterer et al. (2000); Baker et al. (2003).

30 Atualmente, duas outras classificações disponíveis para Phyllostomidae vêm sendo mais utilizadas (Tabela 4). A primeira, obtida por Wetterer et al. (2000) a partir do uso de 150 caracteres morfológicos, cromossômicos e de sítios de restrição do DNAr, é conhecida como a árvore de total-evidência. As árvores mais parcimoniosas provenientes da combinação desses dados indicam que todas as subfamílias tradicionalmente reconhecidas são monofiléticas e que a maioria dos taxa que compartilham especializações alimentares formam clados.

31 Tabela 4. Classificações atualmente adotadas para a família Phyllostomidae. Modificado a partir de Baker et al. (2003).

32 Baseados em seus resultados filogenéticos Wetterer et al. (2000) propuseram uma classificação que melhor reflete as relações hipotetizadas: (1) reconhecimento formal de Hirsutaglossa e Nulicauda no agrupamento de subfamílias nectarívoras e frugívoras, respectivamente; (2) redefinição de Glossophaginae e inclusão de duas tribos, Glossophagini e Lonchophyllini nessa subfamília; (3) reconhecimento de Phyllostomini, Lonchorrhinini, Vampyrini, Micronycterini como tribos de Phyllostominae, subfamília que aparece como um agrupamento natural na topologia gerada; (4) reconhecimento formal de Stenodermatina (Stenodermatines de rostro curto) e Ectophyllina (rostro alongado); (5) elevação dos subgêneros de Micronycteris ao nível de gênero;(6) reconhecimento de Mesophylla como sinônimo júnior de Ectophylla;(7) reconhecimento de Enchisthenes como gênero distinto e (8) retenção de Dermanura e Koopmania como subgêneros de Artibeus. Além disso, nesta classificação, a subfamília Desmodontinae aparece como grupo basal e Brachyphyllinae não apresenta posicionamento definido dentro da árvore. Dessa forma, Phyllostomidae estaria representada por 53 gêneros em sete subfamílias: Desmodontinae, Brachyphyllinae, Phyllonycterinae, Phyllostominae, Glossophaginae, Carolliinae e Stenodermatinae (Fig. 1). Na segunda classificação, resultante de análises de seqüências de DNA mitocondrial agrupados a informações de estudos prévios com o gene nuclear RAG2 (Baker et al., 2000) mais as filogenias obtidas por Wetterer et al. (2000) e Jones et al. (2002), Baker et al. (2003) sugerem que Phyllostomidae estaria dividida em 11 subfamílias, englobando 56 gêneros (Fig. 2). A comparação entre as diferentes árvores analisadas nesse trabalho revela um baixo número de agrupamentos compartilhados, acarretando em pouca resolução para as relações evolutivas entre os grupos. Em

33 contraste, as duas árvores geradas a partir de dados moleculares apresentam-se extremamente semelhantes, compartilhando 21 nós a mais do que se fossem consideradas as três árvores (em um total de 55 nós). Os dados moleculares, entretanto, geram resultados contrastantes com a maioria daqueles obtidos através de estudos prévios baseados em morfologia. As principais implicações desses resultados são as seguintes: (1) Phyllostominae (sensu Wetterer et al., 2000) seria um grupo polifilético, composto por membros de cinco diferentes subfamílias (Macrotinae, Micronycterinae, Lonchorhininae, Phyllostominae e Glyphonycterinae) e (2) Macrotus e Micronycteris + Lampronycteris seriam agrupados em duas subfamílias basais na árvore da família, seguidas por Desmodontinae. O reconhecimento de 11 subfamílias, segundo esses autores, seria necessário para que se pudessem separar as principais subdivisões morfológicas e moleculares em grupos monofiléticos. Apesar das discordâncias entre esses trabalhos com dados morfológicos e moleculares, ambas as classes de dados suportam a monofilia da família (Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker et al., 2003).

34 Fig. 1: Árvore de total-evidência proposta por Wetterer et al. (2000) construída a partir de análise de máxima parcimônia usando 150 caracteres. À direita, classificação proposta por esses autores para a família Phyllostomidae. Decay values e valores de bootstrap correspondem aos números acima e abaixo dos ramos, respectivamente.

35 Fig. 2: Filograma mostrando as relações de divergência de seqüências entre os gêneros de Phyllostomidae, apresentado por Baker et al. (2003). À direita, classificação proposta por esses autores.

36 2.3. SUBFAMÍLIA DESMODONTINAE: Aspectos ecológicos e evolutivos A subfamília Desmodontinae compreende as únicas espécies de morcegos cuja alimentação é baseada exclusivamente na ingestão de sangue. Nenhum outro mamífero apresenta essa característica, a qual confere a esses animais o status de verdadeiros parasitas. Desmodontinae é composta por três gêneros monotípicos, endêmicos da América Latina: Desmodus, Diaemus e Diphylla (Taddei, 1988; LaVal E Rodríguez-H, 2002). Distinguem-se dos demais Phyllostomidae pela morfologia de seu apêndice nasal, similar a uma ferradura, cuja função nestes animais parece ser a detecção de áreas mais vascularizadas na pele de suas presas. São morcegos de médio porte, extremamente especializados para a hematofagia, apresentando modificações nos incisivos, bastante afiados e em forma de bisel, saliva com propriedades anticoagulantes, lábio inferior sulcado e destituído de papilas, língua sulcada que permite ao sangue fluir por capilaridade para o interior da boca, além de estômago e rins especializados na absorção e processamento do plasma sanguíneo (Bernard, 2005; Reis et al., 2007). Como os demais Microchiroptera, os morcegos hematófagos emitem sinais de ecolocalização para a orientação espacial. Contudo, sua audição parece ser mais adaptada à captação de baixas freqüências, entre 100 Hz e 10 KHz (Schmidt et al., 1991). Desmodus rotundus é a espécie mais comum de Desmodontinae, ocorrendo desde o norte do México até o norte da Argentina (Koopman, 1988). No Brasil, por sua vez, foi registrada a sua ocorrência em 25 dos 26 estados. É diferenciado dos outros morcegos hematófagos por suas orelhas pontiagudas, polegar longo, portando duas almofadas ou calosidades, membrana interfemural sem pêlos e por sua fórmula dentária (Nowak, 1994; Reis et al., 2007). Sua alimentação consiste na preferência por sangue de

37 mamíferos, principalmente de grande porte, ocasionalmente alimentando-se de sangue de aves e humanos (Altringham, 1996). Este hábito torna-os potenciais transmissores do vírus rábico, destacando sua importância para a economia e saúde pública (Taddei, 1988). Diphylla ecaudata é o menor dos morcegos hematófagos e parece ocupar o segundo lugar em abundância. Apesar disso, sua distribuição é mais restrita do que a dos outros Desmodontinae, ocorrendo do México até o Brasil. Existe, contudo, registro de apenas um espécime de D. ecaudata para a região sul dos EUA (Reis et al., 2007). No Brasil, há registros da espécie para apenas 13 estados (Reis et al., 2006). Este pequeno hematófago é caracterizado por apresentar grandes olhos, orelhas curtas e arredondadas e polegares curtos, sem calosidades. Além disso, suas pernas são extremamente peludas e apresentam calcâneo alongado que funciona como um sexto dedo, auxiliando sua locomoção por galhos e ramos de árvores (Greenhall e Schutt-Jr, 1996; Schutt-Jr e Altenbach, 1997). A alimentação de D. ecaudata consiste de sangue fresco, quase que exclusivamente de aves. As diferenças no comportamento alimentar, relacionadas à seleção de presas arbóreas e terrestres, reduzem significativamente a competição entre D. ecaudata e D. rotundus. Dessa forma, não é raro encontrar as duas espécies coexistindo em uma determinada área, muitas vezes compartilhando, inclusive, o mesmo abrigo (Reis et al., 2007). Diaemus youngi, por sua vez, assemelha-se a D. rotundus, contudo apresenta características que o distingue dos outros morcegos hematófagos. Suas asas apresentam manchas brancas nas pontas e entre as falanges, seu polegar apresenta apenas uma calosidade, o calcâneo é ausente e apresenta uma conspícua glândula em cada lado da boca, que exala um forte odor característico (Greenhall e Schutt-Jr, 1996; LaVal e

38 Rodríguez-H, 2002). Apesar de apresentar uma ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde o nordeste do México ao norte da Argentina, D. youngi é raro ou incomum ao longo de sua área de ocorrência. Alimenta-se preferencialmente do sangue de aves, contudo, ataca mamíferos dependendo da disponibilidade de presas na região (Greenhall e Schutt-Jr, 1996). Registros do vírus rábico em D. youngi, bem como nos outros dois morcegos vampiros estão presentes na literatura. Entretanto, relatos da raiva em humanos ou em animais domésticos estão mais relacionados à atividade de D. rotundus. Dessa forma, são necessários planos de erradicação desta zoonose que enfoquem exclusivamente o controle desta última espécie, evitando a dizimação desnecessária das outras duas (Reis et al., 2007). As extremas modificações estruturais associadas ao hábito alimentar dos morcegos hematófagos foi, por muito tempo, base para sua classificação em uma família distinta. Miller (1907) foi um dos primeiros pesquisadores a reconhecer Desmodontidae como uma família separada e a discutir algumas relações entre seus membros. Apenas em 1967, Machado-Allison, descrevendo associações parasitahospedeiro e interpretando dados de ecolocalização (Novick, 1963), sugeriu que Desmodidae deveria ser considerada uma subfamília de Phyllostomidae. Essa proposta foi reforçada em 1968, quando Forman et al. chegaram às mesmas conclusões, baseados em estudos comparativos de imunologia, cariologia e morfologia entre os morcegos hematófagos e membros de Phyllostomidae (Wetterer et al., 2000). As relações entre os membros de Desmodontinae, bem como a posição da subfamília na árvore dos Phyllostomidae permanecem em aberto: a árvore gerada por Smith (1976) indica que Diaemus e Desmodus são grupos irmãos, formando um clado separado em relação à Diphylla. Contudo, análises do padrão de bandeamentos C e G

39 sugerem que dentre os morcegos hematófagos, o cariótipo de Diaemus youngi seria o menos modificado em relação ao cariótipo proposto como ancestral da família Phyllostomidae e que Desmodus e Diphylla formam um clado em relação à Diaemus (Bass, 1978; Baker et al., 1988). Entretanto, essas relações não são apoiadas pelos dados gerados a partir de técnicas moleculares. Estudos imunológicos e de eletroforese da albumina indicam uma proximidade maior entre Diaemus e Desmodus, tendo eles divergido após a ramificação da linhagem que deu origem à Diphylla (Honeycutt et al., 1981; Baker et al., 1989). Recentes dados morfológicos e baseados em sequências de DNA nuclear e mitocondrial apresentaram os mesmos resultados (Wetterer et al., 2000; Baker et al., 2000; 2003). Desmodontinae foi por muito tempo considerado como o grupo mais basal da família Phyllostomidae (Wetterer et al., 2000). Contudo, com o avanço das técnicas de genética molecular esse posicionamento vem sendo questionado. A partir de dados de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial, Baker et al. (2000; 2003) sugerem que dois novos grupos (Macrotinae e Karyovarians) ocupariam posições mais basais que Desmodontinae na árvore da família. São necessárias novas investigações a esse respeito, para que a filogenia da família não seja adotada levando-se em consideração apenas um número restrito de classe de dados.

40 2.4. CITOGENÉTICA E EVOLUÇÃO Importância dos estudos citogenéticos Os primeiros estudos relativos à similaridade entre as espécies e sua reunião em grupos taxonômicos foram realizados pela análise de suas características morfológicas e métricas. Entretanto, com o surgimento de novas abordagens, que fazem uso de técnicas citogenéticas, bioquímicas e moleculares, hipóteses filogenéticas geradas a partir dessa classe de dados têm sido reexaminadas e, em alguns casos, reformuladas. Os dados obtidos através de estudos cariotípicos constituem importantes ferramentas no esclarecimento de questões genéticas, sistemáticas e evolutivas dos mais variados grupos de organismos. Alterações nos cromossomos significam modificações no próprio material genético, as quais são geralmente significativas para o rumo evolutivo das espécies. Além disso, os cromossomos apresentam-se menos sujeitos à ação de agentes externos do que qualquer característica morfológica ou fisiológica, tornando-se importantes indicadores filogenéticos (Varella-Garcia e Taddei, 1989). Geralmente, diferentes organismos apresentam cariótipos distintos, de forma que cariótipos de espécies proximamente relacionadas são mais similares entre si do que são os de espécies filogeneticamente distantes. Alterações no número, tamanho e morfologia cromossômicas são, portanto, características evidentes do processo evolutivo (John, 1981). Além disso, modificações do cariótipo primitivo constituem caracteres em estado derivado, que podem ser utilizados, assim como tem sido feito com atributos morfológicos, como base para a reunião de grupos naturais nos taxa examinados. Dessa forma, informações geradas a partir de estudos cariotípicos têm sido usadas por sistematas na formulação de hipóteses mais rigorosas em relação às filogenias dos grupos investigados, pela dedução do número e tipos de rearranjos

41 cromossômicos incorporados durante o curso da evolução, bem como pelo entendimento das forças participantes na fixação desses rearranjos (Qumsiyeh e Baker, 1988). A variedade de alterações cromossômicas durante o processo evolutivo, bem como marcantes diferenças na quantidade de alterações entre espécies próximas, indicam que não existem alterações específicas requeridas para a especiação. Entretanto, alguns tipos de alterações cromossômicas parecem ser mais importantes para o processo de especiação e, conseqüentemente, para a análise da história evolutiva dos organismos. Neste caso, evidências sugerem que rearranjos cromossômicos que tenham um alto nível de associação ao isolamento reprodutivo entre populações serão de extrema importância para a especiação (King, 1993). Além disso, tem sido observado que existem certos tipos de alterações mais relevantes para a evolução cariotípica de determinados grupos (Sumner, 2003). Coghlan et al. (2005) afirmam que rearranjos cromossômicos, incluindo fissões, fusões, translocações e expansão diferencial de seqüências repetitivas, constituíram as forças primárias para as modificações cromossômicas entre os vertebrados. Como exemplo para morcegos, os resultados obtidos no trabalho de Baker e Bickham (1980) mostraram que apesar de 23% das 78 espécies analisadas terem conservado o cariótipo primitivo, proposto para cada família (ou subfamília, no caso de Phyllostomidae), a maioria apresenta vários rearranjos cromossômicos, sendo destacado o papel das fusões Robertsonianas e inversões pericêntricas.

