A INFLUÊNCIA DO TEOR DE ACIDEZ E DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA DO MOSTO NO RENDIMENTO FERMENTATIVO INDUSTRIAL PARA PRODUÇÃO DE ETANOL

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1 Engenharia/Engineering 47 A INFLUÊNCIA DO TEOR DE ACIDEZ E DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA DO MOSTO NO RENDIMENTO FERMENTATIVO INDUSTRIAL PARA PRODUÇÃO DE ETANOL DE CARVALHO;G.G 1 ; MONTEIRO;R.A.B 2 1 Pós Graduando em Processamento na Indústria Sucroalcooleiro, Faculdades Associadas de Uberaba - MG, gleidsoncarvalho@yahoo.com.br 2 MSc. em Ciência dos Alimentos, Universidades Federal de Viçosa - MG, romilda.monteiro@ifmg.edu.br RESUMO: A cada dia, a procura por fontes de energias renováveis aumenta. A preocupação com o meio ambiente e com as transformações climáticas que vem ocorrendo em nosso planeta nos mostra que é necessário mudar nossos hábitos quanto à utilização dos recursos naturais e emissão de poluentes no bioma. A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar torna-se, então, uma boa alternativa para cumprir esse papel de mitigar a emissão dos gases do efeito estufa. Um dos pontos de destaque do processo fermentativo é a produção do mosto de alimentação das dornas. Substrato essencial para a fermentação, o mosto também pode ser um carreador de diversos problemas, quando não produzido adequadamente. Neste trabalho foi realizado um comparativo entre a acidez e a contaminação do mosto e a influência destes dois fatores no rendimento fermentativo final. Com base em análises laboratoriais, foi verificado que existe uma correlação direta entre a acidez do mosto e o nível de contaminação bacteriana e que estes fatores afetam diretamente a conversão do açúcar em etanol pelas leveduras, decrescendo o rendimento fermentativo ao final. PALAVRAS CHAVE: Acidez; Contaminação; Fermentação; Mosto. The influence of teor of acidity and of the contamination by wine on the industrial fermentation to produce Etanol ABSTRACT: Each day, the demand for renewable energy increases. Concern for the environment and climate change by what is happening on our planet shows us that we need to change our habits regarding the use of natural resources and emission of pollutants in the biome. The production of ethanol from sugar cane becomes then a good choice for this role to mitigate the emission of greenhouse gases. One of the highlights of the fermentation process is the production of the wine vats of supply. Essential substrate for fermentation, the wine can also be a carrier of various problems, if not produced properly. In this paper we present a comparison between the acidity and contamination of the wine and the influence of these two factors in the final fermentation yield. Based on laboratory tests, it was verified that there is a direct correlation between wine and the acidity level of bacterial contamination and that these factors directly affect the conversion of sugar into ethanol by yeast fermentation yield decreased at the end. KEY WORDS: Acidity; Contamination; Fermentation; Wine. INTRODUÇÃO A produção de etanol no Brasil, atualmente é realizada por processos de fermentação, onde as leveduras transformam os açúcares presentes no mosto em etanol, gás carbônico e energia (CEBALLOS-SCHIAVONE, 2009). Invertase C 12 H 22 O 11 + H 2 O 2 C 6 H 12 O 6 Zimase 2 C 6 H 12 O 6 4CH 3 CH 2 OH + 4CO ,0 cal (Etanol) Segundo Damasceno (2010), o etanol é um composto químico constituído de carbono, hidrogênio e oxigênio. Sua característica principal é a presença de uma hidroxila ligada a um radical alcoíla. O etanol é um líquido incolor, límpido, de cheiro agradável e fortemente penetrante, seu sabor é caustico e ardente. Durante o processo fermentativo pode ocorrer a contaminação bacteriana, interferindo negativamente na produção e na qualidade, pois, além de consumir parte do substrato adicionado ao meio para produção de etanol, as bactérias também produzem metabólitos tóxicos que inibem as leveduras, favorece a floculação ocasionando perdas de eficiência na fermentação. Dentre estes metabólitos, destaca-se a produção de ácidos orgânicos, produzidos pelas bactérias como produto final de sua síntese e, pelas leveduras como produtos secundários, estimulados pelo estresse ocorrido. Estes fatores aliados causam sérios prejuízos à produtividade. Sendo assim, é