ISOLAMENTO DE FUNGOS EM CARRAPATOS IXODÍDEOS NATURALMENTE INFECTADOS ISOLATION OF FUNGI IN IXODIDS TICKS NATURALLY INFECTED

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1 ISOLAMENTO DE FUNGOS EM CARRAPATOS IXODÍDEOS NATURALMENTE INFECTADOS ISOLATION OF FUNGI IN IXODIDS TICKS NATURALLY INFECTED Silvia Gonzalez Monteiro 1 ; Lilian Roberta Matimoto 2 ; Fabrício Suris da Silveira 3 ; Adriana Monteiro Leal 4 RESUMO Duzentos e vinte e sete carrapatos ixodídeos das espécies Rhipicephalus sanguineus e Boophilus microplus foram coletados e mantidos em câmara climatizada sob temperatura e umidade controladas (27 o C e 80% U. R.) para observação de crescimento fúngico em sua superfície e possível isolamento de fungos entomopatogênicos. Cento e um carrapatos desenvolveram uma ou mais colônias de fungos na sua cutícula. Entre os gêneros isolados foi constatada a presença de Alternaria, Mucor, Fusarium, Curvularia, Penicillium e Aspergillus. Palavras-chave: carrapatos, ixodidae, isolamento, fungos, controle biológico ABSTRACT Two hundred and twenty-seven Ixodidae ticks of the Rhipicephalus sanguineus and Boophilus microplus species were collected and maintained in an acclimatized chamber under controlled temperature and humidity (27 o C and 80%R.U. ) to observe the growth of fungi on their surface and possible isolation of the entomopathogenic fungi. One hundred and one ticks developed one or more colonies of fungi on their cuticle. Among the isolated genera, the presence of Alternaria, Mucor, Fusariun, Curvularia, Penicillium and Aspergillus were verified. Key words: ticks, fungi, ixodidae, biological control, isolation INTRODUÇÃO desenvolvimento dos animais domésticos Os carrapatos ixodídeos além de são considerados importantes transmissores promoverem perdas na produção e de patógenos, como Babesia, Ehrlichia e 1 Prof.ª adjunto, Parasitologia Veterinária, UFSM sgmonteiro@uol.com.br 2 Aluno de graduação em Medicina Veterinária da UFSM 3 Aluno de graduação em Medicina Veterinária da PUCRS Campus Uruguaiana 4 Med. Vet. bolsista do laboratório de Pesquisas Micológicas da UFSM (LAPEMI)

2 Monteiro, S.G. et al. 138 Anaplasma, os quais muitas vezes geram óbito nos animais. O uso indiscriminado de acaricidas tem favorecido ao aparecimento de resistência à esses fármacos e a dificuldade de controle das infestações nos animais domésticos tem incentivado a pesquisa de tratamentos alternativos, como o controle biológico com fungos entomopatogênicos. Segundo FUXA & TANNADA (1987) fungos entomopatogênicos são caracterizados por causarem epizootias, possuírem alta taxa de crescimento, produção elevada de unidades infectantes, capacidade de sobrevivência no ambiente do seu hospedeiro, capacidade de resistir as barreiras físico-químicas do tegumento e da hemolinfa do hospedeiro e capacidade de provocar sua morte rapidamente. O isolamento de fungos nos carrapatos é reportado por diversos autores, entre eles, ESTRADA-PENÃ et al. (1990) que isolaram Aspergillus de R. sanguineus, e MWANGI et al. (1991) que relataram o isolamento de Aspergillus, Beauveria, Penicillium, Torrubiella, Cephalosporium, Paecilomyces, Fusarium e Mucor de carrapatos naturalmente infectados. Na pesquisa de controle biológico de carrapatos com fungos há trabalhos com Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae com excelentes resultados. KAAYA & GODWIN (2000), utilizando Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae na concentração 10 9 conídios/ml obtiveram 100% de mortalidade em larvas e % em ninfas de Rhipicephalus appendiculatus e Amblyomma variegatum. No Brasil, BITTENCOURT et al. (1995,1996) demonstraram a eficácia do fungo Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana no controle do ciclo de Boophilus microplus e MONTEIRO et al. (1998) infectaram larvas de Rhipicephalus sanguineus com os mesmos isolados e obtiveram mortalidade de larvas maior que o grupo controle em todos os tratamentos. Há muitas cepas diferentes de fungos que exibem variação considerável em virulência, patogenia e alcance de hospedeiro. Os esporos (conídios) dos fungos entomopatogênicos, infectam o inseto diretamente pelo tegumento externo e em temperatura favorável e umidade, o conídio adere à cutícula do hospedeiro, penetra no seu interior e germina produzindo hifas. A morte do artrópode ocorre por destruição tecidual e ocasionalmente por toxinas produzidas pelo fungo (CONNOLE, 1969). O objetivo deste trabalho visou o isolamento e identificação de gêneros de fungos que possam ser patogênicos para carrapatos. MATERIAL E MÉTODOS