42 Técnicas citogenéticas empregadas no estudo de Chiroptera Técnicas clássicas: uma abordagem histórica Apesar dos caracteres morfológicos terem sido amplamente utilizados em estudos de genética, sistemática e evolução, o cariótipo como uma complementação a esses estudos se desenvolveu apenas após o aperfeiçoamento das técnicas de preparação e coloração citológicas. Para mamíferos, técnicas adequadas não tinham sido descritas até 1956, quando Ford e Hamerton descreveram a técnica de preparação citológica a partir de medula óssea, com o uso de colchicina e de uma solução salina hipotônica de citrato de sódio a qual permitia o aumento celular e melhor espalhamento cromossômico (choque hipotônico). A partir do final da década de 60, surgiram as primeiras publicações descrevendo cariótipos de morcegos com o uso dessa metodologia. Estas preparações garantiam melhores resultados em comparação aos dados obtidos através de material testicular, anteriormente empregado, fornecendo informações sobre o número, tamanho e morfologia dos cromossomos, bem como sobre os mecanismos de determinação cromossômica do sexo para as espécies analisadas. Dessa forma, até 1970, números diplóides de 126 espécies de morcegos haviam sido descritos (Yonenaga et al., 1969; Baker, 1970b; Varella-Garcia e Taddei, 1989). No início dos anos 70, foram desenvolvidas técnicas de coloração citológica que permitiam a coloração diferencial de regiões cromossômicas. A análise por meio dessas colorações revelou que a eucromatina é heterogênea, apresentando-se dividida longitudinalmente em grandes domínios ou bandas, as quais podem apresentar significados funcionais e/ou estruturais distintos, de forma que determinadas bandas parecem corresponder a domínios cromossômicos com propriedades bioquímicas

43 relacionadas (Bickmore e Sumner, 1989). Seabright (1971) descreveu a técnica de bandeamento G (GTG) que, juntamente com outras técnicas de bandeamento (Q e R), permitiu o aprimoramento de estudos cariotípicos em mamíferos. A primeira aplicação do bandeamento G foi no pareamento cromossômico. Além disso, este tipo de bandeamento é de extrema importância na detecção de variações estruturais como deleções, duplicações e inversões. Essa técnica possibilitou uma melhor compreensão das alterações cromossômicas ocorridas ao longo do processo evolutivo, que se estabeleceram em cariótipos de diversos organismos (Sumner, 2003). Dessa forma, pela comparação do padrão de bandeamento cromossômico específico, vários trabalhos têm procurado estabelecer relações cariotípicas entre espécies de morcegos pertencentes a um mesmo gênero, à mesma família, ou mesmo a famílias diferentes (Baker e Bickham, 1980; Baker et al., 1982). Em 1972, Sumner descreveu uma técnica distinta de coloração, a qual permite a detecção de regiões de heterocromatina constitutiva (HC) em cromossomos: o bandeamento C (CBG). A heterocromatina constitutiva representa uma classe de cromatina que se caracteriza por permanecer condensada durante todo o ciclo celular, bem como por sua forma e localização cromossômica. Apresenta-se geralmente concentrada em blocos distribuídos preferencialmente nas regiões proximais e/ou terminais dos cromossomos, ocorrendo menos frequentemente em regiões intersticiais em algumas espécies. Além disso, é caracterizada pela sua composição, apresentando poucos genes estruturais, sendo formada principalmente por DNA repetitivo. Por outro lado, sabe-se atualmente que a formação de regiões de heterocromatina não depende exclusivamente de sua composição de DNA, mas também de várias proteínas que desempenham um papel essencial na sua estruturação e manutenção (Wallrath, 1998;

44 Sumner, 2003; Grewal e Jia, 2007). Segundo Sumner, (2003), a identificação dos sítios de HC, seu tamanho e composição de DNA são aspectos essenciais na caracterização cariotípica de diversos organismos, uma vez que blocos de heterocromatina podem variar entre as espécies, ou mesmo entre indivíduos da mesma espécie. As regiões organizadoras de nucléolo (RONs), caracterizadas por conter os principais genes para RNAr (18S, 5,8S e 28S), tiveram seu estudo aprimorado após a descrição da marcação com nitrato de prata (Ag-RON) por Goodpasture e Bloom (1975) e Howell e Black (1980). Segundo Trerè (2000), as RONs são compostas por proteínas ácidas não-histônicas, as quais se ligam aos íons de prata, podendo ser visualizadas seletivamente por essa técnica. A visualização das regiões marcadas pelo nitrato de prata aparecem como pontos pretos bem definidos, os quais em núcleos interfásicos estão exatamente localizados no interior do nucléolo. Apesar de ser uma ferramenta útil no estudo da organização estrutural e funcional dos cromossomos, a técnica de Ag-RON apenas detecta as RONs que se encontravam transcricionalmente ativas na intérfase anterior à fase da divisão celular na qual a célula se encontra. Dessa forma, um dos principais enfoques desta técnica é o estudo da expressão de genes ribossomais (Pendás et al., 1993). Atualmente, entretanto, a confirmação do número e localização das seqüências de DNAr, bem como de vários outro tipos de seqüências, tem sido realizada por técnicas de citogenética molecular, destacando-se a importância da hibridização in situ (Sumner, 2003; Guerra, 2004). De acordo com Hsu et al. (1975), a distribuição de genes ribossômicos em genomas de mamíferos pode ser classificada em diferentes padrões: (1) um único sítio principal em que geralmente a própria RON se mostra como uma proeminente constrição secundária, localizada em um par de cromossomos; (2) dois sítios principais;

45 (3) múltiplos sítios em áreas de heterocromatina centromérica; (4) múltiplos sítios em braços curtos heterocromáticos e (5) múltiplos sítios nas regiões teloméricas. A ocorrência de RONs em um único sítio tem sido considerada como o padrão ancestral em termos de distribuição de DNAr. Em morcegos, as primeiras informações citogenéticas obtidas pelas técnicas de bandeamento G e C foram divulgadas por Pathak et al. (1973), enquanto Sites et al. (1981) apresentaram os primeiros resultados com a técnica de Ag-RON. Até o presente, foram publicados os cariótipos bandeados de um número considerável de espécies, representantes das 18 famílias, principalmente de Phyllostomidae e Vespertilionidae (Baker e Bickham, 1980; Hood e Baker, 1986; Morielle e Varella-Garcia, 1988; Reis et al., 2007) Hibridização in situ A técnica de hibridização in situ (HIS), descrita em 1970 por Pardue e Gall, consiste basicamente no pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA (sonda) com uma seqüência de nucleotídeos complementar (seqüência-alvo) no sítio exato onde aquela seqüência ocorre naturalmente. A prévia marcação da sonda permite a determinação precisa da localização do híbrido (sonda/seqüência-alvo) no interior das células ou nos cromossomos. O princípio no qual se baseia a técnica remete à complementaridade de bases na dupla fita de DNA, ou seja, ao anelamento específico das moléculas complementares dos ácidos nucléicos pela formação de pontes de hidrogênio entre suas bases nitrogenadas. As fitas complementares do DNA cromossômico podem ser separadas, no processo denominado desnaturação, sendo posteriormente renaturadas ao estado de fita

46 dupla. Se durante a renaturação do DNA cromossômico houver sonda disponível nas proximidades da região de interesse, as cópias da sonda competirão com a seqüência cromossômica idêntica, podendo ser hibridizadas in situ (Wilkinson, 1999; Guerra, 2004). As primeiras hibridizações in situ foram realizadas com a utilização de sondas marcadas com radioisótopos. Entretanto, certas desvantagens desse tipo de marcação, como a instabilidade das moléculas radioativas, limitada resolução, longos períodos de exposição requeridos para a obtenção das radiografias e os riscos associados à radioatividade, impulsionaram o desenvolvimento de técnicas mais seguras e vantajosas (Levsky e Singer, 2003). Atualmente, as marcações não-isotópicas, nas quais um fluorocromo, um hapteno ou outro grupo químico é acoplado aos nucleotídeos, têm sido mais amplamente utilizados no processo de HIS (Schwarzarcher e Heslop- Harrison, 2000). A FISH (fluorescence in situ hybridization) corresponde à hibridização in situ com o uso de fluorocromos. Dependendo da forma como ocorre a marcação da sonda, duas metodologias têm sido utilizadas: na marcação direta, nucleotídeos da sonda são ligados diretamente a fluorocromos, enquanto na indireta, os nucleotídeos são acoplados a uma molécula marcadora (mais comumente a biotina e a digoxigenina), a qual é posteriormente detectada por outra molécula (anticorpo contra a molécula marcadora) conjugada a um fluorocromo (Guerra, 2004). As análises cromossômicas, utilizando a técnica de FISH, têm levado a um marcante progresso na pesquisa citogenética. Comparada a outros métodos, a detecção fluorescente dos sinais de hibridização apresenta vantagens de resolução, contraste, rapidez, estabilidade e segurança, bem como a possibilidade de localização de diferentes

47 sondas simultaneamente. Essa técnica tem possibilitado estudos sobre a organização física de seqüências repetidas, genes, seqüências clonadas e segmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros em diversos organismos, pelo emprego de sondas correspondentes, sendo comum o uso de sondas para seqüências ribossômicas (45S e 5S), teloméricas (TTAGGG), centroméricas (DNA satélite), cromossômicas (pintura cromossômica), DNA genômico total, entre outras. Além disso, avanços na tecnologia empregada para este tipo de análise têm possibilitado estudos refinados nas mais diversas áreas de pesquisa básica e aplicada, atribuindo à FISH um papel de extrema relevância para a citogenética atual (Trask, 1991; Schwarzarcher e Heslop-Harrison, 2000; Levsky e Singer, 2003; Guerra, 2004) Pintura cromossômica (Chromosome painting) Os estudos citogenéticos se caracterizam como uma importante ferramenta na reconstrução da história evolutiva de diversos grupos. Através deles se torna possível o estabelecimento de homeologias, pela comparação interespecífica do padrão de bandas cromossômicas. Entretanto, os dados gerados a partir de bandeamentos podem não fornecer em alguns casos a verdadeira história evolutiva de segmentos cromossômicos, principalmente em famílias com rápida evolução cariotípica, ou em estudos entre espécies distantemente relacionadas, devido a dificuldades de se estabelecer verdadeiras homeologias entre braços similares e de se realizar a distinção de caracteres primitivos e derivados (O Brien et al., 1999; Wetterer et al., 2000; Ao et al., 2007). Recentemente, com o desenvolvimento das técnicas de FISH, a identificação de segmentos homeólogos entre taxa distantemente relacionados tornou-se possível, independentemente da conservação do padrão de bandeamento cromossômico. Durante

48 os últimos anos, uma das técnicas que tem contribuído significativamente na identificação de regiões cromossômicas conservadas entre diferentes espécies é a pintura cromossômica, a qual consiste basicamente na utilização de sondas específicas para cromossomos inteiros ou segmentos cromossômicos para fornecer um mapa citogenético de homeologias entre espécies diferentes (Wienberg e Stanyon, 1997; Chowdhary et al., 1998; O Brien et al.,1999). As primeiras pinturas cromossomo-específicas foram humanas, utilizadas no estudo de doenças genéticas. Wienberg et al. (1990) foram os primeiros a utilizar sondas produzidas a partir de cromossomos totais de humanos em metáfases de outros mamíferos, no caso, primatas, visando à identificação de homeologias cromossômicas. A partir desse trabalho, vários estudos citogenéticos comparativos foram realizados, utilizando sondas de todos os cromossomos humanos em preparações cromossômicas de primatas e, após o aperfeiçoamento da técnica por Scherthan et al. (1994), em outras ordens de mamíferos, a partir da qual a técnica foi denominada Zoo-FISH. Sondas produzidas a partir de cromossomos não-humanos, por sua vez, apresentam marcante utilidade na análise de grupos próximos de mamíferos ou de outros vertebrados porque a eficiência de hibridização e da resolução é consideravelmente mais alta do que ao usar sondas de ordens diferentes (Wienberg e Stanyon, 1997; Guerra, 2004). Tem sido observado que quando uma sonda cromossômica de uma espécie é hibridizada in situ nos cromossomos de outra, grandes regiões de homeologias contendo genes são detectadas entre as duas espécies. Ocasionalmente, a sonda hibridiza em apenas um cromossomo, indicando que todo o cromossomo é conservado. Em outros casos, vários cromossomos ou partes de cromossomos são marcadas, indicando que rearranjos intercromossômicos ocorreram durante a divergência dessas espécies. Em

49 geral, espécies mais proximamente relacionadas apresentam menos rearranjos entre si do que as mais distantemente relacionadas (Ferguson-Smith et al., 1998). Estudos comparativos confirmam que a pintura cromossômica é bem mais eficaz do que estudos convencionais de bandeamento com Giemsa na determinação das homeologias cromossômicas entre as espécies. Varias conclusões equivocadas de antigos estudos com bandeamento foram refutadas pela Zoo-FISH (Ferguson-Smith et al., 1998). Contudo, cromossomos pintados com sondas cromossômicas totais não apresentam padrão de bandas, sendo geralmente difícil sua identificação precisa apenas por morfologia após a hibridização. Dessa forma, o bandeamento cromossômico é frequentemente requerido em conjunto à técnica de pintura cromossômica, garantindo a identificação dos rearranjos internos ocorridos entre os cromossomos analisados (Trask, 1991; Chaves et al., 2002). A partir da homeologia definida pela pintura e o padrão de bandas gerado pelo bandeamento G, a análise citogenética torna-se uma poderosa ferramenta na elucidação da evolução cariotípica e das relações filogenéticas entre os organismos, principalmente entre mamíferos (Wienberg e Stanyon, 1997; Ao et al., 2007). O papel da Zoo-FISH em estudos de evolução cromossômica em mamíferos está bem documentado na literatura. Atualmente uma ou algumas espécies pertencentes a quase todas as ordens de mamíferos placentários foram estudadas com essa técnica (Frönicke e Scherthan, 1997; Müller et al., 1999; Richard et al., 2000; Yang et al., 2006; Kellog et al., 2007). Os primeiros estudos com pintura cromossômica em morcegos foram realizados por Volleth et al. (1999; 2002) a partir de sondas cromossômicas de humanos. Nesses estudos, dez espécies representantes de seis famílias foram investigadas: Glossophaga

50 soricina (Phyllostomidae), Myotis myotis, M. dasycneme e Pipistrellus blancpygmaeus (Vespertilionidae), Rhinolophus mehelyi (Rhinolophidae), Hipposideros larvatus (Hipposideridae), Mormopterus planiceps, M. jugularis e Mops mops (Molossidae) e Eonycteris spelaea (Pteropodidae). Como resultado, seis sinapomorfias foram encontradas, reunindo todas as famílias, gerando suporte para a monofilia da ordem. Além disso, foi possível obter a divisão das famílias estudadas em três linhagens evolutivas: Megachiroptera, Rhinopholoidea e Yangochiroptera. Contudo, as relações entre essas três linhagens foram consideradas não-resolvidas, por conta da necessidade de se investigar os taxa remanescentes. A partir de 2005 foram produzidas as primeiras sondas cromossômicas derivadas de espécies de morcegos. Pieczarka et al. (2005) realizaram a pintura cromossômica recíproca em duas espécies da família Phyllostomidae: Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae). A partir da análise dos dados gerados, foi sugerido que diversos rearranjos cromossômicos ocorreram durante o processo de diferenciação dos dois gêneros, com subseqüente estabilidade cromossômica intragenérica. Além disso, foi proposto que os dois únicos pares cromossômicos totalmente conservados entre estas espécies estão presentes no cariótipo ancestral da família Phyllostomidae. Com o uso de sondas cromossômicas totais da espécie Myotis myotis (Vespertilionidae), Ao et al. (2006) estabeleceram relações entre sete espécies de Vespertilionidae e concluíram que os rearranjos Robertsonianos constituíram o principal mecanismo de evolução cromossômica da família e que adições de material heterocromático desempenharam um importante papel na evolução cariotípica dos gêneros Tylonycteris e Nyctalus. Além disso, esses autores puderam realizar a