necessário ter um controle rápido e eficaz para minimizar a contaminação bacteriana e, por consequência, reduzir a acidez do meio, resultando em um processo fermentativo de alto desempenho. Um importante ponto de controle é a qualidade do mosto de alimentação das dornas. Para tanto, é necessário que se mantenha algumas condições como: uma baixa contaminação bacteriana, uma concentração adequada de açúcares fermentescíveis e demais nutrientes como minerais específicos e vitaminas. Para se reduzir o nível de contaminação bacteriana do mosto é necessário manter uma boa assepsia dos trocadores de calor, eliminando os pontos mortos nas tubulações, realizando adequadamente os processos de filtração, decantação, clarificação, evaporação e um tratamento térmico do caldo. Segundo Ribeiro (2010), a concentração do mosto é definida pela produção pretendida e capacidade de fermentação da levedura. A qualidade do mosto depende de vários fatores intrínsecos ao processo. Desde o campo,

2 Engenharia/Engineering 48 até a indústria a cana deve ser manejada de forma a preservar o maior teor de sacarose possível e menor quantidade de impurezas e contaminações microbianas. Durante o processamento da cana na indústria, devem-se ter certos cuidados para evitar a multiplicação excessiva de bactérias. Para isso, deve-se empregar o uso de produtos químicos e bactericidas que preservem a composição natural do caldo. O uso do tratamento térmico também auxilia nesse processo. A multiplicação bacteriana após a moagem é um dos grandes problemas enfrentados na atividade sucroalcooleira. Uma das principais causas é a falta de limpeza adequada em tubulações, trocadores de calor, ternos da moenda, peneiras e tanques. Segundo o levantamento da população bacteriana desenvolvido por Gallo (1990) para dornas de fermentação, há uma predominância de 98,52% de bactérias do grupo Gram + sendo na sua maioria do gênero Lactobacillus (59,75) e Bacillus (26,58). Os metabólitos excretados por essas bactérias causam sérios danos as leveduras como a sua intoxicação e até a inibição de sua atividade principal, a produção de etanol. Mesmo a utilização de antibacterianos e o próprio tratamento térmico não minimizam a ação negativa desses compostos, que agem diretamente nas leveduras, causando prejuízos ao processo de fermentação. (CEBALLOS-SCHIAVONE, 2009). Observado os pontos acima citados, surge então o questionamento. Existe uma relação direta entre o nível de contaminação bacteriana e o teor de acidez do mosto de alimentação? É possível correlacionar o teor de acidez do mosto com as variações na eficiência de fermentação? Este estudo contribui para a melhoria da qualidade e do controle sobre a contaminação do mosto utilizado na alimentação das dornas de fermentação, uma vez que, os parâmetros acidez e contaminação bacteriana são as principais causas da má qualidade do substrato. O objetivo deste trabalho é determinar por meio de análise físico-química e microbiológica, os níveis de acidez do mosto de alimentação das dornas e a contaminação bacteriana, correlacionando o teor de acidez produzida no mosto, com o grau de contaminação e as alterações no rendimento fermentativo ao final. REVISÃO DE LITERATURA Características da matéria-prima O Brasil é um líder mundial na produção de etanol. O setor sucroalcooleiro brasileiro detém tecnologia de ponta para a produção desta fonte de energia. Com uma extensa área de plantio de cana, a produção brasileira desta cultura destaca-se tanto em produtividade, quanto em qualidade. Atualmente, a cana-de-açúcar é a terceira cultura mais cultivada, ficando atrás somente da soja e do milho (RIBEIRO, 2008). De acordo com o primeiro levantamento trimestral realizado pela Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2011), a previsão de produção de cana-deaçúcar para a safra de cana-de-açúcar 2011/2012, deve chegar a milhões de toneladas, de uma área estimada de 8,44 milhões de hectares. O estado de São Paulo é o que detém a maior parcela com 4,35 milhões de hectares ou 54,23% do total nacional. Em seguida, vem o estado de Minas Gerais com 8,1% (649,94 mil hectares), Paraná com 7,25% (582,32 mil hectares), Goiás com 7,46% (599,31 mil hectares), Alagoas com 5,46% (438,57 mil hectares), Mato Grosso do Sul com 4,93% (396,16 mil hectares) e Pernambuco com 4,32% (346,82 mil hectares). Com grandes