3 139 Isolamento de fungos... O experimento foi realizado no Laboratório de Parasitologia Veterinária da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Campus Uruguaiana e no Laboratório de Parasitologia Veterinária do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) no período de 2001 à Duzentas e vinte e sete fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus e Rhipicephalus sanguineus foram coletadas de bovinos e cães (respectivamente) naturalmente infestados e ápos caírem ao solo, dessas, cento e vinte e seis eram provenientes de animais naturais de Uruguaiana e cento e uma oriundas de Santa Maria. As teleóginas, após serem levadas ao laboratório, foram limpas, imersas em álcool a 93% e transferidas para solução de hipoclorito de sódio a 5% por três minutos. A seguir, foram submersas três vezes em água destilada estéril e colocadas sobre o papel filtro para secagem. Cada fêmea foi aderida em fita adesiva dupla face e fixada em placa de Petri. As placas com os carrapatos foram mantidas em câmara climatizada (BOD) com temperatura de 27 o C e umidade relativa de ± 80% durante 30 dias e observadas diariamente em microscópio estereoscópio para visualização de micélio. Os ácaros onde houve crescimento fúngico foram levados a câmara de fluxo laminar para isolamento das colônias em meio de cultura. O meio de cultura utilizado foi o BDA (batata dextrose ágar) o qual havia sido previamente distribuído em placas de Petri mantidas em geladeira. A transferência das colônias desenvolvidas na superfície dos carrapatos para as placas de meio de cultura foi feita por meio de alça de platina estéril no interior da capela de fluxo laminar. As placas após a inoculação foram mantidas na câmara climatizada (BOD) em temperatura e umidade controladas (±27 o C e 80% U.R.). Observações diárias foram feitas nas placas inoculadas durante 15 dias. A identificação dos gêneros de fungos foi realizada através de características macroscópicas como coloração da colônia e desenvolvimento do micélio e microscópicas baseadas na classificação de BARNETT & HUNTER (1972) e ARX (1981) através de visualização em microscópio ótico de fragmentos das colônias cultivadas transferidas para lâminas de microscopia, adicionadas de azul algodão e lamínula. Todo o material utilizado neste experimento foi previamente autoclavado. RESULTADOS Dos duzentos e vinte e sete carrapatos coletados, noventa e três pertenciam a espécie Boophilus microplus e

4 Monteiro, S.G. et al. 140 cento e trinta e dois eram da espécie Rhipicephalus sanguineus. Destes, foram isolados seis gêneros de fungos, entre eles: Alternaria sp. (Fig. 1), Mucor sp., Fusarium sp., Curvularia sp., Aspergillus sp. (Fig.2) e Penicillium sp. (Fig. 3). cutícula mais de uma colônia de fungos. Foram isoladas 11 colônias de Aspergillus sp., 154 de Penicillium sp., 04 de Mucor sp., 02 de Fusarium sp., 01 de Curvularia sp. e 02 de Alternaria sp., todos considerados saprófitas (Tabela 1). O fungo prevalente foi o Penicillium, encontrado em 87,5% das colônias isoladas. Os fungos Fusarium sp., Alternaria sp. e Curvularia sp. foram encontrados somente nos carrapatos coletados na cidade de Uruguaiana- RS. Não houve diferença significativa no isolamento de fungos entre as espécies de carrapatos utilizadas no experimento. O material onde ocorreu crescimento bacteriano foi desprezado. Alguns carrapatos desenvolveram na sua

5 TABELA 1. Número de colônias dos gêneros de fungos isolados de Rhipicephalus sanguineus e Boophilus microplus em meio de cultura BDA (Batata dextrose ágar). Fungos Rhipicephalus sanguineus Boophilus microplus Aspergillus Penicillium Mucor Fusarium Curvularia 01 - Alternaria 02 - DISCUSSÃO Dos fungos isolados, o gênero prevalente foi o Penicillium seguido pelo Aspergillus. SALES et al. (2002) em seu trabalho de isolamento de fungos em Musca domestica também obtiveram esse resultado utilizando meio de cultura BDA. Já, GUERRA (2001) utilizando BDA acrescido de antibiótico de amplo espectro isolou 51 colônias de fungos de Musca domestica, Rhipicephalus sanguineus e Cochliomyia macellaria. Os gêneros isolados foram: Cladosporium, Beauveria, Penicillium, Curvularia, Aspergillus, Alternaria, Nigrospora, Fusarium, Metarhizium, Trichoderma e Mycelia sterilia, sendo que os autores não relataram se ocorreu crescimento concomitante de várias colônias de fungos nas espécies estudadas o que contribuiria para a ocorrência de competição entre elas. LIPA (1971) relatou o isolamento de Aspergillus fumigatus, Beauveria bassiana e Penicillium insectivorum em carrapatos e MWANGI (1990) também isolou fungos pertencentes ao gênero Aspergillus, Fusarium e Mucor de teleóginas de R. appendiculatus. Estes autores não descreveram o meio de cultura utilizado. COSTA et al. (2001) isolou de carrapatos naturalmente infectados, os fungos B. bassiana e M. anisopliae porém, o meio de cultivo utilizado foi o Oat dodine agar, que inibe o crescimento de fungos saprófitas. Provavelmente, a competição entre os fungos inibiu o crescimento dos gêneros entomopatogênicos no presente trabalho, pois estes possuem um crescimento mais lento que os saprófitas e segundo SHEARER (1994) essa competição é demonstrada freqüentemente em laboratório em material oriundo de diferentes habitats.