51 comparação de seus dados com o cariótipo humano, fornecendo uma nova abordagem para os estudos de evolução de Vespertilionidae. Com a utilização das mesmas sondas, hibridizadas em cariótipos de três membros de Pteropodidae, Rhinolophidae e Hipposideridae, Ao et al. (2007) integraram seus dados aos resultados de Volleth et al. (2002) e traçaram relações entre as seis famílias investigadas através da Zoo-FISH. Da mesma forma, foi possível a obtenção de informações adicionais acerca de rearranjos ocorridos na evolução cariotípica no gênero Rhinolophus, entre gêneros de Pteropodidae e Hipposideridae bem como entre diferentes famílias da ordem Chiroptera. Segundo Ao et al. (2007), um rearranjo cromossômico sinapomórfico apoiaria a reunião do clado Yinpterochiroptera (Pteropodidae + Rhinolophoidea), proposto por análises moleculares, constituindo a primeira assinatura cromossômica que apóia a reunião dessas famílias como um agrupamento natural. O trabalho mais recente referente à pintura cromossômica em morcegos, foi realizado por Mao et al. (2007). Seis espécies da família Rhinolophidae juntamente com quatro espécies, representantes das famílias Pteropodidae e Hipposideridae foram analisadas por pintura cromossômica com sondas de Aselliscus stoliczkanus (Hipposideridae). Adicionalmente, sondas cromossômicas de humano foram mapeadas no cariótipo de A. stoliczkanus para a integração dos resultados aos previamente publicados. Com a utilização dos rearranjos como caracteres na construção de uma árvore filogenética e com a espécie Myotis altarium como grupo externo, foi refutada a hipótese de que o cariótipo ancestral de Rhinolophus seria 2n=62 e proposto um cariótipo similar ao de R. ferrumequinum, com 2n=58, como o ancestral para o gênero. A ocorrência de translocações parece ter desempenhado um importante papel na

52 evolução cariotípica do grupo, contudo foi reconhecida a necessidade de análises com um maior número de espécies para o esclarecimento dos rearranjos que ocorreram entre espécies de Rhinolophus Evolução cariotípica na família Phyllostomidae Os primeiros estudos citogenéticos na família Phyllostomidae, realizados a partir de 1960, baseavam-se exclusivamente na análise cariotípica convencional. No entanto, contribuíram consideravelmente para o entendimento inicial da evolução cariotípica do grupo. O emprego da coloração convencional permitiu que fossem analisados os números diplóides (2n) e fundamentais (número de braços autossômicos = NF), a morfologia cromossômica e o sistema de determinação sexual em várias espécies. (Baker, 1967; Yonenaga et al., 1969; Baker, 1970a;b). Adicionalmente, estudos usando técnicas que permitem a marcação diferencial dos cromossomos contribuíram de forma significativa para o entendimento dos mecanismos envolvidos na evolução cariotípica da família (Patton e Baker, 1978; Baker e Bickham, 1980). Os dados gerados até o presente mostram que Phyllostomidae apresenta números diplóides que variam de 2n=14 em Vampyressa melissa a 2n=46 em Macrotus waterhousii, com números fundamentais se estendendo de 20 a 70. Os valores mais comumente encontrados são 2n=32 e NF=56, apresentados por representantes de várias subfamílias (Baker, 1970b; Gardner, 1977; Reis et al., 2007). Em relação ao sistema de determinação sexual, apesar do sistema simples (XX;XY) ser o mais comum em Chiroptera, a família Phyllostomidae apresenta adicionalmente dois sistemas distintos, ambos originados a partir de eventos de translocação entre alossomos e autossomos (Baker, 1970b; Tucker, 1986). No sistema

53 múltiplo do tipo XY 1 Y 2, um cromossomo do complemento autossômico foi translocado ao cromossomo X. Dessa forma, seu homólogo permanece livre, correspondendo a um segundo Y em machos. Este sistema tem sido descrito nas subfamílias Carolliinae, Glossophaginae e Stenodermatinae, com esta última apresentando o maior número de espécies. O sistema de determinação sexual Neo-XY, por sua vez, é considerado como derivado do sistema múltiplo, sendo representado em Phyllostomidae por espécies da subfamília Stenodermatinae. Após o rearranjo que originara o sistema múltiplo, uma segunda translocação (Y 1 -Y 2 ) resulta na formação de cromossomos X e Y compostos (Tucker, 1986; Tucker e Bickham, 1986). Patton e Baker (1978) realizaram um dos primeiros trabalhos onde se tentou estabelecer, por bandeamento cromossômico, as relações entre Phyllostomidae e morcegos de outras famílias. Bandeamentos G e C foram utilizados na determinação de homeologias cromossômicas entre representantes das famílias Mormoopidae, Noctilionidae e Phyllostomidae. Como resultado da análise do padrão de bandas G, foi proposto que Mormoopidae e Noctilionidae, compartilhando cinco fusões Robertsonianas sinapomórficas, estariam mais proximamente relacionadas entre si do que a Phyllostomidae. Além disso, um cariótipo com 2n=46, NF=60 foi considerado como ancestral para a família Phyllostomidae, bem como para a superfamília Phyllostomoidea (= Noctilionoidea). Um cariótipo similar, composto por 16 meta/submetacêntricos, 28 acrocêntricos mais cromossomos sexuais, está presente na espécie Macrotus waterhousii e por isso tem sido utilizado por alguns grupos de pesquisa como referência para o sistema de numeração cromossômica em Phyllostomidae (Baker, 2006).

54 A provável tendência evolutiva em Phyllostomidae parece levar à redução do número diplóide por eventos de fusão cêntrica, com a retenção dos grupos de ligação. Dessa forma, a homeologia de muitos segmentos cromossômicos tem sido constatada em espécies representantes das diferentes subfamílias, como por exemplo, Desmodontinae (Varella-Garcia et al., 1989; Santos et al., 2001), Phyllostominae (Rodrigues et al., 2000; Pieczarka et al., 2005), Glossophaginae (Haiduk e Baker, 1982), Carolliinae (Pieczarka et al., 2005) e Stenodermatinae (Souza e Araújo, 1990; Silva et al., 2005). Segundo Baker e Bickham (1980), a evolução cromossômica em várias espécies de morcegos, inclusive da família Phyllostomidae, não ocorre de maneira uniforme, com algumas linhagens apresentando mudanças rápidas e consideráveis, enquanto outras, uma taxa lenta de evolução cromossômica. Dessa forma, os padrões de evolução cariotípica em morcegos podem ser enquadrados em três categorias: conservacionismo cromossômico, ortoseleção cariotípica e megaevolução cariotípica. No conservacionismo cromossômico, a taxa de evolução cariotípica é baixa, com espécies proximamente relacionadas diferindo por poucos ou nenhum rearranjo. O gênero Artibeus (Stenodermatinae) exemplifica esse tipo de padrão, uma vez que a maioria das espécies apresenta o mesmo número diplóide (2n=30/31) com praticamente nenhuma variação no padrão de bandeamento G (Souza e Araújo, 1990). A ortoseleção cariotípica, descrita por White (1975), ocorre quando cariótipos de espécies proximamente relacionadas diferem por poucos ou numerosos rearranjos, contudo sem grandes variações nos tipos de rearranjos apresentados, havendo conseqüentemente a conservação dos grupos de ligação. O gênero Uroderma é citado como exemplo para a família Phyllostomidae (Baker e Bickham, 1980).

55 Nos taxa que apresentam megaevolução cariotípica, os cariótipos de espécies estreitamente relacionadas podem ser tão rearranjados que homeologias não podem ser determinadas através de bandeamento G. Numerosos e diferentes tipos de rearranjos participam na reorganização desses cariótipos, de forma que o estabelecimento dos passos envolvidos na formação dos mesmos é extremamente dificultado. Exemplos de megaevolução cariotípica em morcegos da família Phyllostomidae são encontrados nos gêneros Tonatia, Micronycteris e Vampyressa (Baker e Bickham, 1980). Os resultados obtidos pelo emprego da técnica de bandeamento C na família Phyllostomidae demonstram que a heterocromatina constitutiva (HC) pode restringir-se às regiões centroméricas ou ocorrer também em regiões teloméricas e intersticiais, apresentando variações em relação ao tamanho do bloco heterocromático (Varella- Garcia e Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al., 2001). Nas espécies do gênero Phyllostomus (Phyllostominae), P. discolor, P. elongatus e P. hastatus, a HC têm sido descrita como localizada exclusivamente na região pericentromérica de todos os cromossomos (Varella-Garcia et al., 1989; Santos e Souza, 1998b; Rodrigues et al., 2000). Blocos de HC intersticiais e teloméricos foram encontrados em várias espécies: Carollia perspicillata, Choeroniscus minor, Artibeus lituratus, A. planirostris, A. jamaicencis, A. cinereus, A. obscurus, Diaemus youngi, Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata, Anoura caudifer e Platyrrhinus lineatus. Esta técnica representa uma importante ferramenta na distinção de espécies que são morfologicamente idênticas, e tem sido de extrema utilidade na caracterização das diversas espécies do gênero Artibeus (Stenodermatinae) (Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001; Lemos-Pinto, 2007).

56 Estudos das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) em diversos representantes de Phyllostomidae têm sido realizados a partir do emprego da coloração com nitrato de prata. Nesses morcegos, podem ocorrer de um a quatro pares de RONs em regiões cromossômicas teloméricas ou intersticiais, sendo freqüentemente encontradas nos autossomos (Morielle e Varella-Garcia, 1988; Souza e Araújo, 1990; Silva et al., 2005). Contudo, em duas espécies da subfamília Carolliinae foi descrita a presença de RONs em cromossomos sexuais. Em Carollia perspicillata e C. castanea, foram detectadas marcações no cromossomo X e nos cromossomos X e Y, respectivamente (Goodpasture e Bloom, 1975; Hsu et al., 1975; Santos e Souza, 1998a). Nos casos em que as RONs se apresentam em apenas um par de cromossomos, ocorre geralmente sua marcação em todas as células. Entretanto, nas espécies em que há mais de um par, tem sido observada ampla variabilidade intraespecífica no número de RONs ativas devido à afinidade da prata apenas às regiões de transcrição dos genes de RNAr (Morielle e Varella-Garcia, 1988). Adicionalmente, as RONs de diversas espécies de morcegos têm sido detectadas através da FISH com sondas ribossomais. Representantes das subfamílias Desmodontinae (Santos et al., 2001), Carolliinae (Hsu et al., 1975), Phyllostominae, Stenodermatinae e Glossophaginae (Santos et al., 2002) foram analisados por essa técnica. No trabalho de Baker et al. (1992), foram analisadas 50 espécies pertencentes a sete famílias, sendo 30 de Phyllostomidae e os resultados foram comparados aos obtidos para 40 espécies de roedores. Constatou-se que o número médio de sítios ribossomais em morcegos é significativamente mais baixo do que o observado em roedores. Esses autores justificam a variação encontrada como decorrente de uma provável tendência de

57 contenção do tamanho do genoma em morcegos, por redução na quantidade de seqüências repetitivas. Como em todos os mamíferos parecem existir mecanismos de amplificação e redução de seqüências repetitivas (Wu e Hammer, 1991), foi sugerido que em morcegos, os mecanismos de redução dos sítios ribossomais são mais fortes do que estes mesmos mecanismos em roedores e outros mamíferos. Como a FISH não depende da presença de proteínas ácidas marcadas pela prata no processo de transcrição do DNAr, essa técnica tem sido utilizada não apenas na detecção de RONs ativas, mas também para a detecção de seqüências de DNAr inativas no genoma (Porter, 1994). Um exemplo desta aplicação no estudo de morcegos da família Phyllostomidae foi observado por Santos et al. (2002). A comparação entre os resultados obtidos por FISH e pela marcação com nitrato de prata mostrou a ocorrência de um par cromossômico portando RONs silenciosas em Artibeus cinereus (Stenodermatinae). Estudos com hibridização in situ na ordem Chiroptera ainda são escassos. Segundo Baker (2006), menos de 1% das espécies de morcegos foi estudada por técnicas modernas de citogenética molecular. Apesar disso, existem registros pontuais do emprego dessas técnicas em algumas espécies de Phyllostomidae. Além dos estudos de FISH com sondas ribossomais, outros tipos de sondas têm sido empregados no estudo de representantes do grupo. Parish et al. (2002) utilizaram sondas da seqüência repetitiva LINE-1 no cariótipo de Carollia brevicauda e detectaram um maior acúmulo dessas seqüências na porção original do cromossomo X em relação à porção deste cromossomo representada pelo autossomo translocado. A interpretação dos resultados obtidos atribuiu a estas seqüências um possível papel na inativação do cromossomo X nessa espécie.

58 O uso de sondas teloméricas com a seqüência TTAGGG tem demonstrado certa diversidade de padrões entre diferentes espécies analisadas. Um padrão exclusivamente telomérico foi observado em Macrotus waterhousii e M. californicus. Em Artibeus lituratus e A. jamaicencis foram observados um e quatro pares de cromossomos com sítios centroméricos dessa seqüência, respectivamente, enquanto em uma espécie de Chiroderma grandes sítios centroméricos estão presentes na maior parte dos cromossomos (Meyne et al., 1990; Multani et al., 2001). Em Platyrrhinus lineatus, alguns sinais intersticiais e terminais foram observados, estando em associação com regiões de heterocromatina e RONs (Faria e Morielle-Versute, 2002). Os resultados mais controversos foram observados em Carollia perspicillata. Nos três trabalhos em que se realizaram experimentos com sondas teloméricas, as extremidades da maioria dos cromossomos apresentaram marcações fracas ou ausentes. Apesar disso, foi observada uma forte marcação nas regiões centroméricas na maioria dos pares autossômicos (Meyne et al., 1990; Multani et al., 2001; Faria e Morielle-Versute, 2002). Três espécies da família Phyllostomidae foram estudadas pela técnica de pintura cromossômica: Glossophaga soricina, Phyllostomus hastatus e Carollia brevicauda (Volleth et al., 1999; Pieczarka et al., 2005). Esta técnica tem exemplificado a proposta de Patton e Baker (1978) de retenção dos grupos de ligação entre espécies de morcegos, uma vez que têm sido observados grandes blocos e/ou alguns cromossomos inteiramente marcados quando se hibridizam sondas de cromossomos totais nos cariótipos dessas espécies.

59 Subfamília Desmodontinae A subfamília Desmodontinae tem sido investigada por praticamente todas as técnicas citológicas mencionadas anteriormente. Cadena e Baker (1976) analisaram convencionalmente os cariótipos das três espécies dessa subfamília (Desmodus rotundus, Diaemus youngi e Diphylla ecaudata) e observaram que existe certa variação entre elas. Desmodus rotundus apresenta um número diplóide de 2n=28 e NF=52 enquanto as outras duas espécies apresentam 2n=32 e NF=60. Todas apresentam autossomos com dois braços e sistema simples de determinação do sexo, de forma que os cromossomos sexuais aparecem bastante semelhantes em tamanho e morfologia entre as três espécies. Apesar dos mesmos valores para número diplóide e fundamental, foi constatado que os cariótipos de D. ecaudata e D. youngi não eram idênticos, devido a diferenças na morfologia de alguns cromossomos. Análises mais detalhadas da variação cromossômica entre os morcegos hematófagos foram obtidas através das técnicas de bandeamento C e G. Dessa forma, foi observado que nas três espécies, blocos de HC ocorrem na região pericentromérica de todos os cromossomos, enquanto em D. youngi blocos teloméricos adicionais são evidenciados pela técnica de bandeamento C (Baker et al., 1988 ;Varella-Garcia et al., 1989; Santos et al., 2001). Em relação à presença de blocos de HC intersticiais, existe certa discordância entre diferentes trabalhos. Segundo Baker et al. (1988), nenhum dos três hematófagos apresenta blocos intersticiais C-positivos em seus cariótipos. Varella- Garcia et al. (1989), entretanto, encontraram bandas intersticiais em alguns cromossomos de D. ecaudata. Por outro lado, Santos et al. (2001) observaram que blocos intersticiais estão presentes apenas em cromossomos de D. rotundus e concluem que essa diferença pode ser atribuída a polimorfismos cromossômicos entre distintas populações.