investimentos em pesquisa, trabalhos com cruzamento de espécies e processos de seleção de linhagens tornou-se possível criar variedades de cana mais adaptadas ao clima e solo das diversas regiões produtoras do Brasil. O advento da biotecnologia também foi possível desenvolver variedades mais resistentes a pragas e doenças, contribuindo ainda mais para a redução no uso de defensivos agrícolas e, consequente, aumento da produtividade (OLIVEIRA FILHO, 2010). Segundo Stupiello (1987), a cana-de-açúcar como matéria- prima é definida como colmos em estágio adiantado de maturação, sadios, recém-cortados, normalmente despontados e livres de matérias estranhas. Com uma matéria-prima de qualidade é possível então obter melhores resultados industriais. Maiores teores de sacarose por tonelada de cana resultam numa maior produção de etanol e açúcar, além de uma melhor valorização no momento do pagamento ao fornecedor (OLIVEIRA FILHO, 2010). Ainda, segundo Oliveira Filho (2010), ao processarse uma cana de baixa qualidade, se reduz a velocidade de trabalho da indústria, aumento no consumo de insumos, maior desgaste dos equipamentos, obtendo produtos de menor qualidade, refletindo na queda do rendimento industrial. Mutton (2008), pondera que a cana-de-açúcar pode sofrer diversos tipos de deteriorações. Desde seu cultivo até a entrega no pátio da usina, diversos fatores podem alterar a qualidade da cana. Entre esses aspectos há principalmente três tipos de degradações: fisiológicas causadas pelo florescimento, queima da cana, inversão da sacarose, etc. A deterioração microbiológica, consequência da atividade metabólica de microorganismos, que resulta na formação de compostos nocivos à planta e substâncias prejudiciais aos processos industriais como: ácidos orgânicos, gomas e polissacarídeos. E a deterioração tecnológica causada principalmente pelas impurezas minerais (pedra e terra) e vegetais (palmito, palha, folha, colmos secos). Etanol no Brasil A produção de álcool no Brasil sempre esteve atrelada a fatores climáticos, econômicos e políticos nacionais e internacionais. Com a crise do petróleo em 1973/1974, foi criado em 1975, o programa nacional de produção de álcool, o PROÁLCOOL (RIBEIRO, 2008). Com o propósito de utilizar a tecnologia já existente de produção de álcool carburante a partir da cana-deaçúcar, este programa foi fundamental para o desenvolvimento do setor sucroalcooleiro no país. A partir

3 Engenharia/Engineering 49 deste momento houve uma grande expansão tecnológica na indústria produtora de álcool (RIBEIRO, 2008). Seleção de linhagens de leveduras, desenvolvimento de novos equipamentos, uma reestruturação das destilarias e processos fermentativos, até então obsoletos, foram algumas das melhorias conquistadas após a criação do programa (RIBEIRO, 2010). Com a entrada da mecanização em todas as etapas do cultivo da cana e o aprimoramento técnico da mão-deobra, em trinta anos foi possível dobrar a produtividade da cana por área e reduzir os custos de produção em torno de oitenta por cento (RIBEIRO, 2008). Com o fim do programa PROÁLCOOL, o aumento da atividade petrolífera no mundo e a redução dos preços internacionais da gasolina na década de noventa houve então um retração no consumo e produção de etanol (VENTORIM, 2008). Este cenário mudou nacionalmente, somente a partir de 2003, com a criação dos veículos flex-fuel e devido a questões econômicas, políticas e ambientais, elevando novamente o consumo de álcool hidratado no Brasil (VENTORIM, 2008). Segundo a Conab (2011), a produção brasileira neste período saltou dos 3,8 bilhões de litros no ano de 2003, para 19,5 bilhões de litros em Em especial, a questão ambiental é um fator que opera positivamente a favor da produção de etanol. Questões ambientais passaram a sobrepor as econômicas, devido à necessidade da redução de emissões de gases do efeito estufa na atmosfera. E uma particularidade torna o etanol um combustível renovável. Durante o crescimento da cana, esta absorve CO 2 pelo processo fotossintético. Este fato neutraliza as emissões que ocorrem durante a queima do etanol, reabsorvendo este gás, tornando o balanço de emissão de CO 2 pelo etanol neutro. Assim, o gás carbônico emitido na queima se renova, sem agredir o ambiente (JOSEPH JUNIOR, 2008). O último relatório do Intergovernmental Panel On Climare Change (IPCC) apud