6 Monteiro, S.G. et al. 142 CONCLUSÃO Conclui-se no presente trabalho que o uso do meio batata dextrose agar, isolou gêneros de fungos considerados saprófitas. Há a necessidade da utilização desses isolados em testes laboratoriais para verificação de sua patogenicidade no ciclo de vida dos carrapatos. BIBLIOGRAFIA ARX, J.A. VON. The genera of fungi sporulating in pure culture. 3 rd ed., J. Cramer, Vaduz, Germany, 215 p BARNETT, H.L & HUNTER, B.B. Illustrated genera of imperfect fungi. Burgess Publishing Company. USA. 3 a ed BITTENCOURT, V.R.E.P.; MASSARD, C.L.; LIMA, A.F. Dinâmica da infecção do fungo Metarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1879) Sorokin, 1883, sobre o carrapato Boophilus microplus..(canestrini, 1887) Rev. Univ. Rural Série Ciências da Vida, 17 (1) : BITTENCOURT, V.R.E.P.; PERALVA, S.L.F.S.; VIEGAS, E. C. & ALVES, S. B. Avaliação dos efeitos do contato de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. com ovos e larvas de Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae). Rev. Bras. Parasitol. Vet., 5(2): COSTA, G.L.; SARQUIS, M.I.M. MORAES, A.M.L.; BITTENCOURT, V.R.E.P. Isolation of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae var. anisopliae from Boophilus microplus tick (Canestrini, 1887), in Rio de Janeiro State, Brazil. Mycopathology 154: CONNOLE, M.D. Effect of fungal extracts on the cattle tick, Boophilus microplus. Aust. Vet. J., 45: ESTRADA-PENÃ, A.; GONZÁLEZ, J.; CASASOLAS, A. The activity of Aspergillus ochraceus (Fungi) on replete females of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in natural and experimental conditions. Folia parasitologica, v. 37, p , FUXA, J.R. & TANADA, Y. Epidemiological concepts applied to insect pathology. In: J. R. Fuxa and Y. Tanada. Epizootiology of insect diseases. New York: John Wilwy & Sons p GUERRA, R.M.S.N.C.; TEIXEIRA FILHO, W.L.; COSTA, G.L.; BITTENCOURT, V.R.E.P. Fungos isolados de Rhipicephalus sanguineus

7 143 Isolamento de fungos... (Acari: Ixodidade) Cochliomyia macellaria (Diptera:Muscidae) e Musca domestica (Diptera:Muscidae) naturalmente infectados no município de Seropédica, Rio de Janeiro. Ciência Animal 11(2): , MWANGI, E.N.; DIPEOLU, O.O.; NEWSON, R.M.; KAAYA, G.P.; HASSAN, S.M. Predators, parasitoids and pathogens of ticks: a review. Biological Science and Technology, v. 1, p , KAAYA, G.P. & GODWIN, S. Entomogenous fungi as promising biopesticides for tick control. Experimental and applied Acarology 24: LIPA, J. J. Microbial control of Mites and ticks in Microbial Control of Insect and Mites (Burges, H. D. & Hussey, N. W.) Academic Press, New York. P MONTEIRO, S.G.M.; BITTENCOURT, V.R.E.P.; DAEMON, E.; FACCINI, J.L.H. Pathogenicity under laboratory conditions of the fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on larvae of the tick Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 7: SALES, M.S.N.; COSTA, G.L.; BITTENCOURT, V. R. E. P. Isolation of fungi in Musca domestica Linnaeus, 1758 (Diptera Muscidae) captured at two natural breeding grounds in the municipaly of seropedica, Rio de Janeiro, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo cruz, vol 97, SHEARER, C.A. Fungal Competition. Can. J. Bot. 73 (1) p MWANGI, E.N. The ecology of free-living stages of R. appendiculatus. (Neumann) and otherlivestock ticks, and the role of predators, parasitoids and pathogens in the regulation of natural population. Phd Tesis, Kenyatta University Nairobi, Kenya.1990.