60 A técnica de bandeamento G tem mostrado um padrão no qual boa parte dos cromossomos é compartilhada entre as três espécies. A comparação dos cariótipos bandeados obtidos por Varella-Garcia et al. (1989) mostra que D. rotundus e D. youngi apresentam homeologias entre os pares cromossômicos 1, 2, 3, 4, e 5. Além disso, foi possível detectar inversões entre as duas espécies, como a presente no par 6. Os dados obtidos por Santos et al. (2001) permitiram a identificação de homeologias cromossômicas entre D. rotundus e D. ecaudata, de forma que os padrões de bandeamento se apresentam extremamente conservados entre vários cromossomos dessas espécies. Resultados das análises realizadas por Baker et al. (1988) sugerem que as três espécies de hematófagos compartilham considerável homeologia cromossômica e que vários braços cromossômicos podem ser relacionados entre seus cariótipos e de outros Phyllostomidae, Mormoopidae e Noctilionidae. Foi proposto que o cariótipo de D. youngi apresenta-se menos modificado em relação ao cariótipo ancestral da família, de forma que cinco dos oito cromossomos com dois braços presentes no cariótipo ancestral estão presentes e inalterados nesta espécie. Dos três cromossomos restantes, dois parecem ter sofrido inversão dando origem a cromossomos acrocêntricos, seguida de translocação, gerando os cromossomos de dois braços apresentados atualmente pela espécie. O último par cromossômico ancestral de dois braços parece ter sofrido fissão cêntrica, com posterior inversão. No cariótipo primitivo existem 14 cromossomos acrocêntricos que parecem ter sofrido inversões ou fusões Robertsonianas para a formação do cariótipo atual de D. youngi. A detecção das RONs em morcegos hematófagos tem sido realizada tanto pela técnica de coloração com nitrato de prata como pela FISH. Foi demonstrado que as três

61 espécies apresentam um único sítio, contudo os cromossomos portadores da RON são distintos entre as três espécies. Em D. rotundus a RON localiza-se intersticialmente no braço longo de um par cromossômico numerado como 10 por Varella-Garcia et al. (1989) e 8 por Santos et al. (2001), enquanto em D. ecaudata e D. youngi a marcação aparece no braço curto do par 13 e proximalmente no par 15, respectivamente (Morielle e Varella-Garcia, 1988; Varella-Garcia et al. (1989); Baker et al., 1992; Santos et al., 2001).

62 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Airas M (2003) Echolocation in bats. In Proceedings of spatial sound perception and reproduction. The postgrad seminar course of HUT Acoustics Laboratory. Altringham JD (1996) Bats, Biology and Behaviour. Oxford: Oxford University Press. 255p. Ao L, GU X, Feng Q, Wang J, O Brien PCM, Fu B, Mao X, Su W, Wang Y, Volleth M, Yang F and Nie W (2006) Karyotype relationships of six bat species (Chiroptera, Vespertilionidae) from China revelead by chromosome painting and banding comparison. Cytogen Genome Res 115: Ao L, Mao X, Nie W, Gu X, Feng Q, Wang J, Su W, Wang Y, Volleth M and Yang F (2007) Karyotypic evolution and phylogenetic relationships in the order Chiroptera as revealed by G-banding comparison and chromosome painting. Chromosome Res 15: Baker RJ (1967) Karyotypes of bats of the family Phyllostomidae and their taxonomic implications. The Southern Naturalist 12: Baker RJ (1970a) The role of karyotypes in phylogenetic studies of bats. In: Slaughter BH e Walton DW (Eds) About Bats. Southern Methodist Univ. Press, Dallas, pp Baker RJ (1970b) Karyotypic trends in Bats. In: Wimsatt, W.A. (Ed). Biology of Bats. Academic Press, NY. v. 1: Baker RJ (2006) Order Chiroptera. In: O brien SJ, Menninger JC and Nash WG. (Eds). The Atlas of Mammalian Chromosomes. John Wiley & Sons Inc., Hoboken, New Jersey, pp 760.

63 Baker RJ and Bickham JW (1980) Karyotypic evolution in bats: evidence of extensive and conservative chromosomal evolution in closely related taxa. Syst Zool 29: Baker RJ, Haiduk MW, Robbins LW, Cadena A and Koop BF (1982) Chromosomal studies of south American bats and their systematic implications. In: Mares MA and Genoways HH. (Eds). Mammalian Biology in South America. Special Publications Series Pymatuning Laboratory of Ecology, v.1: Baker RJ, Honeycutt RL and Bass RK (1988) Genetics. pp In: Schmidt U e Greenhall A (Eds.) Natural history of Vampire Bats. CRC Press, 246p. Baker RJ, Hood CS and Honeycutt RL (1989) Phylogenetic relationships and classification of the higher categories of the New World bat family Phyllostomidae. Syst Zool 38: Baker RJ, Hoofer SR, Porter CA and Van Den Bussche RA (2003) Diversification among New World leaf-nosed bats: An evolutionary hypothesis and classification inferred from digenomic congruence of DNA sequence. Occasional Papers, Museum of Texas Tech Univ 230, p. i Baker RJ, Maltbie M, Owen JG, Hamilton MJ and Bradley RD (1992) Reduced number of ribosomal sites in bats: evidence for a mechanism to contain genome size. J of Mammal 73: Baker RJ, Porter CA, Patton JC and Van Den Bussche RA (2000) Systematics of bats of the family Phyllostomidae based on RAG2 DNA sequences. Occasional Papers, Museum of Texas Tech Univ 202: i+1-16.

64 Bass RA (1978) Systematics of the Desmodontinae and Phyllonycterinae (Chiroptera: Phyllostomatidae) based on G-band chromosomal homologies. M.Sc. Thesis, Texas Tech Univ., Lubbock. Bernard E (2005) Morcegos vampiros: sangue, raiva e preconceito. Ciência Hoje 36, 214: Bickmore WA and Sumner AT (1989) Mammalian chromosome banding an expression of genome organization. TIG 5: Cadena A and Baker RJ (1976) Cariótipos de los murciélagos vampiros (Chiroptera: Desmodinae). Caldasia 11: Chaves R, Adega F, Santos S, Guedes-Pinto H and Heslop-Harrison JS (2002) In situ hybridization and chromosome banding in mammalian species. Cytogen Genome Res 96: Chowdhary BP, Raudsepp T, Frönicke L and Scherthan H (1998) Emerging patterns of comparative genome organization in some mammalian species as revealed by Zoo- FISH. Genome Res 8: Coghlan A, Eichler EE, Oliver SG, Paterson AH and Stein L (2005) Chromosome evolution in eukaryotes: a multi-kingdom perspective. Trends in Genet 21: Eick GN, Jacobs DS and Matthee CA (2005) A Nuclear DNA Phylogenetic Perspective on the Evolution of Echolocation and Historical Biogeography of Extant Bats (Chiroptera). Mol Biol Evol 22: Faria KC and Morielle-Versute E (2002) In situ hybridization of bat chromosomes with human (TTAGGG)n probe, after previous digestion with Alu I. Genet Mol Biol 25:

65 Fenton MB (1995) Natural history and biosonar signals. In: Popper, A.N.; Fay, R.R. (Eds), Hearing in bats, New York: Springer-Verlag, pp Ferguson-Smith MA, Yang F and O'Brien PCM (1998) Comparative Mapping Using Chromosome Sorting and Painting. ILAR Journal 39. Findley JS (1993) Bats: a community perspective. Cambridge University Press. Cambridge, 167 pp. Ford CE and Hamerton JL (1956) A colchicine hypotonic citrate squash sequence for mammalian chromosomes. Stain Technol 31: Forman GL, Baker RJ and Gerber J (1968) Comments on the systematic status of vampire bats (Family Desmodontinae). Syst Zool 31: Freeman PW (2000) Macroevolution in Microchiroptera: Recoupling morphology and ecology with phylogeny. Evol Ecology Res 2: Fronicke L and Scherthan H (1997) Zoo-fluorescence in situ hybridization analysis of human and lndian muntjac karyotypes (Muntiacus muntjak vaginalis) reveals satellite DNA clusters at the margins of conserved syntenic segments. Chromosome Res 5: Gardner AL (1977) Chromosomal variation in Vampyressa and a review of chromosomal evolution in Phyllostomidae (Chiroptera). Syst Zool 26: Goodpasture C and Bloom SE (1975) Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining. Chromosoma 53: Greenhall AM and Schutt-Jr WA (1996) Diaemus youngi. Mammalian Species. 533: 1-7. Grewal SI and Jia S (2007) Heterochromatin revisited. Nature Reviews, Genetics 8:

66 Guerra M (2004) FISH. - Conceitos e aplicação na citogenética. Sociedade Brasileira de Genética, 184pp. Gunnel GF and Simmons NB (2005) Fossil evidence and the origin of bats. J. Mamm Evol 12: Haiduk MW and Baker RJ (1982) Cladistical analysis of the G-banded chromosomes of nectar-feeding bats (Glossophaginae: Phyllostomidae). Syst Zool 31: Hill JE and Smith JD (1984) Bats. A Natural history. Austin. Univ. of Texas Press, 243pp. Honeycutt RL, Greenbaum IF, Baker RJ and Sarich VM (1981) Molecular evolution of vampire bats. J of Mammalogy 64: Hood CS and Baker RJ (1986) G- and C-banding chromosomal studies of bats of the family Emballonuridae. J of Mammalogy 67: Hoofer SR and Van Den Bussche RA (2004) Molecular Phylogenetics of the chiropteran family Vespertilionidae. Acta Chiropterol. 5(suppl.): Howell WM and Black DA (1980) Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: Hsu T, Spirito SE and Pardue ML (1975) Distribution of S ribosomal genes in mammalian genomes. Chromosoma 53: John B (1981) Chromosome change and evolutionary change: a critique. In: Atchley WR and Woodruff AD (Eds.) Evolution and Speciation. Cambridge University Press, Cambridge, pp Jones G and Teeling EC (2006) The evolution of echolocation in bats. Trends in Ecol and Evolut 21:

67 Jones KE (2002) Chiroptera (Bats). Encyclopedia of Life Sciences. Macmillan Publishers Ltd, pp1-5. Jones KE, Purvis A, MacLarnon A, Bininda-Emonds ORP and Simmons NB (2002) A phylogenetic supertree of the bats (Mammalia: Chiroptera). Biol Review 77: Kellogg ME, Burkett S, Dennis TR, Stone G, Gray BA, McGuire PM, Zori RT and Stanyon R (2007) Chromosome painting in the manatee supports Afrotheria and Paenungulata. BMC Evolutionary Biology 7, 7p. King M (1993) Species Evolution. The role of chromosome change. Cambridge University Press, v. 1, 336pp. Koopman KF (1988) Syatematics and distribution. In: Greenhall AM and Schmidt U (Eds.) Natural history of vampire bats. Boca Raton: CRC Press, 246pp. Koopman KF (1994) Chiroptera: Systematics. Handbook of Zoology, Vol. 8, Part 60: Mammalia. LaVal RK and Rodríguez-H B (2002) Murciélagos de Costa Rica/ Costa Rica bats. Santo Domingo de Heredia: Costa Rica. Instituto Nacional de Biodiversidad. 320p. Lemos-Pinto MP (2007) Análise Citogenética Comparativa em Espécies do Gênero Artibeus (Phyllostomidae, Chiroptera): bandeamento C, AgNO3 e fluorocromos base-específicos. Dissertação (Mestrado em Genética) - Universidade Federal de Pernambuco. Levsky JM and Singer RH (2003) Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J of Cell Science 116: Lin Y and Penny D (2001) Implications for bat evolution from two new complete mitochondrial genomes. Mol Biol Evol 18:

68 Machado-Allison CE (1967) The systematic position of the bats Desmodus and Chilonycteris, based on host-parasite relationships (Mammalia; Chiroptera). Proc Biol Soc, Washington. 80: Madsen O, Scally M, Douady CJ, Kao DJ, DeBry RW, Adkins R, Amrine HM, Stanhope MJ, de Jong WW and Springer MS (2001) Parallel adaptive radiations in two major clades of placental mammals. Nature 409: Mao X, Nie W, Wang J, Su W, Ao L, Feng Q, Wang Y, Volleth M and Yang F (2007) Karyotype evolution in Rhinolophus bats (Rhinolophidae, Chiroptera) illuminated by cross-species chromosome painting and G-banding comparison. Chromosome Res 15: Meyne J, Baker RJ, Hobart HH, Hsu TC, Ryder OA, Ward OG, Wiley JE, Wurster-Hill D, Yates TL and Moyzis RK (1990) Distribution of non-telomeric sites of the (TTAGGG)n telomeric sequence in vertebrate chromosomes. Chromosoma 99: Miller GS Jr. (1907) The families and genera of bats. Bulletin of the United States National Museum 57: Morielle E and Varella-Garcia M (1988) Variability of nucleolus organizer regions in Phyllostomid bats. Rev Brasil Genet 11: Müller S, Stanyon R, O Brien PCM, Ferguson-Smith MA, Plesker R and Wienberg J (1999) Defining the ancestral karyotype of all primates by multidirectional chromosome painting between tree shrews, lemurs and humans. Chromosoma 108: Multani AS, Ozen M, Furlong CL, Zhao Y-J, Hsu TC and Pathak S (2001) Heterochromatin and interstitial telomeric DNA homology. Chromosoma 110:

69 Murphy WJ, Elzirlk E, Johnson WE, Zhang YP, Ryder OA and O'Brien SJ (2001a) Molecular phylogenetics and the origins of placental mammals. Nature 409: Murphy WJ, Stanyon R and O'Brien SJ (2001b) Evolution of mammalian genome organization inferred from comparative gene mapping. Genome Biol. 2: reviews Neves ACB, Pieczarka JC, Barros RMS, Marques-Aguiar S, Rodrigues LRR and Nagamachi CY (2001) Cytogenetic studies on Choeroniscus minor (Chiroptera, Phyllostomidae) from the Amazon region. Cytobios 105: Nikaido M, Harada M, Cao Y, Hasegawa M and Okada N (2000) Monophyletic origin of the order Chiroptera and its phylogenetic position among Mammalia, as inferred from the complete sequence of the mitochondrial DNA of a Japanese Megabat, the Ryukyu Flying Fox (Pteropus dasymallus). J Mol Evol 51: Novick A (1963) Orientation in Neotropical bats. II. Phyllostomatidae and Desmodontidae. J Mammal 44: Nowak RM (1994) Walker s Mammals of the World. 5 th Ed. Baltimore: The Johns Hopkins Univ. Press. 285pp. Nowak RM (1996) Walker s Bats of the World. 6 th Ed. Baltimore: The Johns Hopkins Univ. Press. 285pp. O'Brien SJ, Menotti-Raymond M, Murphy WJ, Nash WG, Wienberg J, Stanyon R, Copeland NG, Jenkins NA, Womack JE and Graves JAM (1999) The Promise of Comparative Genomics in Mammals. Science, New Series, 286: Pardue ML and Gall JG (1970). Chromosomal Localization of Mouse Satellite DNA. Science 168(3937):