Ribeiro (2008), divulgado em 2007, reforça que a atividade humana está relacionada com o aquecimento global, sendo que, o setor energético foi o que mais contribui para esse aumento devido o uso de combustíveis fósseis. O relatório ainda direciona que é preciso aumentar em 3% a utilização de biocombustíveis na oferta total do setor de energia mundial antes de Isto representaria um aumento na produção de biocombustíveis na ordem de 100 x 10 6 m 3 / ano. Nesta perspectiva a participação do etanol teria que aumentar em 46 x 10 6 m 3 /ano que seriam acrescidos a produção de 113 x 10 6 m 3 /ano já previstos para Fermentação para produção de etanol Segundo Ribeiro (2010), A fermentação alcoólica é um processo biológico comum a todos os substratos açucarados, no qual estes são transformados em etanol e dióxido de carbono. A espécie de microorganismo mais utilizada para a fermentação alcoólica é a levedura, organismos eucarióticos que formam uma das classes mais importantes dos fungos. As células de Saccharomyces cerevisiae possuem, geralmente, forma unicelular, com diâmetros que variam de 2 a 8 micrômetros. Sua reprodução é feita basicamente por brotamento, dando origem a uma nova célula (TOSETTO, 2008). Ventura (2007) destaca que, normalmente, são empregadas nas destilarias brasileiras, linhagens selecionadas de Saccharomyces cerevisiae, com ou sem alteração genética, que possuam características específicas de maior produção de etanol e mais resistentes a ambientes estressantes. Tosetto (2008) explica que, devido a sua característica facultativa, a levedura tem a capacidade de utilizar duas vias distintas de transformação do açúcar durante o processo fermentativo. No primeiro denominado glicólise, a sacarose é degradada até ácido pirúvico, por uma sequência ordenada de reações catalisadas por enzimas específicas. Em anaerobiose há uma tendência para a atuação das enzimas piruvato-descarboxilase e álcool-desidrogenase, produzindo etanol e água a partir do ácido pirúvico. Quando na presença de oxigênio, a levedura tem a capacidade de transformar parte do açúcar em CO 2, biomassa e água. Esta reação ocorre devido o deslocamento reacional de parte do ácido pirúvico para o Ciclo de Krebs onde será oxidado enzimaticamente (TOSETTO, 2008). As enzimas específicas de cada reação podem ter sua atividade influenciada por diversos fatores como: ph, temperatura, inibidores, concentração de substrato, etc. (RIBEIRO, 2010). O balanço global dos dois ciclos pode ser resumido pelas equações: C 6 H 12 O 6 + 2Pi + 2 ADP 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 + 2ATP + 2H 2 O + 57 Kcal (Equação de Gay-Lussac) C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O + 38ATP Kcal (Ciclo de Krebs) De acordo com Ribeiro (2010), na sequência das reações enzimáticas aparecem rotas metabólicas alternativas para a formação de outras substâncias necessárias para o desenvolvimento de produtos secundários, relacionados direta ou indiretamente com a adaptação e sobrevivência das leveduras. Estando sujeito a presença de oxigênio ou não, a levedura forma juntamente com o etanol e gás carbônico, produtos como glicerol, ácidos nucléicos, proteínas, lipídios, alcoóis superiores, ácidos acético, succínico, pirúvico, entre outros. Simultaneamente ocorre também o crescimento celular. Sendo assim, a equação descrita por Gay Lussac, mediante as condições industriais anaeróbicas utilizando sacarose é dada por: C 12 H 22 O 11 + H 2 O 2C 6 H 12 O + levedura 4C 2 H 5 OH + 4CO 2 + (levedura) + (subprodutos) O rendimento teórico de etanol por grama de glicose consumida é 0,511 gramas, sendo este valor considerado 100% quando o substrato for glicose. Como na condição de fermentação industrial brasileira, o