70 Parish DA, Vise P, Wichman HA, Bull JJ and Baker RJ (2002) Distribution of LINEs and other repetitive elements in the karyotype of the bat Carollia: implications for X-chromosome inactivation. Cytogenet and Genome Res 96: Pathak S, Hsu TC and Utakoh T (1973) Relationships between patterns of chromosome banding and DNA synthetic sequences: a study on the chromosomes of the Seba s fruit bat, Carollia perspicillata. Cytogenet Cell Genet 12: Patton J and Baker RJ (1978) Chromossomal homology and evolution of Phyllostomatoid bats. Sist Zool 27: Pendás AM, Morán P and García-Vázquez E (1993) Multi-chromosomal location of ribosomal RNA genes and heterochromatin association in brown trout. Chromosome Res 1: Pettigrew JD (1986) Flying primates? Megabats have the advanced pathwayfrom eye to midbrain. Science 231: Pettigrew JD (1995) Flying primates: crashed, or crashed through? Symposium of the Zoological Society of London 67: Pettigrew JD, Jamieson BGM, Robson SK, Hall LS, McAnally KI and Cooper HM (1989) Phylogenetic relations between microbats, megabats and primates (Mammalia: Chiroptera and Primates). Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 325: Pieczarka JC, Nagamachi CY, O Brien PCM, Yang F, Rens W, Barros RMS, Noronha RCR, Rissino EHCO and Ferguson-Smith MA (2005) Reciprocal chromosome painting between two South American bats: Carollia brevicauda and Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae, Chiroptera). Chromosome Res 13: Porter CA (1994) Organization and chromosomal location of repetitive DNA sequences in three species of squamate reptiles. Chromosome Res 2:

71 Qumsiyeh MB and Baker RJ (1988) Comparative cytogenetics and the determination of primitive karyotypes. Cytogenet Cell Genetics 47: Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA and Lima IP (2006) Mamíferos do Brasil. 1. ed. Londrina. 437 pp. Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA and Lima IP (2007) Morcegos do Brasil. Londrina. 253pp. Richard F, Lombard M and Dutrillaux B (2000) Phylogenetic Origin of Human Chromosomes 7, 16, and 19 and their Homologs in Placental Mammals. Genome Res 10: Rodrigues LRR, Barros RMS, Assis MFL, Marques-Aguiar SA, Pieczarka JC and Nagamachi CY (2000) Chromosome comparison between two species of Phyllostomus (Chiroptera - Phyllostomidae) from Eastern Amazonia, with some phylogenetic insights. Genet Mol Biol 23: Santos N and Souza MJ (1998a) Characterization of the constitutive heterochromatin of Carollia perspicillata (Phyllostomidae, Chiroptera) using the base-specific fluorochromes, CMA 3 (GC) and DAPI (AT). Caryologia 51: Santos N and Souza MJ (1998b) Use of fluorochromes chromomycin A 3 and DAPI to study constitutive heterochromatin and NORs in four species of bats (Phyllostomidae). Caryologia 51: Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y and Souza MJ (2001) Comparative karyology of brazilian vampire bats Desmodus rotundus and Diphylla ecaudata (Phyllostomidae, Chiroptera): banding patterns, base-specific fluorochromes and FISH of ribosomal genes. Hereditas 134:

72 Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y and Souza MJ (2002) Localization of rrna genes in Phyllostomidae bats reveals silent NORs in Artibeus cinereus. Hereditas 136: Scherthan H, Cremer T, Arnason U, Weier HU, Lima-de-Faria A and Frönicke L (1994) Comparative chromosome painting discloses homologous segments in distantly related mammals. Nature Genetics 6: Schmidt U, Schlegel P, Schweizer H and Neuweiler G (1991) Audition in vampire bats, Desmodus rotundus. Journal of Comparative Physiology. A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology 168(1): Schutt-Jr WA and Altenbach JS (1997) A sixth digit in Diphylla ecaudata, the hairy legged vampire bat (Chiroptera, Phyllostomidae). Mammalia 61: Schwarzarcher T and Heslop-Harrison P (2000) Practical in situ hybridization. Bios Scientific Publishers, Oxford. Seabright M (1971) A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 2: Silva AM, Marques-Aguiar SA, Barros RMS, Nagamachi CY and Pieczarka JC (2005) Comparative cytogenetic analysis in the species Uroderma magnirostrum and U. bilobatum (cytotype 2n=42) (Phyllostomidae, Stenodermatinae) in the Brazilian Amazon. Genet Mol Biol 28: Simmons NB (2005) Order Chiroptera. In: Wilson DE e Reeder DM (Eds.) Mammals species of the world: a taxonomic and geographic reference 3rd ed. Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland, pp

73 Simmons NB and Geisler JH (1998) Phylogenetic relationships of Icaronycteris, Archaeonycteris, Hassianycteris, and Palaeochiropteryx to extant bat lineages, with comments on the evolution of echolocation and foraging strategies in Microchiroptera. Bull Am Mus Nat Hist 235: Sites JWJr, Bickham JW and Haiduk MW (1981) Conservative chromosomal change in the bat family Mormoopidae. Can J Genet Cytol 23: Smith JD (1972) Systematics of the chiropteran family Mormoopidae. Univ. Kansas Mus Nat. Hist Misc Publ 56: Smith JD (1976) Chiropteran Evolution. In: Baker RJ, Jones Jr JK e Carter DC (Eds.) Biology of Bats of the New World family Phyllostomatidae, Part I. Special Publications of the Museum of Texas Tech University 10: Smith JD and Madkour G (1980) Penial morphology and the question of chiropteran phylogeny. In: Wilson DE e. Gardner AL (Eds.) Proceedings of the fifth international Bat Research Conference, pp Texas Tech Press, Lubbock, Texas. Souza MJ and Araújo MCP (1990) Conservative pattern of the G-bands and diversity of C-banding patterns and NORs in Stenodermatinae (Chiroptera-Phyllostomatidae). Rev Brasil Genet 13: Speakman JR (2001) The evolution of echolocation in bats: another leap in the dark. Mammal Rev 31: Sumner AT (1972) A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Expl Cell Res 75: Sumner AT (2003) Chromosomes: organization and function. Blackwell Publishing. North Berwick, UK. 287pp.

74 Taddei VA (1988) Morcegos: aspectos ecológicos, econômicos e médico-sanitários, com ênfase para o estado de São Paulo. Zoo Intertropica 12: Teeling EC, Madsen O, Van Den Bussche RA, de Jong WW, Stanhope M.J and Springer MS (2002) Microbat paraphyly and the convergent evolution of a key innovation in Old World rhinolophoid microbats. PNAS 99: Teeling EC, Springer MS, Madsen O, Bates P, O Brien SJ and Murphy WJ (2005) A Molecular Phylogeny for Bats Illuminates Biogeography and the Fossil Record. Science 307: Trask BJ (1991) Fluorescence in situ hybridization: applications in cytogenetics and gene mapping. Tig May 7: Trerè D (2000) AgNOR staining and quantification. Micron 31: Tucker PK (1986) Sex chromosome-autosome translocations in the leaf-nosed bats family Phyllostomidae. I. Mitotic analyses of the subfamilies Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytogenet Cell Genet 43: Tucker PK and Bickham JW (1986) Sex chromosome-autosome translocations in the leaf-nosed bats family Phyllostomidae. II. Meiotic analyses of the subfamilies Stenodermatinae and Phyllostominae. Cytogenet Cell Genet 43: Van Den Bussche RA and Hoofer SR (2004) Phylogenetic relationships among recent Chiropteran families and the importance of choosing appropriate out-group taxa. J Mammal 85: Varella-Garcia M and Taddei VA (1989) Citogenética de Quirópteros: Métodos e Aplicações. Rev Bras Zool 6: Varella-Garcia M, Morielle-Versute E and Taddei VA (1989) A survey of cytogenetic data on brazilian bats. Rev Brasil Genet 12:

75 Volleth M, Heller KG, Pferffer RA and Hameister H (2002) A comparative ZOO-FISH analysis in bats elucidates the phylogenetic relationships between Megachiroptera and five microchiropteran families. Chromosome Res 10: Volleth M, Klett C, Kollak A, Dixkens C, Winter Y, Just W, Vogel W and Hameister H (1999) ZOO-FISH Analysis in a Species of the Order Chiroptera: Glossophaga soricina (Phyllostomidae).Chromosome Res 7: Wallrath LL (1998) Unfolding the mysteries of heterochromatin. Curr Opin Genetics & Development 8: Wetterer AL, Rockman MV and Simmons NB (2000) Phylogeny of phyllostomid bats (Mammalia: Chiroptera): data from diverse morphological systems, sex chromosomes and restriction sites. Bull Ame Mus of Natural History 248: 200. White MJD (1975) Chromosomal repatterning-regularities and restrictions. Genetics 79: Wienberg J and Stanyon R (1997) Comparative painting of mammalian chromosomes. Curr Opin Genetics & Development 7: Wienberg J, Jauch A, Stanyon R and Cremer T (1990) Molecular cytotaxonomy of primates by chromosomal in situ suppression hybridization. Genomics 8: Wilkinson DG (1999) In situ hybridization: A practical approach. Oxford University Press. 244pp. Wu CI and Hammer MF (1991) Molecular evolution of ultraselfish genes of meiotic drive systems. pp In: Selander RK, Clark AG and Whittam TS (Eds) Evolution at the molecular level. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, 350pp.

76 Yang F, Graphodatsky AS, Li T, Fu B, Dobigny G, Wang J, Perelman PL, Serdukova NA, Su W, O Brien PCM, Wang Y, Ferguson-Smith MA, Volobouev V and Nie W (2006) Comparative genome maps of the pangolin, hedgehog, sloth, anteater and human revealed by cross-species chromosome painting: further insight into the ancestral karyotype and genome evolution of eutherian mammals. Chromosome Res 14: Yonenaga Y, Frota-Pessoa O and Lewis KR (1969) Karyotypes of seven species of brazilian bats. Caryologia 22:

77 4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO Elucidação das Homeologias Cromossômicas entre os Morcegos Hematófagos pela Técnica de Zoo-FISH (Desmodontinae: Chiroptera) Manuscrito a ser enviado à revista: Chromosome Research ISSN: Springer, Netherlands

78 Elucidação das homeologias cromossômicas entre os morcegos hematófagos pela técnica de Zoo-FISH (Desmodontinae: Chiroptera) Cibele Gomes de Sotero-Caio 1, Júlio César Pieczarka 2, Cleusa Yoshiko Nagamachi 2, Anderson José Bahia Gomes 2, Thais de Castro Lira 3, Patricia C M O Brien 4 ; Malcolm Andrew Ferguson-Smith 4, Maria José de Souza 1, Neide Santos 1 1 Laboratório de Citogenética e Genética Animal, CCB/UFPE, Recife, Pernambuco, Brasil; 2 Laboratório de Citogenética, CCB/UFPA, Belém, Pará Brasil; 3 Laboratório de Estudo e Conservação de Mamíferos, CCB/UFPE, Recife, Pernambuco, Brasil; 4 Molecular Cytogenetics Laboratory, Department of Clinical Veterinary Medicine, University of Cambridge, UK. Running title: Zoo-FISH em morcegos hematófagos. Corresponding Author: Neide Santos Departamento de Genética, CCB/UFPE, Av. Moares Rego, S/N, Cidade Universitária Recife, Pernambuco, Brasil. Phone: (81) , Fax: (81) santos_neide@yahoo.com.br

79 RESUMO Phyllostomidae caracteriza-se como o grupo mais diverso morfologicamente dentre os mamíferos, o que gera considerável discordância no estabelecimento de suas relações sistemáticas e evolutivas. Citogeneticamente caracteriza-se por cariótipos conservados entre espécies proximamente relacionadas, contudo por intensa variabilidade intergenérica, o que dificulta o estabelecimento de suas relações por bandeamentos clássicos. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo identificar homeologias cromossômicas e possíveis rearranjos ocorridos na diferenciação cariotípica de Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi (Desmodontinae), através da Zoo-FISH com sondas cromossômicas totais de Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae). As 16 sondas de P. hastatus detectaram 23, 22 e 21 segmentos conservados nos cariótipos de D. rotundus, D. ecaudata e D. youngi, respectivamente, enquanto 28, 27 e 27 segmentos conservados foram respectivamente detectados com 11 sondas de C. brevicauda. Os dados obtidos evidenciaram certa conservação cariotípica entre os membros de Desmodontinae, com D. rotundus apresentando o cariótipo mais rearranjado dentre as três espécies. Com base nas relações evolutivas estabelecidas previamente por dados moleculares, morfológicos e citogenéticos são propostas, neste trabalho, as possíveis seqüências de eventos que ocorreram durante a evolução cromossômica do grupo. O estudo comparativo entre as cinco espécies permitiu concluir que Desmodontinae apresenta-se mais proximamente relacionada à Phyllostominae que à Carolliinae. Palavras-chave: Desmodus, Diaemus, Diphylla, Phyllostomidae, pintura cromossômica.