4 Engenharia/Engineering 50 rendimento alcançado é em média 91%, isto corresponde a 0,465 gramas de etanol por grama de açúcar redutor total (ART) consumido (RIBEIRO, 2010). Mosto de alimentação Segundo Ribeiro (2010), o mosto é uma suspensão de substrato açucarado, numa concentração adequada, usada na fermentação. A qualidade do mosto depende tanto da matéria-prima utilizada, quanto das diversas etapas durante o processamento. Dependendo do processo, o mosto utilizado pode ser constituído de caldo de cana in natura, uma mistura de mel, xarope e caldo clarificado. Para Rossell (2008), a qualidade da água de diluição também é muito importante. Normalmente as destilarias captam águas de superfície com teores variáveis de matéria em suspensão, colóides e uma flora microbiológica diversificada. Sendo que, o tratamento desta água nem sempre é conduzido de forma adequada. Relativamente, o custo do processo de depuração da água é baixo e a relação custo benefício do tratamento da água para utilização na fermentação não tem sido quantificada, uma vez que, parte dos contaminantes é introduzida por esta via na fermentação. Ribeiro (2010), explica que a concentração do mosto é determinada de acordo com a produção pretendida, a capacidade de produção e o modelo de fermentação utilizado. Mas, geralmente, esta concentração é entre 15 e 25 ºBrix. Mostos com altos níveis de concentração ocasionam perdas de açúcares, que não são fermentados devido ao estresse osmótico, causados nas leveduras. Nesta situação ocorre inibição pelo substrato, que extrapola a região de saturação. Valores entre 350 a 500g / litro de ART tornam o crescimento impossível devido à desidratação das células. Outro inconveniente é que mostos com elevada concentração sujam mais os aparelhos de destilação e trocadores de calor. Apesar de sujarem menos os equipamentos, mostos muito diluídos gastam mais água na diluição, sendo necessárias dornas maiores, gastando assim mais vapor na destilação e gerando mais vinhaça. Além disso, a fermentação fica mais sujeita a infecção. A utilização de méis, xaropes e caldos filtrados da fabricação do açúcar também podem causar sérios problemas na fermentação. Geralmente, estes substratos são submetidos ao processo de sulfitação. E a presença de sulfito no mosto provoca efeitos negativos na fermentação, aumentando a síntese de glicerol, reduzindo a conversão de açúcar em etanol. Outro problema encontrado é o elevado índice de microrganismos presentes nestas matériasprimas, além de altas concentrações de sais de cálcio e magnésio, materiais em suspensão, ácidos orgânicos e colóides que inevitavelmente inibem a fermentação, reduzindo assim a produção de etanol (ROSSELL, 2008). Para que o processo fermentativo ocorra adequadamente é necessário que haja um tratamento de purificação do caldo anteriormente em decantadores e evaporadores. Nos decantadores ocorre o aquecimento do caldo, correção do ph para faixa de 6,0 7,0 e adição de polímeros, que irão auxiliar na precipitação e remoção de colóides, impurezas minerais, bagacilhos, gomas e compostos nitrogenados (OLIVEIRA FILHO, 2010). Este processo desfavorece a formação de espuma durante a fermentação, o acúmulo de sujeira nas colunas e reduz a presença de microorganismos indesejáveis. Em um estudo desenvolvido por Nolasco e Finguerut (1996), foram avaliados diferentes fluxogramas de preparo e transporte do mosto até a fermentação e caracterizado microbiologicamente as correntes formadoras deste mosto em 39 usinas. Ao final, verificaram que todos os mostos analisados chegavam à fermentação, apresentando altos níveis de bactérias lácticas, além de esporos de mesófilos e termófilos. Um importante agente físico que atua nestes dois processos é o calor. São utilizadas temperaturas que iniciam em 90 até 120ºC. Isto elimina quase que totalmente as bactérias, além de reduzir a densidade do caldo, facilitando seu escoamento nas tubulações e trocadores de calor. Este último equipamento é tido como ponto crítico na contaminação, principalmente o modelo de placas (CEBALLOS-SCHIAVONE, 2009). Nas placas dos trocadores de calor ocorre à inconveniente formação de biofilme, uma camada de polímero que protege as bactérias aderidas nas placas metálicas, impedindo a ação de antibacterianos e produtos químicos. Outra situação que torna o trocador de calor um ponto crucial de monitoramento é o fato de se reduzir a temperatura do mosto para faixa de 28 36ºC, ampla faixa de atuação dos microorganismos mesófilos. Torna-se imprescindível então, manter um controle rígido sobre a qualidade microbiológica da água de diluição, do caldo advindo dos evaporadores e, principalmente, da higiene e do processo de limpeza das placas dos trocadores, das tubulações e anéis de alimentação, até a dorna (RIBEIRO, 2010). Flora contaminante Segundo Gallo (1990), o primeiro cuidado como controle para evitar a contaminação bacteriana de processos fermentativos em produção de etanol, começa ainda no campo. Uma