80 INTRODUÇÃO A família Phyllostomidae apresenta uma ampla diversidade dentre os Chiroptera Neotropicais, incluindo 57 gêneros e cerca de 160 espécies (Simmons 2005). Seus representantes exibem mais variações morfológicas do que qualquer outro grupo de mamíferos, com adaptações a uma grande diversidade de nichos ecológicos. Essa heterogeneidade tem gerado discordâncias no que diz respeito às suas relações sistemáticas e evolutivas. Registros de árvores filogenéticas, obtidas a partir das mais diversas classes de dados, têm mostrado que o número de subfamílias de Phyllostomidae tem variado de um mínimo de duas a um máximo de 11, com considerável reorganização de membros incluídos nestas subfamílias (Wetterer et al. 2000, Baker et al. 2000, 2003). A subfamília Desmodontinae é composta por apenas três gêneros monotípicos, representados por Desmodus rotundus, Diaemus youngi e Diphylla ecaudata, as quais são as únicas espécies de morcegos hematófagos existentes (Simmons 2005, Reis et al. 2007). Apesar das evidencias indicarem a monofilia do grupo, as relações entre os membros de Desmodontinae, bem como a posição da subfamília na árvore dos Phyllostomidae são ainda motivo de controvérsias. Dados imunológicos, morfológicos e de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial indicam que Diaemus e Desmodus são grupos irmãos, tendo divergido após a ramificação da linhagem que deu origem à Diphylla (Honeycutt et al. 1981, Wetterer et al. 2000, Baker et al. 2000, 2003). Contudo, estudos citogenéticos têm mostrado diferentes resultados, nos quais análises do padrão de bandeamento G sugerem que dentre os morcegos hematófagos, o cariótipo de D. youngi representa o menos modificado em relação ao cariótipo ancestral da família Phyllostomidae e que Desmodus e Diphylla formam um clado à parte, em

81 relação à Diaemus. Apesar de várias homeologias identificadas, esse tipo de bandeamento não permitiu o entendimento das mudanças cromossômicas que ocorreram durante a evolução cariotípica do grupo (Bass, 1978, Baker et al. 1988, Varella-Garcia et al. 1989, Santos et al. 2001). Diversos trabalhos têm procurado estabelecer as relações entre os morcegos hematófagos comparativamente aos representantes de outras subfamílias. Dados gerados por análises morfológicas sugerem o posicionamento basal de Desmodontinae na árvore de Phyllostomidae. Entretanto, recentes análises moleculares têm proposto que outras linhagens divergiram mais cedo que Desmodontinae na irradiação da família. Apesar das controvérsias, considera-se que os morcegos vampiros representam um clado que divergiu relativamente cedo na evolução de Phyllostomidae (Wetterer et al. 2000, Jones et al. 2002, Baker et al. 2000, 2003). Dados citogenéticos comparativos entre morcegos hematófagos e outros Phyllostomidae são escassos na literatura. Cadena e Baker (1976) observaram através de coloração convencional, que os três gêneros de Desmodontinae apresentam grande similaridade cariotípica com alguns membros das subfamílias Phyllostominae e Glossophaginae, divergindo dos membros de Carolliinae e Stenodermatinae. Baseados em comparações dos padrões de bandeamento G, Baker et al. (1989) sugeriram, assim como proposto por dados moleculares, que os vampiros compartilham uma acenstralidade comum com Phyllostominae após a divergência dos gêneros Micronycteris e Macrotus. Análises comparativas de cariótipos G-bandeados têm contribuído significativamente para o estabelecimento das relações evolutivas entre várias espécies de morcegos. Entretanto, em alguns casos, este tipo de análise não esclarece a

82 verdadeira história evolutiva de segmentos cromossômicos por conta de similaridades entre bandas não homólogas (Baker e Bickham 1980, Wetterer et al. 2000). Nestes casos, uma das técnicas que tem se mostrado significativamente eficiente na identificação de regiões cromossômicas conservadas entre diferentes espécies é a pintura cromossômica comparativa (Zoo-FISH). Quando combinada com o bandeamento G, esta técnica tem desempenhado um importante papel na determinação dos rearranjos cromossômicos que ocorreram durante a evolução cariotípica de determinado grupo, bem como para a elucidação de suas relações filogenéticas (Volleth et al. 1999, 2002, Pieczarka et al. 2005, Ao et al. 2006, 2007, Mao et al. 2007). As primeiras sondas cromossômicas derivadas de espécies de morcegos foram produzidas no trabalho de Pieczarka et al. (2005), onde se realizou a pintura cromossômica recíproca em duas espécies da família Phyllostomidae: Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae). A partir da análise dos dados gerados, foi sugerido que diversos rearranjos cromossômicos ocorreram durante o processo de diferenciação dos dois gêneros, com subseqüente estabilidade cromossômica intragenérica. Neste trabalho foi destacada a importância do uso dessas sondas no estudo das relações evolutivas entre representantes da família Phyllostomidae. Dessa forma, no presente trabalho foi realizada a Zoo-FISH com sondas cromossômicas totais de Carollia brevicauda (2n=21,XY 1 Y 2 ) e Phyllostomus hastatus (2n=32,XX) nos cariótipos de Diphylla ecaudata, Diaemus youngi e Desmodus rotundus, na tentativa de elucidar suas verdadeiras homeologias cariotípicas, para a reconstrução dos eventos que levaram aos cariótipos apresentados atualmente por essas espécies. Além disso, pela comparação entre os cariótipos dessas cinco espécies, tentou-

83 se estabelecer quais cromossomos estariam presentes no cariótipo ancestral da família Phyllostomidae. MATERIAIS E MÉTODOS Espécies analisadas Espécimes de D. ecaudata, D. youngi e D. rotundus foram coletados em populações naturais no estado de Pernambuco, região Nordeste do Brasil. A Tabela 1 apresenta o número de indivíduos, sexo e local de captura. Os exemplares coletados encontram-se depositados na Coleção de Mamíferos do Departamento de Sistemática e Ecologia da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e na Coleção de mamíferos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). Preparações citológicas e marcação com AgNO 3 As metáfases das espécies analisadas neste trabalho foram obtidas a partir de preparações diretas de medula óssea. Foi realizada a coloração convencional com Giemsa para a verificação do número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo de determinação sexual das espécies, para a comparação com os dados previamente publicados. A marcação com nitrato de prata foi realizada segundo Howell e Black (1980) para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) e comparação com dados previamente descritos na literatura. Hibridização in situ As sondas cromossomo-específicas foram produzidas no trabalho de Pieczarka et al. (2005) no Molecular Cytogenetics Laboratory, Department of Veterinary

84 Medicine, University of Cambridge, UK a partir de linhagens primárias de fibroblasto de Phyllostomus hastatus (2n=32,XX) e Carollia brevicauda (2n=21,XY 1 Y 2 ) estabelecidas no Laboratório de Citogenética, Departamento de Genética/CCB, Universidade Federal do Pará. Cromossomos separados através de citometria de fluxo foram amplificados pela técnica de DOP-PCR e marcados com biotina-16-dutp, FITC- 12-dUTP ou Cy3-dUTP (Amersham) para a obtenção das sondas espécíficas para cada autossomo e o X de cada espécie, totalizando 16 e 11 sondas de P. hastatus e C. brevicauda, respectivamente. Neste trabalho não foram utilizadas sondas para cromossomos Y, exceto pelo Y 2 de C. brevicauda. A hibridização in situ foi realizada segundo Yang et al. (1995) e Pieckzarka et al. (2005) com algumas modificações. As lâminas foram desnaturadas em solução de formamida 70% a 62 C por 1 minuto. Posteriormente, 2 µl de sonda foram adicionados a 13 µl de solução de hibridização (formamida a 50%, 1XSSC, sulfato de dextran a 10%, 5 µg de DNA de esperma de salmão e 2 µg de mouse Cot-1 DNA) e desnaturados a 70 C durante 15 minutos. A solução de hibridização foi aplicada nas lâminas desnaturadas e cobertas com lamínulas de 24X32 mm. A hibridização ocorreu em câmara úmida a 37 C por um período de 72 horas. Nos banhos pós-hibridização, as lâminas foram incubadas duas vezes em solução de formamida 50% em 2XSSC por cinco minutos cada, seguidas de duas lavagens em 2XSSC por cinco minutos e uma lavagem em 4-Tween (4T) por quatro minutos a 42 C. Para a detecção da marcação com biotina, utilizou-se avidina conjugada ao fluorocromo Cy3. Finalmente, foram realizadas três lavagens à temperatura ambiente em 4T por quatro minutos cada, seguida de coloração com DAPI.

85 Captura e processamento das imagens As imagens em campo claro foram obtidas através de um microscópio Leitz Orthoplan, acoplado a uma câmera fotográfica. Fotomicrografias das hibridizações foram obtidas através de um microscópio Zeiss-Axiophot 2 conectado a um sistema de fluorescência e acoplados a uma câmera CCD (Photometrics C250/A). A sobreposição e ajustes de brilho/contraste das fotografias obtidas foram realizados com auxílio do software Adobe Photoshop 7.0. Análise dos dados Para a análise dos dados, foram utilizados os bandeamentos cromossômicos publicados previamente por Santos et al. (2001) para D. ecaudata e por Varella-Garcia et al. (1989) para D. youngi e D. rotundus. A reprodução das imagens referentes ao bandeamento G foi efetuada com a autorização dos respectivos autores. Os sinais de hibridização foram atribuídos a um cromossomo ou região cromossômica específica a partir da comparação do padrão de coloração por DAPI invertido, em preto e branco, similar ao obtido por bandeamento G. As abreviações PHA, CBR, DEC, DYO, e DRO seguidas do número do par cromossômico foram utilizadas para referir-se a determinado cromossomo de P. hastatus, C. brevicauda, D. ecaudata, D. youngi e D. rotundus, respectivamente. RESULTADOS Dados cariotípicos das espécies analisadas As espécies Diphylla ecaudata e Diaemus youngi apresentaram número diplóide 2n=32 e número fundamental (NF) igual a 60, enquanto um cariótipo com 2n=28 e

86 NF=52 foi observado para Desmodus rotundus. As três espécies mostraram um sistema simples de determinação sexual do tipo XX nas fêmeas e XY nos machos. Os cariótipos revelaram morfologia meta/submetacêntrica para todos os cromossomos, exceto para o Y (dados não mostrados), que aparece como um cromossomo puntiforme nas três espécies analisadas e para um par subtelocêntrico de tamanho médio (par 13), em D. ecaudata (Fig. 1 e 2). Um único par de RON foi observado em cada espécie, variando em sua localização: intersticial no braço curto do par 13 em D. ecaudata e proximal no braço longo do par 10 de D. rotundus e no braço longo do par 15 de D. youngi (Fig. 1 e 2). Hibridização de sondas de Phyllostomus hastatus nos cariótipos de Diphylla ecaudata, Diaemus youngi e Desmodus rotundus. O cariótipo de Diphylla ecaudata apresentou 22 segmentos conservados a partir da hibridização com sondas cromossômicas totais de P. hastatus (Fig. 1a,b). Apenas cromossomos marcados com uma ou duas sondas foram observados: os pares DEC2 (PHA3), DEC5 (PHA6), DEC6 (PHA7), DEC8 (PHA8), DEC9 (PHA4), DEC10 (PHA 10), DEC11 (PHA11), DEC12 (PHA9), DEC14 (PHA14) e DECX (PHAX) apresentaram marcações por apenas uma sonda de Phyllostomus. Os demais pares, foram hibridizados por duas sondas simultaneamente: DEC1 (PHA2 e 4), DEC3 (PHA2 e 5), DEC4 (PHA5 e 1), DEC7 (PHA1 e 12), DEC13 (PHA15 e 13) e DEC15 (PHA15 e 12). Todas as sondas de P. hastatus hibridizaram em apenas um par cromossômico de D. ecaudata, exceto PHA1, 2, 4, 5, 12 e 15 as quais apresentaram marcação em dois cromossomos distintos, cada. As sondas de P. hastatus hibridizaram em um total de 21 segmentos conservados

87 no cariótipo de D. youngi (Fig. 1a,c), correspondendo a cromossomos marcados por uma ou duas sondas. As marcações por apenas uma sonda ocorreram nos pares cromossômicos DYO3 (PHA3), DYO5 (PHA6), DYO6 (PHA7), DYO7 (PHA8), DYO8 (PHA1), DYO9 (PHA9), DYO10 (PHA11), DYO11 (PHA4), DYO13 (PHA10), DYO15 (PHA15) e DYOX (PHAX). Os pares DYO1 (PHA4 e 2), 2 (PHA5 e 2), 4 (PHA 5 e 1), 12 (PHA 14 e 12) e 14 (PHA 13 e 12) representam os cromossomos marcados por duas sondas simultaneamente. Todas as sondas de P. hastatus hibridizaram apenas em um par cromossômico de D. youngi, exceto por PHA1, 2, 4, 5 e 12, as quais apresentaram sinais em dois pares distintos. A hibridização com sondas de P. hastatus no genoma de D. rotundus revelou 23 segmentos homeólogos (Fig. 1a,d). Nesta espécie, sete cromossomos apresentaram-se inteiramente marcados com uma única sonda cromossômica de Phyllostomus: DRO2 (PHA3), DRO5 (PHA6), DRO8 (PHA8), DRO9 (PHA7), DRO12 (PHA4), DRO13 (PHA10) e DROX (PHAX). Cinco cromossomos de Desmodus apresentaram-se marcados por duas sondas: DRO1 (PHA4 e PHA2), DRO3 (PHA5 e PHA2), DRO4 (PHA5 e PHA1), DRO7 (PHA1 e PHA12) e DRO11 (PHA13 e PHA14). Adicionalmente, dois cromossomos foram marcados por três sondas cromossômicas diferentes: DRO6 (PHA11, PHA9 e PHA12) e DRO10 (PHA9, PHA12 e PHA15). As sondas PHA3, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15 e X marcaram apenas um cromossomo; PHA1, 2, 4, 5 e 9 hibridizaram em dois cromossomos; enquanto PHA12 apresentou sinais de hibridização em três pares cromossômicos distintos no cariótipo de D. rotundus. Não foi possível a identificação de marcação por nenhuma sonda em pequenos segmentos dos cromossomos 6 e 10 de D. rotundus (Fig. 1d).

88 Hibridização de sondas de Carollia brevicauda nos cariótipos de Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi. As hibridizações com sondas de Carollia brevicauda revelaram a correspondência de todas as sondas a um ou mais segmentos cromossômicos nas três espécies de morcegos hematófagos. Apenas entre as sondas CBRX e Y 2 houve sobreposição das marcações, uma vez que boa parte do braço longo de CBRX é composto pelo cromossomo Y 2. Como resultado, CBRX apresentou-se marcada nas mesmas regiões que CBRY2, com marcação adicional obtida pelo segmento correspondente ao X original. Um total de 27 segmentos homeólogos resultou da hibridização de D. ecaudata com sondas de C. brevicauda (Fig. 2a,b). A marcação por apenas uma sonda ocorreu nos pares cromossômicos DEC2 (CBR1), DEC9 (CBR5), DEC10 (CBR7), DEC11 (CBR3), DEC14 (CBR9), DEC15 (CBR6) e DECX (CBR X). Os demais cromossomos, exceto DEC3 (CBR1, 2 e Y 2 ), foram hibridizados por duas sondas simultaneamente: DEC1 (CBR2 e Y 2 ), DEC4 (CBR1 e 3), DEC5 (CBR Y 2 e 1), DEC6 (CBR1 e 3), DEC7 (CBR4 e 6), DEC8 (CBR4 e 2), DEC12 (CBR2 e 1) e DEC13 (CBR6 e 8). Os cromossomos de C. brevicauda corresponderam a 27 segmentos homeólogos no genoma de D. youngi (Fig. 2a,c). Os cromossomos hibridizados exclusivamente por uma sonda cromossomo-específica foram: DYO3 (CBR1), DYO8 (CBR4), DYO10 (CBR3), DYO11 (CBR5), DYO13 (CBR7), DYO15 (CBR6) e DYOX (CBRX). Duas sondas foram simultaneamente hibridizadas em um único cromossomo de D. youngi nos pares DYO1 (CBR2 e Y 2 ), DYO4 (CBR1 e 3), DYO5 (CBR1 e Y 2 ), DYO6 (CBR1 e 3), DYO7 (CBR4 e 2), DYO9 (CBR2 e 1), DYO12 (CBR9 e 6) e DYO14 (CBR8 e 6). O único par cromossômico marcado por três sondas simultaneamente foi DYO2 (CBR1, 2 e Y 2 ).