matéria- prima muito contaminada aliada a problemas de eficiência no tratamento do caldo levam um grande número de microorganismos contaminantes e os produtos de seus metabólitos para o processo fermentativo. As próprias condições de cada etapa do processo de produção de etanol favorecem a seleção e o desenvolvimento de microorganismos, sendo que, a contaminação está sujeita desde o campo, até a etapa final de fermentação. Ainda, neste sentido Ceballos-Schiavone (2009) relata que a presença de contaminantes na fermentação resulta em sério prejuízo para as leveduras, refletindo diretamente na produtividade e no rendimento final. Sendo que, os maiores prejuízos causados por essa contaminação é a degradação da sacarose e a produção de ácidos orgânicos, que ocasionam perda de açúcar e intoxicação das leveduras. Segundo o levantamento de população microbiológia desenvolvido por Gallo (1990), para dornas

5 Engenharia/Engineering 51 de fermentação a uma predominância de 98,52% de bactérias do grupo Gram + sendo na sua maioria do gênero Lactobacillus (59,75) e Bacillus (26,58). Neste estudo foram identificadas e quantificadas as espécies, sendo eles L. fermentum (15,04%), L. helveticus (14,08%), L. platarum (5,69%), L. animalis (4,55%), L. buchneri (3,76%), L. acidophilus (3,07%), L. vitulinus (2,96%), L. viridescens (2,36%), L. amylophilus (1,88%), L. agilis (1,25%), L. reuteri (1,22%), L. delbrueckii subsp. lactis (1,04%), L. murinus (1,02%), L. delbrueckii subsp. bulgaricus (0,71%), L. coryniformis subsp. torquens (0,71%) e L. sakei (0,42%). Entre as bactérias do gênero Bacillus estão B. coagulans (15,09%), B. stearothernophilus (6,91%), B. megaterium (2,43%), B. brevis (1,23%), B.lentus (0,70%) e B. pasteurii (0,22%). Entre os problemas causados pela contaminação bacteriana, destaca-se a floculação do fermento. Neste caso, ocorre a aglomeração das células de leveduras, formando flocos causando a diminuição da produção de etanol, reduzindo a conversão de açúcar, aumentando a acidez do meio, além de diminuir a eficiência nos processos de centrifugação. Este último, ainda contribui para o aumento da recirculação de bactérias entre as bateladas, devido estas estarem aderidas entre os flocos e retornarem para a cuba de tratamento (RIBEIRO, 2010). Os ácidos orgânicos, principal metabólito produzido pelas bactérias contaminantes, são em sua maioria produtos da síntese do carboidrato, disponível no meio fermentativo. Os mais comumente encontrados são ácido lático, acético, fórmico. Mas nem só as bactérias são responsáveis pela produção destes compostos. As próprias leveduras também podem produzir ácido succínico quando estão sobe situação estressante (CEBALLOS- SCHIAVONE, 2009). Segundo Costa (2006), o ácido acético, por exemplo, produzido tanto pelas leveduras como também pelas bactérias, tem um poder de toxidez até trinta vezes mais que o etanol. Sua toxidade é devido a capacidade de penetração deste ácido no citoplasma das leveduras, promovendo uma acidificação intra-celular, afetando diretamente o sistema motriz de transporte na célula. Seu efeito é tanto maior, quanto menor for o ph do meio, atuando em sinergia com o etanol. Estes compostos podem apresentar ação antibacteriana não seletiva, afetando diretamente o desempenho das leveduras. Tosetto (2008), também afirma que os ácidos presentes no meio fermentativo têm a capacidade de penetrar na membrana protetora e entrar na célula causando danos aos componentes intercelulares, culminando na queda da viabilidade celular. Estes danos associados a outras condições estressantes podem fazer que o fermento pare metabolicamente ou morra. MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi desenvolvido no ano de 2011 em uma usina produtora de etanol localizada no Centro-Oeste Mineiro. O período de coleta dos dados foi de maio a julho deste mesmo ano. A matéria-prima utilizada neste estudo foi o mosto de alimentação das dornas, proveniente do caldo da cana-de-açúcar, coletado na saída de trocador de calor. Foram realizados 95 ensaios, sendo 01 ensaio diário e em duplicata. Os valores obtidos formam a média semanal. Todas as análises foram feitas seguindo os procedimentos descritos por Silva et al. (2003) e Instituto Adolfo Lutz (1985). Análises físico-químicas Para as análises físico-químicas as amostra foram coletadas na saída do trocador