89 Em D. ecaudata e D. youngi O número de cromossomos ou segmentos cromossômicos marcados por sonda variou de um a seis. As sondas CBR5, 7, 8, e 9 marcaram apenas um cromossomo, cada, CBR4 apresentou-se hibridizada em dois, CBR3, 6 e Y 2 em três, CBR2 e X em quatro e CBR1 em seis cromossomos distintos de D. ecaudata. As sondas cromossômicas de C. brevicauda hibridizadas no cariótipo de D. rotundus identificaram 28 segmentos conservados entre essas espécies (Fig. 2a,d). Quatro cromossomos de D. rotundus apresentaram-se inteiramente marcados com uma única sonda cromossômica de C. brevicauda: DRO2 (CBR1), DRO12 (CBR5), DRO13 (CBR7) e DROX (CBRX). A marcação simultânea por duas sondas ocorreu nos pares DRO1 (CBR2 e CBRY 2 ), DRO4 (CBR1 e CBR3), DRO5 (CBR1 e CBR Y 2 ), DRO7 (CBR4 e CBR6), DRO8 (CBR4 e CBR2), DRO9 (CBR1 e CBR3), DRO10 (CBR1 e CBR6) e DRO11 (CBR8 e CBR9). A marcação por três sondas distintas ocorreu nos pares DRO3 (CBR1, CBR2 e CBR Y 2 ) e DRO6 (CBR2, CBR3 e CBR6). As sondas CBR 5, 7, 8 e 9 marcaram apenas um par cromossômico; CBR4 hibridizou em dois pares; CBR3, 6 e Y 2 apresentaram sinais de hibridização em três pares, CBR2 e X em quatro e CBR1 hibridizou em seis pares cromossômicos no cariótipo de D. rotundus. Não foi possível a identificação de marcação por nenhuma sonda em pequenos segmentos dos cromossomos 6 e 10 de D. rotundus (Fig. 2b). As figuras 3 e 4 mostram os resultados de algumas hibridizações com sondas de P. hastatus e C. brevicauda respectivamente, nas três espécies de hematófagos, exemplificando a variação no número de segmentos marcados por sonda. A tabela 2 mostra resumidamente as correspondências cromossômicas entre as cinco espécies.

90 DISCUSSÃO A comparação dos dados cariotípicos gerais das espécies estudadas com os previamente publicados mostra que não existem polimorfismos quanto ao número diplóide e morfologia cromossômica, bem como com relação ao número e localização das RONs entre indivíduos coletados em diferentes regiões (Cadena e Baker 1976, Morielle e Varella-Garcia 1988, Varella-Garcia et al. 1989, Baker et al. 1992, Santos et al. 2001). Dessa forma, este estudo com Zoo-FISH constituirá uma referência para o entendimento da evolução cariotípica da família Phyllostomidae, independente do local de amostragem dos membros da subfamília Desmodontinae. A análise comparativa usando dados de pintura cromossômica entre os morcegos hematófagos mostra um grande número de segmentos cromossômicos compartilhados entre Diphylla ecaudata, Diaemus youngi e Desmodus rotundus. Homeologias de cromossomos inteiros foram observadas entre nove autossomos e o X das três espécies. Adicionalmente, dois pares cromossômicos são inteiramente compartilhados entre D. ecaudata e D. youngi (DEC12= DYO9 e DEC11= DYO10) e um par entre D. rotundus e D. ecaudata (DRO7=DEC7). Baker et al. (1988) sugeriram que apesar de apresentarem o mesmo número diplóide, D. ecaudata e D. youngi não apresentariam cariótipos idênticos devido a diferenças marcantes na morfologia de alguns cromossomos. Os dados de Zoo-FISH corroboram esta hipótese ao evidenciar quatro pares cromossômicos distintos entre as duas espécies (DEC7, 13, 14 e 15 e DYO8, 12, 14 e 15). Entretanto, apesar das diferenças, percebe-se que rearranjos intensos não devem ter ocorrido no processo de diferenciação desses cromossomos, persistindo a macrossintenia em todos os segmentos envolvidos.

91 Por outro lado, ao longo da evolução cromossômica de D. rotundus parece ter ocorrido um número maior de rearranjos na diferenciação de seu cariótipo em relação às demais espécies de Desmodontinae, possibilitando a redução no número diplóide, bem como a marcante diferença no padrão de bandas de alguns autossomos, por exemplo, DRO6. A partir da análise das hibridizações foi observado que os principais segmentos cromossômicos responsáveis pelas diferenças entre os cariótipos dessas três espécies representam os correspondentes a PHA12, 13, 14 e 15. Para D. rotundus estão envolvidos, adicionalmente, os segmentos correspondentes a PHA9 e 11. Com base nas duas hipóteses filogenéticas propostas para a subfamília, tentou-se estabelecer as prováveis seqüências de eventos que atuaram na diferenciação cariotípica do grupo. Quando consideradas as árvores geradas a partir de dados moleculares e morfológicos (Honeycutt et al. 1981, Wetterer et al. 2000, Baker et al. 2000, 2003), D. ecaudata aparece como basal em relação às outras duas espécies. Considerando seu cariótipo como mais próximo ao cariótipo ancestral para a subfamília, seriam necessários pelo menos dois eventos para a formação do cariótipo de D. youngi: uma translocação recíproca envolvendo DEC13 e 15 para a formação de DYO14 e 15 e uma translocação não recíproca, caracterizada por uma fissão de parte do braço longo de DEC7, correspondente a PHA12, seguido de fusão deste segmento ao DEC14, na formação de DYO12 e DYO8. Uma vez considerada a árvore filogenética gerada a partir de dados citogenéticos, o cariótipo de D. youngi seria o mais primitivo em relação ao das duas outras espécies (Baker et al. 1988). Dessa forma, a origem do cariótipo de D. ecaudata aconteceria de forma reversa ao apresentado anteriormente, com uma translocação

92 envolvendo DYO14 e 15 para a formação de DEC13 e 15, seguida pela fissão de DYO12 e fusão do segmento resultante à DYO8 para a formação de DEC7. Não foi possível estabelecer uma seqüência direta de eventos envolvidos na origem do cariótipo de D. rotundus a partir daquele apresentado por D. ecaudata ou D. youngi. Esta dificuldade pode ser justificada pela complexidade dos rearranjos ocorridos na formação dos cariótipos intermediários, fixados anteriormente ao cariótipo atual da espécie. Entretanto, foi possível presumir que rearranjos do tipo translocação recíproca, inversão, fissão e fusão devem ter desempenhado um papel essencial na reorganização dos segmentos no cariótipo de D. rotundus. Esta espécie foi a única que apresentou segmentos não marcados pelas sondas de P. hastatus e C. brevicauda, o que pode ser justificado pela presença de blocos de DNA repetitivo exclusivo da espécie nos cromossomos 6 e 10 (Li et al. 2004, Mao et al. 2008). Os resultados obtidos permitiram observar a correspondência entre a marcação de cada uma das sondas utilizadas de P. hastatus e C. brevicauda nos cariótipos dos membros de Desmodontinae, estando de acordo com os resultados da hibridização recíproca entre essas espécies, realizada por Pieczarka et al. (2005). O uso de sondas cromossômicas de ambas as espécies na comparação dos cariótipos dos morcegos hematófagos foi de extrema importância na distinção de braços cromossômicos homeólogos, como é o caso da marcação correspondente a PHA9 e CBR1 e 2 em D. rotundus. A comparação entre os cariótipos dos Desmodontinae com C. brevicauda (Carolliinae) e P. hastatus (Phyllostominae) revelou a existência de um par cromossômico (CBR7 = PHA10 = DRO13 = DEC10 = DYO13) que permaneceu inalterado durante a divergência dessas espécies. Por estar presente em espécies

93 evolutivamente distantes, este cromossomo provavelmente faz parte do cariótipo ancestral da família Phyllostomidae. Segundo Pieczarka et al. (2005), em adição a este par conservado, CBR9 (PHA14) também estaria presente no cariótipo ancestral de Phyllostomidae. Este cromossomo aparece inteiramente conservado em D. ecaudata e como braços cromossômicos conservados em D. youngi e D. rotundus, o que estaria de acordo com a hipótese de sua presença no ancestral, principalmente se o cariótipo de Diphylla for considerado como basal para a subfamília. Quatro pares cromossômicos apresentaram-se inteiramente conservados exclusivamente entre P. hastatus e os morcegos hematófagos (PHA3, 6, 7 e 8), o que sugere que os mesmos estariam presentes no ancestral comum das subfamílias Phyllostominae e Desmodontinae. A única diferença observada em relação a esses pares é a morfologia submetacêntrica de PHA7 em P. hastatus, que difere da condição metacêntrica observada para os cromossomos correspondentes nos hematófagos, o que sugere a ocorrência de uma inversão pericêntrica. Este maior número de cromossomos compartilhados, se comparado ao número de cromossomos conservados exclusivamente entre C. brevicauda e os hematófagos, podem indicar uma maior relação de proximidade de Phyllostomus a Desmodontinae, o que apoia a hipótese de Cadena e Baker (1976) na qual os morcegos hematófagos seriam mais próximos citogeneticamente aos Phyllostominae e Glossophaginae do que a Carolliinae e Stenodermatinae. Por outro lado, três pares cromossômicos (DRO1, 3 e 4) apresentam a mesma macrossintenia entre as três espécies de hematófagos, de forma que podem constituir sinapomorfias, apoiando a reunião da subfamília como um grupo monofilético. Entretanto, se faz necessária a realização da técnica de Zoo-FISH, com as sondas

94 empregadas neste estudo, em representantes das outras subfamílias de Phyllostomidae para que se confirme a exclusividade desses cromossomos em Desmodontinae. Finalmente, o presente estudo revelou dados importantes em relação à localização das RONs nas cinco espécies. Em P. hastatus, D. ecaudata e D. youngi, o DNA ribossomal manteve sua localização em um mesmo segmento cromossômico, correspondente a PHA15. A correspondência dos sítios das RONs a este segmento específico não foi observada em D. rotundus e C. brevicauda, que apresentaram esse marcador ligado a segmentos correspondentes a PHA12 e X, respectivamente. A variação de localização das RONs nas três primeiras espécies está claramente relacionada à ocorrência de rearranjos estruturais (translocações e inversões) no cromossomo original portador da RON. Em D. rotundus, rearranjos estruturais também parecem ter contribuído para a mudança no posicionamento das seqüências de DNAr. Neste caso, uma inversão envolvendo um segmento delimitado pela RON e por parte do centrômero do cromossomo 10 justificaria o posicionamento paracentromérico da RON em justaposição ao segmento correspondente a PHA12. Por outro lado, a diferença na localização das RONs em C. brevicauda parece estar relacionada a eventos de transposição dessas seqüências por elementos genéticos móveis proximamente ligados aos cístrons de DNAr ou por recombinação envolvendo seqüências repetitivas comuns a cromossomos não-homólogos. Eventos relacionados à mobilidade do DNAr têm sido discutidos para algumas espécies de plantas. Schubert e Wobus (1985) propuseram que as RONs de alguns cromossomos de Allium são capazes de se mover, pelo menos entre alguns sítios cromossômicos preferenciais. Esta mobilidade se daria tanto por meio de elementos de transposição, como pela presença de hotspots de recombinação em blocos

95 heterocromáticos ao quais que encontrariam seqüências homólogas próximas ou internamente às RONs. Para o gênero Aegilops foi proposto o papel do transposon Em/Spm para o deslocamento de seqüências de DNAr 5S e 45S entre cromossomos não homólogos, bem como para a expansão no numero de copias desta seqüência (Raskina et al. 2004). Uma hipótese alternativa para a variabilidade das RONs seria a replicação de seqüências de DNAr diminutas, não detectáveis pela FISH, com concomitante deleção dos cístrons dessa seqüência no cromossomo original portador da RON (Schubert e Wobus 1985, Chung et al. 2008). Estas explicações parecem se adequar à situação de C. brevicauda, estando de acordo com a proposta de Baker et al. (1992) na qual morcegos apresentam mecanismos ativos de movimentação de DNA repetitivo entre cromossomos não-homólogos. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq e à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco-FACEPE pelo auxílio financeiro. REFERÊNCIAS Ao L, GU X, Feng Q et al. (2006) Karyotype relationships of six bat species (Chiroptera, Vespertilionidae) from China revelead by chromosome painting and banding comparison. Cytogenet Genome Res 115:

96 Ao L, Mao X, Nie W et al. (2007) Karyotypic evolution and phylogenetic relationships in the order Chiroptera as revealed by G-banding comparison and chromosome painting. Chromosome Res. 15: Baker RJ, Bickham JW (1980) Karyotypic evolution in bats: evidence of extensive and conservative chromosomal evolution in closely related taxa. Syst Zool 29: Baker RJ, Honeycutt RL, Bass RK (1988) Genetics. Pp In: Schmidt U, Greenhall A, eds. Natural history of Vampire Bats. CRC Press pp Baker RJ, Hood CS, Honeycutt RL (1989) Phylogenetic relationships and classification of the higher categories of the New World bat family Phyllostomidae. Syst Zool 38: Baker RJ, Hoofer SR, Porter CA and Van Den Bussche RA (2003) Diversification among New World leaf-nosed bats: An evolutionary hypothesis and classification inferred from digenomic congruence of DNA sequence. Occasional Papers, Museum of Texas Tech University 230: i Baker RJ, Maltbie M, Owen JG, Hamilton MJ, Bradley RD (1992) Reduced number of ribosomal sites in bats: evidence for a mechanism to contain genome size. J Mammal 73: Baker RJ, Porter CA, Patton JC, van Den Bussche RA (2000) Systematics of bats of the family Phyllostomidae based on RAG2 DNA sequences. Occasional Papers, Mus. of Texas Tech. University 202: i Bass RA (1978) Systematics of the Desmodontinae and Phyllonycterinae (Chiroptera: Phyllostomatidae) based on G-band chromosomal homologies. M.Sc. Thesis, Texas Tech Univ., Lubbock.