de calor do mosto, com o objetivo de quantificar o seu teor de acidez expressos em gramas por litro. Determinação da acidez A acidez total dos mostos foi determinada pelo método da titulação volumétrica com solução de NaOH 0,1N, utilizando-se como indicador a solução alcoólica de fenolftaleína 1%. Para cada titulação, utilizou-se 20 ml do mosto diluído com 50 ml de água de osmose, segundo metodologia descrita pelo Instituto Adolf Lutz (1985). A determinação de acidez foi feita a partir do volume gasto de NaOH 0,1N de acordo com a fórmula abaixo: Cálculo: (1) Acidez = Volume de NaOH 0,1 N gasto x 0,245 x fator de correção do NaOH 0,1N. Expressar em gramas/ litro. Determinação do ph O ph das amostras foi determinado pelo método de leitura direta, por meio do aparelho digital Digimed, modelo DM22 provido de um eletrodo combinado DME- CV1. Análises microbiológicas Para as análises microbiológicas as amostras foram coletadas assepticamente na saída do trocador de calor do mosto. As análises foram realizadas com o emprego do método de contagem rápida em placas Petrifilm, específicas para contagem de microrganismos mesófilos aeróbios totais, seguindo as recomendações do fabricante. Foram utilizadas 95 amostras, sendo feitas diluições seriadas até 10 7 das amostras, utilizando água peptonada esterilizada. Em seguida as placas foram inoculadas em duplicata com 1ml das diluições, utilizando uma câmara de fluxo laminar modelo PcrT2-Eco. As placas foram incubadas por 48 horas em estufa bacteriológica modelo TE-392/1 à 35ºC. A contagem das colônias de bactérias foi realizada na área de crescimento circular considerando como colônia os pontos vermelhos e rosa. A contagem das colônias viáveis corresponde as médias dos valores obtidos em cada uma das duas

6 Engenharia/Engineering 52 repetições. Os resultados foram expressos de acordo com a fórmula abaixo: Cálculo: (2) UFC/ml = número de colônias contadas x diluição da amostra. 3.3-Rendimento fermentativo Para calcular o rendimento fermentativo foi utilizada a metodologia descrita a seguir: B = etanol produzido na fermentação; RF = rendimento fermentativo. Cálculo: (3) B = (Volume dorna x % etanol v/v do vinho bruto) (volume cuba x % etanol v/v do pé de cuba) + (litros de etanol recuperado na coluna de CO 2 ) RF = B / (volume de mosto x %ART mosto x 0,006475) 3.4-Delineamento Estatístico O delineamento usado para o tratamento dos dados foi o Coeficiente de correlação linear simples de Pearson, utilizado para mensurar a intensidade de relação entre as variáveis x e y. 4-RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos na execução dos testes estão apresentados na Tab. 01. Os dados coorespondem as médias semanais entre o período de maio à julho de Tabela 01- Comparação entre as médias semanais de acidez do mosto, rendimento fermentativo e contaminação bacteriana do mosto. Acidez (g/l) Bactérias (UFC/ml) Rendimento Fermentativo 0,92 8,16E+06 79,34 0,83 6,47E+06 81,57 0,60 4,50E+06 83,58 0,58 4,24E+06 88,87 0,56 3,41E+06 89,85 0,47 2,77E+06 90,18 0,46 1,31E+06 90,53 0,46 8,27E+05 90,55 0,43 8,00E+05 90,62 0,42 7,47E+05 90,65 0,42 6,00E+05 90,70 0,40 3,50E+05 91,02 0,31 3,20E+05 91,18 0,30 3,00E+05 91,87 0,28 2,00E+05 91,97 0,28 1,40E+05 92,04 0,27 5,30E+04 92,39 0,21 4,00E+04 92,47 0,20 3,00E+04 92,69 Média 0, ,51E+06 90, Variância 0, ,70E+12 8, Desvio P. 0, ,41E+06 3, CV % 46, , , Correlação: Acidez/Contaminação 0, Correlação:RF/Acidez -0, Correlação: RF/Contaminação -0, Analisando os dados apresentados na Tab.1, verifica-se que, tanto a acidez, como a contaminação bacteriana em níveis elevados afetam o rendimento fermentativo. As concentrações de bactérias acima de 3,0 x 10 6 apresentaram uma maior influência, tanto no aumento da acidez, como na queda do rendimento fermentativo. Os resultados demonstram que, teores entre 0,3 e 0,2 g/l de do mosto não influenciaram a variação do rendimento fermentativo, enquanto que a menor taxa de contaminação bacteriana representou uma elevação no rendimento fermentativo. Os resultados demonstram que os melhores rendimentos fermentativos apresentaram contaminação abaixo de De acordo com Ribeiro (2010), o rendimento fermentativo médio situa-se entre 90-92%, devendo manter um índice de contaminação na dorna entre /ml. Outro fator mencionado é a queda do rendimento fermentativo quando a levedura é exposta a condições ácidas durante o processo de fermentação. O estudo demonstrou que existe uma relação indireta entre a contaminação bacteriana e o rendimento fermentativo final. O rendimento fermentativo decresceu à medida que a contaminação bacteriana aumentou, conforme Fig. 01. Figura 1. Rendimento fermentativo em função da contaminação bacteriana Este fato também é comentado por Ribeiro (2010), o qual relata que o rendimento fermentativo diminui com o aumento da contaminação bacteriana no mosto fermentado. O mesmo também descreve que a contaminação bacteriana é uma das causas frequentes de estresse nas leveduras. E