97 Cadena A, Baker RJ (1976) Cariótipos de los murciélagos vampiros (Chiroptera: Desmodinae). Caldasia 11: Chung MC, Lee YI, Cheng YY, Chou YJ, LU CF (2008) Chromosomal polymorphism of ribosomal genes in the genus Oryza. Theor Appl Genet 116: Honeycutt RL, Greenbaum IF, Baker RJ, Sarich VM (1981) Molecular evolution of vampire bats. J Mammal 64: Howell WM, Black DA (1980) Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: Jones KE, Purvis A, MacLarnon A, Bininda-Emonds ORP, Simmons NB (2002) A phylogenetic supertree of the bats (Mammalia: Chiroptera). Biological Review 77: Li T, O Brien PCM, Biltueva L et al. (2004) Evolution of genome organizations of squirrels (Sciuridae) revealed by cross-species chromosome painting. Chromosome Res. 12: Mao X, Nie W, Wang J et al. (2008) Comparative cytogenetics of bats (Chiroptera): The prevalence of Robertsonian translocations limits the power of chromosomal characters in resolving interfamily phylogenetic relationships. Chromosome Res. 16: Mao X, Nie W, Wang J et al. (2007) Karyotype evolution in Rhinolophus bats (Rhinolophidae, Chiroptera) illuminated by cross-species chromosome painting and G-banding comparison. Chromosome Res 15: Morielle E, Varella-Garcia M (1988) Variability of nucleolus organizer regions in Phyllostomid bats. Rev Brasil Genet 11:

98 Pieczarka JC, Nagamachi CY, O Brien PCM et al. (2005) Reciprocal chromosome painting between two South American bats: Carollia brevicauda and Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae, Chiroptera). Chromosome Res 13: Raskina O, Belyayev A, Nevo E (2004) Activity of the En/Spm-like transposons in meiosis as a base for chromosome reppaterning in a small, isolated, peripheral population of Aegilops speltoides Tauch. Chromosome Res 12: Reis NR, Peracchi AL, Pedro WA, Lima IP (2007) Morcegos do Brasil. Londrina. 253p. Santos N, Fagundes V, Yonenaga-Yassuda Y, Souza MJ (2001) Comparative karyology of brazilian vampire bats Desmodus rotundus and Diphylla ecaudata (Phyllostomidae, Chiroptera): banding patterns, base-specific fluorochromes and FISH of ribosomal genes. Hereditas 134: Schubert I, Wobus U (1985) In situ hybridization confirms jumping nucleolus organizing regions in Allium. Chromosoma 92: Seabright M (1971) A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 2: Simmons NB (2005) Order Chiroptera. pp In: Wilson DE, Reeder DM, eds. Mammals species of the world: a taxonomic and geographic reference 3rd ed. Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland. Varella-Garcia M, Morielle-Versute E, Taddei VA (1989) A survey of cytogenetic data on brazilian bats. Rev Brasil Genet 12: Volleth M, Heller KG, Pferffer RA, Hameister H (2002). A comparative ZOO-FISH analysis in bats elucidates the phylogenetic relationships between Megachiroptera and five microchiropteran families. Chromosome Res 10:

99 Volleth M, Klett C, Kollak A et al. (1999) ZOO-FISH Analysis in a Species of the Order Chiroptera: Glossophaga soricina (Phyllostomidae).Chromosome Res 7: Wetterer AL, Rockman MV, Simmons NB (2000) Phylogeny of phyllostomid bats (Mammalia: Chiroptera): data from diverse morphological systems, sex chromosomes and restriction sites. Bull Am Mus of Natural History 248: Yang F, Carter NP, Shi L, Ferguson-Smith MA (1995) A comparative study of karyotypes of muntjacs by chromosome painting. Chromosoma 103:

100 Tabela 1. Espécies analisadas Nome científico e abreviação Localidade georeferenciada Número e sexo* Total de indivíduos Desmodus rotundus, DRO Toritama, S e O Tapacurá S e O Diphylla ecaudata, DEC Toritama, S e O Diaemus youngi, DYO Ipojuca, S e O * M = macho; F = fêmea 5M, 1F 2M, 1F 09 4M, 1F 05 1M, 2F 03

101 Tabela 2. Correspondências cromossômicas entre Phyllostomus hastatus (PHA), Carollia brevicauda (CBR), Diphylla ecaudata (DEC), Diaemus youngi (DYO) e Desmodus rotundus (DRO) obtidas através da pintura cromossômica comparativa com sondas das duas primeiras espécies. PHA CBR DEC DYO DRO 1 3/4 4/7 4/8 4/7 2 2/X/Y 2 1/3 1/2 1/ /5 1/9 1/11 1/12 5 1/X/Y 2 3/4 2/4 3/ / / / / /15 12/14 6/7/ / / X X X X X

102

103

104

105

106 5. CONCLUSÕES 1. A partir da pintura cromossômica com sondas de Phyllostomus hastatus e Carollia brevicauda foi possível a detecção com maior precisão das homeologias cromossômicas compartilhadas entre estas e as três espécies da subfamília Desmodontinae. 2. As espécies de Desmodontinae apresentam cariótipos mais similares entre si do que às duas outras espécies utilizadas neste estudo, confirmando sua proximidade filogenética. 3. O cariótipo de Desmodus rotundus apresenta mais rearranjos do que as demais espécies de morcegos hematófagos, incluindo fusões que justificam a redução em seu número diplóide. 4. Apesar das espécies pertencerem a subfamílias distintas, foi possível o reconhecimento de cromossomos conservados, os quais possivelmente estão presentes no cariótipo ancestral da família Phyllostomidae. 5. Desmodontinae apresenta-se mais proximamente relacionada a Phyllostominae do que a Carolliinae. 6. A variação na localização das RONs nas espécies estudadas parece acompanhar os rearranjos cromossômicos em algumas espécies, contudo podendo ser resultado de mecanismos de movimentação de seqüências repetitivas entre cromossomos nãohomólogos. 7. Os resultados obtidos no presente estudo mostram que as sondas geradas a partir de P. hastatus e C. brevicauda são ferramentas úteis no estudo da evolução cariotípica dos morcegos da família Phyllostomidae.

107 6. ABSTRACT The bat family Phyllostomidae is the most diverse of all mammalian groups. Its wide range of morphological variation has led to several disagreements among researchers regarding its systematic and evolutionary relationships. This family is cytogenetically characterized by highly conserved karyotypes among closely related species, however by great intergeneric variability, which leads to difficulties in comparative analysis using classical banding methods. Great effort has been made concerning Phyllostomidae Karyotypic evolution elucidation through comparisons of G-banding patterns between species. However, in some circumstances these data might not provide the true evolutionary history of chromosome segments due to similarity of non-homologous bands. Recent studies have overcome this situation by applying chromosome painting to reveal syntenic segments between species. Thus, in this study, comparative chromosome painting was used to identify chromosomal homologies between five species, belonging to three subfamilies of Phyllostomidae. Emphasis is given on the probable events that led the differentiation of Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi (Desmodontinae) by the use of probes from Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) and Carollia brevicauda (Carolliinae) on their karyotypes. Painting probes of P. hastatus have detected 23, 22 and 21 conserved segments on D. rotundus, D. ecaudata and D. youngi karyotypes, respectively, while C. brevicauda paints respectively detected 28, 27 and 27. The obtained data show chromosomal conservation among Desmodontinae members, with D. rotundus presenting the most rearranged karyotype. Based on the evolutionary relationships proposed by morphological, molecular and cytogenetic data, we present the probable sequence of events that has occurred during chromosomal evolution of hematophagous bats. Additionally, karyotypic comparison between the five species allowed inferring a closer affinity of Desmodontinae to Phyllostominae than to Carolliinae. Key words: Chromosomal homeologies, chromosome painting, Desmodus, Diaemus, Diphylla.

108 7. ANEXOS

109 7.1 Anexo1 Instruções para Autores Revista Chromosome Research ISSN: Springer, Netherlands

110 Manuscript Submission There are no page charges or charges for the publication of colour illustrations or administration charges for papers published in Chromosome Research. Manuscripts may be sent by to any of the Associate Editors or to the Editor-in-Chief (Please see addresses below). When submitting an article to one of the Associate Editors a copy of the covering letter, the title page and the abstract must be sent at the same time to the Editor-in-Chief, Professor Herbert Macgregor (herbert.macgregor@btinternet.com) The decision with regard to acceptance for publication is made by the Associate Editor/Editor to whom the manuscript is sent. North American authors are encouraged, but under no obligation, to send their manuscripts to one of our Associate Editors in that region. This often helps to speed up editorial processing and can lead to better communication and a faster decision on acceptance for publication. For the same reasons, Japanese authors are encouraged to submit their papers through our Associate Editor in Japan. It is understood that papers submitted for publication have not been published previously and are not simultaneously offered to any other journal. Before submission, the submitting author must ensure that the manuscript has been seen and approved by all other named authors. Editor in Chief: Professor Herbert Macgregor School of Biosciences Geoffrey Pope Building University of Exeter Stocker Road Exeter EX4 4QD England, UK Tel.+fax: (+44) (0) herbert.macgregor@btinternet.com Associate Editors: Wendy Bickmore MRC Human Genetics Unit Western General Hospital NHS Trust Edinburgh EH4 2XU Scotland, UK Tel: (+44) (0) Fax: (+44) (0) wendy.bickmore@hgu.mrc.ac.uk Website: Mary E. Delany 2131D Meyer Hall Department of Animal Science University of California Davis, CA USA Tel: office Tel: lab Fax: medelany@ucdavis.edu J.S. (Pat) Heslop Harrison Department of Biology University of Leicester Leicester LE1 7RH UK Tel: (+44) Fax: phh@genome.waitrose.com phh4@leicester.ac.uk Website: Dr Jiming Jiang Department of Horticulture University of Wisconsin-Madison

111 Madison, WI USA Fax: (+1) Professor Dr. Hans J. Lipps Institut für Zellbiologie Universität Witten/Herdecke Stockumer Str Witten Germany Tel.: (49) Fax.: (49) wh.de Adrian Summer 7 Smileyknowes Court North Berwick East Lothian EH39 4RG Scotland Tel/Fax: (+44) (0) atsumner@clara.net Nobuo Takagi Hokusei Gakuen University Atsubetsu ku Sapporo, Japan ntakagi@u01.gate01.com Fengtang Yang The Wellcome Trust Sanger Institute Wellcome Trust Genome Campus Hinxton, Cambridge CB10 1SA UK Tel: (+44) (0) Fax: (+44) (0) fy1@sanger.ac.uk How to Submit your Manuscript There are no page or administration charges for papers published in Chromosome Research. Manuscripts should be submitted by as PDF files with the illustrations integrated into the text or as Word files for the text and compressed JPEG files for the illustrations. Do not send very large files as attachments by as they may not be accepted by the editors' and reviewers' Web servers or they may take a very long time to download. Receipt of your manuscript by the receiving editor will be acknowledged immediately. Style and Presentation The manuscript should be typed with double spacing throughout, allowing for ample margins. The first page should show the paper title, names and addresses of all authors, a short running title, and fax and telephone numbers and the e mail address for the corresponding author. The second page should present a summary of less than 200 words, along with 3 5 key words, and should be followed by the text of the paper, arranged in the following sequence: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Informative legends should be provided for all illustrations and should be grouped together at the end of the paper, along with all tables. Subheadings may be inserted in the main text, but should not be numbered or lettered. Manuscripts should be written in clear, grammatical, idiomatic English. Spelling

112 should conform to Webster's International Dictionary or The Concise Oxford English Dictionary and data should be presented simply and concisely, using Systeme International (SI) units. Abbreviations should be kept to a minimum and must be defined at their first occurrence. References References should be cited in the text using the Harvard (name date) system. Where there are three or more authors, only the first author's name should appear, followed by et al. Where several references are cited at the same point in the text, these should be arranged in chronological order. The reference list should be typed with double spacing and arranged in alphabetical order. References should include: names and initials of all authors (unless there are more than six authors, when only the first three authors should be given, followed by et al.); year of publication; full title of the article; source using abbreviations for journals as shown in Index Medicus; volume number; and first and last page numbers. Abstracts should be identified as such. For citations from books, the chapter title should be followed by the names and initials of all editors, the title of the book, edition, place of publication, publisher and first and last page numbers. Examples: Thomas HM, Harper JA, Morgan WG (2001) Gross chromosome rearrangements are occurring in an accession of the grass Lolium rigidum. Chromosome Res 9: Ohno S (2001) The one to four rule and paralogues of sex determining genes. In: Scherer G, Schmid M, eds. Genes and Mechanisms in Vertebrate Sex Determination. Birkhauser Verlag, pp Engel E, Antonarakis SE (2002) Genomic Imprinting and Uniparental Disomy in Medicine. New York: Wiley Liss. Only accepted papers should be referenced; all other material should be referred to in the text as 'in preparation', 'personal communication' 'unpublished observations' and should not be included in the reference list. Citing Internet References World Wide Web: All references should include the same information that would be provided for a printed source (or as much of that information as possible). The Web information is then placed at the end of the reference. It is important to use "Retrieved from" and the date because documents on the Web may change in content, move, or be removed from a site altogether. To cite a Web site in text (but not a specific document), it is sufficient to give the address (e.g., there and no reference entry is needed. However, when citing a particular web page a citation in the text (e.g. Gaten 2000) and an entry in the reference list will be required. For example: Gaten E. (2000) Internet references. Retrieved from 19/9/2000 E mail: E mail communications from individuals should be cited as personal communications. The format in the text (personal communications are not cited in the reference list) is as follows: (E. Gaten personal communication, March 28, 2001). It is possible to send an e mail note disguised as someone else. Authors not journal editors or copy editors are responsible for the accuracy of all references, which includes verifying the source of e mail communications before citing them as personal communications in manuscripts. One of the most comprehensive guides to citing internet references is provided by the American Psychological Association: Tables and Illustrations All tables and illustrations should be referred to in the text, with appropriate locations indicated in the text margin. Tables should present new information and not duplicate data included in the text. Every table should have a descriptive title and, if numerical measurements are given, the units should be included in the column heading. Line drawings should be supplied in a form suitable for high quality reproduction. Axes should be labelled clearly; other lettering should be kept to a minimum. Avoid the use of fine tints, especially as background to text. Photographs may be submitted either as electronic files or as glossy prints. One complete set of high quality glossy prints of all illustrations must be provided with the final revised and accepted manuscript. These should be supplied exactly as the author wishes to see them published with regard to layout, colour, resolution and contrast. Magnifications must be shown by scale bars and any lettering should be in lower case Helvetica bold type, approximately 3mm in height(12 or 14 point size type). Photographs should be cropped as close as possible to the area of interest. Where two or more photographs are mounted together on one page, they should be separated by 2 3mm of white space.

113 If you send us your manuscript in electronic form and it is accepted for publication, we will invite you to send us high quality glossy prints of all your colour illustrations. This is not a requirement for publication in the journal but it does assist our production team in reproducing your pictures exactly as you would wish them to appear with regard to colour and definition. Colour figures There are no charges for the publication of colour illustrations, either in the online or in the printed version of Chromosome Research. Electronic Supplementary Material Electronic Supplementary Material (ESM) for a paper will be published in the electronic edition of this journal provided the material is: submitted in electronic form together with the manuscript accepted after peer review ESM may consist of: information that cannot be printed: animations, video clips, sound recordings (use QuickTime,.avi,.mpeg, animated GIFs, or any other common file format) information that is more convenient in electronic form: sequences, spectral data, etc. large quantities of original data that relate to the paper, e.g. additional tables, large numbers of illustrations (colour and black & white), etc. Legends must be brief, self-sufficient explanations of the ESM. ESM is to be numbered and referred to as S1, S2, etc. After acceptance for publication, ESM will be published as received from the author in the online version only. Reference will be given in the printed version. Permission and Copyright It is the responsibility of the author to obtain written permission for a quotation from unpublished material, or for all quotations in excess of 250 words in one extract or 500 words in total from any work still in copyright, and for the reprinting of figures or tables from unpublished or copyrighted material. Copyright in articles published in this journal is the property of Springer to the extent transferable. Authors are themselves responsible for obtaining permission to reproduce copyright material from other sources. There are no page charges or administration charges for papers published in this journal. Springer Open Choice In addition to the normal publication process (whereby an article is submitted to the journal and access to that article is granted to customers who have purchased a subscription), Springer now provides an alternative publishing option: Springer Open Choice. A Springer Open Choice article receives all the benefits of a regular subscription-based article, but in addition is made available publicly through Springer s online platform SpringerLink. To publish via Springer Open Choice, upon acceptance please visit to complete the relevant order form and provide the required payment information. Payment must be received in full before publication or articles will publish as regular subscription-model articles. We regret that Springer Open Choice cannot be ordered for published articles. Proofs Proofs will be sent to the corresponding author by . Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours. Off-prints Fifty free off-prints of each paper are provided. Authors may order additional off-prints on the form which accompanies the proofs. Additional Information Peter Butler Editorial Director, Chromosome Research Springer P.O. Box AA Dordrecht The Netherlands peter.butler@springer.com

114

115 7.2 Anexo2 Fotografias das espécies analisadas Fig. 1: Fotografias de espécimes de Desmodus rotundus (a), Diphylla ecaudata (b) e Diaemus youngi (c).