7 Engenharia/Engineering 53 que, este fato pode levar à formação de glicerol pelas leveduras, composto que atua na manutenção do equilíbrio redox (NADH produzido é igual ao NADH consumido). Ainda, segundo Ribeiro (2010), uma causa da alteração desse equilíbrio é a presença de ácidos orgânicos produzidos pelas bactérias contaminantes do meio fermentativo. Com relação à acidez, a Fig. 2 mostra uma correlação indireta entre as variáveis, onde o rendimento fermentativo decresceu à medida que se elevou de acidez do meio. que, enquanto a acidez produzida aumentou em 2,7 vezes em 15 ciclos fermentativos, houve uma redução da viabilidade em 64%, sendo que o rendimento fermentativo decresceu de 75% para 49%. CONCLUSÃO Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que, o rendimento fermentativo decresce à medida que os níveis de contaminação bacteriana do mosto aumentam. Os ácidos produzidos pela síntese dessas bactérias também afetam diretamente a conversão de açúcar em etanol pelas leveduras, comprometendo o rendimento fermentativo final. Portanto a contaminação bacteriana do mosto e seus metabólitos afetam diretamente a produção de etanol. Sendo assim, o controle microbiológico e a quantificação dos níveis de acidez do mosto, tornam-se ferramentas indispensáveis para o controle e prevenção de tais problemas. REFERÊNCIAS Figura 2. Rendimento fermentativo em função da acidez do mosto de alimentação. Esta relação foi apresentada por Amorim e Oliveira (1982), o qual relata que a presença de ácidos orgânicos e láticos, em quantidades superiores às normais podem ser responsáveis por uma queda no rendimento de fermentação. Em outro trabalho Amorim e Oliveira (1981), destacam que quando a contaminação bacteriana em meio fermentativo ultrapassa 1,0 x 10 7 células/ml, ocorre uma significativa redução do rendimento alcoólico. Analisando a Fig. 3 verifica-se que os teores de acidez variam conforme o nível de contaminação do mosto. O que demonstra uma relação direta entre as variáveis. Figura 3. Acidez do mosto em função da contaminação bacteriana. Oliva Neto e Yokoya (1994) apud Ventura (2007), em seu estudo, também mostraram o efeito negativo da acidez sobre a viabilidade celular das leveduras e o rendimento fermentativo final. Estes autores identificaram AMORIM, H. V.; OLIVEIRA, A. J. Infecção na fermentação: como evitá-la. Álcool e Açúcar, São Paulo, v.2, n.5, p.12-18, AMORIM, H. V.; OLIVEIRA, A. J.; CAMPOS, H. Infecção, problema sério na produção de álcool. In: Congresso Nacional da Sociedade dos Técnicos Açucareiros do Brasil, 2., Rio de Janeiro, Anais... Piraciaba: Stab. P CEBALLOS SCHIAVONE, C. A. D. M. Tratamento térmico do caldo de cana-de-açúcar visando a redução de contaminantes bacterianos Lactobacillus na produção de etanol e eficiência de tratamento do fermento por etanol p. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, CONAB. Avaliação da safra agrícola de cana-de-açúcar 2011/2012: primeiro levantamento. Brasília, maio Disponível em: < OlalaCMS/uploads/arquivos/11_05_27_11_53_13_boletim _cana_portugues_-_maio_2011_1o_lev..pdf >. Acesso em: 03 ago COSTA, V. M. Perfil de metabólitos excretados por Lactobacillus isolados de processos industriais de produção de etanol, com ênfase nos isômeros óticos D(-) e L(+) do ácido lático p. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, DAMASCENO, J. J. R. Destilação: obtenção de álcool hidratado e anidro. Uberaba, Apostila do Módulo I. Processamento na Indústria Sucroalcooleira. FAZU. GALLO, C. R. Determinação da microbiota bacteriana de mosto e de dornas de fermentação alcoólica p. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz: métodos físico-químicos para

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